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一种用于鉴别杨梅雌雄的分子标记、引物对及其应用

阅读：762发布：2020-05-08

专利汇可以提供一种用于鉴别杨梅雌雄的分子标记、引物对及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种用于鉴别杨梅雌雄的分子标记、引物对及其应用。通过对雌雄杨梅植株的基因组测序，发现了雌株特异性基因FT1以及与FT1基因具有较高序列同源性的雌雄植株共有的FT2基因，通过分析比较两者的序列，设计得到本发明引物对。引物对，包括上游引物和下游引物，核苷酸序列为：上游引物：5′‑GTATCAAATCGATCTTTTC‑3′；下游引物：5′‑ACAGCTACCTATTTTGGATT‑3′。利用本发明引物对来鉴别杨梅植株的性别，其预测雌株的准确性高达99％。利用本发明引物对进行PCR鉴定杨梅性别，对杨梅的幼苗鉴定、杂交育种等具有重要的意义，对杨梅的实践生产具有较高的指导价值。，下面是一种用于鉴别杨梅雌雄的分子标记、引物对及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于鉴别杨梅雌雄的分子标记，为杨梅雌性特异的基因FT1，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，
所述分子标记在用于鉴别杨梅雌雄时的方法包括以下步骤：
（1）对待检测杨梅植株取样并提取基因组DNA；
（2）以所述基因组DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增；
（3）PCR扩增产物进行电泳检测，
若电泳检测结果在470bp和268bp处均有特异性条带，则待检测杨梅植株为雌株；
若电泳检测结果只在268bp处有特异性条带，则待检测杨梅植株为雄株，所述引物对，包括上游引物和下游引物，核苷酸序列为：
上游引物：5´-GTATCAAATCGATCTTTTC-3´；
下游引物：5´-ACAGCTACCTATTTTGGATT-3´。
2.引物对，包括上游引物和下游引物，其特征在于，核苷酸序列为：
上游引物：5´-GTATCAAATCGATCTTTTC-3´；
下游引物：5´-ACAGCTACCTATTTTGGATT-3´。
3.如权利要求2所述引物对在鉴别杨梅性别中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述杨梅为杨梅幼苗。
5.如权利要求2所述引物对在制备用于鉴别杨梅性别的试剂盒中的应用。
6.一种包含如权利要求2所述引物对的试剂盒。
7.如权利要求6所述试剂盒在鉴别杨梅性别中的应用。
8.一种鉴别杨梅性别的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对待检测杨梅植株取样并提取基因组DNA；
（2）以所述基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物对进行PCR扩增；
（3）PCR扩增产物进行电泳检测，
若电泳检测结果在470bp和268bp处均有特异性条带，则待检测杨梅植株为雌株；
若电泳检测结果只在268bp处有特异性条带，则待检测杨梅植株为雄株。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系为：
2×SapphireAmp Fast PCR Master Mix   5 µL
10 µM上游引物                        0.5µL
10 µM下游引物                        0.5µL
30 ng/µL模板                         1µL
ddH2O                                3µL。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件为：
94℃预变性5 min；94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸10 s，共35个循环；72℃延伸10 min。

说明书全文

一种用于鉴别杨梅雌雄的分子标记、引物对及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及分子鉴别技术领域，特别是涉及一种用于鉴别杨梅雌雄的分子标记、引物对及其应用。

背景技术

[0002] 杨梅(Myrica rubra Sieb.&Zucc.)属于杨梅科杨梅属植物，原产于我国东南各省及云贵高原，栽培历史悠久，是我国南方的特色水果，目前杨梅主栽品种分布在我国浙江，江苏、福建、江西、湖南、广东、贵州和云南等省，其中浙江省的栽培面积、产量、质地等均为最佳。杨梅果实成熟期(6月份)恰逢一年中的水果淡季，能够有效填补市场上的水果空缺期，再加上杨梅果色艳丽，风味独特，同时富含花青苷，具有较高的营养价值，深受消费者的喜爱。

[0003] 杨梅多为雌雄异株植物，少有雌雄同株；花小，单性，无花被，为风媒花；雌花为葇荑花序，雌花自3月上旬至4月初渐次开放，3月中旬为盛花期，花期约20天；雄花为复葇荑花序，自2月下旬至4月上旬陆续开放，3月中旬为盛花期，花期约45天。

