控制玉米籽粒灌浆的基因及编码产物、引物、载体和应用
阅读：559发布：2020-05-08
专利汇可以提供控制玉米籽粒灌浆的基因及编码产物、引物、载体和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了控制玉米籽粒灌浆的基因及编码产物、引物、载体和应用。通过多种手段解析一份人工诱变玉米籽粒灌浆突变体的调控机制，克隆了调控玉米籽粒灌浆和籽粒大小的基因ZmGAMYB1，并解析其功能。ZmGAMYB1敲除，会导致其下游系列基因表达量改变，进而造成玉米籽粒灌浆加快，籽粒大小增加。同时，ZmGAMYB1敲除引起玉米 幼苗 对重金属砷的抗性增加。本发明利用基因敲除位点的特异检测引物，可 跟踪 检测ZmGAMYB1基因敲除情况。而该基因的敲除与玉米籽粒灌浆和籽粒大小性状以及玉米苗期对重金属砷的抗性性状相关联，可用于改良玉米籽粒灌浆特性、籽粒大小和重金属抗性，应用于玉米产量和重金属抗性提高的育种实践。，下面是控制玉米籽粒灌浆的基因及编码产物、引物、载体和应用专利的具体信息内容。
1.一种控制玉米籽粒灌浆的基因ZmGAMYB1，其特征在于，所述基因ZmGAMYB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述控制玉米籽粒灌浆基因ZmGAMYB1的编码产物，其特征在于，所述基因ZmGAMYB1编码产物的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.用于扩增权利要求1所述控制玉米籽粒灌浆的基因ZmGAMYB1的引物，其特征在于，外侧上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，外侧下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，内侧上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，内侧下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
4.用于表达权利要求1所述的控制玉米籽粒灌浆基因ZmGAMYB1的基因编辑载体CRISPR/Cas9-ZmGAMYB1，其特征在于，所述基因编辑载体的核苷酸序列含ZmGAMYB1基因的PAM碱基序列，可针对该基因进行编辑表达。
5.利用权利要求4所述基因编辑载体扩增的控制玉米籽粒灌浆基因ZmGAMYB1基因编辑阳性克隆。
6.用于跟踪检测权利要求5所述阳性克隆的引物，其特征在于，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
7.如权利要求1所述的控制玉米籽粒灌浆基因ZmGAMYB1在调控玉米籽粒大小中的应用。
8.如权利要求1所述的控制玉米籽粒灌浆基因ZmGAMYB1在调控植物重金属砷抗性中的应用。
9.如权利要求1所述的控制玉米籽粒灌浆基因ZmGAMYB1在玉米体内对启动子区域含有TAACTTCCTA模体的下游基因的表达调控中的应用。
10.如权利要求1所述的控制玉米籽粒灌浆基因ZmGAMYB1在玉米遗传育种中的应用。
控制玉米籽粒灌浆的基因及编码产物、引物、载体和应用
技术领域
[0001] 本发明属于玉米遗传育种技术领域，具体涉及控制玉米籽粒灌浆的基因及 编码产物、引物、载体和应用。
背景技术
[0002] 玉米(Zea may L.)作为世界上最重要的粮食、饲料和能源作物之一，在保障 世界粮食安全、促进经济发展及缓解能源危机等方面发挥着不可替代的作用。 籽粒是玉米生物学产量最重要的构成因子，而籽粒发育直接决定了籽粒产量。 研究表明，玉米籽粒发育是一个连续的生物学过程，涉及一系列复杂的生理生 化代谢，可以分为三个主要时期：(1)授粉后0-15天(0-15DAP)，该时期胚 和胚乳细胞快速分裂，主要完成胚和胚乳的细胞学构架，决定了光合产物的潜 在积累空间；(2)授粉后15-40天(15-40DAP)籽粒快速灌浆，在此期间的灌 浆速率高低决定光合产物积累的速度，有效灌浆时间则决定了光合产物积累的 时间；(3)授粉后40-70天(40-70DAP)是籽粒脱水成熟期，这一时期完成由 逐步衰老的叶片和茎转化而来的营养物质向籽粒的输送，籽粒生理成熟。
