一种lncRNA在藏绵羊低氧适应性检测中的应用
阅读：677发布：2020-05-19
专利汇可以提供一种lncRNA在藏绵羊低氧适应性检测中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了lncRNA在藏 绵羊 低 氧 适应性检测中的应用，所述lncRNA为TCONS_00332125、TCONS_00377466或TCONS_00139593，通过系统研究藏绵羊低氧适应性lncRNA表达谱，筛选经qRT-PCR验证的与低氧适应性相关的lncRNA，能够应用于藏绵羊低氧适应性检测，有助于阐明藏绵羊对低氧 环境胁迫 下的适应性机制，丰富极端环境下 反刍动物 分子生态适应性方面的 基础 理论，且为藏绵羊分子育种及功能基因组学研究提供科学 支撑 。，下面是一种lncRNA在藏绵羊低氧适应性检测中的应用专利的具体信息内容。
1.lncRNA在藏绵羊低氧适应性检测中的应用，其特征在于，所述lncRNA为TCONS_
00332125、TCONS_00377466或TCONS_00139593；所述TCONS_00332125、TCONS_00377466和TCONS_00139593的序列如SEQ IDNO.1-3所示。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述lncRNA的筛选方法包括以下步骤：
1)分别提取具有3个生物学重复的不同海拔藏绵羊和对照组湖羊肝脏和肺脏组织样品进行lncRNA测序，通过分析获得Clean Data数据；
2)分析所述Clean Data数据获得预测的lncRNA；
3)分别比较不同海拔藏绵羊和对照组湖羊肝脏和肺脏组织样品中显著差异表达的候选lncRNA即为检测获得的低氧适应性lncRNA。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述不同海拔藏绵羊包括高海拔霍巴藏绵羊和阿旺藏绵羊以及中海拔祁连白藏绵羊和甘加藏绵羊。
4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述步骤1)包括以下步骤：
1.1)提取藏绵羊和湖羊肝脏和肺脏组织样品的总RNA；
1.2)构建所述步骤1.1)提取总RNA的cDNA文库；
1.3)质检所述步骤1.2)构建的cDNA文库；
1.4)将所述总RNA的cDNA文库上机测序，通过分析获得Clean Data数据。
5.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述步骤2)包括以下步骤：
2.1)对所述Clean Data数据进行预处理及均一化，使Q30碱基百分比大于85％，获得有效数据；
2.2)将所述步骤2.1)获得的有效数据与参考基因组Oar_v3.1进行序列比对，获得Mapped Reads；
2.3)利用Cufflinks和Scripture程序将所述Mapped Reads进行转录本拼接；2.4)选择长度≥200bp、Exon个数≥2的转录本，利用cufflinks计算每个转录本的最小覆盖度、选择最小覆盖度≥3的转录本，或者同时被Cufflinks和Scripture拼接得到的lncRNA为预测的lncRNA。
6.一种检测藏绵羊肝脏和肺脏组织中低氧适应性的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：总RNA的反转录体系和cDNA的扩增体系；所述总RNA的反转录体系中包括总RNA，逆转录酶，dNTP和oligdT；所述cDNA的扩增体系中包括TCONS_00332125引物、TCONS_00377466引物和TCONS_00139593引物，所述TCONS_00332125引物具有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示核苷酸序列，所述TCONS_00377466引物具有SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示核苷酸序列，所述TCONS_00139593引物具有SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示核苷酸序列。
7.权利要求6所述试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待测组织样品总RNA；
利用所述总RNA反转录体系将提取的总RNA反转录制备成cDNA；
利用所述cDNA扩增体系，用所述TCONS_00332125引物、TCONS_00377466引物和TCONS_
