技术领域
[0001] 本
发明涉及核酸检测
生物分析技术领域，特别是涉及一种检测结核分枝杆菌 (MTB)分子靶标(mts90)的高灵敏、快速检测方法的建立与应用。
背景技术
[0002] 结核病(Tuberculosis,TB)的流行性传播严重危害了公共的卫生安全，特 别是在TB高发和卫生资源贫乏的国家和地区。由于缺乏快速、准确的TB检测方 法，不能及时对早期TB进行诊断
治疗，这加剧了疫情的传播，并可能引发多药 耐药菌株，从而延缓了控制TB流行的步伐。因此，迫切需要研发高灵敏、快速 的TB诊断方法。
[0003] 在我们的前期研究中，发现了一个新的人型结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)分子靶标——mts90，而目前关于mts90的检测方法存在灵 敏度不够高，检测时间长和依赖昂贵的专
门设备等问题。因此，有必要建立一种 易于操作和不依赖昂贵仪器设备的能高灵敏、快速检测mts90的方法。
发明内容
[0004] 鉴于以上所述
现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种MTB新靶标 mts90的高灵敏、快速检测方法的建立与应用，用于解决现有技术中缺乏快速准 确的TB检测方法、MTB分子靶标的检测方法灵敏度不高、耗时长、设备昂贵等 问题。
[0005] 为实现上述目的及其它相关目的，本发明提供一种以RPA技术为
基础对 mts90进行扩增检测的方法，包括：筛选最优引物、分析方法的灵敏度和特异性、 准确性，同时评价该方法的临床应用性能。
[0006] 可选地，所述筛选最优引物根据英国TwistDx公司的RPA设计方案(see Appendix at https://www.twistdx.co.uk/en/support/rpa-assay-design-2)， 设计RPA引物和探针。
[0007] 可选地，所述分析方法以mts90重组质粒标准品、相关分枝杆菌和常见病原 体的基因组DNA为模板，分析该方法的灵敏度和特异性。
[0008] 可选地，所述评价该方法的准确性包括通过检测疑似结核临床样本，建立受 试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic，ROC)并评价该方法 的准确性。
[0009] 可选地，所述评价该方法的临床应用性能包括，同时与qPCR的检测结果进 行对比分析，评价该方法的临床应用性能。
[0010] 本发明所提供的一种MTB新靶标mts90的高灵敏、快速检测方法的建立与应用， 包括如下步骤：
[0011] (a)引物和检测探针的筛选
[0012] 可选地，根据英国TwistDx公司的RPA设计方案，设计RPA引物和探针。 其中，引物的
扩增子均包含了MTB新分子靶标mts90的全部序列。
[0013] 可选地，以检测mts90序列为目的，设计探针。
[0014] 可选地，对经过了在线分析所设计引物和探针的二级结构进行实验筛选， 从而缩小候选引物范围。(筛选结果：引物F： CCTCTGACCAGGCGACATAGACAACAGTACCC；R：GTCGGTGAGCCATGCTTCGGCGTCGATCTTG； 探针P： CAGAGACGCAAATTCGGTCGCATCCGACAGT(FAM-dT)(THF)AAC(BHQ-dT)CCGGCCGCTGGCAA G-Spacer C3)
[0015] (b)实时mts90RPA检测方法的灵敏度分析
[0016] 可选地，检测构建的mts90质粒标准品的连续稀释液。
[0017] 可选地，6×105～6×100copies/μL浓度范围的质粒稀释液均可在20min 内获得扩增
信号，浓度最低的每个反应6个拷贝的质粒模板扩增后的荧
光信号明 显高于空白对照产生的背景
荧光信号
[0018] 可选地，多次对不同浓度的反应重复测试(n≥3)，6个拷贝的质粒模 板在5次检测中均得到阳性结果
[0019] 可选地，反应开始8min左右后出现明显的阳性扩增信号，起始模板浓 度越高的反应，出现阳性扩增的时间越短
[0020] (c)实时mts90RPA检测方法的特异性分析
[0021] 可选地，提取相关的菌株和一些常见的
呼吸道病原体基因组DNA作为模 板。
[0022] 可选地，以mts90的质粒为阳性对照，发现只在MTB标准菌株H37Rv 中观察到阳性扩增信号，而其它菌株未见阳性扩增信号。
[0023] (d)实时mts90RPA方法的临床样本的ROC曲线分析
[0024] 可选地，收集45例疑似结核病患者的临床样本进行DNA检测。
[0025] 可选地，对实时mts90RPA方法的临床样本检测结果建立ROC曲线，并 进行评价分析。
[0026] 可选地，实时mts90RPA检测方法的曲线下面积为0.876(0.754～0.998)， 与临床检查结果相比较，本发明对结核病的诊断具有较高的准确性。
[0027] 可选地，利用ROC曲线确定实时mts90RPA检测方法的最佳诊断界点。当 cut-off值取378个荧光相对单位时，灵敏度和特异性分别是96.4％，76.5％，此 时的准确度和Youden’s index分别是88.9％，0.729。
[0028] (e)实时mts90RPA方法的临床样本检测性能对比分析
[0029] 可选地，对收集的45例临床样本进行mts90qPCR检测分析。
[0030] 可选地，qPCR检测方法的灵敏度和特异性分别是100％(28/28)和88.2％ (15/17)。实时mts90RPA方法的灵敏度(96.4％)和特异性(76.5％)与qPCR 检测方法相接近。
[0031] 可选地，在27例均检测为阳性的临床样本中，qPCR检测方法的检出时间 均值是26.1min，完成检测需要73min，而实时mts90RPA方法的检出时间均值 是11.8min，其整个检测过程可在20min内完成。
[0032] 可选地，临床上的DNA微阵列芯片法以PCR技术基础，但操作步骤繁琐， 单次检测至少需要6个小时。