[0003] 玉米籽粒发育过程由许多调控基因和功能基因构成的复杂调控网络进行控 制。通过多种基因之间的相互作用，影响玉米籽粒的细胞构架、灌浆速率、有 效灌浆时间等与籽粒发育直接相关的性状，从而造成不同品系材料之间籽粒产 量的差异。在玉米籽粒发育研究方面，现有技术利用农大108的双亲构建的重 组自交系群体进行了两年两点的QTL分析，鉴定出6个遗传稳定的籽粒发育相 关QTL；利用“永久F2”群体定位了33个遗传稳定的籽粒发育非条件QTL 和12个条件QTL。通过筛选籽粒发育突变体克隆了玉米2号染色体上的rgf1 基因，该基因主要通过减少淀粉积累造成籽粒饱满程度降低；该研究同时表明， 细胞快速分裂期(尤其是5-10DAP)的糖分吸收决定rgf1基因型玉米籽粒的发 育。通过突变体筛选和图位克隆，揭示了玉米Urb2基因的自然突变显著影响 籽粒长度和生物学产量。
[0004] 玉米籽粒灌浆相关性状对籽粒大小的遗传改良和玉米单产水平的提高具有 重要意义。然而目前在玉米籽粒灌浆相关结构基因和非编码基因克隆方面仍较 为欠缺，亟待发掘籽粒灌浆相关基因的优异等位变异并探索其调控机制，进而 对玉米产量提高的育种实践提供理论和材料支撑。
发明内容
[0005] 本发明的目的之一是提供一种控制玉米籽粒灌浆的基因ZmGAMYB1，所述 基因ZmGAMYB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006] 本发明的目的之二是提供所述控制玉米籽粒灌浆基因ZmGAMYB1的编码 产物，所述基因ZmGAMYB1编码产物的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007] 本发明的目的之三是提供用于扩增所述控制玉米籽粒灌浆的基因 ZmGAMYB1的引物，外侧上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，外侧下 游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，内侧上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，内侧下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0008] 本发明的目的之四是提供用于表达所述控制玉米籽粒灌浆基因 ZmGAMYB1的基因编辑载体CRISPR/Cas9-ZmGAMYB1，所述基因编辑载体的 核苷酸序列含ZmGAMYB1基因的PAM碱基序列，可针对该基因进行编辑表达。
[0009] 本发明的目的之五是提供利用所述基因编辑载体扩增的控制玉米籽粒灌浆 基因ZmGAMYB1基因编辑阳性克隆。
[0010] 本发明的目的之六是提供用于跟踪检测所述阳性克隆的引物，其特征在于， 上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0011] 本发明的目的之七是提供所述的控制玉米籽粒灌浆基因ZmGAMYB1在调 控玉米籽粒大小中的应用。
[0012] 本发明的目的之八是提供所述的控制玉米籽粒灌浆基因ZmGAMYB1在调 控植物重金属砷抗性中的应用。
[0013] 本发明的目的之九是提供所述的控制玉米籽粒灌浆基因ZmGAMYB1在玉 米体内对启动子区域含有TAACTTCCTA模体的下游基因的表达调控中的应 用。
[0014] 本发明的目的之十是提供所述的控制玉米籽粒灌浆基因ZmGAMYB1在玉 米遗传育种中的应用。
[0015] 与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：
[0016] 1.本发明发现了调控玉米籽粒灌浆的基因ZmGAMYB1，克隆了其cDNA序 列并解析了其编码产物的氨基酸序列，为该基因在玉米育种的应用实践打下基 础。
[0017] 2.本发明的ZmGAMYB1可导致基因编辑株系玉米籽粒变大。
[0018] 3.本发明的ZmGAMYB1可影响启动子含有TAACTTCCTA模体的下游基因 表达量改变。
[0019] 4.本发明的ZmGAMYB1可导致基因编辑株系对重金属砷胁迫的抗性增强， 对于提高玉米重金属抗性的育种实践提供帮助。
[0021] 图1为CRISPR/Cas9-GAMyb基因编辑阳性事件在不同转基因植株中检测 的阳性克隆情况。
[0022] 图2为为CRISPR/Cas9-GAMyb靶位点编辑情况。
[0023] 图3CRISPR/Cas9-GAMyb转基因玉米与野生型在粒宽、粒长、百粒重的比 较。A、B分别表示CRISPR/Cas9-GAMyb转基因玉米与野生型在粒宽、粒长比 较；C、D、E表示CRISPR/Cas9-GAMyb转基因玉米与野生型在粒宽、粒长、 百粒重的方差分析；**和***分别表示差异达到p＝0.05和p＝0.01显著水平。