00139593引物对制备得到的cDNA进行qRT-PCR扩增lncRNA。
8.lncRNA在靶基因检测中的应用，其特征在于，所述lncRNA为TCONS_00332125、TCONS_
00377466或TCONS_00139593，所述靶基因的预测通过cis和trans作用方式实现。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述低氧适应性lncRNA的靶基因qRT-PCR扩增引物包括SEQ ID NO.10-29。
一种lncRNA在藏绵羊低氧适应性检测中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 青藏高原藏绵羊主要分为高原型(草地型)、山谷型和欧拉型三大类，各地根据其自然生态特点又细分为不同的类型，属粗毛型绵羊地方品种。藏绵羊原产于青藏高原，主要分布于西藏自治区及青海、甘肃、四川、云南、贵州等地，由于各生态条件差异悬殊，形成了不同的类型。高原型(草地型)藏绵羊是主体，数量最多，主要分布于西藏境内的冈底斯山、念青唐古拉山以北的藏北高原和雅鲁藏布江地带；山谷型藏绵羊主要分布在青海省南部的班玛、囊谦两县的部分地区，四川省阿坝藏族羌族自治州南部牧区，云南昭通市、曲靖市、丽江市及保山市腾冲县。欧拉型藏绵羊是一个特殊生态类型，中心产区位于甘肃省甘南藏族自治州玛曲县欧拉乡及比邻地区及青海省河南蒙古族自治县和久治县等地。
[0003] 高寒和缺氧是高原地区主要的生态限制因子，高原土著动物在长期的适应进化过程中形成了独特的低氧适应策略(Liu et al.,2016；Wei et al.,2015；Beall,2013)。藏绵羊是青藏高原的土著反刍家畜和草地生态系统的重要组成部分，是藏族人民重要的生活和生产资料，同时也是其财富的象征(Long et al.,2008)。藏绵羊在粗放和传统的放牧管理模式下，千百年来对青藏高原严酷的生态环境具有极强的适应能力。藏绵羊经过长期的自然选择和进化，对高寒、低氧、强紫外线和冷季营养胁迫等恶劣的自然环境条件具有极强的适应能力，并通过生理和营养代谢加以调节。在对高海拔藏绵羊和低海拔小尾寒羊的肺组织结构研究中，发现藏绵羊单位面积肺泡数比小尾寒羊显著增多、肺泡隔的厚度显著增加、终末细支气管的管径显著减小,并认为这些差异和特点是藏绵羊肺组织适应高寒低氧的形态学特点(俞红贤，1999)。测定藏绵羊的肺动脉压、肺动脉楔压、体动脉压和心输出量、计算肺血管阻力，在NOS非选择性抑制剂的作用下，藏绵羊肺动脉压稍有增加，心输出量减少，且4500米比2300米处藏绵羊的肺血管阻力显著增大(P<0.05)；在NOS选择性抑制物作用下，只有前者的肺血管阻力增加，后者没有变化。随内源性NOS活性受到抑制，NO的生成量亦减少，促使机体肺血管收缩，使藏绵羊适应低氧环境(Ruan et al.,2004)。这与Koizumi等对不同海拔藏绵羊的肺血管阻力的测定结果一致(Koizumi et al.,2004)。在慢性缺氧条件下，引进高海拔绵羊胎盘中的VEGF和NOS基因的表达量上调，机体通过合成VEGF来缓解低氧，这可能是低海拔绵羊在高海拔地区的长期习服机制(Parraguez et al.,2010)。在对高海拔藏绵羊和低海拔湖羊生化指标研究中，藏绵羊生化指标(红血细胞、红细胞压积、平均红细胞体积、红细胞平均血红蛋白)高或显著高，藏绵羊对高寒低氧的适应并不是从增加血红蛋白浓度上来实现的，可能是提高了血红蛋白输送氧气的能力和效率,这些独特的生理机能有利于增加肺通气量和肺血流量，并通过内源NO产量高低来调节肺部血管系统以适应高寒低氧的环境(Liu et al.,2016)。
[0004] 藏绵羊不仅形成有效摄取、输送和利用氧的结构特征和生理机制，而且通过对细胞代谢和抗低氧因子诱导从分子水平上来适应高寒低氧环境(Wei et al.,2016；Yang et al.,2016；Liu et al.,2016)。这主要表现在一些细胞因子、淋巴因子、激素、能量代谢、氧传输、响应缺氧、DNA修复酶等一些适应性相关基因和信号通路的变化上；处于低氧环境中的组织细胞则可能通过其膜上的氧受体分子来感受低氧信号，并启动许多低氧反应基因做出复杂的响应(Wu,2012)。
[0005] 近年来随基因检测技术的革新，高寒土著动物适应高寒低氧环境的神秘面纱被逐步揭开。通过对不同海拔梯度7个地方绵羊品种122只个体进行全基因组扫描，揭示了适应高寒低氧环境的236个差异基因和8个特异候选基因，其中EPAS1基因在高海拔低氧调控网络中起着核心作用，同时也包含了与低氧诱导因子HIF-1α相关的三个基因Adam17、Arg2、Mmp3(Wei et al.,2016；Liu et al.,2016)。利用高通量测序技术及生物信息分析策略，从基因组水平充分揭示了高原藏猪(Li et al.,2013)和地山雀(Qu et al.,2013)特有的高寒低氧适应性分子机制。在饲料消化代谢方面，藏绵羊瘤胃微生物群落通过基因调控提高了饲料干物质、粗蛋白、纤维消化率、氮沉积、日粮氮利用率、有效尿素的转化利用效率(Huang andLiu,2009；周建伟，2015)，揭示了藏绵羊氮素胁迫下营养适应性机制。
