技术领域
[0001] 本
发明为
微生物技术领域，具体为一株抗坏血酸克吕沃尔菌(Kluyvera ascorbata)菌株及其应用。
背景技术
[0002] 紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum)，菊科泽兰属，多年生草本或亚灌木，能快速形成单优群落，并且会以多种方式抑制其它
植物生长，是一种世界性的恶性
杂草，也是我国现存危害最大的一种外来植物。由于紫茎泽兰含有多种有毒组分及恶臭组分，仅有泽兰等极少数物种对其有采食现象。近年来虽然人们对紫茎泽兰的治理采取了投放专性天敌、
除草剂、植物防控等手段，但均收效甚微。
[0003] 微生物作为一种高效、安全、无残留的现代
农药在现代农业生产及科学研究中有着举足轻重的地位。相应地，针对紫茎泽兰的微
生物农药研发也成为近年来紫茎泽兰防治领域的一个主要方向，但由于紫茎泽兰本身含有多种抑菌物质，导致研发工作至今也收效甚微。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一株抗坏血酸克吕沃尔菌及其应用，以该抗坏血酸克吕沃尔菌为活性成分的菌剂用于紫茎泽兰的防控，效果好成本低。
[0005] 本发明所提供的抗坏血酸克吕沃尔菌(Kluyvera ascorbata)，
专利申请人的菌株编号为ZLSY22；该菌株已于2017年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC),地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.13726,分类命名：抗坏血酸克吕沃尔菌Kluyvera ascorbata。
[0006] 本发明菌株ZLSY22 CGMCC No.13726的生物学特性为：
[0007] LB培养基(LB Medium)培养的菌落为乳白色，圆形隆起，边缘整齐，表面光滑湿润，有臭味；
[0008] 菌体为小的杆状细胞，0.5～0.7μm×2～3μm，革兰氏阴性，以稀周毛运动。
[0009]
淀粉水解实验阴性，油脂水解实验阴性，石蕊
牛奶实验阳性，尿素实验阴性；
发酵葡萄糖可产酸，但不产气；吲哚实验阳性，
柠檬酸盐实验阳性，
硫化氢实验阴性，V-P阴性，M-R阳性。
[0010] 本发明菌株是从
云南野外紫茎泽兰寄生昆虫泽兰实蝇(Procecidochares utilis Stone)消化道筛分出来的。本发明菌株可在自然环境下快速侵染紫荆泽兰根茎，造成根茎病变，嫩茎、根部快速腐败，直至植株整株枯死，是一种具有良好效果及开发研究前景的微生物。
[0011] 本发明菌株ZLSY22 CGMCC No.13726用于防控紫茎泽兰。
[0012] 本发明菌株ZLSY22 CGMCC No.13726可以由以下方法分离纯化得到：
[0013] 泽兰实蝇采自云南农业大学化学楼附近的紫茎泽兰上，将有虫瘿的紫茎泽兰采回实验室。对采回的虫瘿整体消毒后在超净
工作台内解剖出幼虫，幼虫用75％酒精漂洗三次，每次两分钟，无菌水漂洗三次后解剖，获得泽兰实蝇消化道。
[0014] 1.灭菌
[0015] 所用培养皿、离心管、试管，枪头等实验器材及无菌水均采用高压灭菌，0.1MPa，121℃，灭菌30分钟。
[0017] 将泽兰实蝇消化道分段放入无菌离心管中，加入1ml无菌水，用研磨棒研磨。
[0018] 3.梯度稀释
[0019] 取研磨后的汁液1ml，放入盛有9ml无菌水的试管中，即为10-1稀释度的菌液，再从10-1稀释度的菌液中取1ml放入盛有9ml无菌水的试管中，即为10-2稀释度的菌液，以此类推制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释度的菌液。
[0020] 4.培养基的配置
[0021] 细菌的分离常用的培养基是牛肉膏蛋白胨培养基(NA培养基)，纯化常用LB培养基。