[0024] 图4为GAMYB1及同源物的系统发育树。
[0025] 图5为GAMYB转录因子DAP文库的构建。
[0026] 图6为GAMYB转录因子特体结合的motif。
[0027] 图7为GAMYB转录因子下游调控基因的GO注释。
[0028] 图8为CRISPR/Cas9-GAMyb转基因玉米用砷处理和未用砷处理的表型比 较。
具体实施方式
[0029] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明 的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟 知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商 业途径得到。
[0030] 实施例1
[0031] 玉米籽粒灌浆的基因ZmGAMYB1控制玉米籽粒灌浆和籽粒大小的发现与 确认[0032] 1.ZmGAMYB1基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建
[0033] (1)gRNA引物设计
[0034] 设计引物时，插入BsaI酶切识别位点，并在基因单拷贝序列中寻找Cas9 识别PAM位点，查找以上单拷贝序列中的NGG位点前19nt，将其作为引物序 列，交由武汉奥科鼎盛生物科技公司完成引物合成。
[0035] (2)四引物扩增
[0036] 以pCBC-MT1T2质粒为模板进行4引物PCR扩增。 Zma-GAMyb1-MT1T2-F/Zma-GAMyb1-MT1T2-R为10mM； Zma-GAMyb2-MT1T2-F0/Zma-GAMyb2-MT1T2-R0稀释20倍，引物序列参考 表1。用2×Es Taq Master Mix扩50μL的体系，反应程序表2，将72℃反应 时间延长至1min，随后对PCR产物进行纯化回收。
[0037] 表1引物序列信息
[0038]
[0039]
[0040] 表2反应程序
[0041]
[0042] (3)将上述PCR产物进行纯化回收，步骤如下：
[0043] a CP加450μl于1.5ml离心管中，与PCR产物混匀；
[0045] c加入600ul漂洗液WB于吸附柱中，12000rpm离心1min，倒掉废液；
[0046] d重复步骤d；
[0047] e将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min；
[0048] f将吸附柱置于一个新的1.5ml离心管中，室温放置10min晾干；
[0049] g晾干后向吸附柱中加入65℃预热的灭菌水30ul，静置2min，12000rpm 离心2min收集DNA溶液。
[0050] (4)纯化回收PCR产物后进行酶切-连接，37℃酶切连接2h，80℃酶灭活10min。将上述体系转化大肠杆菌，进行菌落PCR后测序，将测序正确的单克 隆扩繁进行质粒小提。
[0051] 2.ZmGAMYB1基因CRISPR/Cas9敲除载体的转化
[0053] (1)加100～200ul的农杆菌到50mlLB培养基中；
[0054] (2)28℃，200rpm过夜揺菌培养；
[0055] (3)当OD600＝0.4～0.6，加50ul As最终浓度为100uM；
[0056] (4)当OD600＝0.8～1.0，开始转化(大约2h)；
[0057] (5)3500rpm，18～20℃离心15min；
[0058] (6)弃上清，用预侵染悬浮菌体OD600＝0.2～0.4加As最终浓度为100uM；
[0059] (7)取授粉后10～11d穗，用70％酒精消毒，晾干剥胚到预侵染中；
[0060] (8)在2mlEP管中将幼胚和农杆菌轻轻混匀；
[0061] (9)涡旋EP管正40s，反40s；
[0062] (10)静止10min；
[0063] (11)吸出农杆菌溶液，将幼胚放在灭菌后的滤纸上干燥10～15min，黑暗 条件下，共培养3天；
[0064] (12)转移至静息培养基黑暗培养5～10天；
[0065] (13)转移至筛选培养基，筛选浓度减半(PPT由原来的0.8mg/L降至 0.4mg/L，Hyg由原来的25～30mg/L降至12.5～15mg/L)且在筛选的过程中， 筛选剂浓度逐步提高，培养2个月，每两周继代一次；
[0066] (14)抗性愈伤组织继代到再生培养基，光照培养，直至有叶形成；