[0006] 藏绵羊是我国青藏高原特有的、古老的、品质优良的地毯毛绵羊地方群体。由于藏绵羊能够适应恶劣的高寒气候环境、充分利用其它大家畜无法利用的自然资源。因其长期生活在低氧、寒冷、干燥、辐射强烈、降水少，平均海拔4000米的高原地区，在环境压力和粗放式饲养方式下，已形成对高寒低氧、干燥生境稳定的遗传机制。
[0007] 长链非编码RNA(longnon-coding RNA，lncRNA)是一类位于细胞核或细胞质内的功能性RNA分子，由RNA聚合酶II(RNAPolymerase II)或RNA聚合酶III(RNAPolymerase III)转录而成，其重复序列较少，半衰期较短，结合位点单一，是一类转录本长度超过200个核苷酸的非编码RNA，其本身并不编码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面调控基因的表达水平。近年研究发现lncRNA是一类具有重要生物学功能的RNA，参与转录激活、转录干扰、核内运输、染色体修饰、染色体沉默、基因组印记等多种重要的调控过程，在遗传和表观遗传、基因转录和翻译、细胞分化和发育等生命活动中均发挥重要的调控作用。
发明内容
[0009] 有鉴于此，本发明的目的在于提供lncRNA在藏绵羊低氧适应性检测中的应用。
[0010] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0011] 本发明提供了lncRNA在藏绵羊肝脏和肺脏组织中低氧适应性检测中的应用，所述lncRNA为TCONS_00332125、TCONS_00377466或TCONS_00139593。
[0012] 所述lncRNA的筛选方法包括以下步骤：
[0013] 1)提取具有3个生物学重复的不同海拔藏绵羊和对照组湖羊肝脏和肺脏组织样品进行lncRNA测序，通过分析获得Clean Data数据；
[0014] 2)分析所述Clean Data数据获得预测的lncRNA；
[0015] 3)分别比较不同海拔藏绵羊和对照组湖羊肝脏和肺脏组织样品中显著差异表达的候选lncRNA即为检测获得的低氧适应性lncRNA。
[0016] 优选的，所述不同海拔藏绵羊包括高海拔霍巴藏绵羊和阿旺藏绵羊以及中海拔的祁连白藏绵羊和甘加藏绵羊。
[0017] 优选的，所述步骤1)包括以下步骤：
[0018] 1.1)提取藏绵羊和湖羊肝脏和肺脏组织样品的总RNA；
[0019] 1.2)构建所述步骤1.1)提取总RNA的cDNA文库；
[0020] 1.3)质检所述步骤1.2)构建的cDNA文库；
[0021] 1.4)将所述总RNA的cDNA文库上机测序，通过分析获得Clean Data数据。
[0022] 优选的，所述步骤2)包括以下步骤：
[0023] 2.1)对所述Clean Data数据进行预处理及均一化，使Q30碱基百分比大于85％，获得有效数据；
[0024] 2.2)将所述步骤2.1)获得的有效数据与参考基因组Oar_v3.1进行序列比对，获得Mapped Reads；
[0025] 2.3)利用Cufflinks和Scripture程序将所述Mapped Reads进行转录本拼接；
[0026] 2.4)选择长度≥200bp、Exon个数≥2的转录本，利用cufflinks计算每个转录本的最小覆盖度、选择最小覆盖度≥3的转录本，或者同时被Cufflinks和Scripture拼接得到的lncRNA为预测的lncRNA。
[0027] 本发明还提供了一种检测藏绵羊肝脏和肺脏组织中低氧适应性的试剂盒，包括以下组分：总RNA的反转录体系和cDNA的扩增体系；所述总RNA的反转录体系中包括总RNA，逆转录酶，dNTP和oligdT；所述cDNA的扩增体系中包括TCONS_00332125引物、TCONS_00377466引物和TCONS_00139593引物，所述TCONS_00332125引物具有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示核苷酸序列，所述TCONS_00377466引物具有SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示核苷酸序列，所述TCONS_00139593引物具有SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9所示核苷酸序列。
