[0001] 技术领域：
[0002] 本
发明属于
生物饲料领域中的
微生物饲料添加剂技术领域，涉及一种以产
纤维素酶为主要目的的饲料用益生菌制剂的液态发酵生产方法。
[0003] 背景技术：
[0004] 纤维素酶作为一种绿色饲料添加剂，能将饲料中的纤维素降解成可消化吸收的还原糖（如：
二糖或
葡萄糖），提高饲料利用率。添加纤维素酶可补充饲养动物内源酶的不足，溶解
植物细胞壁促进吸收；减低动物胃肠道黏稠度，消除
抗营养因子；降低有害微生物的附着生长；维持小肠绒毛形态完整等。因此纤维素酶作为一种高活性生物添加剂在动物饲料领域有着广阔的应用前景。
[0005] 益生菌指“当摄入一定量时能对宿主健康有作用的微生物活体”。动物饲料中添加益生菌可以（：1）维持消化道菌群平衡，
预防和
治疗菌群失调症；（2）通过有益菌群对致病菌的生物拮抗作用降低肠道和
粪便中的致病菌的含量；（3）提高
机体体液免疫和细胞免疫
水平，抵抗病原体的感染（；3）参与菌群生存竞争，消除毒素和有害代谢产物（；4）产生多种消化酶，改善机体代谢，促进机体生长。
[0006] 枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌属于农业部《饲料添加剂品种目录》（2013）规定的益生菌添加范畴，其耐酸、耐盐、耐高温、耐
挤压，并代谢产生多种酶类和杆菌肽、大环脂、环脂、类
噬菌体颗粒等多种抗菌物质，是一类较好的饲用益生菌来源。酿酒
酵母也是农业部《饲料添加剂品种目录》（2013）所允许使用的饲料添加剂。益生芽孢杆菌和
酿酒酵母类产品具有无毒
副作用、无污染和不产生抗药性等有点，是一种绿色的饲料添加剂。
[0007] 芽孢杆菌能产纤维素酶等多种酶类（一种利用芽孢杆菌制备纤维素酶的方法，中国
专利：CN 102766615 B；产纤维素酶菌株、纤维素酶及其生产发酵培养的方法，中国专利：CN102586133A），但上述文献均为采用单一菌生产纤维素酶的方法，未提及发酵后微生物菌体与纤维素酶联合应用尤其是作为饲料添加剂的有效方法。发明专利
申请书
201110389177.1和201110268139.0涉及多菌发酵生产饲用益生菌的方法，但都采用相对简单的固态堆积发酵工艺，培养过程粗放，易污染杂菌，不利于产品
质量控制，且非侧重纤维素酶产品。发明专利申请书201310422513.7涉及包含多种酶的益生菌饲料生产方法，但是酶来源于生产过程中人为的额外添加，而不是由菌株自身在发酵过程中产生，这相当于变相的增加生产成本。
[0008] 发明内容：
[0009] 本发明的目的在于克服上述已有技术的不足而提供一种具有高活性的纤维素酶，兼有多种消化酶活
力，饲用纤维素酶制剂与益生菌制剂两大功能合二为一，避免环境污染，且降低后续酶制剂的回收纯
化成本；效率高，增加动物对饲料产品的适口性，有助于动物对饲料营养的吸收，适宜大规模生产与推广，对畜禽养殖业的健康养殖具有良好推动作用的主产纤维素酶饲用益生菌制剂的液态发酵生产方法。
[0010] 本发明的可以通过如下措施来达到：一种主产纤维素酶饲用益生菌制剂的液态发酵生产方法，其特征在于其包括如下步骤：
[0011] 1）发酵菌种的制备：菌种为芽孢杆菌和酿酒酵母；将试管斜面保存的菌种转接活化培养基，28-32℃的旋转摇床上培养20-35小时至菌种的对数生长期；所述的芽孢杆菌的活化培养基的配方组分（g/L）：酵母粉 5-8，蛋白胨 10-16，
氯化钠 6-12，pH 7.0；所述的酿酒酵母的活化培养基的配方组分（g/L）：酵母粉 2-6，蛋白胨 10-15，葡萄糖 20-30，pH 6.5；活化培养基在使用前均在115℃下灭菌20分钟；
[0012] 2）发酵用液体培养基的制备：
[0013] 发酵用液体培养基的配方组分（g/L）为：
啤酒糟的干燥
粉碎物 5-20，玉米面 40-60，葡萄糖 10-20，蛋白胨 10-20，酵母粉 5-10，
磷酸氢二
钾 3-6，磷酸二氢钠 3-6，七水
硫酸镁 0.5-2，pH 6.5—7.5；
[0014] 3）主产纤维素酶的饲用益生菌混合发酵：
[0015] 采用步骤2所述的液体发酵培养基进行阶段式混合菌种发酵；首先按照5—10%（v/v）的单菌接种量接入芽孢杆菌的活化菌种，通过
发酵罐转速和无菌空气流量的调节使溶解
氧控制在10%以上；该发酵过程以增加益生芽孢杆菌数目和产纤维素酶为主要目标；
[0016] 上述发酵培养阶段进行20-40小时后，添加按照6-15%（v/v）的接种量接入酿酒酵母活化菌种，同时通过流加补料方式补充葡萄糖至终浓度为2-5g/L，通过发酵罐转速和无菌空气流量的调节使溶解氧控制在2%以上；该过程以培养酿酒酵母和产纤维素酶为主要目标，从而增加产品的
