检测莲草直胸跳甲ERP基因表达特性的引物及方法
阅读：864发布：2020-05-17
专利汇可以提供检测莲草直胸跳甲ERP基因表达特性的引物及方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了检测莲草直胸跳甲ERP基因表达特性的 荧光 定量PCR引物，引物包含两对，其序列如SEQ ID NO.1‑4所示，本发明建立了莲草直胸跳甲雌雄虫取食不同CO2浓度培育的空心莲子草后ERP基因表达量检测的荧光定量PCR法，并进行了转录组的测序，对ERP基因荧光定量的表达量趋势与转录组的表达量趋势做了比较，为研究莲草直胸跳甲受到 环境胁迫 时产生的防御机制及ERP基因表达特性奠定了 基础 。，下面是检测莲草直胸跳甲ERP基因表达特性的引物及方法专利的具体信息内容。
1.一种检测莲草直胸跳甲ERP基因表达特性的荧光定量PCR引物，其特征在于：包括符合荧光定量PCR反应特点的上下游引物：
ERP-F：5`-AAGACATTCAAATCAGCATCGTAGA-3`，
ERP-R：5`-GGTAGGCAACTGGACATCAC-3`；
以及作为内参基因的上下游引物：
Tubulin-F: 5`-AGATGTCCGCCACCTTCA-3` ，
Tubulin-R: 5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`。
2.一种采用权利要求1所述引物检测莲草直胸跳甲ERP基因表达特性的荧光定量PCR方法，其特征在于按如下步骤：
（1）cDNA第一链合成：提取样本的总RNA并纯化，采用反转录试剂盒得到以提取的RNA为模板反转录得到的cDNA；
（2）对下述引物进行常规PCR检测
该基因的荧光定量上下游引物：
ERP-F：5`-AAGACATTCAAATCAGCATCGTAGA-3`
ERP-R：5`-GGTAGGCAACTGGACATCAC-3`
以及作为内参基因的上下游引物：
Tubulin-F: 5`-AGATGTCCGCCACCTTCA-3`
Tubulin-R: 5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`
常规PCR扩增体系为25µL：10×buffer 2.5µL ，dNTP 1.0µL，上游引物0.5µL，下游引物
0.5µL，100ng/µL cDNA模板1.0µL，Ex-TaqE 0.15µL，水19.35µL；
常规PCR反应程序为：94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s， 56℃退火30 s， 72℃延伸1 min，此条件下35个循环，最后72℃再延伸10min；
（3）实时荧光定量PCR反应：
以步骤（1）得到的cDNA为模板，加入步骤（2）所述的引物，进行荧光定量PCR反应，每个样品设置3个重复，扩增后取平均值；
实时荧光定量PCR扩增体系为：SYBR® Premix Ex TaqTM 12.5µL，上游引物0.5µL，下游引物0.5µL，100ng/µL cDNA 1.0µL，补足水至25µL；
实时荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性 30 s，然后95℃变性5 s 、60℃退火30 s，
40个循环。
检测莲草直胸跳甲ERP基因表达特性的引物及方法
技术领域
背景技术
[0002] 莲草直胸跳甲属鞘翅目，叶甲科，是空心莲子草的主要生防天敌之一。George Vogt于1962年首次发现了莲草直胸跳甲对空心莲子草有很好的控制作用。其后，莲草直胸跳甲在美国、澳大利亚等地被广泛应用于空心莲子草的控制，并取得了较好的防治效果。我国于1986年从美国引进莲草直胸跳甲，并应用于空心莲子草的生物防治，在四川、浙江、福建、广西等地取得一定的成功。
[0003] 昆虫的天生免疫可以简单的分为体液免疫和细胞免疫，一旦入侵物较多时，细胞通过吞噬作用清除入侵物，当外源物太大不能被血细胞吞噬时，比如寄生蜂卵和幼蜂，真菌和原生动物寄生虫，甚至非生物对象，昆虫血细胞常会在外源物外形成一层或多层的鞘状物质以包囊外源物来杀死病原物。当外源物进入寄主血腔后，寄主血细胞与外源物随机接触，若颗粒血细胞接触到外源物，它能够识别外源物为“异己”进而附于外源物上，并释放出识别因子以吸引浆血细胞。浆血细胞附着后，在颗粒血细胞与外源物的复合体上延展，并且浆血细胞间会形成粒桥、微管，层层埋集，形成包囊。包囊是无脊椎动物对抗外源物质的主要防御反应。在不同种的昆虫中，参与包囊反应的细胞种类也有所差异，鳞翅目昆虫参与包囊作用的主要是粒细胞和浆细胞，而果蝇是叶状细胞。
