技术领域
[0001] 本
发明属于病毒纯化技术领域，尤其涉及一种烟草为砧木嫁接接种番茄褪绿病毒的纯化方法、应用。
背景技术
[0002] 番茄褪绿病毒是由粉虱类
害虫传播的一种新发病毒，侵染寄主植株引起严重的“黄化失调”，导致果实成熟延迟，影响产量，给种植户带来巨大的经济损失。该病害于1989年在美国弗罗里达州番茄种植区被发现，1998年首次被确定为番茄褪绿病毒，随后迅速在全球范围内暴发、流行。根据文献统计发现，除南极洲和大洋洲之外，其余5大洲20多个国家和地区均有ToCV的报道。我国首次于2004年在中国台湾检测到ToCV的发生，2012年在中国北京大兴区设施番茄和辣椒植株上检测到该病毒。目前，ToCV已在北京、山东、河南、天津、山西、江苏、辽宁、广东等番茄种植区暴发、流行，造成了严重的经济损失。
[0003] ToCV属于长线形病毒科Closteroviridae毛形病毒属Crinivirus，其基因组包含两条正义单链RNA(+ssRNA)，分别
包装在线形的病毒粒子中。RNA1长8594nt，包含4个ORFs，编码的蛋白控制病毒复制。RNA2长8242nt，包含9个ORFs，编码的蛋白与病毒壳体化、运动及介体传播相关。先前的研究发现，RNA1链和RNA2链同时存在才能确保成功侵染寄主细胞。如同其它毛形病毒属病毒一样，ToCV是韧皮部限制性病毒，不能通过人工机械摩擦接种，也不经由
种子传播。自然条件下，ToCV只能通过粉虱以半持久性方式传播，分属于小粉虱属Bemisia和粉虱属Trialeurodes的烟粉虱Bemisiatabaci、
温室白粉虱Trialeurodesvaporariorum和纹翅粉虱T.abutilonea通过刺吸取食植株韧皮部位传播病毒。虽然这几种粉虱的传毒效率有所差异，但都具备有效传播能
力。
[0004] 解决上述技术问题的难度：实验室内通常利用粉虱取食带毒植株进行病毒保存，但粉虱作为多种
植物病毒的传毒媒介，很难保证病毒单一侵染(Andret-Link P and Fuchs M,2005；Hohn,2007)。同时粉虱接种还受到性别、饲养、技术等多种因素的影响，而且操作复杂，接种率较低。常规的嫁接接种以发病的番茄植株为砧木，由于番茄植株可以通过媒介昆虫获得多种病毒，因此很难保证毒源单一。
[0005] 解决上述技术问题的意义：针对媒介昆虫传毒接种和常规番茄嫁接接种存在方法上的
缺陷，本发明提供了一种以烟草为砧木嫁接接种番茄褪绿病毒的方法，该方法适用于韧皮部植物病毒的嫁接接种，接种率高达80％，操作简单、快速有效，在实验室内重复性强，对ToCV致病机理、媒介昆虫-病毒-寄主互作机制、抗性品种选育等方面提供技术支持。
发明内容
[0006] 针对
现有技术存在的问题，本发明提供了一种烟草为砧木嫁接接种番茄褪绿病毒的纯化方法、应用。
[0007] 本发明是这样实现的，一种烟草为砧木嫁接接种番茄褪绿病毒的纯化方法，所述烟草为砧木嫁接接种番茄褪绿病毒的纯化方法以发病本氏烟为砧木，以番茄植株为
接穗，以健康番茄植株为接穗，劈接法将接穗番茄嫁接到砧木上。待接穗番茄长到一叶期，从番茄根部切断，保留地上部分作为接穗，接穗番茄下部左右各斜切一部分韧皮部，插入本氏烟植株切口，用嫁接夹固定。
[0008] 进一步，接种的本氏烟植株置于
温度26±1℃，
相对湿度70±5％，光周期L:D＝16:8h的人工
