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3-甲基-丁酸作为葡萄球菌的代谢标记物在非疾病诊断和治疗中的应用

阅读：400发布：2020-05-13

专利汇可以提供3-甲基-丁酸作为葡萄球菌的代谢标记物在非疾病诊断和治疗中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了3-甲基-丁酸作为葡萄球菌的代谢标记物在非疾病诊断和治疗目的的检测葡萄球菌中的应用，属于病原微生物检验技术领域。本发明研究确认：3-甲基-丁酸是金黄色葡萄球菌和其他葡萄球菌(包括产色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、表皮葡萄球菌和施氏葡萄球菌)共同的典型挥发性代谢产物，可作为葡萄球菌的代谢标记物应用。，下面是3-甲基-丁酸作为葡萄球菌的代谢标记物在非疾病诊断和治疗中的应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.3-甲基-丁酸作为葡萄球菌的代谢标记物在非疾病诊断和治疗目的的检测葡萄球菌中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述葡萄球菌包括金黄色葡萄球菌、产色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、表皮葡萄球菌和施氏葡萄球菌中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用为：基于代谢标记物3-甲基-丁酸检测生牛乳中的葡萄球菌。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用为：基于代谢标记物3-甲基-丁酸检测巴士杀菌乳中的葡萄球菌。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用为：基于代谢标记物3-甲基-丁酸检测奶牛乳房炎传播媒介中的葡萄球菌。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述奶牛乳房炎传播媒介包括挤奶员的手、擦洗奶牛乳房用的抹布、挤奶杯、奶牛饮水槽和奶牛饲养室中的一种或多种。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，基于代谢标记物3-甲基-丁酸检测食品中的葡萄球菌。

说明书全文

3-甲基-丁酸作为葡萄球菌的代谢标记物在非疾病诊断和治

疗中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及病原微生物检验技术领域，具体涉及一种3-甲基-丁酸作为葡萄球菌的代谢标记物在非疾病诊断和治疗目的的检测葡萄球菌中的应用。

背景技术

[0002] 乳房炎(Mastitis)是奶牛乳腺组织的炎症，可引起组织损伤、纤维化，降低奶产量、奶的品质和营养价值，影响奶制品的加工，是造成奶业经济损失最为严重的疾病。据国际奶牛联合会统计，全世界每年因奶牛乳房炎造成的经济损失高达2000多亿元。引起奶牛乳房炎的病原微生物达150多种，但临床上最常见的有20多种，尤其是葡萄球菌、链球菌和肠道菌是最主要的感染病因，占总致病菌的90％～95％。

[0003] 葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的重要病原菌，葡萄球菌引起的乳房炎症状多出现在产奶高峰期，常为慢性，也可呈急性。葡萄球菌广泛存在于外界环境中，挤奶员的手、擦洗乳房用的抹布和消毒不严的挤奶杯，是传播该菌的主要媒介。

[0004] 另外，由葡萄球菌引起乳房炎的奶牛，其产奶中也含有葡萄球菌，存在一定的安全隐患。

[0005] 随着分析化学技术的进步，促进了分析微生物学的发展，寻找各种病原微生物的特征性代谢产物及代谢产物谱已成为病原微生物快速检测和鉴定研究的一个重要方向。近年来，基于挥发性化合物分析的气味标记技术在食品中的应用越来越活跃。微生物的次级代谢产物会产生特定的挥发性气味物质，基于这点可利用气味标记技术来检测食品中的微生物。

发明内容

[0006] 有鉴于背景技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种3-甲基-丁酸作为葡萄球菌的代谢标记物在非疾病诊断和治疗目的的检测葡萄球菌中的应用。

[0007] 本发明提供了3-甲基-丁酸作为葡萄球菌的代谢标记物在非疾病诊断和治疗目的的检测葡萄球菌中的应用。

[0008] 优选的，所述葡萄球菌包括金黄色葡萄球菌、产色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、表皮葡萄球菌和施氏葡萄球菌中的一种或多种。

[0009] 优选的，所述应用为：基于代谢标记物3-甲基-丁酸检测生牛乳中的葡萄球菌。

[0010] 优选的，所述应用为：基于代谢标记物3-甲基-丁酸检测巴士杀菌乳中的葡萄球菌。

[0011] 优选的，所述应用为：基于代谢标记物3-甲基-丁酸检测奶牛乳房炎传播媒介中的葡萄球菌。

[0012] 优选的，所述奶牛乳房炎传播媒介包括挤奶员的手、擦洗奶牛乳房用的抹布、挤奶杯、奶牛饮水槽和奶牛饲养室中的一种或多种。

[0013] 优选的，所述应用为：基于代谢标记物3-甲基-丁酸检测食品中的葡萄球菌。

[0014] 有益效果：本发明提供了3-甲基-丁酸作为葡萄球菌的代谢标记物在非疾病诊断和治疗中的应用。本发明研究确认：3-甲基-丁酸是金黄色葡萄球菌和其他葡萄球菌(包括产色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、表皮葡萄球菌和施氏葡萄球菌)共同的典型挥发性代谢产物，可作为葡萄球菌的代谢标记物应用。附图说明