[0004] 包 囊 蛋 白（encapsulation-relating protein，ERP）是昆虫产生包囊反应时最先在外来物周围积聚的蛋白。目前国内外对 ERP 的研究较少，最早研究的鞘翅目 ERP 基因来自黄粉虫。毛珊珊等（2016）测定了5种不同农药作用下，松墨天牛ERP上调表达，表明农药可能刺激了松墨天牛产生包囊反应，致使 ERP 的表达量增高。昆虫具备相当完善的先天免疫系统，可通过特定的蛋白分子快速有效地介导整个免疫过程。昆虫居住环境的类型较为复杂，为了应对外部的选择压力，已进化出不同类型且高效的防御策略，从而更好地保护自己，抵御外来物的入侵。研究分子介导所产生的对包囊反应的抑制或诱发，有助于了解无脊椎动物细胞免疫反应的基本过程。
[0005] 关于莲草直胸跳甲ERP基因的表达等研究国内外未见报道，因此采用实时荧光定量PCR研究不同CO2浓度处理下莲草直胸跳甲ERP基因的表达特性，结果表明，随着CO2浓度的升高，雌雄虫ERP基因的表达量均下降，这与转录组表达量下调的变化趋势一致，说明CO2浓度升高可以影响ERP基因的表达调控。探讨不同CO2浓度处理后 ERP 基因表达情况，为探索莲草直胸跳甲免疫系统与环境胁迫的互作关系提供参考，为进一步研究该基因在昆虫防御反应中的作用奠定基础。
发明内容
[0006] 本发明的目的是一种高效快捷检测莲草直胸跳甲ERP基因表达量的实时荧光定量PCR引物及方法，为全面了解莲草直胸跳甲ERP基因的表达特性而设计的不同处理CO2浓度。
[0007] 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：将取食不同CO2浓度培育的空心莲子草的莲草直胸跳甲雌雄虫各采9只到Eppendorf管中，分为3个生物学重复，共12组样品。
[0008] 设计一对检测莲草直胸跳甲ERP基因表达特性的引物，其特征包括符合荧光定量PCR反应特点的上下游引物：ERP-F：5`-AAGACATTCAAATCAGCATCGTAGA-3`
ERP-R：5`-GGTAGGCAACTGGACATCAC-3`
以及作为内参基因的上下游引物：
Tubulin-F: 5`-AGATGTCCGCCACCTTCA-3`
Tubulin-R: 5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`
本发明所述检测莲草直胸跳甲ERP基因表达特性的荧光定量PCR法，其特征按如下步骤进行：
（1）cDNA第一链合成：提取样本的总RNA并纯化，采用反转录试剂盒得到以提取的RNA为模板反转录得到的cDNA；
（2）对下述引物进行常规PCR检测
该基因的荧光定量上下游引物：
ERP-F：5`-AAGACATTCAAATCAGCATCGTAGA-3`
ERP-R：5`-GGTAGGCAACTGGACATCAC-3`
以及作为内参基因的上下游引物：
Tubulin-F: 5`-AGATGTCCGCCACCTTCA-3`
Tubulin-R: 5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`
常规PCR扩增体系如下：
常规PCR反应程序如下：94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s， 56℃退火30 s，72℃延伸1 min，此条件下35个循环，最后72℃再延伸10min；
（3）实时荧光定量PCR反应：
以步骤（1）得到的cDNA为模板，加入步骤（2）所述的引物，进行荧光定量PCR反应，每个样品设置3个重复，扩增后取平均值。
ERP-R：5`-GGTAGGCAACTGGACATCAC-3`
以及作为内参基因的上下游引物：
Tubulin-F: 5`-AGATGTCCGCCACCTTCA-3`
Tubulin-R: 5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`
本发明所述检测莲草直胸跳甲ERP基因表达特性的荧光定量PCR法，其特征按如下步骤进行：
（1）cDNA第一链合成：提取样本的总RNA并纯化，采用反转录试剂盒得到以提取的RNA为模板反转录得到的cDNA；
（2）对下述引物进行常规PCR检测
该基因的荧光定量上下游引物：
ERP-F：5`-AAGACATTCAAATCAGCATCGTAGA-3`
ERP-R：5`-GGTAGGCAACTGGACATCAC-3`
以及作为内参基因的上下游引物：
Tubulin-F: 5`-AGATGTCCGCCACCTTCA-3`
Tubulin-R: 5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`
常规PCR扩增体系如下：