气候箱内进行隔虫育苗，待植株长到四叶期进行农杆菌接种。接种的步骤如下：第一步，将30uL活化的阳性克隆农杆菌菌液加入到30mL含有抗生素的LB液体培养基中，振荡培养，离心收集菌体，MMA缓冲液重悬4h，用分光光度计调整到菌体OD600值为1.0；第二步，选取健康生长一致的植株用灭菌的无针头1mL
注射器将0.5mL菌体浸润植株
叶片，放置智能温室内培养，以pCY空载质粒的农杆菌作为阴性对照。接种21d后用RT-PCR检测本氏烟植株的感病率，选择表现ToCV典型症状的本氏烟植株作为嫁接砧木。
[0009] 进一步，所述烟草为砧木嫁接接种番茄褪绿病毒的纯化方法待本氏烟根部茎粗长到2mm，在本氏烟第三第四真叶中间平行地面切断，
自上而下垂直切1.5cm的切口，备用。接穗番茄植株置于温度26±1℃，相对湿度70±5％，光周期L:D＝16:8h的人工气候箱内进行隔虫育苗，待植株长到一心期，从番茄植株根部切断，保留地上部分作为接穗，接穗番茄下部左右各斜切部分韧皮部，插入本氏烟植株切口，用嫁接夹固定。
[0010] 进一步，所述第一步28℃、200r/min振荡培养12h。
[0011] 进一步，所述第二步放置于温度26±1℃，相对湿度70±5％，光周期L:D＝16:8h的人工气候箱内进行培养。
[0012] 进一步，劈接法嫁接后植株置于温度26±1℃，相对湿度70±5％的人工气候箱内黑暗处理24h。
[0013] 本发明的另一目的在于提供一种所述烟草为砧木嫁接接种番茄褪绿病毒的纯化方法在获取番茄褪绿病毒单一毒源中的应用。
[0014] 本发明的另一目的在于提供一种所述烟草为砧木嫁接接种番茄褪绿病毒的纯化方法在其它韧皮部限制性病毒单一毒源获取中的应用。
[0015] 本发明的另一目的在于提供一种所述烟草为砧木嫁接接种番茄褪绿病毒的纯化方法在番茄褪绿病毒致病机理检测中的应用。
[0016] 本发明的另一目的在于提供一种所述烟草为砧木嫁接接种番茄褪绿病毒的纯化方法在番茄褪绿病毒与寄主互作机制中的应用。
[0017] 本发明的另一目的在于提供一种所述烟草为砧木嫁接接种番茄褪绿病毒的纯化方法在抗性品种选育中的应用。
[0018] 综上所述，本发明的优点及积极效果为：本实验以发病本氏烟为砧木，以健康番茄植株为接穗，建立番茄褪绿病毒的嫁接接种技术，为ToCV的后续研究提供技术支持。烟粉虱传播的番茄褪绿病毒(Tomatochlorosisvirus，ToCV)给全世界番茄产业带来了严重的经济损失，引起了科研工作者的高度重视。高效稳定的ToCV单一毒源获取技术的缺乏，导致其致病机理、与寄主互作及抗性品种选育等相关方面的研究受到了极大限制。针对这一问题，本发明以烟草为砧木进行嫁接接种番茄褪绿病毒的相关分析。将ToCV侵染性克隆接种到非自然寄主本氏烟和自然寄主番茄植株上，结果发现，ToCV侵染性克隆能成功侵染本氏烟，且发病症状明显，而在番茄植株体内侵染率极低，且不表现症状，烟粉虱取食该番茄植株48h后体内未检测到病毒
片段；利用不同嫁接方法将健康番茄植株嫁接到发病本氏烟植株上，均能引起番茄植株系统感染，且劈接法嫁接的番茄植株发病率高达79.08％，更适用于本氏烟为砧木番茄植株的嫁接，烟粉虱取食嫁接的发病番茄植株可完成对病毒的传播。
[0019] 相比于现有技术，本发明的优点进一步包括：
[0020] 本发明利用发病本氏烟为砧木嫁接接种番茄褪绿病毒，无需通过饲养烟粉虱和复杂的操作完成烟粉虱的传毒，而且烟粉虱是多种植物病毒的媒介昆虫，烟粉虱传毒容易造成多种植株病毒在番茄植株上复合侵染；常规的嫁接接种以发病的番茄植株为砧木，由于番茄植株可以通过媒介昆虫获得多种病毒，因此很难保证毒源是单一的，影响番茄褪绿病毒的后续分析；接穗番茄选择育苗7d左右的一叶期植株，从根部直接切断，利用插接法嫁接到本氏烟植株上，由于