风味和活菌数目；待酿酒酵母发酵培养8-12小时后终止发酵过程；
[0017] 4）辅料添加：
[0018] 发酵终止后，加入辅料增加固形物含量，辅料添加量为发酵液体积的20—50%，并搅拌均匀；辅料组成（按重量比计算）：玉米面20—30%，
酒糟粉碎物30—50%，麸皮粉碎物20—50%；
[0020] 将4）步骤处理后的发酵液，在出风
温度为80—85℃下，经
喷雾干燥，包装获得成品。
[0021] 为了进一步实现本发明的目的，所述的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌的至少两种。
[0022] 为了进一步实现本发明的目的，所述的芽孢杆菌从中国农业微生物菌种保藏中心（ACCC）获得，其中枯草芽孢杆菌是ACCC 编号为03291、03282、03338、04303、03317中的一种；地衣芽孢杆菌是ACCC 编号为03314、02367、05186中的一种；短小芽孢杆菌是ACCC 编号为02757、04309、04305、04301、04297中的一种。为了进一步实现本发明的目的，所述的酿酒酵母从中国农业微生物菌种保藏中心（ACCC）获得，是ACCC 编号为20157、20168、20251、20064中的一种。
[0023] 本发明所提及的产品符合中华人民共和国农业行业标准NY/T 1444-2007规定的微生物饲料添加剂技术指标。
[0024] 本发明产品中益生菌活菌数目利用显微计数法和平板涂布法测定，纤维素酶活力按照中华人民共和国国家标准GB/T 23881-2009中介绍方法测定，以每克产品每分钟
水解滤纸条生成1微克葡萄糖的量为1个活力单位（U）。
[0025] 本发明同已有技术相比可产生如下积极效果：1）采用益生菌菌种生产纤维素酶制剂，产品强调益生菌功能和纤维素酶促进饲料利用率的功能并重，发酵菌种全部使用益生菌，依靠益生芽孢杆菌自身分泌纤维素酶的特性，发酵生产饲用益生菌的同时生产纤维素酶。发酵后微生物菌体可以作为益生菌制剂与纤维素酶一起作为饲料添加剂；2）发酵生产过程中采用全封闭发酵装置避免杂菌污染进而导致产品质量下降的问题，有别于传统的益生菌粗放生产方式；3）发酵后菌液完全利用，几乎可以实现零排放，避免环境污染，且降低后续酶制剂的回收纯化成本；4）多菌混合发酵使得纤维素酶系更加均衡，降解利用饲料
生物质的效率更高；5）在发酵后期通过接种培养酿酒酵母方式进一步增加益生菌数目和产品风味，增加动物对饲料产品的适口性；6）本发明产品中除含有益生菌和纤维素酶外，还有一定的蛋白酶、
淀粉酶和半纤维素酶，有助于动物对饲料营养的吸收。通过本发明方案的实施，可以解决目前饲料酶制剂和益生菌制剂生产成本高且品质不稳定的问题，能够明显提高经济与社会效益。
[0026] 具体实施方式：
[0027] 以下结合
实施例对本发明进行进一步说明，本发明的保护范围不受实施例的限制。
[0028] 芽孢杆菌从中国农业微生物菌种保藏中心（ACCC）获得，其中枯草芽孢杆菌从中国农业微生物菌种保藏中心（ACCC）获得，是ACCC 编号为03291、03282、03338、04303、03317中的一种；
[0029] 地衣芽孢杆菌从中国农业微生物菌种保藏中心（ACCC）获得是ACCC 编号为03314、02367、05186中的一种；
[0030] 短小芽孢杆菌从中国农业微生物菌种保藏中心（ACCC）获得是ACCC 编号为02757、04309、04305、04301、04297中的一种；
[0031] 酿酒酵母从中国农业微生物菌种保藏中心（ACCC）获得，是ACCC 编号为20157、20168、20251、20064中的一种。
[0032] 实施例1
[0033] 一种主产纤维素酶饲用益生菌制剂的液态发酵生产方法，包括如下步骤：
[0034] （1）发酵菌种的制备：菌种为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和酿酒酵母。将试管斜面保存的菌种转接活化培养基，28℃的旋转摇床上培养35小时至菌种的对数生长期。芽孢杆菌的活化培养基（g/L）：酵母粉 5，蛋白胨 10，氯化钠 10，pH 7.0；酿酒酵母的活化培养基（g/L）：酵母粉 2，蛋白胨 10，葡萄糖 20，pH 6.5；活化培养基在使用前均在115℃下灭菌20分钟；
[0035] （2）发酵用液体培养基（g/L）：啤酒糟的干燥粉碎物 10，玉米面 50，葡萄糖 20，蛋白胨 12，酵母粉 6，
