TaNCED1基因B基因组C/T SNP标记与应用
阅读：703发布：2020-05-13
专利汇可以提供TaNCED1基因B基因组C/T SNP标记与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了TaNCED1基因B基因组C/T SNP标记与应用。NCED基因是ABA 生物 合成过程中的关键限速酶。在 植物 的抗逆过程中发挥着重要的调控作用，在TaNCED1基因B基因组295bp处发现C/T等位变异，开发了KASP标记，并对364份来自不同地区的小麦品种进行了检测，其中抗旱品种74个，占总数的20.33%； 水 地种植的品种290个，占总数的79.67%。分析发现有116个品种是C类型，占总数的31.9%，其中具有抗旱性小麦品种有42个，占该类型的36.21%；234个品种是T类型，占总数的64.3%，具有抗旱性小麦品种31个，占该类型的13.25%；还有14个品种属于未知类型。结果发现，耐盐小麦品种如农大399、3D232和德抗961等多属于C类型，该位点可以作为筛选抗旱耐盐材料的标记。，下面是TaNCED1基因B基因组C/T SNP标记与应用专利的具体信息内容。
1.一个TaNCED1基因B基因组SNP标记，其特征在于：在TaNCED1基因B基因组295bp处具有等位变异C/T 。
2.根据权利要求1所述的TaNCED1基因B基因组SNP标记，其特征在于：所述SNP标记的两条正向特异性引物和一条反向通用引物DNA序列如SEQ ID No.1-3所示。
3.根据权利要求1所述的TaNCED1基因B基因组SNP标记，其特征在于：所述SNP标记具有C变异的小麦品种抗旱性强 。
4.根据权利要求3所述的TaNCED1基因B基因组SNP标记，其特征在于：所述SNP标记具有C变异的小麦品种水分胁迫耐受性强或耐盐性强。
5.根据权利要求1-4任一项所述的TaNCED1基因B基因组SNP标记，其特征在于：所述标记在筛选抗旱材料中的应用。
TaNCED1基因B基因组C/T SNP标记与应用
技术领域
[0001] 本发明属于小麦遗传学领域，具体涉及TaNCED1基因B基因组C/T SNP标记与应用。
背景技术
[0002] 在ABA的生物合成途径中，9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）是关键的限速酶，能够调控ABA的合成速度。2012年本课题组成功克隆了小麦NCED1基因的全长，并将其命名为TaNCED1，GenBank登录号为JQ772528.1，该基因为单拷贝，长度为1 848 bp，无内含子。研究表明，在小麦中TaNCED1基因对脱水、盐、冷和ABA胁迫均产生不同程度的响应；过表达TaNCED1的转基因烟草抗旱性显著提高。
[0003] 为了研究小麦中TaNCED1基因表达和ABA积累的关系，我们分析了8个抗旱性不同的小麦品种在干旱胁迫和复水过程中TaNCED1基因表达和ABA积累的动态变化过程，结果表明品种间TaNCED1的表达水平存在明显差异，且TaNCED1对ABA影响程度存在较明显的差异。
发明内容
[0004] 为明确不同材料中TaNCED1基因对ABA影响不同的原因，本专利研究进一步分析了17个抗旱性不同材料的TaNCED1基因序列的差异，发现在B基因组存在C/T变异位点。为了研究这个变异位点在小麦种质中的分布情况，探讨TaNCED1不同的变异类型与小麦品种的抗旱性关系，针对这个变异位点，本专利开发了KASP标记，并对小麦品种进行检测，以期为小麦分子辅助育种提供宝贵资源和有效的分子标记。
[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：本发明提供了一个TaNCED1基因B基因组SNP标记，在TaNCED1基因B基因组295bp处具有等位变异C/T 。
[0006] 所述SNP标记的两条正向特异性引物和一条反向通用引物DNA序列如SEQ ID No.1-3所示。
[0007] 所述SNP标记具有C变异的小麦品种抗旱性强 。
[0009] 该标记可以在筛选抗旱材料中应用 。
[0010] 本发明的有益效果是：1、TaNCED1基因是ABA合成的限速酶，其表达水平调控着植物体内ABA含量，不同品种间TaNCED1对水分变化的响应快慢程度及其表达水平存在显著差异。本专利分析了TaNCED1基因C/T等位变异在小麦品种中分布，耐盐小麦品种如农大399、3D232和德抗961等多属于C类型，该位点可以作为筛选小麦抗旱耐盐材料的标记。
[0012] 图 1是小麦品种的DNA电泳图。
