一种利用长春花富集枣疯病植原体的方法
阅读：337发布：2020-05-13
专利汇可以提供一种利用长春花富集枣疯病植原体的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种利用长春花富集枣疯病植原体的方法，所述方法是以长春花为 砧木 ，以枣疯病枝为 接穗 进行嫁接，然后将嫁接后的植株移至人工 气候 控制室内培养，先在23℃， 相对湿度 85％的条件下进行1d暗培养，然后改为在16h光周期、23℃、相对湿度65％条件下培养至发病为止。该方法较好实现了枣疯病植原体的富集，从而较好克服了现有枣疯病植原体分离研究中的植原体在原始寄主内含量低、分离困难及操作繁琐等问题，进而为枣疯病植原体的深入研究及如何防治枣疯病奠定了 基础 。，下面是一种利用长春花富集枣疯病植原体的方法专利的具体信息内容。
1.一种利用长春花富集枣疯病植原体的方法，其特征在于，所述方法是以长春花为砧木，以枣疯病枝为接穗进行嫁接，使用腹接法或者劈接法进行嫁接，然后将嫁接后的植株移至人工气候控制室内培养：先在23℃，相对湿度85％的条件下进行1d暗培养，然后改为在
16h光周期、23℃、相对湿度65％条件下培养，及时观测和记录枣疯病植原体入侵长春花后的典型致病表型，当典型表型出现后，使用巢氏PCR技术在分子水平上进行植原体定性，分子检测植原体存在即为枣疯病植原体转染成功。
2.根据权利要求1所述的利用长春花保存和富集枣疯病植原体的方法，其特征在于，所述枣疯病枝的粗度为4-7mm。
3.根据权利要求1所述的利用长春花保存和富集枣疯病植原体的方法，其特征在于，所述长春花砧木选择以播种后生长30～40d的长春花幼苗。
4.根据权利要求1所述的利用长春花富集枣疯病植原体的方法，其特征在于，嫁接时选择的长春花砧木地径为5～8mm。
5.根据权利要求1所述的利用长春花富集枣疯病植原体的方法，其特征在于，所述典型致病表型包括丛枝、簇生、矮化及花变叶。
6.根据权利要求1所述的利用长春花富集枣疯病植原体的方法，其特征在于，嫁接方法采用腹接法或者劈接法。
7.根据权利要求6所述的利用长春花富集枣疯病植原体的方法，其特征在于，所述腹接法的具体步骤为：
(1)对嫁接刀进行消毒，利用嫁接刀将长春花砧木腹侧的叶片去除，斜切一个长1.5cm的劈口，深度超过砧木直径的一半，但不超过2/3；
(2)将枣疯病枝两侧对称斜切2-3cm作为接穗，削面“里长外短”，两侧高低要一致；
(3)将接穗插入砧木缝中紧紧贴紧；
(4)使用嫁接带从下至上将接口包好固定，捆扎紧。
8.根据权利要求7所述的利用长春花保存和富集枣疯病植原体的方法，其特征在于，所述腹接法的接穗与砧木直径一致；或者保证至少一侧形成层对接，并使接穗的削面上部留
2mm。
9.根据权利要求6所述的利用长春花富集枣疯病植原体的方法，其特征在于，所述劈接法具体步骤为：
(1)对嫁接刀进行消毒，利用嫁接刀将长春花砧木去顶削平，从中间劈开一条长2-3cm的劈口；
(2)将枣疯病枝两侧对称斜切2-3cm作为接穗；
(3)将接穗插入砧木缝中紧紧贴紧；
(4)使用嫁接带从下至上将接口包好固定，捆扎紧。
一种利用长春花富集枣疯病植原体的方法
技术领域
[0001] 本发明属于植原体保存技术领域，具体涉及一种利用长春花保存和富集枣疯病植原体的方法。
背景技术
[0002] 枣疯病(jujube witches’broom)是由植原体(phytoplasma)引起的，是在东亚地区广泛蔓延的一种流行性病害。因其防治难度大，兼具传播速度快、致病力高、具有毁灭性等特点，因此又被称之为“枣癌症”。而枣树一旦感染枣疯病将出现丛枝、矮化、不育等症状，进而对枣产业造成严重的经济损失。研究表明，枣疯病的病原-植原体专性寄生在植物韧皮部和幼嫩组织中，无法离体培养，这为该种病害的研究带来了很大的困难。而由于病原无法离体培养，枣疯病的发病机理尚不明确，因此砍除和烧毁感病植株，消除植原体的来源，是枣疯病防治过程中最常用的方法。但这种方法耗费大量人力物力，且对枣树造成不可逆的伤害。因此如何快速准确地将枣疯病植原体与寄主分离，获取植原体基因组信息，明确枣疯病发生机理是目前该类病害防治研究的重点方向。