[0028] 本发明还提供了所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：提取待测组织样品总RNA；利用所述总RNA反转录体系将提取的总RNA反转录制备成cDNA；利用所述cDNA扩增体系，用所述TCONS_00332125引物、TCONS_00377466引物和TCONS_00139593引物对制备得到的cDNA进行qRT-PCR扩增lncRNA。
[0029] 本发明提供了lncRNA在藏绵羊肝脏和肺脏组织中低氧适应性检测中的应用，所述lncRNA为TCONS_00332125、TCONS_00377466或TCONS_00139593，通过cis和trans作用方式预测了所述lncRNA的10个靶基因。
[0030] 优选的，所述低氧适应性lncRNA靶基因的qRT-PCR扩增引物包括SEQ ID NO.10-29。
[0031] 本发明的有益效果
[0032] 本发明所述的lncRNA包括TCONS_00332125、TCONS_00377466或TCONS_00139593，能够应用于藏绵羊低氧适应性检测，有助于阐明藏绵羊对低氧环境胁迫下的适应性机制，丰富极端环境下反刍动物分子生态适应性方面的基础理论，且为藏绵羊分子育种及功能基因组学研究提供科学支撑。附图说明
[0033] 图1为肝脏组织中筛选的藏绵羊差异表达lncRNA；
[0034] 图2为肺脏组织中筛选的藏绵羊差异表达lncRNA；
[0035] 图3为肝脏组织中筛选的藏绵羊低氧适应性lncRNA；
[0036] 图4为肺脏组织中筛选的藏绵羊低氧适应性lncRNA；
[0037] 图5为肝脏和肺脏组织藏绵羊低氧适应性lncRNA及其靶基因的qRT-PCR验证结果。
具体实施方式
[0038] 本发明提供了lncRNA在藏绵羊肝脏和肺脏组织低氧适应性检测中的应用，所述lncRNA为TCONS_00332125、TCONS_00377466或TCONS_00139593。
[0039] 在本发明中，所述lncRNA的筛选方法优选包括以下步骤：
[0040] 1)提取不同海拔藏绵羊和对照组湖羊肝脏和肺脏组织样品进行lncRNA测序，通过分析获得Clean Data；
[0041] 2)分析Clean Data数据获得预测的lncRNA；
[0042] 3)比较不同海拔藏绵羊和对照组湖羊肝脏和肺脏组织样品中显著差异表达的候选lncRNA即为检测获得的低氧适应性lncRNA。
[0043] 在本发明中所述的不同海拔藏绵羊具体包括高海拔霍巴藏绵羊和阿旺藏绵羊；所述霍巴藏绵羊海拔高度为4468m、所述阿旺藏绵羊海拔高度为4452m；中海拔祁连白藏绵羊和甘加藏绵羊；所述祁连白藏绵羊海拔高度为3520m，所述甘加藏绵羊海拔高度为3551m；本发明中对照组湖羊海拔高度为-67m。所述TCONS_00332125引物具有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示核苷酸序列，所述TCONS_00377466引物具有SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示核苷酸序列，所述TCONS_00139593引物具有SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示核苷酸序列。
[0044] 本发明优选从不同的地点采集上述各个藏绵羊和湖羊样本的肝脏和肺脏组织，分别提取肝脏和肺脏组织总RNA。本发明中所述的肝脏和肺脏组织总RNA的提取优选的采用Life Technologies公司的 试剂进行，具体的操作步骤见 试剂货号为15596026的说明书。
[0045] 本发明在提取获得肝脏和肺脏总RNA后，优选的采用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific，USA)测定所提取的总RNA纯度和浓度，确定总RNA的OD260/OD280在1.8-2.1之间，总RNA的浓度大于等于100ng/μL。本发明在确定提取的总RNA纯度和浓度符合上述条件后，再对提取的总RNA完整性进行检测，所述总RNA完整性的检测优选的采用琼脂糖凝胶电泳质检的方法，电泳出现清楚的两个条带(28S/18S rRNA)，有时会有第三条带(5S rRNA)，最上方不可出现DNA污染条带，28S/18S应近似两倍。
[0046] 本发明在确定肝脏和肺脏组织总RNA的纯度、浓度和完整性都符合要求后，优选构建RNA的cDNA文库，所述构建cDNA文库具体的包括以下步骤：
