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生物样品中维生素A的液相串联质谱分析方法

阅读：892发布：2024-02-17

专利汇可以提供生物样品中维生素A的液相串联质谱分析方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及生物样品中维生素A的液相串联质谱分析方法，包括步骤：提供一种待测样品、沉淀剂和萃取剂；将待测样品和沉淀剂进行混合，使待测样品中的蛋白质发生沉淀；从而形成第一固液混合液；用萃取剂对第一固液混合液进行萃取处理，获得含有维生素A的萃取相；干燥萃取相，得到干燥的维生素A样品；采用有机溶剂复溶所述的维生素A样品，并进行液相串联质谱检测；基于标准曲线得到生物体样品中维生素A的分析结果。本发明的分析方法可以应用于临床采集的人血清样本中维生素A的定量检测，为确定该化合物在体内含量变化与生理功能、疾病的关系提供了有力支持。，下面是生物样品中维生素A的液相串联质谱分析方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种对待测样品中的维生素A进行液相串联质谱的分析方法，其特征在于，包括步骤：
(1)提供一种待测样品、沉淀剂和萃取剂；
(2)将待测样品和沉淀剂进行混合，使待测样品中的蛋白质发生沉淀；从而形成第一固液混合液；
(3)用萃取剂对第一固液混合液进行萃取处理，获得含有维生素A的萃取相；
(4)干燥萃取相，得到干燥的维生素A样品；和
(5)采用有机溶剂复溶所述的维生素A样品，并进行液相串联质谱检测；和(6)基于标准曲线得到待测样品中维生素A的分析结果。
2.如权利要求1中所述的分析方法，其特征在于，所述的沉淀剂选自下组：乙腈、甲醇、或其组合。
3.如权利要求1中所述的分析方法，其特征在于，所述的待测样品为血清或血浆。
4.如权利要求1中所述的分析方法，其特征在于，所述的沉淀剂的体积为待测样品体积的2～4倍，较佳地，为2.5～3.5倍，更佳地，为3倍。
5.如权利要求1中所述的分析方法，其特征在于，所述的萃取剂为包含4～8个碳原子的烷烃，较佳地，为己烷，更佳地，为正己烷。
6.如权利要求1中所述的分析方法，其特征在于，采用选自下组的有机溶剂复溶所述的维生素A样品：甲醇、乙腈、或其组合；较佳地，为甲醇。
7.如权利要求1中所述的分析方法，其特征在于，所述的分析方法还包括标准曲线的绘制，包括步骤如下：
(i)提供标准品溶液、沉淀剂和萃取剂，所述的标准品溶液含有已知浓度的维生素A标准品和已知浓度的维生素A同位素内标；
(i i)将标准品溶液和沉淀剂进行混合，使标准品溶液中的蛋白质发生沉淀；从而形成第二固液混合液；
(iii)用萃取剂对第二固液混合液进行萃取处理，获得含有维生素A标准品的萃取相；
(iv)干燥萃取相，得到干燥的维生素A标准品；和
(v)采用有机溶剂复溶所述的维生素A标准品，并进行液相串联质谱检测，从而获得标准曲线。
8.如权利要求7中所述的分析方法，其特征在于，所述的标准品溶液至少为2组，且含有已知的不同浓度的维生素A标准品。
9.如权利要求7中所述的分析方法，其特征在于，所述的标准品溶液含有人血清白蛋白和生理盐水。
10.如权利要求1中所述的分析方法，其特征在于，所述的液相串联质谱检测中，采用APCI离子源。

说明书全文

生物样品中维生素A的液相串联质谱分析方法

技术领域

[0001] 本发明属于化学分析检测领域，具体地，本发明涉及生物样本中维生素A的纯化提取并利用液相串联质谱进行检测的方法，本发明的方法具有快速、高效、灵敏的特点，为确定该化合物在体内含量变化与生理功能、疾病的关系奠定基础。

