技术领域
[0001] 本
发明属于分析化学领域，涉及SALDI-MS基底材料，具体涉及一种负载金-功能化多孔TiO2薄膜及在SALDI-MS分析中的应用。
背景技术
[0002] 基质辅助激光
解吸/电离(MALDI)质谱(MS)依赖吸收激光
能量的基质，与被分析物共结晶，以达到高的电离和解吸效率。MALDI具有许多优点，是高分子分析不可缺少的工具。然而，基质的存在会导致在质谱m/z 700以下区域产生了高的化学背景，在分析小分子时遇到了挑战。表面辅助激光解吸/电离(SALDI)MS是一种基于软激光的电离技术。SALDI采用各种纳米结构或微结构化基底将激光能量转移至分析物，以促进分析物从表面解吸/电离。
SALDI MS且用活性表面代替了MALDI的化学基质进一步消除了高背景干扰而获得了广泛的关注。近年来，SALDI MS因高通量、在质谱低
质量区域不受基质干扰、能够对复杂
生物基质进行全局分析和组织成像等优点已发展成为一种具有巨大潜
力的技术，可洞悉现代研究中面临的许多挑战。
[0003] 目前在SALDI中使用三种主要类型的
基板，包括基于
半导体的(例如多孔
硅和硅
纳米线阵列)，基于
碳的(例如
石墨烯和碳
纳米管)和基于金属的(例如金和
银纳米粒子)材料。这些结构具备较强的紫外吸收能力，然而这些材料检测
信号的重复性差；
耐盐性差；疏
水性较差，削弱了检测的灵敏度；与靶表面作用弱，容易污染离子源。
[0004] 因此，开发一种具有重现性、耐盐性，低背景干扰且可检测分析多种低分子量化合物的基底对SALDI MS分析的研究有重要意义。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于克服现有MALDI技术的不足，提供一种负载金-功能化多孔TiO2薄膜及在SALDI-MS分析中的应用。
[0006] 本发明上述目的通过如下技术方案实现：
[0007] 一种负载金-功能化多孔TiO2薄膜，通过如下步骤制备：
[0008] 步骤S1，制备前体溶液：向反应器中加入适量的
钛酸四丁酯和无水
乙醇，磁力搅拌充分混合以形成前体溶液，并将载体放置在反应器中；
[0009] 步骤S2，制备TiO2薄膜：向剧烈搅拌的前体溶液中依次加入适量十六烷基三甲基溴化铵乙醇溶液和超纯水，
冰浴，依次用无水乙醇和水彻底冲洗修饰后的载体，加热老化，在载体上形成TiO2薄膜；
[0010] 步骤S3，制备功能化多孔TiO2薄膜：将负载TiO2薄膜的载体浸入酸性乙醇溶液中搅拌制备多孔TiO2薄膜，用无水乙醇彻底冲洗负载多孔TiO2薄膜的载体，加热老化，去除十六烷基三甲基溴化铵，得多孔TiO2薄膜
镀层的载体；将上述载体浸入含有N-三甲
氧基甲硅烷基丙基-N,N,N-三甲基
氯化铵的丙
酮溶液中，常温磁力搅拌，然后依次用丙酮、乙醇和水冲洗，加热老化；
[0011] 步骤S4，负载金：将功能化的负载多孔TiO2薄膜的载体浸入HAuCl4水溶液中，常温搅拌，用超纯水冲洗，并浸入NaBH4水溶液中冰浴，最后加热老化即得。
[0012] 进一步地，步骤S1和步骤S2中所述载体为ITO玻璃。
[0013] 进一步地，ITO玻璃清洗后使用，清洗过程如下：首先将ITO玻璃用1M NaOH水溶液浸泡过夜，然后在丙酮、乙醇和超纯水中超声处理15min，最后用超纯水彻底洗涤并用N2干燥。
[0014] 进一步地，各步骤中的搅拌速度均为1500r/min。
[0015] 进一步地，步骤S2中十六烷基三甲基溴化铵乙醇溶液的浓度为50mg/mL。
[0016] 进一步地，步骤S1中向反应器中加入5mL的钛酸四丁酯和20mL的无水乙醇。
[0017] 进一步地，步骤S2中十六烷基三甲基溴化铵乙醇溶液的体积为10mL。
[0018] 上述任一所述负载金-功能化多孔TiO2薄膜作为基底在小分子量化合物的表面辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测中的应用。
[0019] 进一步地，所述小分子量化合物指分子量小于1000Dalton的化合物，包括
氨基酸、
脂肪酸、生物
碱、黄酮、糖类、多巴胺、尿液
代谢物和血清代谢物。
[0020] 上述任一所述负载金-功能化多孔TiO2薄膜用于印迹花瓣间接对其次生代谢物进行质谱成像分析的用途。
[0021] 有益效果：
[0022] 本发明提供的负载金-功能化多孔TiO2薄膜是一种高效的激光解吸电离(LDI)材料，制备方法简单可控，该薄膜基底材料具有规则的多孔结构，强紫外吸收能力，高灵敏度，低背景噪声，良好的重现性和耐盐性和定量能力，是表面辅助激光解吸