[0015] 图1-A为本发明实施例1所述培养12h时的3-甲基-丁酸提取离子流色谱图；

[0016] 图1-B为本发明实施例1所述培养16h时的3-甲基-丁酸提取离子流色谱图；

[0017] 图1-C为本发明实施例1所述培养20h时的3-甲基-丁酸提取离子流色谱图；

[0018] 图1-D为本发明实施例1所述培养24h时的3-甲基-丁酸提取离子流色谱图；

[0019] 图2-A为本发明实施例1所述培养12h时的辛酸提取离子流色谱图；

[0020] 图2-B为本发明实施例1所述培养16h时的辛酸提取离子流色谱图；

[0021] 图2-C为本发明实施例1所述培养20h时的辛酸提取离子流色谱图；

[0022] 图2-D为本发明实施例1所述培养24h时的辛酸提取离子流色谱图；

[0023] 图3为本发明实施例1所述不同金黄色葡萄球菌的生长曲线图；

[0024] 图4为本发明实施例1所述不同金黄色葡萄球菌3-甲基-丁酸产生情况；

[0025] 图5为本发明实施例1所述不同非金黄色葡萄球菌的生长曲线图；

[0026] 图6为本发明实施例1所述不同非金黄色葡萄球菌3-甲基-丁酸产生情况；

[0027] 图7为本发明实施例1所述混合培养金黄色葡萄球菌的生长情况；

[0028] 图8为本发明实施例1所述混合培养金黄色葡萄球菌的3-甲基-丁酸的产生情况；

[0029] 图9为本发明实施例1所述混合培养非金黄色葡萄球菌的生长情况；

[0030] 图10为本发明实施例1所述混合培养非金黄色葡萄球菌的3-甲基-丁酸的产生情况；

[0031] 图11为本发明实施例1所述牛乳葡萄球菌代谢标记物检测技术和传统培养法的流程图对比情况。

具体实施方式

[0032] 本发明提供了3-甲基-丁酸作为葡萄球菌的代谢标记物在非疾病诊断和治疗目的的检测葡萄球菌中的应用。

[0033] 在本发明中，所述葡萄球菌包括金黄色葡萄球菌、产色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、表皮葡萄球菌和施氏葡萄球菌中的一种或多种。

[0034] 本发明以乳源金黄色葡萄球菌和非金黄色葡萄球菌两类菌株为试验对象，分析乳源葡萄球菌挥发性代谢产物的类型，确定葡萄球菌的典型挥发性代谢产物，然后与乳房炎乳中其它病原菌大肠杆菌和链球菌的挥发性代谢产物进行比较，最终确认：3-甲基-丁酸是葡萄球菌的典型且特异的挥发性代谢产物，可作为葡萄球菌的代谢标记物应用。另外，葡萄球菌与其他奶牛乳房炎病原菌混合培养下的3-甲基-丁酸强度低于葡萄球菌单独培养下的3-甲基-丁酸强度；但其他奶牛乳房炎病原菌(如无乳链球菌和大肠杆菌)的存在不会影响葡萄球菌的生长与3-甲基-丁酸产生之间的相关性。

[0035] 在本发明的一种优选方案中，所述应用为：基于代谢标记物3-甲基-丁酸检测生牛乳中的葡萄球菌。

[0036] 在本发明的另一种优选方案中，所述应用为：基于代谢标记物3-甲基-丁酸检测巴士杀菌乳中的葡萄球菌。

[0037] 上述两种应用方法能在牛奶类食品的安全监测中发挥作用。

[0038] 本发明还提供了一种优选的方案，在该优选方案中，所述应用为：基于代谢标记物3-甲基-丁酸检测奶牛乳房炎传播媒介中的葡萄球菌。所述奶牛乳房炎传播媒介优选包括挤奶员的手、擦洗奶牛乳房用的抹布、挤奶杯、奶牛饮水槽和奶牛饲养室中的一种或多种。

[0039] 上述应用方法能检测出奶牛乳房炎传播媒介中的葡萄球菌，有助于预防奶牛乳房炎的发生。

[0040] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0041] 实施例1

[0042] 1材料与仪器

[0043] 1.1试验菌株

[0044] 金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 6538(Staphylococcus aureus ATCC 6538)，购自美国模式培养物集存库；大肠杆菌O157:H7标准菌株CICC21530(Escherichia coli O157:H7CICC 21530)，无乳链球菌标准菌株CICC10465(Streptococcus agalactiae CICC
10465)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