[0003] 现有技术中，分离植原体的主要方法包括密度梯度超速离心法及差速离心结合脉冲电泳分离法。密度梯度超速离心法的原理是将植物病组总DNA溶于不同浓度梯度的氯化铯或蔗糖溶液中，使用超速离心机使得不同密度的DNA在溶液中呈现梯度分离。而差速离心结合脉冲电泳法的原理是通过多次的差速离心逐步去除寄主细胞组分，获取植原体。两种方法都可以一定程度上分离枣疯病植原体。具体例如：陈昱圻以枣疯病叶为材料，利用氯化铯密度梯度离心结合Real-time PCR法分离得到较为纯净的枣疯病植原体DNA(陈昱圻等，超速离心结合Real-time PCR分离纯化枣疯病植原体DNA，北京农学院学报，2015，30(2)：5-9)；傅强等以感病组培苗为材料，使用差速离心结合脉冲电泳法成功在1600 kb-2200kb之间分离得到一条明亮条带，经过PCR检测，证明该条带是植原体DNA(傅强等，差速离心结合脉冲电泳分离枣疯病植原体DNA，江西农业学报，2016(12)：66-69)。但是这些分离方法都无法成功分离到高质量的枣疯病植原体，主要原因在于，植原体只寄生在植物韧皮部及幼嫩部位，而此部位的植原体的浓度很低，无法大量聚集，从而使得最终得到的植原体DNA质量不高且有大量的寄主基因组干扰，进一步地， DNA浓度和纯度均无法达到测序要求。因此，能否获得大量富集枣疯病植原体的植物材料是该类病原被成功分离的关键因素。
[0004] 对植原体的相关宿主研究表明，植原体在寄主昆虫及草本植物中的浓度要远远高于木本植物中。而由于枣疯病植原体的介体昆虫(中华菱纹叶蝉等)个头小，较难捕捉及培养，且生长周期短，因此，筛选能够在体内富集枣疯病植原体的草本植物并将其作为植原体分离材料是较为可行的策略。
[0005] 长春花(Catharanthus roseus)别名金盏草、四时春、日日新、雁头红、三万花，为多年生草本植物。近年来在国外分离植原体的研究中，长春花因可以富集多种植原体而大量被培育。例如，陈旺等通过条沙叶蝉(Psammotettix striatus L.)将小麦蓝矮(Wheat blue dwarf)植原体传播到长春花中，并最终利用差速离心法分离得到了WBD植原体的染色体 DNA(陈旺等，小麦蓝矮植原体染色体DNA的分离，微生物学通报，2013， 40(4)：706-710)。而针对如何利用长春花来富集枣疯病植原体，则未见到相关报道。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于一种提供利用长春花富集枣疯病植原体的方法，用以解决现有技术中枣疯病植原体难以大量获取的难题。
[0007] 为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
[0008] 一种利用长春花富集枣疯病植原体的方法，所述方法是以长春花为砧木，以枣疯病枝(粗度为4-7mm较佳)为接穗进行嫁接，使用腹接法或者劈接法进行嫁接，然后将嫁接后的植株移至人工气候控制室内培养：先在23℃，相对湿度85％的条件下进行1d暗培养，然后改为在16h光周期、23℃、相对湿度65％条件下培养，及时观测和记录枣疯病植原体入侵长春花后的典型致病表型，当典型表型出现后，使用巢氏PCR技术在分子水平上进行植原体定性，分子检测植原体存在即为枣疯病植原体转染成功。传病时间差异较大，一般在培养40-80d后可以在长春花中检测到枣疯病植原体。
[0010] 进一步地，长春花嫁接枣疯病枝的嫁接方法可以采用腹接法或者劈接法。
[0011] 其中，所述腹接法的具体步骤为：
[0012] (1)对嫁接刀进行消毒，利用嫁接刀将长春花砧木腹侧的叶片去除，斜切一个长1.5cm的劈口，深度超过砧木直径的一半，但不超过2/3；