常规PCR反应程序如下：94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s， 56℃退火30 s，72℃延伸1 min，此条件下35个循环，最后72℃再延伸10min；
（3）实时荧光定量PCR反应：
以步骤（1）得到的cDNA为模板，加入步骤（2）所述的引物，进行荧光定量PCR反应，每个样品设置3个重复，扩增后取平均值。
[0009] 实时荧光定量PCR扩增体系如下：实时荧光定量PCR反应程序如下：95℃预变性 30 s，然后95℃变性5 s 、60℃退火30 s，40个循环。
[0010] 本发明更加详细的试验方法如下：莲草直胸跳甲ERP基因的实时荧光定量PCR检测方法可通过以下步骤实现：
（1）引物设计：根据转录组测序结果得到的莲草直胸跳甲ERP基因的序列，使用DNAMAN软件设计适合荧光定量PCR检测的特异性引物，引物序列如下：
ERP-F：5`-AAGACATTCAAATCAGCATCGTAGA-3`
ERP-R：5`-GGTAGGCAACTGGACATCAC-3`
同时，根据转录组测序结果得到的莲草直胸跳甲tubulin基因的序列，设计用于荧光定量PCR内对照物的引物，引物序列如下：
Tubulin-F: 5`-AGATGTCCGCCACCTTCA-3`
Tubulin-R: 5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`
－1 －1
（2）莲草直胸跳甲处理试验：在对照CO2浓度（420μL·L ）和高CO2浓度（750μL·L ）的人工气候箱里培育空心莲子草，用于饲养莲草直胸跳甲雌雄虫，不同CO2浓度的雌雄虫各采
9只到Eppendorf管中，分为3个生物学重复，共12组样品。虫样处理后迅速放入液氮中固定，于-80℃保存备用。
（1）引物设计：根据转录组测序结果得到的莲草直胸跳甲ERP基因的序列，使用DNAMAN软件设计适合荧光定量PCR检测的特异性引物，引物序列如下：
ERP-F：5`-AAGACATTCAAATCAGCATCGTAGA-3`
ERP-R：5`-GGTAGGCAACTGGACATCAC-3`
同时，根据转录组测序结果得到的莲草直胸跳甲tubulin基因的序列，设计用于荧光定量PCR内对照物的引物，引物序列如下：
Tubulin-F: 5`-AGATGTCCGCCACCTTCA-3`
Tubulin-R: 5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`
－1 －1
（2）莲草直胸跳甲处理试验：在对照CO2浓度（420μL·L ）和高CO2浓度（750μL·L ）的人工气候箱里培育空心莲子草，用于饲养莲草直胸跳甲雌雄虫，不同CO2浓度的雌雄虫各采
9只到Eppendorf管中，分为3个生物学重复，共12组样品。虫样处理后迅速放入液氮中固定，于-80℃保存备用。
[0011] （3）cDNA第一链合成：参照全式金公司的TransZolTM Up Plus RNA Kit试剂盒说明书提取总RNA，按照TransScript公司的 One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明书，合成cDNA第一链。
[0012] （4）实时荧光定量PCR反应：实时荧光定量PCR采用Takara公司的SYBR® Premix Ex TaqTM试剂盒进行。以上述合成的cDNA第一链为模板，上述ERP-F、ERP-R和Tubulin-F、Tubulin-R为特异性引物，进行荧光定量PCR程序，每个样品设3个平行重复，扩增后取所得平行Ct值的平均数。
[0013] 实时荧光定量PCR扩增体系如下：实时荧光定量PCR反应程序如下：95℃预变性 30 s，然后95℃变性5 s 、60℃退火30 s，40个循环。
[0014] （5）莲草直胸跳甲ERP基因相对于tubulin基因的表达量的计算公式为：相对mRNA表达= 2-ΔΔCt×100%，其中Ct值=靶基因Ct值- tubulin Ct值。
[0015] （6）图3和图4分别为莲草直胸跳甲雌雄虫取食不同CO2浓度培育的空心莲子草后ERP基因的差异表达。结果表明，随着CO2浓度的升高，雌雄虫ERP基因的表达量均升高，并与转录组的表达量变化趋势一致，这为我们深入开展莲草直胸跳甲ERP基因的研究提供了重要的基础数据。
[0017] （2）本发明所述高效快捷的荧光定量PCR法，包括荧光定量PCR程序等，实际用时55 min，相对于现有技术大大缩短了反应时间，具有高效快捷的特性。
[0019] 附图为莲草直胸跳甲雌雄虫ERP基因转录水平的荧光定量PCR检测结果。
[0020] 图1：莲草直胸跳甲ERP基因荧光定量引物常规PCR产物电泳结果：产物长度为137 bp，Marker条带从上到下依次为：2000、1000、750、500、250、100bp。