[0047] 1.21)利用epicentre Ribo-ZeroTM试剂盒去除样品总RNA中的rRNA，得到rRNA-depletedRNA，具体步骤按照epicentre Ribo-ZeroTM试剂盒说明书进行操作；
[0048] 1.22)然后向所述rRNA-depleted RNA中加入Fragmentation Buffer，将rRNA-depleted RNA随机打断；
[0049] 1.23)以所述随即打断的rRNA-depleted RNA为模板，用六碱基随机引物(randomhexamers)合成第一条cDNA链，然后向所述第一条cDNA链中加入缓冲液、dATP、dUTP、dCTP、dGTP、RNase H和DNApolymerase I合成第二条cDNA链，利用AMPure XPbeads对合成的双链cDNA纯化；
[0050] 1.24)对所述纯化的双链cDNA依次进行末端修复、加A并连接测序接头，用AMPure XPbeads选择180-200bp大小的片段；
[0051] 1.25)将所述步骤1.24)得到的双链cDNA降解含U链，通过PCR富集得到cDNA文库。
[0052] 本发明在获得RNA的cDNA文库后，优选的对获得的cDNA文库进行文库质控，文库质控合格后进行上机测序，通过分析获得Clean Data。所述的文库质控优选的采用Qubit 2.0和Agilent 2100对文库的浓度和插入片段大小(Insert Size)进行检测，插入片段大小优选的为180-200bp；使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，文库的有效浓度大于2nM为合格。
[0053] 本发明在文库质控合格后，进行上机测序，所述测序优选的用HiSeq2500进行高通量测序，测序读长为PE125，每个文库样品测序产出不少于10Gb CleanData。
[0054] 本发明在获得Clean Data数据后，对Clean Data数据进行分析，获得预测的lncRNA。本发明中分析Clean Data数据包括以下步骤：
[0055] 2.1)对Clean Data数据进行预处理及均一化，使Q30碱基百分比大于85％，获得有效数据；
[0056] 2.2)将步骤2.1)获得的有效数据与参考基因组Oar_v3.1进行序列比对，获得Mapped Reads；
[0057] 2.3)利用Cufflinks和Scripture程序将Mapped Reads进行转录本拼接；
[0058] 2.4)选择长度≥200bp、Exon个数≥2的转录本，利用cufflinks计算每个转录本的最小覆盖度、选择最小覆盖度≥3的转录本，或者同时被Cufflinks和Scripture拼接得到的lncRNA为预测的lncRNA。
[0059] 本发明在获得预测lncRNA后，检测差异表达lncRNA，在差异表达lncRNA检测过程中，将Fold Change≥2且FDR<0.01作为筛选标准。本发明筛选出差异表达lncRNA后，分别比较不同海拔藏绵羊和对照组湖羊肝脏和肺脏组织中显著差异表达的候选lncRNA即为检测获得的低氧适应性lncRNA。
[0060] 在本发明中，所述lncRNA的qRT-PCR引物是根据lncRNA序列用引物设计软件设计合成的，优选的所述lncRNA中TCONS_00332125上游和下游引物分别为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5、TCONS_00377466上游和下游引物分别为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7、TCONS_00139593上游和下游引物分别为SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9。
[0061] 本发明在验证检测低氧适应性lncRNA过程中所述的提取肝脏和肺脏组织样品总RNA步骤与上述lncRNA的筛选方法中提取肝脏和肺脏组织样品总RNA步骤一致，在此不再赘述。
[0062] 本发明在提取组织样品总RNA后，进行组织样品cDNA的制备。本发明中所述组织样品cDNA的制备优选为：对所述组织样品总RNA进行反转录合成组织样品cDNA。具体的在本发明中采用Vazyme试剂盒HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNAwiper)(货号R223-01)对提取的组织样品总RNA进行反转录合成cDNA。具体反应包括两个步骤：第一步去除基因组DNA和第二步反转录合成cDNA。本发明中第一步去除基因组DNA反应，反应体系如表1[0063] 表1去除基因组DNA的反应体系