[0067] (15)之后继代到生根培养基；
[0068] (16)当根形成(约3～4周)加少量无菌水3天，移植到土壤中；
[0069] 3.ZmGAMYB1基因CRISPR/Cas9敲除载体的阳性检测
[0070] (1)T1代阳性植株的筛选
[0071] 所有转基因材料的的T1代种子，通过育苗并移栽到大田，同时提取叶片 DNA通过PCR检测鉴定植株阳性。对GAMyb-Crispr/Cas9的编辑位点两侧设 计检测引物，检测靶位点的编辑情况，扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶检测。T2 代植株的处理都与T1代植株相同。
[0072] (2)SLS法提取玉米叶片DNA
[0073] 当玉米幼苗达到5片叶时，用SLS法提取叶片DNA，操作步骤如下：
[0074] a取少量叶片装于2ml离心管中，用磨样机将已装有叶片的离心管在液氮中 冷冻后磨碎，加入0.8ml SLS-DNA提取液。摇晃5min使溶液和样品充分混匀；
[0075] b加入等体积已提前配置好的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)溶液，摇晃5min 充分混匀；
[0076] c放入离心机12000rpm离心10min，小心吸取上清液于一新的1.5ml离心管， 加入等体积预冷异戊醇摇匀，-20℃孵育5min；
[0077] d取出离心管12000rpm离心10min，倒掉上清，加入500ml 75％酒精漂洗；
[0078] e倒掉试管内溶液，加入纯酒精漂洗，晾干；
[0079] f加水溶解，根据所得DNA量和用途加入适当体积灭菌水；
[0081] (3)转基因PCR阳性鉴定
[0082] 将上述SLS提取DNA进行Bar基因检测，反应体系为Bar-F/Bar-R各1μl， 引物序列见表1，2×Taq Master Mix 5μl，DNA模板1μl，用ddH2O补至10μl， 反应程序参考。用1％的琼脂糖电泳检测，结果见图1。
[0083] (4)靶位点编辑检测
[0084] 利用靶位点两端特异引物，用高保真酶扩增靶位点，然后对体系进行胶回 收。将胶回收产物进行TA克隆，反应体系为pMD19-T Simple Vector 1μl，回 收的PCR产物，Solution I 5μl，在16℃连接30min，然后进行大肠杆菌转化， 每个单株挑取10个单克隆进行测序，与野生型C01进行比对，结果如图2所 示。
[0085] 4.ZmGAMYB1基因CRISPR/Cas9敲除载体阳性转化事件的表型鉴定
[0086] 分别测量了C01、转基因植株籽粒的粒长、粒宽、百粒重，用t-测验进行 了方差分析。结果如图3所示，与野生型相比，转基因的粒长、粒宽和百粒重 显著增加。
[0087] 实施例2
[0088] 玉米籽粒灌浆的基因ZmGAMYB1的进化保守性
[0089] 如图4所示，进化树的结果表明，MYB类转录因子在进化过程中具有保 守性与多样性的统一，推断它们是植物为适应和应答环境的变化而产生的一类 富有弹性调节功能的蛋白。
[0090] 实施例3
[0091] 玉米籽粒灌浆的基因ZmGAMYB1影响下游基因的表达
[0092] 利用DAP-seq技术研究GAMYB转录因子的全基因组结合位点，并分析其 下游可能调控的基因。操作主要分为：(1)转录因子的体外翻译，(2)DAP-library 的构建，(3)结合反应,(4)数据分析。具体操作如下：
[0093] 将2-3μg pFN-19k-GAMyb1、pFN-19k-GAMyb2、pFN-19k-GAMyb3的质粒 与30μl TnT SP6 High-Yield Wheat Germ Protein Expression System(Promega) 无细胞表达体系混合后在25℃表达2h即可表达出标签融合蛋白。
[0095] 1)将提取的基因组DNA按照以下方法打断(平均长度200bp)：
[0096] 超声设置：
[0097] Sample volume(μl)：130
[0098] Peak Incident Power(W)：50
[0099] Duty Factor：20％
[0100] Cycles per Burst：200
[0101] Treatment Time(s)：420
[0102] Temperature(℃)：11
[0103] 2)将小于等于5μg的DNA样品稀释至130μl TE缓冲液内，按照以上程 序打断，用2％的琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图5a所示。