离子化质谱实现对低分子量化合物分析的优选基底。该基底材料消除了传统有机基质的背景干扰，可快速、高效地实现在正负离子模式下对分子量小于1000Dalton化合物如氨基酸、脂肪酸、生物碱、黄酮、
葡萄糖、多巴胺以及生物样品中的一些小分子代谢物的准确分析，同时可印迹花瓣间接成像分析花瓣组织中各种次生代谢物的分布。
附图说明
[0023] 图1为负载金-功能化多孔TiO2薄膜表面的扫描电镜影像；
[0024] 图2为负载金-功能化多孔TiO2薄膜表面
接触角分析图；
[0025] 图3为负载金-功能化多孔TiO2薄膜作为基底分析氨基酸混合物的质谱图，其中，*为背景干扰峰；
[0026] 图4为负载金-功能化多孔TiO2薄膜作为基底分析脂肪酸混合物的质谱图其中，*为背景干扰峰；
[0027] 图5为负载金-功能化多孔TiO2薄膜(b图)与传统基质CHCA(a图)分析生物碱混合物的质谱图；其中，*为背景干扰峰；
[0028] 图6为用负载金-功能化多孔TiO2薄膜检测血清中葡萄糖的质谱图，内插图为葡萄糖的标定曲线；
[0029] 图7为长春花中长春质碱(m/z 337.20)和
芦丁(m/z 609.10)的质谱成像图。
具体实施方式
[0030] 下面结合附图和
实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
[0031] 实施例1：
[0032] 一种负载金-功能化多孔TiO2薄膜，通过如下步骤制备：
[0033] 步骤S1，制备前体溶液：向反应器中加入5mL的钛酸四丁酯和20mL的无水乙醇，磁力搅拌5min充分混合以形成前体溶液，并将ITO玻璃放置在反应器中；
[0034] 步骤S2，制备TiO2薄膜：向剧烈搅拌的前体溶液中依次加入10mL浓度为50mg/mL的十六烷基三甲基溴化铵乙醇溶液和1％(V/V)的超纯水，冰浴2h后依次用无水乙醇和水彻底冲洗修饰后的ITO玻璃，在80℃下老化2h，在ITO上形成TiO2薄膜(TDF/ITO)；
[0035] 步骤S3，制备功能化多孔TiO2薄膜：将TDF/ITO浸入0.1M HCl乙醇溶液中搅拌15min以制备多孔TiO2薄膜(PTDF/ITO)，用无水乙醇彻底冲洗PTDF/ITO，在80℃下老化2h后，将PTDF/ITO浸入含有1％(V/V)N-三甲氧基甲硅烷基丙基-N,N,N-三甲基氯化铵的丙酮溶液中，在常温下磁力搅拌2h，然后依次用丙酮、乙醇和水冲洗，在80℃下老化2h；
[0036] 步骤S4，负载金：将功能化的PTDF/ITO浸入5mM HAuCl4水溶液中，在常温下搅拌8h，用超纯水冲洗，并浸入0.1M NaBH4水溶液中冰浴2h，最后在80℃老化2h即得。图1为负载金-功能化多孔TiO2薄膜表面的扫描电镜影像。图2为负载金-功能化多孔TiO2薄膜表面的接触角分析图，可以看出薄膜表面疏水。
[0037] 其中，ITO玻璃清洗后使用，清洗过程如下：首先将ITO玻璃用1M NaOH水溶液浸泡过夜，然后在丙酮、乙醇和超纯水中超声处理15min，最后用超纯水彻底洗涤并用N2干燥。
[0038] 上述步骤中的搅拌速度均为1500r/min。
[0039] 实施例2：
[0040] 实施例1制备的负载金-功能化多孔TiO2薄膜表面辅助激光解吸离子化质谱在正离子模式下分析氨基酸，具体操作如下：
[0041] 将17种氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、
色氨酸)混合配成1mM的溶液，取0.2μL氨基酸混合溶液滴加到负载金-功能化多孔TiO2薄膜表面，待干燥后在正离子模式下进行表面辅助激光解吸离子化质谱分析(质谱图如图3所示)。从图3中可以发现，检测到17种氨基酸，低背景干扰且表现出较高的
信噪比(S/N)。结果表明，该基底材料可作为SALDI基底用于氨基酸小分子的分析。
[0042] 实施例3：
[0043] 实施例1制备的负载金-功能化多孔TiO2薄膜表面辅助激光解吸离子化质谱在负离子模式下分析脂肪酸，具体操作如下：将14种脂肪酸(十一酸、十二酸、十三酸、十四酸、十五酸、棕榈酸、十七酸、
硬脂酸、十九酸、花生酸、二十一酸、二十二酸、二十三酸、二十四酸)混合配成1mM的溶液，取0.2μL脂肪酸混合溶液滴加到负载金-功能化多孔TiO2薄膜表面，待干燥后在负离子模式下进行表面辅助激光解吸离子化质谱分析(质谱图如图4所示)。从图4中可以发现，检测到14种脂肪酸，低背景干扰且表现出较高的信噪比。结果表明，该基底材料可作为SALDI基底用于脂肪酸小分子的分析。