[0064]试剂 使用量
4×gDNAwiperMix 2.0μL
TotalRNA 0.5μg
Nuclease-freeH2O 加至8.0μL
4×gDNAwiperMix 2.0μL
TotalRNA 0.5μg
Nuclease-freeH2O 加至8.0μL
[0065] 本发明将第一步反应所需上述试剂混合后置于42℃反应2min。
[0066] 本发明中第二步反转录合成cDNA的反应体系如表2
[0067] 表2反转录合成cDNA的反应体系
[0068]试剂 使用量
第一步的反应液 8.0μL
5×HiScriptIIQRTSuperMixII 2.0μL
总体积 10.0μL
第一步的反应液 8.0μL
5×HiScriptIIQRTSuperMixII 2.0μL
总体积 10.0μL
[0069] 本发明将上述第二步反应组份混合均匀后在 480Ⅱ型荧光定量PCR仪(Roche，Swiss)上反应，反应程序如下：25℃下10min→50℃下30min→85℃下5min。逆转录完毕后，本发明向得到的逆转录体系中加入90μL Nuclease-free H2O稀释至100μL，获得cDNA。在本发明中，所述cDNA储存于-20℃条件下备用。
[0070] 本发明在获得cDNA后，以所述cDNA为模板，用lncRNA的qRT-PCR引物对cDNA进行扩增。在本发明中具体的采用 Green PCRKit试剂盒(Qiagen，Germany)进行qRT-PCR扩增，以上述获得的cDNA为模板在 480Ⅱ型荧光定量PCR仪
(Roche，Swiss)上进行荧光定量PCR扩增。所述荧光定量PCR扩增体系如表3所示。
(Roche，Swiss)上进行荧光定量PCR扩增。所述荧光定量PCR扩增体系如表3所示。
[0071] 表3荧光定量PCR扩增体系
[0072]
[0073]
[0074] 荧光定量PCR程序：95℃5min；95℃10s，60℃30s，40个循环；循环结束后利用熔解曲线检测产物特异性，从60℃缓慢升温至97℃，每1℃采集5次荧光信号。
[0075] 本发明还提供了藏绵羊低氧适应性lncRNA在其靶基因检测中的应用，所述lncRNA为TCONS_00332125、TCONS_00377466或TCONS_00139593，所述藏绵羊低氧适应性lncRNA通过cis和trans作用方式与其靶基因相互作用。所述Cis作用方式是lncRNA的一种靶基因作用方式，所述低氧适应性lncRNA的靶基因优选的在lncRNA上下游10kb范围内的，优选的启动子区域同向转录的靶基因一般是促进表达作用，反向为抑制。而在3’-UTR区域时，部分情况下反向也为促进表达。
[0076] 本发明中所述低氧适应性lncRNA及其靶基因的表达量通过qRT-PCR扩增进行验证。本发明中所述低氧适应性lncRNA的表达量qRT-PCR扩增的方法和步骤与上述lncRNA的qRT-PCR检测方法一致，在此不再赘述。所述低氧适应性lncRNA靶基因的qRT-PCR扩增的引物优选的包括SEQ ID NO.10-29。
[0077] 通过对检测获得的低氧适应性差异表达lncRNA进行功能注释、富集(GO、KEGG)和蛋白互作网络分析，有助于阐明藏绵羊对低氧环境胁迫下的适应性机制，丰富极端环境下反刍动物分子生态适应性方面的基础理论，且为藏绵羊分子育种及功能基因组学研究提供科学支撑。
[0078] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
[0079] 实施例1
[0080] 一、材料和方法
[0081] 1、材料
[0082] 藏绵羊肝脏和肺脏组织样本信息如表4所示
[0083] 表4藏绵羊肝脏和肺脏组织样本信息
[0084]
[0085] 2、方法
[0086] 2.1藏绵羊肝脏和肺脏组织总RNA的提取
[0087] 按照Life Technologies公司的 试剂(货号15596026)说明书提取肝脏和肺脏的Total RNA，再用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific，USA)测定所提取的RNA的纯度和浓度，琼脂糖凝胶电泳质检确保提取的RNA的完整性。
[0088] 2.2RNA文库构建
[0089] 2.2.1利用epicentre Ribo-ZeroTM试剂盒去除样品rRNA；
[0090] 2.2.2加入FragmentationBuffer将rRNA-depleted RNA随机打断；
[0091] 2.2.3以rRNA-depleted RNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dATP、dUTP、dCTP、dGTP、RNase H和DNApolymerase I合成第二条cDNA链，利用AMPure XP beads纯化cDNA；