[0013] 图2是TaNCED1基因B基因组C/T 位点KASP标记检测图。
具体实施方式
[0015] 表1 试验小麦品种及对应的SNP统计表大田抗性 来源地区 小麦品种名称 TaNCED1-2-B-d2（C/T）
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水地种植 山东 ’975106 T:T
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水地种植 山东 烟农578 T:T
水地种植 河北 藁优5218 T:T
水地种植 山东 临选5186 T:T
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水地种植 山东 山农29 T:T
水地种植 山东 4510(泰农18/烟农19) T:T
水地种植 山东 3768（烟农19/良星66） T:T
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水地种植 山东 山农24 T:T
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1.2 方法
1.2.1 DNA的提取
取小麦叶片，使用快捷型植物基因组DNA提取系统（非离心柱型 目录号：DP321，天根）进行小麦叶片DNA的提取。
耐旱 法国 Manital
水地种植 法国 NSA09-3645
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水地种植 北京 BFB20
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耐肥水 山东 鲁麦5号 C:C
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1.2 方法
1.2.1 DNA的提取
取小麦叶片，使用快捷型植物基因组DNA提取系统（非离心柱型 目录号：DP321，天根）进行小麦叶片DNA的提取。
[0016] 引物设计及引物序列根据KASP标记的工作原理，针对SNP/Indel 位点设计3条引物，两条正向特异性引物和一条反向通用引物，两条正向引物对应两种荧光信号，经过PCR反应，最终检测两种荧光的荧光值大小来判断样本分型情况。
[0017] 表2 TaNCED1基因B基因组KASP引物1.2.3 反应体系和反应程序
通过Replikator仪器将样本从96孔板中转移到384孔板，最终再转移至1536孔板中。将装有DNA的1536孔板置于烘箱中烘干。干燥后的1536孔板通过Meridian仪器进行PCR体系构建，每个反应仅需1ul反应体系：
表3 PCR反应体系
Plate format 1536-well plate
2*KASP Master mix 0.5 ul
72*Assay mix 0.014 ul
H2O 0.486 ul
Total 1 ul
将加好反应体系的孔板进行封膜，并快速进行低速离心。离心后进行水浴PCR反应，反应程序如下：
表4 PCR反应程序
步骤 说明 温度 时间 循环次数
1 Activation激活 94℃ 15 mins 1
2 Denaturation变性 94℃ 20s 10
Annealing/Elongation退火/延伸率 61-55℃ 60s
3 Denaturation变性 94℃ 20s 26
Annealing/Elongation退火/延伸率 55℃ 60s
将完成反应的孔板，擦干水降温后，在酶标仪Pherastar上进行读板。若没有出现清晰的分型结果，可适当增加额外的PCR反应进一步扩增。
通过Replikator仪器将样本从96孔板中转移到384孔板，最终再转移至1536孔板中。将装有DNA的1536孔板置于烘箱中烘干。干燥后的1536孔板通过Meridian仪器进行PCR体系构建，每个反应仅需1ul反应体系：
表3 PCR反应体系
Plate format 1536-well plate
2*KASP Master mix 0.5 ul
72*Assay mix 0.014 ul
H2O 0.486 ul
Total 1 ul
将加好反应体系的孔板进行封膜，并快速进行低速离心。离心后进行水浴PCR反应，反应程序如下：
表4 PCR反应程序
步骤 说明 温度 时间 循环次数
1 Activation激活 94℃ 15 mins 1
2 Denaturation变性 94℃ 20s 10
Annealing/Elongation退火/延伸率 61-55℃ 60s