背景技术

[0002] 维生素A，又称为视黄醇及抗干眼维生素，顾名思义是具有人体维持正常视觉功能不可缺少的营养素。除此之外，维生素A能够维护上皮组织细胞的健康和促进免疫球蛋白的合成、维持骨骼正常生长发育、促进生长与生殖抑制肿瘤生长，是人和动物维持机体正常生理功能保持健康所必需的微量有机物，在人体生长、代谢、发育过程中起着重要的作用。维生素A通常从食物获得，体内储量很少。但是当人体出现某些生理、病理变化时，维生素A的摄入量会减少，或消耗量增加，从而引起维生素缺乏，反之，某些生理变化会导致维生素在体内积聚，故临床上人体内维生素A含量偏离正常值表现为维生素缺乏症或维生素过多症。为了监测人体内维生素A的含量变化，人们根据其特性建立了众多检测方法，如高效液相色谱法(Petr,S.,Dalibor,S.,Martin,O.,Radek,S.,Petr,S.Cur.Anal.Chem.2009,5(4),
311-315)、毛细管电泳荧光激发光谱法(Ma,Y.,Wu,Z.,Furr,H.C.,Lammi-Keefe,C.,Craft,N.E.J.Chrom.B:Biomed.Appl.1993,616(1),31-37.)和化学发光法(Asgher,M.,Yaqoob,M.,Waseem,A.,Nabi,A.Luminescence 2011,26(6),416-423)等，这些方法在检测营养品中维生素A有效成分，以及研究维生素A代谢通路过程都有着诸多应用。但是，在临床检验过程中，由于人体样本来源复杂，受干扰因素大，简单的光谱法容易受到样本本身成分颜色的干扰，往往给出假阳性或者假阴性的结果，难以实现在临床应用中快速、准确、特异性地检测维生素A。

[0003] 因此，本领域迫切需要一种快速准确检测维生素A化合物的分析方法。为了满足质谱检测，避免样本中的杂质污染设备，需要对人体样本进行前处理，本发明提供了一种优化的生物样本前处理方法，结合液相串联质谱检测方法，实现了对临床生物样本中维生素A的含量测定。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种快速精准的检测维生素A的方法。