[0045] 试验中所用金黄色葡萄球菌菌株(31B、0250H、777H、S2-2、S12-1)和非金黄色葡萄球菌菌株(表皮葡萄球菌S1-1、施氏葡萄球菌S3-2、腐生葡萄球菌S5-1、溶血性葡萄球菌S6-2、产色葡萄球菌S13-1)分离于生牛乳样品，分离菌株由实验室保存。

[0046] 1.2采集的样品

[0047] 从成都市青白江区1号(5份)、2号(5份)、3号(5份)和4号(5份)四个散养牛场采集不同牛的生牛乳样品共计20份，每份为500mL，低温保藏运输，送入实验室立即进行检测。

[0048] 从成都市各大超市购买不同品牌、不同生产日期和不同产地的巴氏杀菌乳共计20份，每份500mL，送入实验室立即进行检测。

[0049] 1.3主要试剂

[0050] 胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptone Soy Broth，TSB)培养基、Baird-Parker(BP)琼脂基础、亚碲酸盐卵黄增菌液、Todd-Hewitt琼脂(Todd-HewittAgar，TH)、新生牛血清、伊红美蓝琼脂(Eosin-Methylene BlueAgar，EMB)，均购自青岛高科园海博生物技术有限公司；氯化钠，购自成都市科隆化学品有限公司；蒙牛纯牛奶，购自沃尔玛超市。

[0051] 1.4仪器与设备

[0052] 热电气相色谱/质谱联用仪(GC/MS)配置Triplus自动进样器，碳分子筛/二乙基苯/聚二甲基硅氧烷(carboxen/divinylbenzene/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS)萃取头(50/30μm)，美国Supelco公司；低温冰箱(MOF-4086S)、高压蒸汽灭菌锅(MLS-3020)，日本三洋公司；超净工作台(SW-CJ-1F)，苏州安泰空气技术有限公司；电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9203A)，上海一恒科技有限公司；电热恒温培养箱(DHP-9162D)，上海齐欣科学仪器有限公司；恒温振荡培养箱(ZWY-100H)，上海智城分析仪器制造有限公司；DYY-12型电泳仪，北京市六一仪器厂；PCR扩增仪，购自四川新科仪器有限公司。

[0053] 2实验方法

[0054] 2.1细菌新鲜培养物制备

[0055] 从冻藏管中吸取葡萄球菌分离菌株保藏菌液50μL接种到5mL TSB培养基中，于37℃，200r/min条件下培养13h，将菌液划线于BP固体培养基上，37℃下培养24h。挑取具有典型特征的单菌落接入5mL TSB培养基中，于37℃，200r/min条件下培养16h，作为细菌新鲜培养物。

[0056] 从冻藏管中吸取50μL金黄色葡萄球菌ATCC 6538保藏菌液，接种至5mL TSB培养基，37℃±1℃，200r/min培养16h。勾取一环新鲜菌液，划线于BP平板上，在37℃±1℃条件下，静置培养24h±1h，至平板上长出灰黑色至黑色并带有晕圈的菌落。挑取具有典型特征的单菌落接入5mL TSB培养基中，于37℃，200r/min条件下培养13h，作为细菌新鲜培养物。

[0057] 从冻藏管中吸取50μL大肠杆菌CICC 21530保藏菌液，接种至5mL TSB培养基，在36℃±1℃条件下，200r/min培养16h。勾取一环新鲜菌液，划线于EMB平板上，在36℃±1℃条件下，静置培养24h±1h。至平板上长出黑色带有金属光泽的菌落。挑取具有典型特征的单菌落接入5mL TSB培养基中，于37℃，200r/min条件下培养13h，作为细菌新鲜培养物。

[0058] 从冻藏管中吸取50μL无乳链球菌CICC 10465保藏菌液，接种至5mL TSB培养基，外加5％的新生牛血清，在36℃±1℃条件下，200r/min培养16h。勾取一环新鲜菌液，划线于TH平板上，在36℃±1℃条件下，静置培养24h±1h。至平板上长出乳白色小菌落。挑取具有典型特征的单菌落接入5mL TSB培养基中，于37℃，200r/min条件下培养13h，作为细菌新鲜培养物。接种无乳链球菌的TSB中加入5％新生牛血清。