[0092] 2.2.4纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A并连接测序接头，然后用AMPure XPbeads进行片段大小选择；
[0093] 2.2.5最后降解含U链，通过PCR富集得到cDNA文库。
[0094] 2.3文库质控
[0095] 2.3.1使用Qubit 2.0进行初步定量，使用Agilent 2100对文库的Insert Size进行检测，Insert Size符合预期后才可进行下一步实验；
[0096] 2.3.2Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度＞2nM)，完成库检。
[0097] 2.4上机测序
[0098] 库检合格后，用HiSeq2500进行高通量测序，测序读长为PE125，每个样品测序产出不少于10Gb Clean Data。
[0099] 3、数据分析
[0100] 3.1测序数据及其质量控制
[0101] 经过测序质量控制，共获得379Gb CleanData，对所获得的Clean Data数据进行数据预处理及均一化，各样品Q30碱基百分比达到85％以上。
[0102] 3.2长链非编码数据与参考基因组序列比对
[0103] 使用基因组Oar_v3.1作为参考进行序列比对及后续lncRNA分析，Oar_v3.1下载地址：//ftp.ensembl.org/pub/release-78/fasta/ovis_aries/。
[0104] 3.3长链非编码文库质量评估
[0105] 合格的长链非编码文库是长链非编码测序的必要条件，为确保文库的质量，从以下3个不同角度对长链非编码测序文库进行质量评估：
[0106] 3.3.1通过检验Mapped Reads在转录本上的分布，评估mRNA片段化的随机性、mRNA的降解情况；
[0107] 3.3.2通过插入片段的长度分布，评估插入片段长度的离散程度；
[0108] 3.3.3通过绘制饱和度图，评估文库容量和Mapped Data是否充足。
[0109] 3.4转录本拼接
[0110] 利用Cufflinks和Scripture程序将Mapped Reads进行转录本拼接。
[0111] 3.5 lncRNA筛选
[0112] lncRNA基本筛选包括：去除基因组数据库中的mRNA(转录本及其剪接体)，选择长度≥200bp、Exon个数≥2的转录本，利用cufflinks计算每个转录本的最小覆盖度、选择最小覆盖度≥3的转录本，同时被Cufflinks和Scripture拼接得到的lncRNA也筛选出来，得到最终藏绵羊低氧适应性lncRNA检测。
[0113] 4、结果
[0114] 4.1本发明利用Cufflinks和Scripture组装获得473766个转录本，通过CPC、PFAM、CNCI、CPAT编码潜能性分析，肝脏组织中鉴定得到8107个lncRNA(图1)，通过不同海拔组合比较分析共有79个差异表达lncRNA；肺脏组织中鉴定得到1798个lncRNA(图2)，通过不同海拔组合比较分析共有151个差异表达lncRNA。
[0115] 4.2本发明比较不同海拔藏绵羊与对照组湖羊肝脏组织共有2个低氧适应特异性候选差异表达lcnRNA(图3)，肺脏组织共有1个低氧适应特异性候选差异表达lcnRNA(图4)。
[0116] 4.3本发明通过cis和trans作用方式预测了3个藏绵羊低氧适应性lncRNA的10个靶基因。
[0117] 实施例2
[0118] 1、材料：同实施例1。
[0119] 2、方法
[0121] 表5引物序列、退火温度和产物长度信息
[0122]
[0123]
[0124] 2.2藏绵羊和湖羊肝脏和肺脏组织总RNA的提取
[0125] 同实施例1。
[0126] 2.3肝脏和肺脏组织样品cDNA的制备
[0127] 采用Vazyme试剂盒HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(货号R223-01)对提取的总RNA反转录合成cDNA。
[0128] 第一步去除基因组DNA反应，反应体系及条件如表6所示。
[0129] 表6除基因组DNA反应体系及条件
[0130]试剂 使用量
4×gDNAwiperMix 2.0μL
TotalRNA 0.5μg
Nuclease-freeH2O 加至8.0μL
4×gDNAwiperMix 2.0μL
TotalRNA 0.5μg
Nuclease-freeH2O 加至8.0μL
[0131] 将上述组份混合后42℃反应2min；