[0005] 本发明的第一方面提供了一种对待测样品中的维生素A进行液相串联质谱的分析方法，包括步骤：

[0006] (1)提供一种待测样品、沉淀剂和萃取剂；

[0007] (2)将待测样品和沉淀剂进行混合，使待测样品中的蛋白质发生沉淀；从而形成第一固液混合液；

[0008] (3)用萃取剂对第一固液混合液进行萃取处理，获得含有维生素A的萃取相；

[0009] (4)干燥萃取相，得到干燥的维生素A样品；和

[0010] (5)采用有机溶剂复溶所述的维生素A样品，并进行液相串联质谱检测；和[0011] (6)基于标准曲线得到生物体样品中维生素A的分析结果。

[0012] 在另一优选例中，所述步骤(3)中还包括对所述的第一固液混合液进行离心处理。

[0013] 在另一优选例中，所述步骤(3)中对所述的第一固液混合液进行离心处理的离心力为10000～15000g。

[0014] 在另一优选例中，所述步骤(3)中对所述的第一固液混合液进行离心的时间为3～8min。

[0015] 在另一优选例中，所述步骤(4)中的干燥方法为氮气吹扫。

[0016] 在另一优选例中，所述的沉淀剂选自下组：乙腈、甲醇、或其组合。

[0017] 在另一优选例中，所述的沉淀剂为乙腈。

[0018] 在另一优选例中，所述的待测样品为血清或血浆。

[0019] 在另一优选例中，所述的待测样品为人血清或血浆。

[0020] 在另一优选例中，所述的沉淀剂的体积为生物体样品体积的2～4倍，较佳地，为2.5～3.5倍，更佳地，为3倍。

[0021] 在另一优选例中，所述的萃取剂为包含4～8个碳原子的烷烃，较佳地，为己烷，更佳地，为正己烷。

[0022] 在另一优选例中，采用选自下组的有机溶剂复溶所述的维生素A样品：甲醇、乙腈、或其组合；较佳地，为甲醇。

[0023] 在另一优选例中，所述的分析方法还包括标准曲线的绘制，包括步骤如下：

[0024] (i)提供一标准品溶液、沉淀剂和萃取剂，所述的标准品溶液含有已知浓度的维生素A标准品和已知浓度的维生素A同位素内标；

[0025] (ii)将标准品溶液和沉淀剂进行混合，使标准品溶液中的蛋白质发生沉淀；从而形成第二固液混合液；

[0026] (iii)用萃取剂对第二固液混合液进行萃取处理，获得含有维生素A标准品的萃取相；

[0027] (iv)干燥萃取相，得到干燥的维生素A标准品；和

[0028] (v)采用有机溶剂复溶所述的维生素A标准品，并进行液相串联质谱检测，从而获得标准曲线。

[0029] 在另一优选例中，所述的标准品溶液为人血清白蛋白溶液

[0030] 在另一优选例中，所述步骤(ii)中的沉淀剂为乙腈。

[0031] 在另一优选例中，所述步骤(iii)中的萃取剂为正己烷。

[0032] 在另一优选例中，所述步骤(v)中的有机溶剂为甲醇。

[0033] 在另一优选例中，所述的维生素A标准品至少为2组，且含有已知的不同浓度的维生素A。

[0034] 在另一优选例中，所述的维生素A标准品浓度选自下组：0,0.05,0.1,0.2,0.5,1,2.5,或5μg/mL。

[0035] 在另一优选例中，所述的标准品溶液含有人血清白蛋白和生理盐水。

[0036] 在另一优选例中，所述的标准品溶液中人血清白蛋白浓度为30～50mg/mL。

[0037] 在另一优选例中，所述的液相串联质谱检测中，采用APCI离子源。

[0038] 在另一优选例中，所述的液相串联质谱检测中，采用乙腈和水混合液作为流动相。

[0039] 在另一优选例中，所述的液相串联质谱检测中，采集时间为3min。

[0040] 在另一优选例中，所述的液相串联质谱检测中，采用正离子扫描、多反应监测模式。

[0041] 在另一优选例中，所述的液相串联质谱检测中，同时扫描多个离子通道。

[0042] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明

[0043] 图1.实施例1中维生素A含量分析主要步骤示意图。

[0044] 图2.维生素A标准曲线示例。

[0045] 图3.不同溶剂作为萃取剂时磷脂信号的影响。

具体实施方式

[0046] 本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现了一种高效快速的生物样品中维生素A的液相串联质谱分析方法。本发明的分析方法采用乙腈作为血清生物样品中蛋白质的沉淀剂，采用正己烷作为维生素A的萃取剂。由于乙腈和正己烷的相容性差，使得更加高效地提取维生素A。在此基础上，完成了本发明。

[0047] 本发明的分析方法

[0048] 本发明提供了一种基于液相串联质谱定量检测生物样本中维生素A的方法，可以用于血清或血浆样本中维生素A化合物的分析检测。此方法包括下列步骤：

[0049] a)生物样本中维生素A的释放和蛋白质的除去；

[0050] b)利用液液萃取选择性地提取生物样本中的维生素A；

[0051] c)将提取后溶剂吹干复溶用于LC-MS/MS定量检测维生素A。

[0052] LC-MS/MS分析所用的优选条件是：液相采用乙腈(含0.1％甲酸)作为有机相，水(0.1％甲酸)作为水相，总采集时间3min，大大提高了检测通量；质谱采用APCI离子源，有效地降低了人血清对于维生素A化合物的基质效应，在正离子模式下采集，利用多反应监测同时扫描目标化合物维生素A及其同位素内标(维生素A-d5)，根据同位素内标与待测物离子化效率类似的特性，由待测物与内标的峰面积比对应二者的浓度关系，计算待测物浓度。由于维生素A为内源性化合物，故本发明采用人血清白蛋白作为空白基质，通过添加已知梯度浓度的一系列维生素A标准溶液，得到标准曲线，根据采集得到的维生素A及其内标的相对峰面积代入标准曲线线性方程，计算得到生物样本中维生素A的浓度值。计算方法如下：按照(1)～(4)检测获得的标准曲线(如y＝ax+b)计算人血清中的维生素A浓度，C样品为血清样本中维生素A含量，y为维生素A化合物相对于其同位素
内标的峰面积比,b为线性方程截距，a为线性方程斜率。