[0059] 2.2样品的制备

[0060] 将金黄色葡萄球菌6538新鲜培养物进行梯度稀释至10-4，吸取10-4菌悬液200μL分别接入350mL纯牛奶中，使初始接种量为100～200CFU/mL；将大肠杆菌O157:H721530新鲜培养物进行梯度稀释至10-5，吸取10-5菌悬液750μL接入350mL纯牛奶中，使初始接种量为100～200CFU/mL；将无乳链球菌10465新鲜培养物梯度稀释至10-3，吸取10-3菌悬液200μL接入350mL纯牛奶中，使初始接种量为100～200CFU/mL。于36℃±1℃下，200r/min振荡培养，培养至12、16、20、24h各吸取5mL培养物转入20mL顶空瓶内，加入2g氯化钠，加盖密封，每个时间点取3份平行样品，同时取3份未接种的空白牛奶作为对照样品。

[0061] 将葡萄球菌分离菌株新鲜培养物进行梯度稀释至10-4，吸取10-4菌悬液200μL分别接入350mL纯牛奶中，使初始接种量为100～200CFU/mL，于37℃下，200r/min振荡培养至24h。每隔2h吸取1mL培养物，梯度稀释，平板计数。培养至12、16、20、24h各吸取5mL培养物转入20mL顶空瓶内，加入2g氯化钠，加盖密封，作为挥发性代谢物测试样品。每个时间点取3份平行样品，同时取3份未接菌的空白牛奶作为对照样品。

[0062] 吸取金黄色葡萄球菌31B、大肠杆菌O157:H721530、无乳链球菌10465的新鲜培养物接入350mL纯牛奶中，使三种菌的初始接种量均为100～200CFU/mL。设置混合培养I(金黄色葡萄球菌31B:大肠杆菌O157:H7＝1:1)，混合培养II(金黄色葡萄球菌31B:无乳链球菌＝1:1)和混合培养III(金黄色葡萄球菌31B:大肠杆菌O157:H7:无乳链球菌＝1:1:1)。同时吸取金黄色葡萄球菌31B新鲜培养物接入350mL纯牛奶中，使该菌的初始接种量为100～
200CFU/mL，单独培养。混合模式和单独模式均于36℃±1℃，200r/min条件下培养24h。每隔
2h吸取1mL培养物，梯度稀释，平板计数。从第12h开始，每隔4h吸取细菌培养物5mL转入20mL顶空瓶内，加入2g氯化钠，加盖密封，作为挥发性代谢物测试样品。每个时间点做3份平行样品，同时取3份未接菌的空白牛奶作为对照样品。

[0063] 吸取产色葡萄球菌S13-1、大肠杆菌O157:H721530、无乳链球菌10465的新鲜培养物接入350mL纯牛奶中，使三种菌的初始接种量均为100～200CFU/mL。设置混合培养IV(产色葡萄球菌S13-1:大肠杆菌O157:H7＝1:1)，混合培养V(产色葡萄球菌S13-1:无乳链球菌＝1:1)和混合培养VI(产色葡萄球菌S13-1:大肠杆菌O157:H7:无乳链球菌＝1:1:1)。同时吸取产色葡萄球菌S13-1新鲜培养物接入350mL纯牛奶中，使该菌的初始接种量为100～200CFU/mL，单独培养。混合和单独模式均于36℃±1℃，200r/min条件下培养24h。每隔2h吸取1mL培养物，梯度稀释，平板计数。从第12h开始，每隔4h吸取细菌培养物5mL转入20mL顶空瓶内，加入2g氯化钠，加盖密封，作为挥发性代谢物测试样品。每个时间点做3份平行样品，同时取3份未接菌的空白牛奶作为对照样品。

[0064] 对于采集的20份生牛乳或巴氏杀菌乳样品，吸取1mL，梯度稀释，平板计数；吸取5mL转入20mL顶空瓶内，加入2g氯化钠，加盖密封，作为基质本底样品，每份样品做3个平行。
取350mL生牛乳或巴氏杀菌乳置于500mL锥形瓶内进行培养，于36℃±1℃、200r/min振荡培养20h。每隔4h吸取1mL培养物，梯度稀释，平板计数；从第12h开始取样，每隔4h吸取细菌培养物5mL转入20mL顶空瓶内，加入2g氯化钠，加盖密封，检测代谢标记物。每个时间点做3份平行样品，同时取3份未接菌的空白牛奶作为对照样品。

[0065] 2.3挥发性代谢产物测定

[0066] (1)萃取条件

[0067] 采用50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头，在80℃预孵化30min，萃取10min。

[0068] (2)气相色谱分析条件

[0069] TR-FFAP色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；分流模式，分流比为20:1；流速1mL/min；升温程序：40℃保持3min，以7℃/min升温至220℃并保持2min；载气为99.999％氦气；进样口温度230℃；解吸时间2min。