[0013] (2)将枣疯病枝两侧对称斜切2-3cm作为接穗，削面“里长外短”，两侧高低要一致；
[0014] (3)将接穗插入砧木缝中紧紧贴紧；
[0016] 优选地，所述腹接法的接穗与砧木直径一致；或者保证至少一侧形成层对接，并使接穗的削面上部留2mm。
[0017] 另外，所述劈接法具体步骤为：
[0018] (1)对嫁接刀进行消毒，利用嫁接刀将长春花砧木去顶削平，从中间劈开一条长2-3cm的劈口；
[0019] (2)将枣疯病枝两侧对称斜切2-3cm作为接穗；
[0020] (3)将接穗插入砧木缝中紧紧贴紧；
[0021] (4)使用嫁接带从下至上将接口包好固定，捆扎紧。
[0022] 本发明具有如下优点：
[0023] 一般情况下，草本植物和木本植物之间由于亲缘关系较远，嫁接很难成功，在本发明中枣树属于木本植物，而长春花属于草本植物，嫁接后接穗会很快死亡。如果嫁接后按照常规条件进行培养，接穗很快死亡则不能将植原体传至长春花内。本发明发明人在试验过程中对其培养方法进行了改进：将嫁接后的植株移至人工气候控制室内培养，先在23℃，相对湿度85％的条件下进行1d暗培养，然后改为在16h光周期、23℃、相对湿度65％条件下培养，在这种条件下，可以有效的延长接穗存活时间，有效的将枣疯病植原体转染传播至长春花，通过长春花对其枣疯病植原体进行富集。
[0024] 另外，虽然采用了较为常见的腹接法或劈接法等嫁接方法，但通过合理的对嫁接后的长春花进行培养，较好实现了枣疯病植原体的富集，从而较好克服了现有枣疯病植原体分离研究中的植原体在原始寄主内含量低、分离困难及操作繁琐等问题，进而为枣疯病植原体的深入研究及如何防治枣疯病奠定了基础。附图说明
[0025] 图1为嫁接转染材料及工具；
[0026] 图2为采用腹接法将枣疯病枝接穗与长春花砧木进行嫁接；
[0027] 图3为采用劈接法将枣疯病枝接穗与长春花砧木进行嫁接；
[0028] 图4为嫁接后感染枣疯病植原体的长春花形态图；
[0029] 图5为DAPI染色法鉴定枣疯病植原体时采用荧光拍照系统记录的植原体在植物体内分布状态图；
[0030] 图6为巢氏PCR检测枣疯病植原体的电泳检测结果；
[0031] 图中，M表示DL2000 marker，1、2、3泳道的DNA模板为嫁接传病处理的长春花DNA，+表示枣疯病病叶DNA，-表示健康长春花DNA对照。
[0032] 图7为植原体浓度标准曲线。
具体实施方式
[0033] 下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
[0034] 如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
[0035] 本发明所采用的实验材料：
[0036] 长春花，一种常见花卉植物，从公开市场渠道获得。
[0037] 枣疯病枝，是发病(枣疯病)的枣树上的枝条，从种植的枣树上获得，枣树材料尽量不要用抗枣疯病的枣品种(如壶瓶枣、蛤蟆枣等)。
[0038] 实施例1
[0039] 一种利用长春花富集枣疯病植原体的方法，具体步骤如下：
[0040] (1)培育长春花幼苗作为嫁接砧木
[0041] 将长春花种子播种后，正常培养，以播种后生长30～40d的长春花幼苗作为嫁接材料，其中以地径5～8mm作为嫁接材料较佳；
[0042] (2)嫁接转染
[0043] 从病发枣疯病的枣树上选取枣疯病枝，以枣疯病枝作为接穗，采用腹接法(如图2所示)将枣疯病枝嫁接到砧木长春花幼苗上。具体嫁接操作前，如图1所示，准备好砧木、枣疯病枝接穗，以及若干操作工具：嫁接带、75％酒精及嫁接刀，其中，腹接法的具体操作步骤如下：
[0044] A.利用酒精擦拭或火烤对嫁接刀进行消毒，然后利用嫁接刀将长春花砧木腹侧的叶片去除，斜切一个长约1.5cm的劈口，深度应超过砧木直径的一半，但不能超过2/3；
[0045] B.将枣疯病枝两侧对称斜切2～3cm作为接穗，削面“里长外短”两侧高低要一致；