[0044] 实施例4：
[0045] 实施例1制备的负载金-功能化多孔TiO2薄膜和传统基质CHCA在正离子模式下分析生物碱，具体操作如下：称量10mg CHCA溶于1ml的乙腈水溶液(V/V，6:4)，将7种生物碱(葫芦巴碱、麻黄碱、金雀花碱、苦豆碱、氧化苦参碱、东莨菪碱、消旋山莨菪碱)混合配成1mM的溶液，取0.2μL生物碱混合溶液滴加到负载金-功能化多孔TiO2薄膜表面，然后再取0.2μL生物碱混合溶液和0.2μL CHCA基质溶液依次滴加到普通ITO玻璃表面，待干燥后在正离子模式下进行激光解吸离子化质谱分析(质谱图如图5所示)。从图5中可以发现，与CHCA相比，负载金-功能化多孔TiO2薄膜基底检测到7种生物碱，低背景干扰且表现出较高的信噪比，而传统的CHCA基质不仅没有检测到目标生物碱，还检测到了强
干扰信号。结果表明，该基底材料可作为SALDI基底用于生物碱小分子的分析。
[0046] 实施例5：
[0047] 实施例1制备的负载金-功能化多孔TiO2薄膜重现性考察，具体操作如下：分别配制1.0mM浓度的多巴胺(Dop)、葡萄糖(Glu)、组氨酸(His)、硬脂酸(SA)，取0.2μL四种标准品溶液依次滴加到负载金-功能化多孔TiO2薄膜表面进行表面辅助激光解吸离子化质谱分析。每个样品收集10个数据，计算每种物质检测信噪比的相对标准偏差(RSD)(如表1所示)。从表1中可以发现，可以看出负载金-功能化多孔TiO2薄膜具有良好的重现性。
[0048] 表1负载金-功能化多孔TiO2薄膜重现性考察表
[0049]
[0050] 实施例6：
[0051] 使用实施例1制备的负载金-功能化多孔TiO2薄膜定量检测老鼠血清中的葡萄糖，具体操作如下：在不同浓度的葡萄糖标准品溶液(0.5，1，3，5，7，9mM)和5mM的葡萄糖同位素溶液中得到葡萄糖标定曲线。收集SD大鼠的血液样品，室温静置2h，4℃下离心10min，4000r/min，收集上清液即为血清。将同位素D-葡萄糖-1-13C加入到血清中，最终的浓度为
5mM，再加入乙腈(乙腈：血清：1:3，V/V)进行简单预处理，去除血清样品大部分高丰度蛋白，然后涡旋5min，4℃下离心10min，13000r/min，收集血清进行SALDI-MS分析。图6为用负载金-功能化多孔TiO2薄膜检测血清中葡萄糖的质谱图以及葡萄糖标定曲线。根据葡萄糖标定曲线计算大鼠血清中的葡萄糖含量，并用葡萄糖检测
试剂盒进行比较，进一步验证方法的可靠性。表1为用不同方法测定三只大鼠血清中的葡萄糖。以上结果表明该方法测定的老鼠血清中的葡萄糖含量与葡萄糖试剂盒测定的结果基本一致。
[0052] 表2用不同方法测定三只大鼠血清中的葡萄糖
[0053]
[0054] 实施例7：
[0055] 使用实施例1制备的负载金-功能化多孔TiO2薄膜印迹花瓣间接成像分析次生代谢物。具体操作如下：解剖鲜花，将花瓣上表面压在负载金-功能化多孔TiO2薄膜上，在花瓣背面依次放无尘纸以及普通玻璃，用
胶带固定，并通过使用手动虎钳压力机在45×100mm的区域上施加压力5分钟来对花朵进行手动压印。压印后，立即用
镊子将组织残留物从基底上去除，在空气中干燥后，即可对花瓣印迹成像分析。图7为长春花中长春质碱(m/z 337.20)和芦丁(m/z609.10)的质谱成像图，可以看出，长春质碱在整片花瓣均有分布，但主要分布在花瓣中心
位置，芦丁主要分布在花瓣中心部分，其他部位含量极低，因此该基底可用于对花瓣印迹检测花瓣中的一些次生代谢物。
[0056] 本发明提供的负载金-功能化多孔TiO2薄膜基底材料制备过程中无需高温，实验操作简单方便。该薄膜表面疏水，有利于浓缩高样品量的低丰度样品，提高灵敏度，还具有良好的耐盐性和重现性，可以定量检测生物样品中的一些小分子代谢物，如血清中的葡萄糖。
[0057] 该基底材料无需基质，消除基质存在的背景干扰，可实现对低分子量化合物快速分析。
[0058] 该基底材料可应用于正负离子双模式下检测低分子量化合物。
[0059] 该基底材料可实现对花瓣印迹，间接成像花瓣组织中各种次生代谢物的分布。对长春花进行花瓣印迹，检测到生物碱类、黄酮类以及糖类以及相关代谢物。
[0060] 上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。