[0070] (3)质谱分析条件

[0071] 电子电离源，电子能量70eV；离子源温度250℃；传输线温度220℃；全扫描模式，质量扫描范围50～550amu。

[0072] 2.4细菌生长水平测定

[0073] 在细菌培养过程中，在取样时间点吸取1mL培养物，采用10倍梯度稀释法，将菌液稀释至合适浓度，吸取1mL稀释菌液于平皿中，倒入BP琼脂，混摇均匀，于36℃±1℃，静置培养24h，平板计数有效范围30～300CFU/mL，记录葡萄球菌的生长数量。

[0074] 2.5牛乳中葡萄球菌生长数量测定

[0075] 吸取1mL牛乳或巴氏杀菌乳，采用10倍梯度稀释法将菌液稀释至合适浓度，吸取1mL稀释菌液于平皿中，倒入BP琼脂，36℃±1℃，静置培养24～48h。每份样品做3个平行，平板计数有效范围30～300CFU/mL，记录细菌生长量，作为样品初始污染量。将牛乳或巴氏杀菌乳在36℃进行培养，每隔4h吸取培养物1mL培养物，采用10倍梯度稀释法将菌液稀释至合适浓度，吸取1mL稀释菌液于平皿中，倒入BP琼脂，混摇均匀，36℃±1℃，静置培养24～48h。
每个时间点做3个平行，平板计数有效范围30～300

[0076] CFU/mL，记录12、16、20h葡萄球菌的生长量。

[0077] 2.6数据分析

[0078] 质谱结果经计算机自动检索(NIST 08)进行定性分析，同时由Xcalibur 软件系统完成手动对照检索，要求正向反向匹配因子均大于750。采用提取特征离子流模式报告挥发性代谢产物的峰面积，作为峰信号响应强度。每个取样时间点的峰信号强度为三个平行样品的平均值扣除空白培养基质的本底值。

[0079] 采用OriginPro 8.5软件绘制细菌的生长曲线和挥发性代谢产物的变化曲线。使用SPSS 18.0软件对葡萄球菌典型挥发性代谢产物与细菌生长之间进行相关分析。

[0080] 3结果与分析

[0081] 3.1葡萄球菌特征代谢标记物的确定

[0082] 3.1.1葡萄球菌挥发性代谢产物类型分析

[0083] 对五株金黄色葡萄球菌16h培养物检出的物质类型进行统计，总计检出28个挥发性代谢产物(见表1)，包括烷烃类1个、醇类2个、酸类11个、醛类1个、酮类9个、苯环类2个、含氮化合物2个，在各类挥发性代谢产物中酸类物质数量最多，其次是酮类。其中菌株31B检出烷烃类1个、醇类2个、酸类4个、酮类7个、含氮化合物1个、苯环类1个；菌株0250H检出醇类1个、酸类6个、酮类5个、苯环类1个；菌株777H检出醇类1个、酸类7个、醛类1个、含氮化合物1个；菌株S12-1检出醇类2个、酸类6个、醛类1个、酮类6个、苯环类1个；菌株S2-2检出醇类1个、酸类3个、醛类1个、酮类7个、含氮化合物2个。另外，菌株检出的癸酸、丙酮、2-戊酮、2-庚酮、2-壬酮、2-十一烷酮的相对百分含量和牛乳空白相近，甚至低于空白基质，说明菌株并没有产生这些物质。五株金黄色葡萄球菌共同检出了2-呋喃甲醇、辛酸和3-甲基-丁酸，牛乳空白没有这些物质，被认为是金黄色葡萄球菌典型的挥发性代谢产物。

[0084] 表1金黄色葡萄球菌16h培养物的挥发性代谢产物类型统计(单位：个)[0085]

[0086] 对5株非金黄色葡萄球菌16h培养物检出的物质类型进行统计，总计检出28个挥发性代谢产物(见表2)，包括烃类1个、醇类5个、酸类8个、醛类1个、酮类10个、苯环类1个、含氮化合物2个。菌株S1-1检出醇类1个、酸类5个、酮类8个、苯环类1个、含氮化合物2个；菌株S3-2检出烃类1个、醇类3个、酸类4个、酮类6个、苯环类1个；菌株S5-1检出醇类1个、酸类5个、酮类7个、含氮化合物1个；菌株S6-2检出醇类2个、酸类3个、醛类1个、酮类6个、苯环类1个；菌株S13-1检出醇类3个、酸类4个、酮类8个。另外，菌株检出的2-庚酮、2-十一烷酮、丙酮、2-戊酮和2-壬酮的相对百分含量与牛乳空白基质相近或低于牛乳空白基质，说明菌株没有产生这些物质。5株非金黄色葡萄球菌共同检出了辛酸、己酸和3-甲基-丁酸，牛乳空白基质没有这些物质，可认为是非金黄色葡萄球菌典型的挥发性代谢产物。

[0087] 表2非金黄色葡萄球菌16h培养物的挥发性代谢产物类型统计(单位：个)[0088]