3 Denaturation变性 94℃ 20s 26
Annealing/Elongation退火/延伸率 55℃ 60s
将完成反应的孔板，擦干水降温后，在酶标仪Pherastar上进行读板。若没有出现清晰的分型结果，可适当增加额外的PCR反应进一步扩增。
[0018] 表5 PCR反应进一步扩增程序步骤 温度 时间 循环次数
1 94℃ 20s 3
2 57℃ 60s
2 结果分析
2.1 DNA的提取质量检测
利用Nanodrop 2000/2000C 分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测了DNA的质量和完整性，结果发现，364份小麦品种的DNA提取质量较好，Nanodrop 2000/2000C 分光光度计检测的结果260/280的比值大于1.8，260/230的比值大于2.0；琼脂糖电泳结果显示DNA没有降解，完整性很好（见图1）。
1 94℃ 20s 3
2 57℃ 60s
2 结果分析
2.1 DNA的提取质量检测
利用Nanodrop 2000/2000C 分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测了DNA的质量和完整性，结果发现，364份小麦品种的DNA提取质量较好，Nanodrop 2000/2000C 分光光度计检测的结果260/280的比值大于1.8，260/230的比值大于2.0；琼脂糖电泳结果显示DNA没有降解，完整性很好（见图1）。
[0019] 检测结果分析利用KASP引物共检测了4个96孔板，96孔板的编号分别为NCED-1、NCED-2、NCED-3和NCED-4。每个96孔板放置92个DNA，剩余最后4孔用于放置阳性对照，在第4个96孔板中放置了4个阳性对照材料，故共参加分析的小麦品种364个。4个96孔板中KASP的分型结果统计如表6。TaNCED1基因B基因组C/T 位点KASP标记检测图见图2。
[0020] 表6 KASP分型结果统计表2.3 C/T变异类型分布
C/T变异位点位于TaNCED1基因295bp处，在检测的364个小麦品种中，有116个品种是C类型，占总数的31.9%；234个品种是T类型，占总数的64.3%；还有14个品种属于未知类型。
C/T变异位点位于TaNCED1基因295bp处，在检测的364个小麦品种中，有116个品种是C类型，占总数的31.9%；234个品种是T类型，占总数的64.3%；还有14个品种属于未知类型。
[0021] 根据小麦品种审定及文章中报道的品种抗旱性，对364个小麦品种进行了抗旱性分类，分为水地种植、抗旱、耐旱、节水、耐渍、耐盐等类型，在统计过程中除水地种植外，其余材料均认为耐水分胁迫，属于抗旱类型。在参试的364个品种中，其中抗旱的品种74个，占总数的20.33%；水地种植的品种290个，占总数的79.67%。分析小麦品种的抗旱性及对应的SNP类型发现，在含有T SNP 的234个品种中，具有抗旱性小麦品种有31个，占该类型的13.25%；而在含有C SNP的116个小麦品种中，具有抗旱性小麦品种有42个，占该类型的
36.21%。根据分型结果发现，耐盐小麦品种如农大399、3D232和德抗961等多属于C类型（见表1），该位点可以作为筛选抗旱耐盐材料的标记。
36.21%。根据分型结果发现，耐盐小麦品种如农大399、3D232和德抗961等多属于C类型（见表1），该位点可以作为筛选抗旱耐盐材料的标记。
[0022] TaNCED1基因是ABA合成的限速酶，其表达水平调控着植物体内ABA含量，研究发现不同品种间TaNCED1对水分变化的响应快慢程度及其表达水平存在显著差异。不同品种间TaNCED1对水分变化的响应快慢程度及其表达水平的差异，是否是导致不同品种抗旱性不同的原因，因此分析了TaNCED1基因C/T等位变异在小麦品种中分布，耐盐小麦品种如农大399、3D232和德抗961等多属于C类型，该位点可以作为筛选小麦抗旱耐盐材料的标记。
[0023] 目前在小麦上分别研究了TaPK7、TaDREB1和TaFer-A等基因的等位变异与抗旱性的关系，并开发与抗旱性相关的分子标记。随着小麦基因组学的迅速发展，利用优异基因的等位变异，开发分子标记应用到小麦育种中，成为提高小麦育种效率的有效手段。
[0024] 以上所述仅是本专利的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本专利的保护范围。
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