幼苗的再生能力更强，使得比传统的4～5叶期嫁接的接种率更高。该嫁接方法还具有重复性好、接种时间短、简单易学等优势，适用于韧皮部限制性病毒毒源的获取，对植物病毒致病机理、媒介昆虫-病毒-寄主互作研究、抗性品种选育等方面具有重要意义。
附图说明
[0021] 图1是本发明
实施例提供的烟草为砧木嫁接接种番茄褪绿病毒的纯化方法的
流程图。
[0022] 图2是本发明实施例提供的ToCV的目的片段示意图。植株接种ToCV侵染性克隆的
电泳检测。图中：1、3：本氏烟；2、4：番茄；5：健康对照。
[0023] 图3是本发明实施例提供的接种ToCV侵染性克隆的本氏烟和接种ToCV侵染性克隆的番茄植株对比示意图。图中：(A)接种ToCV侵染性克隆的本氏烟；(B)接种ToCV侵染性克隆的番茄植株。
[0024] 图4是本发明实施例提供的烟粉虱接种到本氏烟、番茄植株的存活率示意图。
[0025] 图5是本发明实施例提供的取食本氏烟和番茄烟粉虱的ToCV检测示意图。
[0026] 图6是本发明实施例提供的不同砧木对病毒累积的影响示意图。
[0027] 图7是本发明实施例提供的利用2种不同嫁接方法将健康番茄植株嫁接到发病本氏烟植株示意图。番茄植株的不同嫁接方法注：A靠接法；B劈接法。
[0028] 图8是本发明实施例提供的不同嫁接方法对ToCV在番茄植株上积累结果示意图。
[0029] 图9是本发明实施例提供的不同嫁接方法对ToCV发病率的影响示意图。
[0030] 图10是本发明实施例提供的烟粉虱对嫁接番茄植株的传播示意图。
具体实施方式
[0031] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0032] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种烟草为砧木嫁接接种番茄褪绿病毒的纯化方法、应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
[0033] 如图1所示，本发明实施例提供的烟草为砧木嫁接接种番茄褪绿病毒的纯化方法包括以下步骤：
[0034] S101：将30uL活化的阳性克隆农杆菌菌液加入到30mL含有抗生素的LB液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养12h，离心收集菌体，MMA缓冲液重悬4h，用分光光度计调整到菌体OD600值为1.0。
[0035] S102：选取健康生长一致的植株用灭菌的无针头1mL注射器将0.5mL菌体浸润植株叶片，放置温度26±1℃，相对湿度70±5％，光周期L:D＝16:8h的人工气候箱内培养，接种21d后用RT-PCR检测其侵染率，以pCY空载质粒的农杆菌作为阴性对照。
[0036] S103：待本氏烟根部茎粗长到2mm，用灭菌的刀片在本氏烟第三和第四片真叶中间将茎平切断，自上而下垂直切1.5cm长的切口，接穗番茄保留一叶，从番茄根部切断，保留地上部分作为接穗，接穗番茄下部左右各斜切一部分韧皮部，插入本氏烟植株切口，用嫁接夹固定。
[0037] 下面结合试验对本发明的技术方案作进一步的描述。
[0038] 1、材料与方法
[0039] 试验方法
[0040] 1.1 ToCV侵染性克隆接种