[0046] C.将接穗插入砧木缝中紧紧贴紧；接穗选择与砧木直径一致为最佳，如果不是，则保证至少一侧形成层对接，并使接穗的削面上部留2mm左右，以利于伤口愈合；
[0047] D.使用嫁接带从下至上将接口固定，捆扎要紧，达到防水保湿的目的。
[0048] (3)培养富集植原体
[0049] 将嫁接后的植株(长春花)移至人工气候控制室内培养：先进行1d 暗培养，培养条件为23℃，相对湿度85％；暗培养1d后于16h光周期、 23℃、相对湿度65％条件下培养至发病为止。不同株系的长春花感病时间不同，最快的40d左右可检测到植原体并出现感病症状。平均感病时间为60d左右，出现感病症状后的长春花便可用于后续试验材料。
[0050] 实施例2
[0051] 一种利用长春花富集枣疯病植原体的方法，具体步骤如下：
[0052] (1)培育长春花幼苗作为嫁接砧木
[0053] 将长春花种子播种后，正常培养，以播种后生长30～40d的长春花幼苗作为嫁接材料，其中以地径5～8mm作为嫁接材料较佳；
[0054] (2)嫁接转染
[0055] 从病发枣疯病的枣树上选取枣疯病枝，以枣疯病枝作为接穗，采用劈接法(如图3所示)将枣疯病枝嫁接到砧木长春花幼苗上。具体嫁接操作前同实施例1，其中，劈接法的具体操作步骤如下：
[0056] A.对嫁接刀进行消毒，利用嫁接刀将长春花砧木去顶削平，从中间劈开一条长约2-3cm的劈口；
[0057] B.将枣疯病枝两侧对称斜切2-3cm作为接穗；
[0058] C.将接穗插入砧木缝中紧紧贴紧；
[0059] D.使用嫁接带从下至上将接口包好；
[0060] (3)培养富集植原体
[0061] 将嫁接后的植株(长春花)移至人工气候控制室内培养，先进行1d 暗培养，培养条件为23℃，相对湿度85％；暗培养1d后于16h光周期、 23℃、相对湿度65％条件下培养至发病为止。出现感病症状后的长春花便可用于后续试验材料。
[0062] 以实施例1或2嫁接成功的植株为材料继续进行以下试验：
[0063] (一)转染效果鉴定
[0064] 培养50d左右后，嫁接后长春花会表现出典型枣疯病植原体侵染症状(如图4所示，丛枝、小叶、植株黄化、簇生等特征)，此时，采集症状部位茎段进行DAPI染色，以对转染效果进行鉴定。
[0065] DAPI染色的具体操作方式为：将感病长春花茎段用5％戊二醛进行固定后，使用冷冻切片机将茎段横切为10mm厚的切片；切片用载玻片承载，使用磷酸缓冲液反复清洗三次以上后使用DAPI燃料染色；将染色后的切片置于荧光倒置显微镜下观测，采用UV荧光，放大倍数为100×10 倍，观察植原体的形态特征，并使用荧光拍照系统记录植原体在感病长春花内分布状态，并与健康长春花、病枣、健康枣进行比较(图5所示)。结果证明感病长春花内的植原体在韧皮部位置呈片状分布，而病枣中植原体为点状分布，表明感病长春花中植原体含量远远多于病枣枝中。
[0066] 本次试验过程中，分别采用劈接法及腹接法嫁接了150株长春花(一共300株)，通过对典型植原体入侵症状的观察，可以鉴定统计有125 株感染有枣疯病植原体，而通过DAPI染色的细胞观察，统计鉴定有植原体荧光现象的165株(DAPI染色观察同时发现，感病长春花中的荧光斑点区域面积显著大于感病枣组织中)，结合后续PCR定性鉴定(在178 株嫁接的长春花中检测到枣疯病植原体)，结果表明通过常规嫁接操作，能够较好的将枣疯病植原体跨种传播至长春花中，表明转染成功。
[0067] (二)巢氏PCR定性鉴定
[0068] 对培养50d左右、表现出典型枣疯病植原体侵染症状的长春花取样，使用巢氏PCR技术对感病长春花中植原体进行检测。具体过程为：
[0069] (1)第一次PCR
[0070] 采集感病长春花的叶片及茎段样品，提取总DNA，以此为模板，利用植原体通用引物对(5’-3’)用50μL反应体系进行PCR扩增；
[0071] R16mF2：CATGCAAGTCGAACGGA