[0022] NA培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂18g，水1000ml，pH 7.0-7.2，121℃灭菌20min。
[0023] LB培养基：蛋白胨10g；
酵母提取物5g；
氯化钠10g；琼脂15g；蒸馏水1L；PH 7.0，121℃灭菌20min。
[0024] 倒平板，每个培养皿倒大约15ml的培养基，平放静置，待冷却备用。
[0025] 5.涂布
[0026] 将稀释菌液10-4、10-5、10-6、10-7分别涂布于平板上，每个梯度涂三皿，并在皿低做上标记。
[0027] 6.培养
[0028] 倒置平皿于28℃
培养箱中培养3-5天。
[0029] 7.菌的纯化
[0030] 在无菌条件下用挑针将NA培养基上长出的单菌落挑取于LB培养基上划线培养。纯化3-4次可得纯化后的单菌落。
[0031] 抗坏血酸克吕沃尔菌培养条件研究
[0033] 将抗坏血酸克吕沃尔菌接种于pH 7.0的LB培养基，分别在15℃、25℃、30℃、35℃、40℃温度条件下，转速为220r/min的摇床培养，培养了24h时取样测定在
波长600nm处的光吸收值(OD600)。见下面的表1，比较各温度条件下抗坏血酸克吕沃尔菌培养液的OD600值可知，抗坏血酸克吕沃尔菌的最适培养温度为25℃，较适宜的生长范围在20℃-30℃之间。
[0034] 表1 温度对抗坏血酸克吕沃尔菌生长的影响
[0035]
[0036] 2.pH值
[0037] 抗坏血酸克吕沃尔菌分别接种于pH为5.5、6、6.5、7、7.5、8和8.5的LB培养基，在摇床(转速为220r/min，温度为25℃)培养，在24h时取样测定在波长600nm处的光吸收值(OD600)。见表2，比较各pH条件下抗坏血酸克吕沃尔菌培养液的OD600值可知，在5.5-8.5pH范围之间抗坏血酸克吕沃尔菌均能较好地生长，其中pH为7.5时生长最好。
[0038] 表2 pH对抗坏血酸克吕沃尔菌生长的影响
[0039]
[0040] 3.培养基
[0041] 抗坏血酸克吕沃尔菌分别接种于pH 7.0的LB培养基、TSB培养基和NA培养基，在摇床(转速为220r/min，温度为25℃)培养，在24h时取样测定在波长600nm处的光吸收值(OD600)。由表3可知，在三种培养基中，LB培养基最适合抗坏血酸克吕沃尔菌的生长。
[0042] 表3 培养基对抗坏血酸克吕沃尔菌生长的影响
[0043]
[0044] 注：NA培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂18g，水1000ml，121℃灭菌20min。
[0045] LB培养基：蛋白胨10g；酵母提取物5g；氯化钠10g；琼脂15g；蒸馏水1L；121℃灭菌20min。
[0046] TSB培养基：胰蛋白胨15g；大豆蛋白胨5g；氯化钠5g；琼脂15g；蒸馏水1L；121℃灭菌20min。
[0047] 用本发明菌株ZLSY22 CGMCC No.13726制成菌剂防控紫茎泽兰可以按以下方法：
[0048] ZLSY22的一阶段扩繁培养：用标准固体LB培养基，按体积比0.2％比例添加紫茎泽兰水提取物，调pH值5.5～8.5，倒平板培养皿冷却后，接种ZLSY22菌株，温度15℃-40℃培养1-3天，见菌落长满培养基即可。
[0049] ZLSY22的二阶段扩繁培养基：标准液体LB培养基，按体积比0.5％比例添加紫茎泽兰水提取物，pH值5.5-8.5。接入第二步扩繁后长满菌株的固体培养基，在温度15℃～40℃培养1～3天，每12小时进行一次搅拌，接种比例为：1cm2二阶段固体培养基接种2L液体培养基的比例进行接种。
[0050] ZLSY22的使用液，将二阶段培养完成的培养液，8℃冷藏8小时，取出后静置至常温按1:5～1:10的比例加水稀释后，直接喷洒至紫茎泽兰茎部或通过
灌溉方式浇灌至植株根部。