[0004] 然而，杨梅雄株不能直接产生经济效益，因此目前在栽培上以雌株为主。而在杨梅育种上多采用实生育种，需要等待10多年方能鉴别出植株的雌雄。这种传统的育种方式年限长，生产成本高，经济效益低。利用分子标记鉴定雌雄异株植物的性别有利于较早选择雌株后代，可以使得上述问题得以改善。其他果树相关的性别决定机制在国内外都有过大量的报道，比如木瓜、猕猴桃等，然而在杨梅上相关研究却是空白。寻找到一种可以在杨梅植株早期就能够有效鉴别杨梅植株性别的方法，对杨梅的幼苗鉴定、杂交育种等具有重要的意义，对杨梅的实践生产具有较高的指导价值。

发明内容

[0005] 本发明针对现有技术的不足，提供了一种用于鉴别杨梅雌雄的分子标记，以及基于该分子标记设计的一种引物对，利用该引物对能够有效地对杨梅植株进行早期性别鉴定。

[0006] 一种用于鉴别杨梅雌雄的分子标记，为杨梅雌性特异的基因FT1，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

[0007] 该分子标记是通过对杨梅基因组测序，雌、雄各100个个体分别组成的混池进行测序，以及雌雄5个个体重测序，发现雌性特异的基因组区段，其中一个与开花相关的功能基因FT1(SEQ ID No.3)，雄性植株中并不含有该基因。

[0008] 引物对，包括上游引物和下游引物，核苷酸序列为：

[0009] 上游引物：5′-GTATCAAATCGATCTTTTC-3′；

[0010] 下游引物：5′-ACAGCTACCTATTTTGGATT-3′。

[0011] 与FT1基因的核苷酸序列80％同源的基因序列FT2(SEQ ID No.4)在雌雄中都存在。通过对他们的序列进行分析比较，最终设计得到本发明引物对，并经过验证具有较高的可靠性。

[0012] 使用本发明引物对进行PCR扩增，理论上雌性的杨梅植株最后能够扩增出470bp和268bp两条特异性条带，其中470bp的条带是引物扩增雌性特异性基因FT1所得，扩增的片段序列如SEQ ID No.5所示，而268bp的条带是引物扩增基因FT2所得，扩增的片段序列如SEQ ID No.6所示；而雄性的杨梅植株只能扩增出268bp的一条特异性条带。

[0013] 当然，由于植株个体之间的差异，个别杨梅植株可能存在基因突变或者染色体方面的变异，造成个别雄性植株也扩增出两条特异性条带，但整体来讲，使用本发明引物对对197份杨梅植株进行性别鉴定，鉴定杨梅植株雌性的准确率高达99％左右，具有足够的经济效益。

[0014] 本发明又提供了所述引物对在鉴别杨梅性别中的应用。

[0015] 所述杨梅为杨梅幼苗。

[0016] 本发明又提供了所述引物对在制备用于鉴别杨梅性别的试剂盒中的应用。

[0017] 本发明还提供了一种包含所述引物对的试剂盒。

[0018] 本发明还提供了所述试剂盒在鉴别杨梅性别中的应用。

[0019] 本发明还提供了一种鉴别杨梅性别的方法，包括以下步骤：

[0020] (1)对待检测杨梅植株取样并提取基因组DNA；

[0021] (2)以所述基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物对进行PCR扩增；

[0022] (3)PCR扩增产物进行电泳检测，

[0023] 若电泳检测结果在470bp和268bp处均有特异性条带，则待检测杨梅植株为雌株；

[0024] 若电泳检测结果只在268bp处有特异性条带，则待检测杨梅植株为雄株。

[0025] 所述PCR扩增的体系为：

[0026]

[0027] 所述PCR扩增的条件为：

[0028] 94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸10s，共35个循环；72℃延伸10min。

[0029] 本发明通过对雌雄杨梅植株的基因组测序，发现了雌株特异性基因FT1以及与FT1基因具有较高序列同源性的雌雄植株共有的FT2基因，通过分析比较两者的序列，最后设计得到本发明引物对。对大量来自不同地方不同品系的杨梅雌雄植株进行检测，发现利用本发明引物对来鉴别杨梅植株的性别，其预测雌株的准确性高达99％。利用本发明引物对进行PCR鉴定杨梅性别，对杨梅的幼苗鉴定、杂交育种等具有重要的意义，对杨梅的实践生产具有较高的指导价值。附图说明

[0030] 图1为实施例2中杨梅2号染色体上在雄混池DNA测序覆盖深度为0情况下的雌混池覆盖度结果图，其中横线上部的点为雌性，下部的点为雄性。

[0031] 图2为实施例4中使用引物Mr-F1时部分植株的电泳检测结果图，其中，M为DL2000DNA Markers；泳道1～9为雌株，品系依次为：荸荠、东魁、粉红种、上虞白杨梅、安海片早生、纽叶梅、广东黑梅、大纪、黑瑞林；泳道10～18为雄株，品系依次为：C2010-1、Y2010-1、T2011-26、W2011-4、Y2015-1、Y2015-2、FJ2011-40、JS2011-14、GX2011-20。