[0053] 本发明在血清或血浆样本中维生素A化合物的分析检测中有以下几个优点：首先，本发明采用了3倍于样本体积的乙腈沉淀蛋白，沉淀蛋白效果优于甲醇，更有利于维生素A的释放，且乙腈与后续液液萃取的溶解性差，更有利于选择性地提取维生素A。

[0054] 其次，在液液萃取步骤，采用正己烷作为提取溶剂，能够有效地与沉淀蛋白溶剂和生物样本体系分层，维生素A为脂溶性维生素，选择性地分配于正己烷的有机相中，排除样本中其他杂质的干扰，更有效地排除了不利于质谱检测的样本中高浓度的盐和蛋白。

[0055] 在液相条件下，经过优化，乙腈作为流动相时，分离效果优于甲醇，排除了磷脂的干扰，因此，流动相洗脱时间缩短至3min，可以达到高通量检测的目的。

[0056] 在质谱检测中，虽然在纯溶剂条件下，APCI离子源的信号弱于传统的ESI源信号，但是由于人血样本中的基质干扰，ESI源中，样本中的维生素A的信号明显低于溶剂体系中的信号，表现出明显的基质效应。而本发明采用了APCI离子源由于受到样本中物质干扰因素被削弱，可以消除生物样本的基质效应，更利于对生物样本的准确定量。

[0057] 本发明的分析方法的具体实施步骤

[0058] 本发明的方法通过以下具体步骤进行，包括标准曲线的绘制(步骤(1)～(4))和生物样品中维生素A浓度的检测(步骤(5)～(8))：

[0059] (1)取含已知浓度标准品维生素A(0,0.05,0.1,0.2,0.5,1,2.5,5μg/mL)的人血清白蛋白溶液(40mg/mL蛋白的生理盐水溶液)100μL，加入300μL(3倍于样本体积)乙腈(含维生素A同位素内标0.5μg/mL)，用于沉淀蛋白，离心13000g*5min；

[0060] (2)在(1)获得的蛋白沉淀后样本中加入1mL正己烷，用于液液萃取，充分振荡1min使两相接触均匀，脂溶性较强的维生素A化合物进入优先进入有机相正己烷中，离心13000g*5min，有助于水相及有机相分层；

[0061] (3)从(2)获得的离心分层的两相中，吸取上层有机相900μL于96孔板中，并在室温下用温和氮气吹干，得到干燥的样品附于瓶底；

[0062] (4)用100μL甲醇溶液复溶(3)获得的吹干样品，700rpm充分摇匀10min，进样10μL液相串联质谱检测，获得标准曲线；

[0063] (5)取人血清样本100μL，加入300μL乙腈(含维生素A同位素内标0.5μg/mL)，用于沉淀蛋白，离心13000g*5min；

[0064] (6)在(5)获得的蛋白沉淀后样本中加入1mL正己烷，用于液液萃取，充分振荡使两相接触均匀，脂溶性较强的维生素A化合物进入优先进入有机相正己烷中，离心13000g*5min，有助于水相及有机相分层；

[0065] (7)从(6)获得的离心分层的两相中，吸取上层有机相900μL，并用温和氮吹，得到干燥的样品附于瓶底；

[0066] (8)用100μL甲醇溶液复溶(7)获得的吹干样品，进行液相串联质谱检测，按照(1)～(4)检测获得的标准曲线(如y＝ax+b)计算人血清中的维生素A浓度，C样品为血清样本中维生素A含量，y为维生素A化合物相对于其同位素
内标的峰面积比,b为线性方程截距，a为线性方程斜率。