[0089] 综合上述，金黄色葡萄球菌和非金黄色葡萄球菌的典型挥发性代谢产物的结果可得，辛酸和3-甲基-丁酸是十株葡萄球菌共同检出的典型代谢产物。

[0090] 3.1.2葡萄球菌典型代谢产物的特异性分析

[0091] (1)3-甲基-丁酸的特异性测定

[0092] 采集各培养时间点的3-甲基-丁酸提取离子流色谱图，结果见图1-A、图1-B、图1-C和图1-D(统称图1)。

[0093] 其中，图1-A为12h提取离子流色谱图(注：图中方框内色谱峰为3-甲基-丁酸(RT＝17.16min)，由上到下依次为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌)；

[0094] 图1-B为16h提取离子流色谱图(注：图中方框内色谱峰为3-甲基-丁酸(RT＝17.14min)，由上到下依次为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌)；

[0095] 图1-C为20h提取离子流色谱图(注：图中方框内色谱峰为3-甲基-丁酸(RT＝17.13min)，由上到下依次为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌)；

[0096] 图1-D为24h提取离子流色谱图(注：图中方框内色谱峰为3-甲基-丁酸(RT＝17.15)，由上到下依次为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌)。

[0097] 比较各培养时间点3-甲基-丁酸的信号强度，结果见表3。

[0098] 表3各培养时间点3-甲基-丁酸信号强度比较(单位：峰面积，counts*sec)[0099]菌株 12h 16h 20h 24h
金黄色葡萄球菌ATCC6538 2645534 3871812 2987955 1836512
大肠杆菌O157:H7CICC21530 0 0 0 0
无乳链球菌CICC10465 0 0 0 0

[0100] 扣除牛乳空白本底值，提取3-甲基-丁酸特征碎片离子m/z＝87，大肠杆菌O157:H7CICC21530、无乳链球菌CICC 10465和金黄色葡萄球菌ATCC6538提取离子流色谱图和峰强度值进行比较，由图1和表3发现培养时间12、16、20、24h四个时间点，金黄色葡萄球菌均产生了3-甲基-丁酸。而大肠杆菌O157:H7和无乳链球菌都没有产生3-甲基-丁酸。因此，3-甲基-丁酸可以作为葡萄球菌的候选标记物。

[0101] (2)辛酸的特异性测定

[0102] 采集各培养时间点的辛酸提取离子流色谱图，结果见图2-A、图2-B、图2-C和图2-D(统称图2)。

[0103] 其中，图2-A为12h提取离子流色谱图(注：图中方框内色谱峰为辛酸(RT＝23.03-23.05)，由上到下依次为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌)；

[0104] 图2-B为16h提取离子流色谱图(注：图中方框内色谱峰为辛酸(RT＝23.03-23.05)，由上到下依次为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌)；

[0105] 图2-C为20h提取离子流色谱图(注：图中方框内色谱峰为辛酸(RT＝23.03-23.05)，由上到下依次为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌)；

[0106] 图2-D为24h提取离子流色谱图(注：图中方框内色谱峰为辛酸(RT＝23.02-23.06)，由上到下依次为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌)。

[0107] 比较各培养时间点辛酸的信号强度，结果见表4。

[0108] 表4各培养时间点辛酸信号强度比较(单位：峰面积，counts*sec)

[0109]菌株 12h 16h 20h 24h
金黄色葡萄球菌ATCC6538 283802950 394605014 489261661 565520529
大肠杆菌O157:H7CICC21530 90954043 93433738 78863007 102398681
无乳链球菌CICC10465 85542757 85264001 104959760 123395088

[0110] 扣除牛乳空白本底值，提取辛酸特征碎片离子m/z＝101，大肠杆菌O157:H7CICC21530、无乳链球菌CICC 10465和金黄色葡萄球菌ATCC6538提取离子流色谱图和峰强度值进行比较，由图2和表4发现培养时间12、16、20、24h四个时间点，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7和无乳链球菌均产生了辛酸。因此，辛酸不能作为葡萄球菌的候选标记物。

[0111] 3.1.3葡萄球菌的生长与代谢标记物动态变化分析

[0112] (1)金黄色葡萄球菌生长与3-甲基-丁酸产生情况

[0113] 测定不同金黄色葡萄球菌的生长曲线，结果见图3。

[0114] 测定不同金黄色葡萄球菌3-甲基-丁酸的产生情况，结果见图4。

[0115] 由图3可知：在培养过程中，五株金黄色葡萄球菌的生长趋势无显著性差异(p>0.05)。对数生长期大约是从第0h至第10h，培养10h后均进入稳定期，细菌数量达到109CFU/mL。