[0132] 第二步反转录反应，反应体系及条件如表7所示
[0133] 表7反转录反应体系及条件
[0134]试剂 使用量
第一步的反应液 8.0μL
5×HiScriptIIQRTSuperMixII 2.0μL
总体积 10.0μL
第一步的反应液 8.0μL
5×HiScriptIIQRTSuperMixII 2.0μL
总体积 10.0μL
[0135] 将上述组份混合均匀后在 480Ⅱ型荧光定量PCR仪(Roche，Swiss)上反应，25℃10min，50℃30min，85℃5min；逆转录完毕后加入90μL Nuclease-free H2O稀释至100μL，储存在-20℃冰箱备用。
[0136] 2.4染料类荧光定量PCR检测特异性候选差异表达lncRNA及其靶基因的表达量[0137] 采用 GreenPCR Kit试剂盒(Qiagen，Germany)，以反转录的cDNA为模板在 480Ⅱ型荧光定量PCR仪(Roche，Swiss)上进行荧光定量PCR扩增。
[0138] 染料类荧光定量PCR体系如表8所示。
[0139] 表8染料类荧光定量PCR体系
[0140]
[0141] 荧光定量PCR程序：95℃5min；95℃10s，60℃30s，40个循环；循环结束后利用熔解曲线检测产物特异性，从60℃缓慢升温至97℃，每℃采集5次荧光信号。
[0142] 2.5根据qRT-PCR的相对定量公式计算低氧适应特异性候选差异表达lncRNA及其靶基因的表达水平
[0143] 根据qRT-PCR的相对定量公式： 分别比较3个特异性候选差异表达lncRNA及其10个靶基因在4个藏绵羊群体(2个高海拔群体和2个中海拔群体)和对照组(低海拔)湖羊群体中的表达量水平。结果如图5所示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中3个特异性候选差异表达lncRNA在肝脏组织呈现表达显著上调，相对表达水平在0.6279-5.9141之间，明显高于对照组(低海拔)湖羊肝脏组织相对表达水平；2个特异性候选差异表达lncRNA(TCONS_00332125和TCONS_00377466)在肺脏组织呈现表达显著下调，相对表达水平在0.0042-
0.0857之间，明显低于对照组(低海拔)湖羊肺脏组织相对表达水平，而1个特异性候选差异表达lncRNA(TCONS_00139593)在肺脏组织呈现表达显著上调，相对表达水平在2.7931-
4.7042之间，明显高于对照组(低海拔)湖羊肺脏组织相对表达水平。
0.0857之间，明显低于对照组(低海拔)湖羊肺脏组织相对表达水平，而1个特异性候选差异表达lncRNA(TCONS_00139593)在肺脏组织呈现表达显著上调，相对表达水平在2.7931-
4.7042之间，明显高于对照组(低海拔)湖羊肺脏组织相对表达水平。
[0144] 4个靶基因(ENSOARG00000007330、ENSOARG00000007403、ENSOARG00000007412和ENSOARG00000018872)在肝脏和肺脏组织均呈现表达显著下调，相对表达水平分别在0.0763-0.9654和0.0022-0.5571之间，均明显低于对照组(低海拔)湖羊肝脏和肺脏组织相对表达水平；2个靶基因(ENSOARG00000007321和ENSOARG00000006342)在肝脏和肺脏组织均呈现表达显著上调，相对表达水平分别在0.6467-1.2546和1.1334-4.5153之间，均明显高于对照组 (低海拔) 湖羊肝脏和肺脏组织相对表达水平 ；3个靶基因
(ENSOARG00000006399、ENSOARG00000007219和ENSOARG00000000775)在肝脏和肺脏组织分别呈现表达显著上调和下调，相对表达水平分别在0.6339-1.9008和0.0197-0.5896之间，分别明显高于和低于对照组(低海拔)湖羊肝脏和肺脏组织相对表达水平。因此，结果表明qRT-PCR结果与RNA-seq结果是一致的。
(ENSOARG00000006399、ENSOARG00000007219和ENSOARG00000000775)在肝脏和肺脏组织分别呈现表达显著上调和下调，相对表达水平分别在0.6339-1.9008和0.0197-0.5896之间，分别明显高于和低于对照组(低海拔)湖羊肝脏和肺脏组织相对表达水平。因此，结果表明qRT-PCR结果与RNA-seq结果是一致的。
[0145] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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