[0072] R16mR2：CTTAACCCCAATCATCGAC
[0073] PCR反应条件为：94℃、5min；94℃、40s，57℃、1min，72℃、 2min，35个循环；最后72℃延伸10min；
[0074] (2)第二次PCR
[0076] R16F2n：GAAACGACTGCTAAGACTGG
[0077] R16R2：TGACGGG.GGTGTGTACAAACCCCG
[0078] 对PCR扩增产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现在1400 bp处出现目的条带(图6)。
[0079] 对嫁接后所有长春花进行采样、并进行PCR鉴定后，统计表明，共在178株嫁接的长春花中检测到枣疯病植原体，这一结果表明，转染效率较高，可以较好的利用嫁接方式来转染并保存枣疯病植原体。
[0080] (三)qRT-PCR定量鉴定
[0081] 为进一步确定富集后感病长春花内枣疯病植原体浓度，发明人利用 qRT-PCR技术对植原体浓度进行了测定，具体过程简介如下。
[0082] (1)建立标准曲线
[0083] 以枣疯病病叶总DNA为模板，利用枣疯病植原体特异引物 ZFF1/ZFR1进行PCR扩增，
[0084] ZFF1：5’-ACTGCTTTCGGGTATTGCTAAC-3’，
[0085] ZFR1：5’-TGACGGGACTCCGCACAAGC-3’；
[0086] 采用50μL反应体系进行PCR扩增，
[0087] PCR反应条件为：94℃、5min；94℃、30s，61℃、30s，72℃、1min， 35个循环；最后72℃延伸10min。
[0088] 将扩增产物按照0、50、100、200、300、400和500ng/μL的浓度梯度进行稀释；以稀释后的PCR溶液为模板，利用枣疯病植原体特异引物 16SF/16SR进行Real-time PCR试验，获得其对应CT值，建立标准曲线 (结果如图7所示)。
[0089] (2)感病长春花样品测定
[0090] 以感病长春花DNA为模板，使用16SF/16SR引物对进行Real-time PCR检测，得到CT值。
[0091] 16SF：5’-ACTGCTTTCGGGTATTGCTAAC-3’，
[0092] 16SR：5’-TGACGGGACTCCGCACAAGC-3’；
[0093] (3)植原体浓度及拷贝数测定
[0094] 将步骤(2)中所得感病长春花CT值代入步骤(1)中所得标准曲线内，计算获得感病长春花内植原体浓度。
[0095] 需要说明的是，Real-time PCR检测时，采用SYBR染料法，使用ABI PRISM 7500FAST(Applied Biosystems)检测系统。
[0096] 使用20μL反应体系，体系包含：
[0097] cDNA模板，1μL；
[0098] 上下游引物各1μL(引物浓度为0.4μM)；
[0099] SYBR Premix Ex Taq II酶，10μL；
[0100] ddH2O，7μL。
[0101] 扩增程序设定为：95℃、30s；95℃、5s，60℃、31s，40个循环；最后步骤为95℃、15s，60℃、1min和95℃、15s；
[0102] 检测过程中，每个样品设置3个生物学重复，每个生物学重复设置3 个操作重复。
[0103] 按照上述操作方法，分别对嫁接之前用于接穗的枣疯病病枝以及感病长春花的枣疯病植原体浓度进行检测，结果发现，嫁接之前用于接穗的枣疯病病枝内植原体平均浓度为200ng/μL，感病长春花内枣疯病植原体浓度平均为525ng/μL，说明长春花可以富集枣疯病植原体。
[0104] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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