[0041] 将30uL活化的阳性克隆农杆菌菌液加入到30mL含有抗生素的LB液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养12h，离心收集菌体，MMA缓冲液(10mmol·L-1MgCl2，10mmol·L-1MES，-1200μmol·L As)重悬4h，用分光光度计调整到菌体OD600值为1.0。选取健康生长一致的植株用灭菌的无针头1mL注射器将0.5mL菌体浸润植株叶片(Zhao etal.，2016)，放置温度26±1℃，相对湿度70±5％，光周期L:D＝16:8h的人工气候箱内培养，接种21d后用RT-PCR检测其侵染率，以pCY空载质粒的农杆菌作为阴性对照。
[0042] 1.2嫁接方法
[0043] 靠接法：待本氏烟根部茎粗长到2mm，用灭菌的刀片在本氏烟第三和第四片真叶中间自下向上将茎切断，切面
角约45度，接穗番茄保留一心，与砧木茎粗相近处切断，切面角与砧木保持一致，切口光滑，两切口对齐，用嫁接夹固定。
[0044] 劈接法：待本氏烟根部茎粗长到2mm，用灭菌的刀片在本氏烟第三和第四片真叶中间将茎平切断，自上而下垂直切1.5cm长的切口，接穗番茄保留一心，与砧木茎粗相近处切断根部，接穗番茄下部左右各斜切一刀，插入本氏烟切口，用嫁接夹固定。
[0045] 1.3不同嫁接方法对番茄植株发病的影响
[0046] 试验共设2个处理：靠接法(A)和劈接法(B)，每个处理选取生长势一致的已发病本氏烟和番茄植株各30棵，按照不同嫁接方法将番茄嫁接到本氏烟植株上，防虫网隔断害虫，并进行统一生产管理，每个处理重复3次。嫁接21d后采集番茄植株叶片，RT-PCR检测不同嫁接方式下番茄植株的发病率，qRT-PCR检测病毒累积量，并进行处理间差异显著分析。
[0047] 1.4不同砧木对病毒累积的影响
[0048] 为确定不同砧木对ToCV累积的影响，共设2个处理：A，以发病本氏烟为砧木，将健康番茄穗嫁接到烟草上；B，以健康番茄植株为砧木，将发病本氏烟穗嫁接到番茄植株上。每个处理各选取30棵植株，重复3次。嫁接7、10、14和21d后采集番茄叶片，利用qRT-PCR检测病毒累积量，并进行处理间差异分析。
[0049] 2、结果与分析
[0050] 2.1 ToCV侵染性克隆在本氏烟和番茄植株的侵染情况
[0051] ToCV侵染性克隆侵染本氏烟21d后，利用RT-PCR技术可检测到约751bp、463bp的目的片段(图2)，同时检测到两条目的片段的概率为76.79％。经克隆、测序、BLAST比对后，发现该2条目的片段与GenBank中已登录的RNA1、RNA2序列相比较，同源性高达99.0％以上。相对于健康烟草，接种ToCV侵染性克隆的本氏烟表现出典型的ToCV发病症状，上部叶片黄化，下部叶片出现明显的褪绿斑点，且叶片变脆(图3-A)，这说明ToCV侵染性克隆已成功侵染本氏烟。
[0052] ToCV侵染性克隆侵染番茄植株21d后，利用RT-PCR技术可检测到约751bp、463bp的目的片段(图2)，同时检测到两条目的片段的概率为12.85％。经克隆、测序、BLAST比对后，发现该2条目的片段与GenBank中已登录的RNA1、RNA2序列相比较，同源性高达99.0％以上。但接种ToCV侵染性克隆的番茄植株未表现发病症状(图3-B)。
[0053] 2.2本氏烟和番茄对烟粉虱生存及获毒的影响
[0054] 用微虫笼将初