[0104] 将反应体系分别加入将反应体系分别加入Adapter 3μl，Quick T4 DNA Ligase 5μl，5×Quick Ligation Reaction Buffer 10μl，用ddH2O补充至50μl，5μl， 10×dA-Tailing Reaction Buffer 10μl，End Repaired DNA 42μl，dA-Tailed DNA 25μl，用ddH2O补充至50μl。将上述反应体系在20℃反应1h对DNA片段末 端进行加A，然后用1.8×的beads进行纯化回收，最后加入55μl 0.1×TE将 目标DNA从beads上洗脱下来，即为DAP-library，取1μl检测浓度。
[0105] DAP-library检测
[0106] 将构建的DAP-library取1μl用未退火DAP-seqA1和DAP-seqB1的引物进 行PCR扩增，用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5b所示。
[0107] DNA富集
[0108] 将体外翻译的GAMYB1-HaloTag融合蛋白与Magne HaloTag Beads进行孵 育，通过捕获标签的方式固定转录因子，与构建好DAP-library进行反应。随后 洗脱与GAMYB1-HaloTag特异结合的DNA片段，通过PCR的方式加上高通量 测序用的长接头，结果如图5c所示。对GAMYB1的motif进行分析
[0109] 从6094peaks分析GAMYB结合基序(motif)，发现GAMYB1转录因子 结合的motif为TAACTTCCTA(图6)，motif在测序所得357个基因的启动子 区域被检出。
[0110] GAMYB直接结合motif在357个基因的启动子区域中被检出，包括14个 非编码基因在内，有功能注释(除去功能未知的)的基因个数为244个。为进 一步揭示GAMYB1调控的下游基因的功能，对这244个功能基因进行了Gene ontology(GO)注释，结果显示(图7)，在细胞组分中显著富集的是质体(24％)， 叶绿体(23％)，叶绿体部分(15％)；在分子功能中显著富集的是裂解酶活性 (10％)，碳-碳裂解酶活性(5％)，催化活性(6％)；在生物学过程中显著富集 的是胁迫相应(23％)，细胞壁生物合成(6％)，对刺激响应(29％)，根系发育 (5％)，有氧酸代谢(11％)。
[0111] 实施例4
[0112] 玉米籽粒灌浆的基因ZmGAMYB1基因内标记用于玉米砷重金属胁迫抗性 增强的育种实践
[0113] 选取籽粒饱满、大小均匀无虫害的种子C01、Cas9-ZmGAMYB1,置于有湿 润滤纸的培养皿中催芽72h,发芽条件为温度(25±1)℃、相对湿度75％的生化 培养箱。玉米出苗后,选取长势一致健康植株移栽到装有1/2Hoagland(pH 6.0) 营养液中,于人工气候室内常规培养，培养条件为：光照/黑暗时间为16h/8h, 昼夜温度为28℃/20℃,光照强度为110μmol·m-2·s-1,相对湿度为70％。培 养期间，持续用真空抽气泵向营养液中泵气，每3天更换一次营养液，在4叶 一心期，分别设置0、20mg/L浓度的As处理幼苗，每个浓度处理30株长势一 致的植株。
[0114] 水培处理10天，WT与Cas9-ZmGAMYB1未用砷处理，无表型差异，图8 左；用20mg/L浓度的As处理后，Cas9-ZmGAMYB1的材料明显抗性增加，图 8右。
[0115] 尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基 本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要 求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0116] 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发 明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及 其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
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