磷酸氢二钾 4，磷酸二氢钠 4，七水
硫酸镁 1，pH7.3；
[0036] （3）主产纤维素酶的饲用益生菌混合发酵
[0037] 采用步骤（2）所述的液体发酵培养基进行阶段式混合菌种发酵；采用10L发酵罐发酵，按照5%（v/v）的接种量接入地衣芽孢杆菌，发酵8小时后再按5%（v/v）接种量接入枯草芽孢杆菌。通过发酵罐转速和无菌空气流量的调节使溶解氧控制在10%以上；
[0038] 上述发酵培养阶段进行32小时后，添加按照6%（v/v）的接种量接入酿酒酵母活化菌种，同时通过流加补料方式补充葡萄糖至终浓度为4g/L，通过发酵罐转速和无菌空气流量的调节使溶解氧控制在2%以上，继续持续发酵10小时后终止发酵过程；
[0039] （4）辅料添加：发酵终止后，加入辅料增加固形物含量，辅料添加量为发酵液体积的30%，并搅拌均匀。辅料组成（按重量比计算）：玉米面20%，酒糟粉碎物50%，麸皮粉碎物30%；
[0040] （5）产品干燥包装：将（4）步骤处理后的发酵液，出风温度在 82℃下经喷雾干燥，包装后即为主产纤维素酶的饲用益生菌制剂。
[0041] 经检测，产品有效活菌数为4.2亿个/克，纤维素酶活力为291.78 活力单位/克。
[0042] 实施例2：
[0043] 一种主产纤维素酶饲用益生菌制剂的液态发酵生产方法，包括如下步骤：
[0044] （1）发酵菌种制备：发酵菌种为短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和酿酒酵母。将试管斜面保存的菌种转接活化培养基，32℃的旋转摇床上培养20小时至菌种的对数生长期。芽孢杆菌的活化培养基（g/L）：酵母粉 6，蛋白胨 12，氯化钠 8，pH 7.0；酿酒酵母的活化培养基（g/L）：酵母粉 4，蛋白胨 10，葡萄糖 25，pH 6.5；活化培养基在使用前均在115℃下灭菌20分钟；
[0045] （2）发酵用液体培养基（g/L）：啤酒糟的干燥粉碎物20，玉米面 40，葡萄糖 10，蛋白胨 15，酵母粉 5，磷酸氢二钾 5，磷酸二氢钠 5，七水硫酸镁 1.2，pH7.5；
[0046] （3）主产纤维素酶的饲用益生菌混合发酵
[0047] 采用步骤（2）所述的液体发酵培养基进行阶段式混合菌种发酵；采用10L发酵罐发酵，按照8%（v/v）的单菌接种量接入地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌同时接入，通过发酵罐转速和无菌空气流量的调节使溶解氧控制在10%以上；
[0048] 上述发酵培养阶段进行20小时后，添加按照12%（v/v）的接种量接入酿酒酵母活化菌种，同时通过流加方式补充葡萄糖至终浓度为2g/L，通过发酵罐转速和无菌空气流量的调节使溶解氧控制在3%以上，继续持续发酵8小时后终止发酵过程；
[0049] （4）辅料添加：发酵终止后，加入辅料增加固形物含量，辅料添加量为发酵液体积的40%，并搅拌均匀。辅料组成（按重量比计算）：玉米面30%，酒糟粉碎物30%，麸皮粉碎物50%；
[0050] （5）产品干燥包装：将（4）步骤处理后的发酵液，出风温度在 80℃下经喷雾干燥，包装后即为主产纤维素酶的饲用益生菌制剂。
[0051] 经检测，产品有效活菌数为7.1亿个/克，纤维素酶活力为452.6 活力单位/克。
[0052] 实施例3：
[0053] 一种主产纤维素酶饲用益生菌制剂的液态发酵生产方法，包括如下步骤：
[0054] （1）发酵菌种制备：发酵菌种为枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和酿酒酵母。将试管斜面保存的菌种转接活化培养基，30℃的旋转摇床上培养25小时至菌种的对数生长期。芽孢杆菌的活化培养基（g/L）：酵母粉 8，蛋白胨 12，氯化钠 6，pH 7.0；酿酒酵母的活化培养基（g/L）：酵母粉 6，蛋白胨 12，葡萄糖 25，pH 6.5；活化培养基在使用前均在115℃下灭菌20分钟；
[0055] （2）发酵用液体培养基（g/L）：啤酒糟的干燥粉碎物 12，玉米面 55，葡萄糖 15，蛋白胨 10，酵母粉 8，磷酸氢二钾 3，磷酸二氢钠 3，七水硫酸镁 2，pH6.5；
[0056] （3）主产纤维素酶的饲用益生菌混合发酵
[0057] 采用步骤（2）所述的液体发酵培养基进行阶段式混合菌种发酵；采用50L发酵罐发酵，按照10%（v/v）的接种量接入短小芽孢杆菌，发酵8小时后再按5%（v/v）接种量接入枯草