羽化的烟粉虱成虫接种到ToCV侵染的本氏烟、健康本氏烟、ToCV侵染的番茄植株和健康番茄植株上，记录烟粉虱的生存情况。取食1h后，ToCV侵染的本氏烟和健康本氏烟植株上接种的烟粉虱开始出现死亡；2h后烟粉虱出现死亡高峰，且ToCV侵染的本氏烟上的烟粉虱死亡率高达59.37％，显著高于健康本氏烟和番茄植株；取食12h后，侵染ToCV本氏烟植株上的烟粉虱全部死亡，24h后健康本氏烟植株上的烟粉虱全部死亡；接种在番茄植株上的烟粉虱生长良好(图4)。
[0055] 在ToCV侵染的本氏烟植株上采集取食6h的烟粉虱，经RT-PCR检测发现，烟粉虱体内未检测到该病毒；在ToCV侵染的番茄植株上采集取食24h的烟粉虱，经RT-PCR检测发现，烟粉虱体内不携带该病毒(图5)。
[0056] 2.3不同砧木对番茄植株发病的影响
[0057] 嫁接7，10，14和21d后采集处理组A和B番茄植株的叶片，利用qRT-PCR检测不同时期ToCV的积累情况。结果发现，处理组A植株在10d后检测到ToCV，随着时间的增长，病毒含量增加。处理组B植株在14d后检测到ToCV，同样随着时间增长，病毒含量增加(图6)。这些结果表明嫁接技术可以导致韧皮部限制性病毒系统侵染健康番茄植株，且以本氏烟为砧木更有利于番茄植株体内病毒的积累。
[0058] 2.4不同嫁接方法对番茄植株发病的影响
[0059] 利用2种不同嫁接方法将健康番茄植株嫁接到发病本氏烟植株上(图7)，21d后采集番茄植株叶片进行qPCR检测，结果发现处理组A和B番茄样品病毒的积累量无显著差异(图8)，但不同嫁接方法番茄植株的发病率存在明显差异，劈接法的发病率高达79.08％，明显高于靠接法(图9)。因此，劈接法更有利于以本氏烟为砧木番茄植株ToCV的嫁接接种。
[0060] 2.5烟粉虱对嫁接番茄植株的传毒研究
[0061] 用微虫笼将初羽化的烟粉虱成虫接种到发病的嫁接番茄叶片上取食48h后，采集单头烟粉虱进行RT-PCR检测发现，64.20％的烟粉虱体内可检测到ToCV片段；将带毒的烟粉虱成虫接种到健康的5叶期番茄植株上传毒48h，21d后采集番茄叶片进行RT-PCR检测发现，85.98％的番茄植株均可检测到ToCV片段且表现出明显的发病症状(图10)。
[0062] 3、如同其它毛形病毒属病毒，ToCV侵染植株后，病毒粒子在植株韧皮部进行双向传导。利用嫁接技术将ToCV番茄植株的单叶移植到幼苗番茄的韧皮部，结果发现87.8％的番茄植株能成功感染病毒。同样，将一段含有韧皮部组织的ToCV番茄植株茎段贴片贴到健康番茄植株的韧皮部，也引起番茄植株的系统感染。本实验中，利用靠接法和劈接法将健康番茄植株嫁接到发病本氏烟植株上，均能导致番茄植株发病，这说明该侵染性克隆在本氏烟植株里复制后具备了在番茄植株体内增值的能力，并表现出典型症状。将烟粉虱接种到嫁接的带毒番茄植株上可进行有效传播也能证实ToCV病毒粒子的完整性。嫁接接种法简单高效易行，不受季节、温度的限制，尤其是劈接嫁接法更适用以本氏烟为砧木番茄植株的嫁接，可以作为获取单一番茄褪绿病毒的一种有效方法，对加快种质资源选育、互作机制研究具有重要意义。
[0063] 表 检测引物的信息表
[0064] 表1引物信息
[0065] Table1 Primer pairs used in paper
[0066]
[0067]
[0068] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何
修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