[0021] 图2：莲草直胸跳甲tubulin基因荧光定量引物常规PCR产物电泳结果：产物长度为199 bp，
Marker条带从上到下依次为：2000、1000、750、500、250、100bp。
Marker条带从上到下依次为：2000、1000、750、500、250、100bp。
[0022] 图3：莲草直胸跳甲雌虫（F）取食不同CO2浓度培育的空心莲子草后ERP基因的差异表达，柱形和左边坐标轴为荧光定量的表达量，散点和右边坐标轴为转录组的表达量。
[0023] 图4：莲草直胸跳甲雄虫（M）取食不同CO2浓度培育的空心莲子草后ERP基因的差异表达，柱形和左边坐标轴为荧光定量的表达量，散点和右边坐标轴为转录组的表达量。具体实施方案
[0024] 以下结合具体实施例及附图说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制发明，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
[0025] 实施例1试验材料的处理
在对照CO2浓度（420μL·L－1）和高CO2浓度（750μL·L－1）的人工气候箱里培育空心莲子草，用于饲养莲草直胸跳甲雌雄虫，不同CO2浓度的雌雄虫各采9只到Eppendorf管中，分为3个生物学重复，共12组样品。虫样收集后迅速放入液氮中固定，于-80℃保存备用。
在对照CO2浓度（420μL·L－1）和高CO2浓度（750μL·L－1）的人工气候箱里培育空心莲子草，用于饲养莲草直胸跳甲雌雄虫，不同CO2浓度的雌雄虫各采9只到Eppendorf管中，分为3个生物学重复，共12组样品。虫样收集后迅速放入液氮中固定，于-80℃保存备用。
[0026] 实施例2引物的设计
（1）引物设计：根据转录组测序得到的莲草直胸跳甲ERP基因的序列，使用DNAMAN软件设计适合荧光定量PCR检测的特异性引物，引物序列如下：
ERP-F：5`-AAGACATTCAAATCAGCATCGTAGA-3`
ERP-R：5`-GGTAGGCAACTGGACATCAC-3`
莲草直胸跳甲ERP基因荧光定量PCR产物长度为137 bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光定量PCR检测，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。
（1）引物设计：根据转录组测序得到的莲草直胸跳甲ERP基因的序列，使用DNAMAN软件设计适合荧光定量PCR检测的特异性引物，引物序列如下：
ERP-F：5`-AAGACATTCAAATCAGCATCGTAGA-3`
ERP-R：5`-GGTAGGCAACTGGACATCAC-3`
莲草直胸跳甲ERP基因荧光定量PCR产物长度为137 bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光定量PCR检测，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。
[0027] （2）同时，根据转录组测序得到的莲草直胸跳甲tubulin基因的序列，设计用于荧光定量PCR内对照物的引物，引物序列如下：Tubulin-F: 5`-AGATGTCCGCCACCTTCA-3`
Tubulin-R: 5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`
莲草直胸跳甲tubulin基因荧光定量PCR产物长度为199 bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光定量PCR检测，琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。
Tubulin-R: 5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`
莲草直胸跳甲tubulin基因荧光定量PCR产物长度为199 bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光定量PCR检测，琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。
[0028] 实施例3总RNA的提取
参照全式金公司的TransZolTM Up Plus RNA Kit试剂盒说明书提取总RNA，用液氮将虫体研磨成粉，加入1ml TransZolTM Up，转到1.5 ml 转离心管中，室温静置5 min后，加入