[0067] 本发明的主要优点

[0068] (1)本发明的分析方法获得的标准曲线具有良好的线性，其中相关系数R2值达到0.9999，因此，本分析方法能较为精准地测定维生素A含量。

[0069] (2)本发明的分析方法步骤少，操作简单，所用试剂廉价易得，因此，非常值得推广应用。

[0070] 应用

[0071] 本发明的分析方法被应用于生物样本如血清或血浆样本中维生素A的定量检测，是一种快速、高通量、灵敏的检测方法，可以应用于临床采集的人血清样本中维生素A的定量检测，为确定该化合物在体内含量变化与生理功能、疾病的关系提供了有力支持。

[0072] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

[0073] 实施例1：人血清样本中维生素A的分析检测

[0074] 分别取含已知浓度维生素A的人血清白蛋白溶液100μL，含维生素A浓度分别为0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2.5、5μg/mL，加入300μL乙腈沉淀蛋白，离心13000rpm*5min。再加入
1mL正己烷，振荡混匀提取，离心13000rpm*5min，取上层有机相900μL于96孔板中，温和氮气吹干，用100μL甲醇复溶，用于质谱检测，并获得人血清白蛋白基质条件下标准曲线。

[0075] 取血清样本100μL于1.5mLEP管中，加入300μL乙腈沉淀蛋白，离心13000rpm*5min。再加入1mL正己烷，振荡混匀提取，离心13000rpm*5min，取上层有机相900μL于96孔板中，温和氮气吹干，用100μL甲醇复溶，用于质谱检测。液相串联质谱检测中采用APCI离子源。图1为本实施例1中维生素A的含量分析的主要步骤。在本发明所述的方法中，所用的血清样本或溶剂的用量并不限于此。

[0076] 所得人血清白蛋白基质条件下标准曲线如图2所示。根据线性方程y＝0.927x+0.0175， y为维生素A化合物相对于其同位素内标的峰面积比，人
血清样本中测定维生素A浓度为0.33μg/mL。

[0077] 表1为APCI离子源检测条件下的基质效应：

[0078] 表1

[0079] 维生素A内标峰面积 RSD％
空白基质 2.52E+05 2.44
人血清 2.32E+05 3.29

[0080] 从表中可以看出，内标在空白基质和人血清中信号强度接近，无基质效应。

[0081] 对比例1：

[0082] 采用如实施1所述的方法，不同之处在于，用甲醇替换乙腈对人血清白蛋白溶液中的蛋白进行沉淀处理。

[0083] 表2为分别用甲醇和乙腈对蛋白作沉淀处理时，所获得的维生素A峰面积以及相对标准偏差：

[0084] 表2

[0085] 维生素A峰面积 RSD％
甲醇沉淀 2.52E+04 3.19
乙腈沉淀 4.05E+04 4.59

[0086] 从表2中可以看出，乙腈沉淀蛋白对目标化合物的提取效果更好，所获得的维生素A含量大于甲醇提取。

[0087] 对比例2：

[0088] 采用如实施1所述的方法，不同之处在于，分别用乙酸乙酯和甲基叔丁基醚作为萃取剂，对样品中的维生素A进行萃取。

[0089] 从图3中可以看出，采用正己烷提取可以有效的排除血液样本中磷脂对于目标化合物检测的干扰，而乙酸乙酯和甲基叔丁基醚都会提取出血样中的磷脂，磷脂信号很强，易产生信号抑制，影响待测物的信号。

[0090] 对比例3：

[0091] 采用如实施1所述的方法，不同之处在于，用ESI离子源代替APCI离子源进行监测。表3为ESI离子源检测条件下的基质效应：

[0092] 表3

[0093] 维生素A内标峰面积 RSD％
水 3.44E+05 3.26
空白基质 2.55E+05 2.89
人血清 2.95E+04 10.37

[0094] 从表3中可以看出，目标化合物的同位素内标在人血清与空白基质中相比信号相差10倍。

[0095] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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