[0116] 由图4可知：在培养时间内，五株金黄色葡萄球菌产生的3-甲基-丁酸强度均呈上升趋势。菌株777H产生的峰强度高于其余四株菌，24h时累积强度达到2.3×105counts*sec。其次，菌株0250H和S12-1的峰信号强度在24h时达到最大，分别为1.9×105counts*sec、9×104counts*sec。菌株31B和S2-2产生的3-甲基-丁酸信号水平较低，仅在103～104counts*sec。不同菌株3-甲基-丁酸的产生量有较大差异。

[0117] (2)非金黄色葡萄球菌生长与3-甲基-丁酸产生情况

[0118] 测定不同非金黄色葡萄球菌生长曲线，结果见图5。

[0119] 测定不同非金黄色葡萄球菌3-甲基-丁酸产生情况，结果见图6。

[0120] 由图5可知：在培养过程中，五株非金黄色葡萄球菌的生长趋势无显著性差异(p>9
0.05)。对数生长期大约是从第0h至第10h，培养10h后均进入稳定期，细菌数量达到10CFU/mL。

[0121] 由图6可知：在培养时间内，五株非金黄色葡萄球菌产生的3-甲基-丁酸信号强度均呈上升趋势，S13-1在培养16h后迅速增加，24h时达到8.7×104counts*sec，其它四株菌在4
培养周期内3-甲基-丁酸信号强度变化幅度很小，峰强度范围大体在1.29～2×10 counts*sec，不同菌株之间3-甲基-丁酸的产生能力存在差别。

[0122] 3.2牛乳中其它病原菌对葡萄球菌的影响

[0123] 测定混合培养金黄色葡萄球菌的生长情况，结果见图7。

[0124] 测定混合培养金黄色葡萄球菌的3-甲基-丁酸的产生情况，结果见图8。

[0125] 测定混合培养非金黄色葡萄球菌的生长情况，结果见图9。

[0126] 测定混合培养非金黄色葡萄球菌的3-甲基-丁酸的产生情况，结果见图10。

[0127] 由图7可知：与金黄色葡萄球菌31B单独培养相比，混合培养I、II、III下，金黄色葡萄球菌的生长变化趋势与单独培养无明显差异，均在10h后进入生长稳定期；在达到生长稳定期后，三种混合培养和单独培养下，金黄色葡萄球菌31B的生长量均能达到108～109CFU/mL水平。

[0128] 由图8可知：对于金黄色葡萄球菌31B，培养至24h时，混合培养I、II和III下3-甲基-丁酸的强度低于单独培养。在单独和混合培养下，金黄色葡萄球菌产生的3-甲基-丁酸强度在培养时间内均呈持续上升趋势。

[0129] 由图9可知：对于产色葡萄球菌S13-1，混合培养IV、V、VI下，均在10h进入生长稳定期，最终菌体生长量在108～109CFU/mL水平。混合培养时产色葡萄球菌S13-1的生长变化趋势与单独培养无明显差异。

[0130] 由图10可知：对于产色葡萄球菌S13-1，与单独培养相比，混合培养IV下3-甲基-丁酸的信号强度在12h时被检出，20h后迅速增加；混合培养V下3-甲基-丁酸的强度在12～24h略微增加；混合培养VI下3-甲基-丁酸的强度在16～24h缓慢增加。产色葡萄球菌S13-1单独培养时3-甲基-丁酸的信号强度最高，混合培养下3-甲基-丁酸的强度均低于单独培养。

[0131] 测定葡萄球菌挥发性代谢标记物与细菌生长的Spearman相关系数，结果见表5。

[0132] 表5葡萄球菌挥发性代谢标记物与细菌生长的Spearman相关系数

[0133]

[0134] **p<0.01

[0135] 由表5可知：金黄色葡萄球菌31B与大肠杆菌12530(1：1)、金黄色葡萄球菌31B与无乳链球菌10465(1：1)、金黄色葡萄球31B与大肠杆菌12530和无乳链球菌10465(1：1：1)混合培养时，检测到3-甲基-丁酸的信号强度与菌体生长数量之间均呈极显著相关(p<0.01)。另一方面，产色葡萄球菌S13-1与大肠杆菌12530(1：1)、产色葡萄球菌S13-1与无乳链球菌10465(1：1)、产色葡萄球菌S13-1与大肠杆菌12530和无乳链球菌10465(1：1：1)混合培养时，检测到3-甲基-丁酸的信号强度与菌体生长数量之间均呈极显著相关(p<0.01)。

[0136] 表5结果说明：无乳链球菌和大肠杆菌的存在不会影响金黄色葡萄球菌或非金黄色葡萄球菌的生长与3-甲基-丁酸产生之间的相关性。

[0137] 3.3葡萄球菌代谢标记物的应用

[0138] 3.3.1基于代谢标记物检测生乳中葡萄球菌

[0139] 测定不同培养时间生乳中葡萄球菌生长和代谢标记物检测结果，结果见表6。

[0140] 表6不同培养时间生乳中葡萄球菌生长和代谢标记物检测结果

[0141]