[0051] 所说紫茎泽兰水提取物为：紫茎泽兰鲜品植株(含
叶片)，
粉碎后在40℃±5℃下，按照
质量比1:9～1:12的比例浸提2小时，去除固体后取上清，0.22μm滤
膜过滤后即可使用。
[0052] 通过试验获得了不同施用方式、致死率与施用后时间的关系，见图1。图1的纵坐标为紫荆泽兰的致死率，横坐标为施用时间。致死率和施用时间观察统计的是第4、6、10、12、14、18、20天。图1中的线条1为浇灌，线条2为叶面喷洒，线条3为空白对照。
[0053] 从图1可看出，使用含本发明菌的菌液后，紫荆泽兰会快速发病并死亡，其高峰期出现在第8至10天，至20天。尚未死亡的植株，表明未被感染或产生抗性，具体原因和机理仍待进一步研究。
[0054] 本发明的有益效果：本发明提供的抗坏血酸克吕沃尔菌用于紫茎泽兰的防控，效果好成本低。
附图说明
[0055] 图1为不同施用方式、施用后时间与紫茎泽兰致死率的关系图。具体实施方式：
[0057] 第一步：将筛分纯化好的ZLSY22菌株，用标准固体LB培养基灭菌后，在未
凝固前添加0.2％紫茎泽兰提取物，并调整pH值至5.5.倒平板，待冷凝后将ZLSY22接种至培养基上，在25℃培养基上培养1天后，将带菌培养基分割成顶面面积为1平方厘米的小
块备用。
[0058] 第二步：配置标准液体LB培养基。灭菌后按体积比添加0.5％的紫茎泽兰提取物，调整pH值至5.5，降温至25℃，将上一步骤准备好带菌的1cm2小块培养基按比例接种(添加)至液体培养基中，在25℃下培养3天，每12小时进行一次搅拌。取出降温至8℃冷藏8小时。
[0059] 第三步：将冷藏好的带菌液体培养基取出，按1份体积的培养基加水10份体积的比例稀释后，喷洒至紫茎泽兰茎部或芽基部。
[0060] 实施例2。
[0061] 第一步：首选将筛分纯化好的ZLSY22菌株，用标准固体LB培养基灭菌后，在未凝固前添加0.2％紫茎泽兰提取物，并调整pH值至7.0倒平板，待冷凝后将ZLSY22接种至培养基上，在29℃培养基上培养3天后，将带菌培养基分割成顶面面积为1平方厘米的小块备用。
[0062] 第二步：配置标准液体LB培养基，灭菌后按体积比添加0.5％的紫茎泽兰提取物，调整pH值至6.5，降温至29℃，将上一步骤准备好带菌的1cm2小块培养基按比例接种(添加)至液体培养基中，在29℃下培养5天，每12小时进行一次搅拌。取出降温至8℃冷藏8小时。
[0063] 第三步：将冷藏好的带菌液体培养基取出，按体积比为培养基：水＝1:10的比例加水稀释后，浇灌至植株基部。
[0064] 实施例3：
[0065] 第一步：首选将筛分纯化好的ZLSY22菌株，用标准固体LB培养基灭菌后，在未凝固前添加0.2％紫茎泽兰提取物，并调整pH值至7.5倒平板，待冷凝后将ZLSY22接种至培养基上，在25℃培养基上培养5天后，将带菌培养基分割成顶面面积为1平方厘米的小块备用。
[0066] 第二步：配置标准液体LB培养基，灭菌后按体积比添加0.5％的紫茎泽兰提取物，调整pH值至7.5，降温至25℃，将上一步骤准备好带菌的1cm2小块培养基按比例接种(添加)至液体培养基中，在25℃下培养3天，每12小时进行一次搅拌，取出降温至8℃冷藏8小时。
[0067] 第三步：将冷藏好的带菌液体培养基取出，按体积比为培养基：水＝1:5的比例稀释后，喷洒至紫茎泽兰茎部或芽基部。
[0068] 实施例4。
[0069] 对人工种植的紫茎泽兰各100株，进行效果对比的实验。空白对照为紫茎泽兰鲜品植株(含叶片)，粉碎后在45℃下，按照质量比1:10的比例浸提2小时，去除固体后取上清，0.22μm滤膜过滤后加10倍水稀释为空白对照液，其余均用实施例2的菌液。使用量：喷洒为
100株2L，灌溉模式为100株5L，使用一次后连续观察20天累计数据如下：
[0070]
[0071] 以上数据可以看出施用ZLSY22菌株后能够在20天内显著诱发紫茎泽兰发生多项病变，并且能够快速导致紫茎泽兰死亡。