[0032] 图3为实施例4中使用引物Mr-F2时部分植株的电泳检测结果图，其中，M为DL2000DNA Markers；泳道1～9为雌株，品系依次为：荸荠、东魁、粉红种、上虞白杨梅、安海片早生、纽叶梅、广东黑梅、大纪、黑瑞林；泳道10～18为雄株，品系依次为：C2010-1、Y2010-1、T2011-26、W2011-4、Y2015-1、Y2015-2、FJ2011-40、JS2011-14、GX2011-20。

具体实施方式

[0033] 实施例1

[0034] 基因组DNA的提取。

[0035] 用改良的CTAB法分别提取197份(雄株100份，雌株97份)杨梅品种的基因组DNA，具体方法如下：

[0036] 1、配制缓冲液

[0037] CTAB缓冲液：2％CTAB，0.1M Tris，20mM EDTA，1.4M NaCl，pH 8.0；

[0038] DNA溶解缓冲液TE：10mM Tris；1mM EDTA；pH 8.0。

[0039] 2、提取杨梅基因组DNA

[0040] ①用天平迅速称取约1.0g贮藏于-80℃冰箱中的杨梅幼嫩叶片组织，加少许PVP防止氧化，用液氮于研钵中充分研磨后将粉末快速转入盛有在65℃预热的4mL CTAB溶液与80μLβ-巯基乙醇的10mL离心管中，65℃水浴1h；

[0041] ②将步骤①混合物中加入4mL氯仿/异戊醇(24∶1)，涡旋混匀，12000rpm离心10min，取上清液于新10mL管中，再次加入4mL氯仿/异戊醇(24∶1)，涡旋混匀，12000rpm离心
10min；

[0042] ③将步骤②离心后所得的上清液转入新10mL管，并加入等体积-20℃预冷的异丙醇，轻轻混匀，在-20℃放置30min至DNA沉淀。10000rpm离心2min，去上清液；

[0043] ④用75％的乙醇清洗步骤③DNA沉淀物3次；

[0044] ⑤将步骤④洗涤后的DNA晾干并溶于200μL的TE缓冲液中，加入2μL RNA酶(10mg/mL)以除去RNA；DNA检测采用紫外分光光度计(Beckman coulter，USA)，确定其浓度和质量，同时取1μL用TE缓冲液稀释5倍后在1.0％的琼脂糖凝胶上检测。DNA原液保存于-20℃，工作液稀释为30ng/μL备用。

[0045] 实施例2

[0046] 基因组测序分析，引物设计。

[0047] 通过杨梅基因组测序，雌、雄各100个混池测序，以及雌雄5个个体重测序，发现雌性特异的基因组区段，2号染色体(chr2)上具有一个与开花相关的功能基因FT1(SEQ ID No.3)，测序分析结果如图1所示。与此序列80％同源的基因序列FT2(SEQ ID No.4)在雌雄中都存在。据此设计了2对鉴别杨梅性别的PCR引物Mr-F1，Mr-F2，委托杭州金百奥生物科技有限公司合成，引物信息如表1所示。

[0048] 表1

[0049]

[0050] 实施例3

[0051] PCR扩增。

[0052] ①反应体系：

[0053]

[0054] ②反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸10s，共35个循环；72℃延伸10min。

[0055] ③产物在2.0％琼脂糖凝胶上电泳检测，紫外灯下观察并照相记录结果。

[0056] 实施例4

[0057] 以实施例1中提取的基因组DNA为模板，利用实施例2中设计的引物，按照实施例3中的PCR扩增方法进行扩增检测。部分植株的电泳结果如图2(引物Mr-F1)和图3(Mr-F2)所示，由于Mr-F2引物扩增片段大小相近，电泳检测效果不清晰，因此将Mr-F1引物作为最终检测用引物。

[0058] 使用Mr-F1引物进行扩增，197份(雄株100份，雌株97份)杨梅群体检测结果如表2所示。结果显示：用Mr-F1引物扩增，雌株主要基因型为268/470bp，雄株主要的基因型为268bp，将197份杨梅植株的性别与扩增基因型相对应，其中97份雌株杨梅检测结果均正确；
100份雄株杨梅检测结果中98份检测结果正确，2份(编号为99、100)雄性杨梅检测结果与预期不符，出现两条特异性片段。利用Mr-F引物预测杨梅植株雌性的准确率高达99％。

[0059] 表2

[0060]

[0061]

[0062]

[0063]

[0064]

[0065] 注：*与性别关联的标记名，片段大小：bp；-/-为未得到扩增产物；♀-雌；♂-雄。

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