200 μL氯仿/1 ml TransZolTM Up，剧烈振荡30 s ，室温孵育3 min。 4℃ 10000 g 离心15 min后，移上层水相（一般<80%）于新的离心管中，加入1/3体积的无水乙醇，轻轻颠倒混匀。
将RNA离心柱套于2 ml收集管中，将上步混合物全部转入离心柱中，12000 g，30 60 s离心，~
弃流动相，重复使用收集管。加入500 μLCB9，室温12000 g离心30 s，弃流动相，再加入500 μLCB9，室温12000 g离心30 s，弃流动相。加入稀释的500 μLWB9，12000 g 离心30 s，弃流动相，再加入稀释的500 μLWB9，12000 g 离心30 s，弃流动相。12000 g 离心2 min，彻底去除残留的乙醇，在室温静置数分钟彻底晾干离心柱。将离心柱放入RNase-free Tube中，加
50 μLRNase-free Water在离心柱的中央，室温静置1 min，12000 g离心1 min，洗脱RNA。所得的RNA置于-80℃备用。
参照全式金公司的TransZolTM Up Plus RNA Kit试剂盒说明书提取总RNA，用液氮将虫体研磨成粉，加入1ml TransZolTM Up，转到1.5 ml 转离心管中，室温静置5 min后，加入
200 μL氯仿/1 ml TransZolTM Up，剧烈振荡30 s ，室温孵育3 min。 4℃ 10000 g 离心15 min后，移上层水相（一般<80%）于新的离心管中，加入1/3体积的无水乙醇，轻轻颠倒混匀。
将RNA离心柱套于2 ml收集管中，将上步混合物全部转入离心柱中，12000 g，30 60 s离心，~
弃流动相，重复使用收集管。加入500 μLCB9，室温12000 g离心30 s，弃流动相，再加入500 μLCB9，室温12000 g离心30 s，弃流动相。加入稀释的500 μLWB9，12000 g 离心30 s，弃流动相，再加入稀释的500 μLWB9，12000 g 离心30 s，弃流动相。12000 g 离心2 min，彻底去除残留的乙醇，在室温静置数分钟彻底晾干离心柱。将离心柱放入RNase-free Tube中，加
50 μLRNase-free Water在离心柱的中央，室温静置1 min，12000 g离心1 min，洗脱RNA。所得的RNA置于-80℃备用。
[0029] 实施例4cDNA第一链合成：按照TransScript公司的 One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明书步骤，以实施例3中的RNA为模板，反转录生成cDNA第一链，具体步骤如下：
（1）反转录体系
（2）42℃温育30 min。
（1）反转录体系
（2）42℃温育30 min。
[0030] （3）85℃加热5 min，产物可放在-20℃、-80℃保存。
[0031] 实施例5进行荧光定量PCR反应。实时荧光定量PCR采用Takara公司的SYBR® Premix Ex TaqTM试剂盒进行。以实施例4中的cDNA为模板，用实施例2中的引物进行实时荧光定量PCR扩增反应，每个样品设3个平行重复，扩增后取所得平行Ct值的平均数。
[0032] （1）实时荧光定量PCR扩增体系如下：（2）实时荧光定量PCR反应程序如下：95℃预变性 30 s，然后95℃变性5 s 、60℃退火
30 s，40个循环。
30 s，40个循环。
[0033] （3）实时荧光定量PCR完成后，根据Ct值计算不同处理条件下相对表达量的比值2-ΔΔCt。莲草直胸跳甲ERP基因相对于tubulin基因的表达量的计算公式为：相对mRNA表达= 2-ΔΔCt×100%，其中Ct值=靶基因Ct值- tubulin Ct值。
[0034] 表1：莲草直胸跳甲雌虫（F）取食不同CO2浓度培育的空心莲子草后ERP基因的C(T)值、平均值、标准偏差、荧光定量表达量及转录组的表达量表2：莲草直胸跳甲雄虫（M）取食不同CO2浓度培育的空心莲子草后ERP基因的C(T)值、平均值、标准偏差、荧光定量表达量及转录组的表达量
（4）图3和图4分别为莲草直胸跳甲雌雄虫取食不同CO2浓度培育的空心莲子草后ERP基因的差异表达。结果表明，随着CO2浓度的升高，雌雄虫ERP基因的表达量均降低，与转录组的表达量下调的变化趋势一致。这为我们深入开展莲草直胸跳甲ERP基因的研究提供了重要的基础数据。
（4）图3和图4分别为莲草直胸跳甲雌雄虫取食不同CO2浓度培育的空心莲子草后ERP基因的差异表达。结果表明，随着CO2浓度的升高，雌雄虫ERP基因的表达量均降低，与转录组的表达量下调的变化趋势一致。这为我们深入开展莲草直胸跳甲ERP基因的研究提供了重要的基础数据。
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