[0142]

[0143] 由表6可知：20份生乳样品3-甲基-丁酸的本底值均为0，葡萄球菌的初始污染量在102～104CFU/mL。培养12h后，葡萄球菌的生长量增至稳定水平，与16h和20h的生长水平相似。培养12h后，每份样品都能检测到3-甲基-丁酸信号，并且3-甲基-丁酸的信号强度累积增加至稳定水平，与16h和20h的信号强度相似。说明12h的培养时间足够满足代谢标记物检测生乳中葡萄球菌。通过20份样品的检测结果可以看出，3-甲基-丁酸检出强度范围在104～106couts*sec，葡萄球菌的检出率为100％。

[0144] 3.3.2基于代谢标记物检测巴氏杀菌乳中葡萄球菌

[0145] 测定不同培养时间巴氏杀菌乳中葡萄球菌生长和代谢标记物检测结果，结果见表7。

[0146] 表7不同培养时间巴氏杀菌乳中葡萄球菌生长和代谢标记物检测结果

[0147]

[0148] -表示未检出。

[0149] 由表7可知，20份巴氏杀菌乳样品3-甲基-丁酸的本底值为0，葡萄球菌的污染量在10CFU/mL以内。培养到12h时，2号和17号样品3-甲基-丁酸的检出强度为0，葡萄球菌的生长量也为0，培养至16h和20h时，检测结果同样如此，说明这两份样品不存在葡萄球菌污染，传统培养法与代谢标记物检测法的结果相符。对于其余18份样品，12h时只有10份样品检测出
3-甲基-丁酸，对应其葡萄球菌生长量在104～106CFU/mL，其余未检测出3-甲基-丁酸的8份样品的葡萄球菌生长量在104CFU/mL以下。培养至16h时，18份样品均检测出3-甲基-丁酸信号，葡萄球菌生长量在104～106CFU/mL。20h与16h的3-甲基-丁酸检测信号和菌体生长量相似。可见，培养16h可以满足巴氏杀菌乳中葡萄球菌的检测，3-甲基-丁酸检出强度范围在
105～106couts*sec。

[0150] 3.3.3代谢标记物检测技术与传统培养法的比较

[0151] 牛乳葡萄球菌代谢标记物检测技术和传统培养法的流程图见图11。

[0152] 由图11可以看出：牛乳样品直接培养16h后，就可以采用本发明提供的代谢标记物检测其中葡萄球菌，代谢标记物检测技术与传统培养法的符合率达到100％。从牛乳样品到最终鉴定结果，代谢标记物检测技术只需要大约17h就能完成整个检测过程，而且不需要复杂的样品前处理；而传统培养法需要大约2天的时间才能完成整个检测过程，并且还包括繁琐的前期准备和细菌分离纯化工作。

[0153] 4结论

[0154] 牛乳中金黄色葡萄球菌检出的挥发性代谢产物以酸类和酮类居多，非金黄色葡萄球菌检出的挥发性代谢产物以醇类、酸类、醛类和酮类居多，辛酸和3-甲基-丁酸是十株葡萄球菌共同检出的典型代谢产物。牛乳中大肠杆菌O157:H7和无乳链球菌均未检测出3-甲基-丁酸，进一步确认了3-甲基-丁酸为葡萄球菌的代谢标记物。不同菌株代谢标记物的响应强度动态变化结果表明，不同的葡萄球菌菌株产生3-甲基-丁酸的能力不同，3-甲基-丁酸是葡萄球菌稳定的代谢标记物。

[0155] 将葡萄球菌与其它病原菌混合培养，3-甲基-丁酸的产生量低于单独培养，但是3-甲基-丁酸产生与葡萄球菌生长之间的相关性不受混合培养时无乳链球菌、大肠杆菌的影响。

[0156] 对20份生牛乳进行检测，培养12h后均能检测到3-甲基-丁酸信号，与传统培养法检出葡萄球菌的结果一致。对20份巴氏杀菌乳进行检测，培养16h后18份样品检测到3-甲基-丁酸信号，与传统培养法检出葡萄球菌的结果一致，有2份样品没有检测到3-甲基-丁酸信号，与传统培养法未检出葡萄球菌的结果也一致。与传统培养法相比，牛乳中葡萄球菌代谢标记物检测技术用时较短，约17h就能完成整个检测过程，而传统培养法则需要2天左右的时间。在符合率方面，代谢标记物检测技术与传统培养法的检测结果完全相符。

[0157] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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