[0033] 因此，本发明提供了前述MTB新靶标mts90的高灵敏、快速检测方法在诊 断结核病中的用途。
[0034] 本发明的有益效果为：
[0035] (1)本发明建立了一种能高灵敏、快速检测MTB新靶标mts90的实时分析 方法。首先采用RPA技术对mts90进行扩增，该扩增技术主要依赖于重组酶、单 链DNA结合蛋白(Single-stranded DNA-binding Protein,SSB)和链置换DNA 聚合酶。在常温条件下，它们也有活性，最佳的反应
温度是37℃度左右，本实 验经过预实验选择的反应温度是39℃。引物和重组酶结合形成DNA-蛋白的复合 物，可在靶标中寻找同源序列。找到同源序列后进行链交换反应并开始DNA合成， 对靶标区域进行扩增放大。SSB和被替换的DNA链相结合，防止被进一步的替换。 RPA可结合探针，实现特异性检测。当探针结合靶序列形成DNA双链时，具有DNA 修复酶功能的ExonucleaseⅢ能识别THF位点的间隙并切割，分离淬灭基团， 释放出荧光信号。整个扩增检测过程进行非常快，20分钟内可完成。
[0036] (2)与此同时，本发明通过检测构建的mts90质粒标准品的连续稀释液发 现该方法的灵敏度是每个反应可以检测低至6个拷贝的DNA模板。
[0037] (3)综上所述，本发明成功构建了可用于检测MTB新靶标mts90的高灵敏、 快速检测方法。应用本发明的检测方法，对MTB新靶标mts90的测定显示了灵敏 度高、特异性好、稳定的能
力。与现有技术比较，本发明的MTB新靶标mts90 检测方法不需要专门的仪器，适用于目前大多数临床实验室现有的设备，且操作 快速简单、灵敏度高、特异性好、与临床鉴定结果高度相符、准确性好。可作为 现有TB核酸检测方法的补充，具有潜力开发成为筛查早期结核病的有利工具， 适合在结核病高发和卫生资源贫乏的国家和地区推广。
附图说明
[0038] 图1为本发明的原理图。
[0039] 图2为
电泳分析方法图，结果显示F3/R2引物对扩增效果最好。
[0040] 图3为
荧光染料实时监测筛选引物图，结果显示F3/R5引物对的阳性扩增和 阴性对照区别最明显。
[0041] 图4为本发明所设计的2个探针的二级结构在线分析结果图。
[0042] 图5为本发明用探针测试和比较不同引物对产生的荧光信号强度图。
[0043] 图6为对3对不同引物以MTB的标准菌株H37Rv为模板进行比较测试，由探 针P2筛选的引物对F3/R10的产物条带最亮。
[0044] 图7为本发明实时RPA扩增检测mts90的灵敏度分析结果图。
[0045] 图8为本发明用不同浓度模板获得阳性扩增的时间图。
[0046] 图9为本发明mts90RPA方法的特异性分析结果图(实时荧光检测)。
[0047] 图10为本发明mts90RPA方法的特异性分析结果图(电泳法)。
[0048] 图11为本发明检测临床样本的ROC曲线图。
[0049] 图12为本发明检测临床样本的诊断效能图。
[0050] 图13为实时mts90RPA法和qPCR在检测临床样本中的对比分析图。
[0051] 图14为实时mts90RPA方法和qPCR检测临床结核阳性标本所需的时间对比 图。
具体实施方式
[0052] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说 明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外 不同的具体实施方式加以实施或应用，本
说明书中的各项细节也可以基于不同观 点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0053] 须知，下列
实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设 备或装置；所有压力值和范围都是指绝对压力。
[0054] 此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤 前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方 法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间 的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置 或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说 明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为
鉴别各方法步骤的便利工具， 而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改 变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
[0055] 实施例1建立MTB新靶标mts90的高灵敏、快速检测方法
[0056] 1.材料与方法
[0057] 1.1材料
[0058] rTaq DNA聚合酶和pMD19-T Vector Cloning Kit(Takara，大连，中国)， Plasmid Mini kit(Omega Bio-Tek，USA)，High Pure PCR Product Purification Kit(Roche，Switzerland)，Twist fpg kit和 exo kit(TwistDx Inc.，Cambridge，UK)，20× Dye(Biotum，USA)。其他
试剂配制： ①LB液体培养基：将1g
氯化钠，0.5g
酵母提取物和10g胰蛋白胨全部溶于100mL 去离子
水中，调节pH至7.0，高压灭菌后室温冷却，置于4℃保存备用。②Amp 抗性的X-Gal选择琼脂平板的制备：每100ml的LB液体培养基中，加入1.5g 琼脂粉，高压灭菌后冷却至约40℃时，分别加入100μL Amp溶液(100mg/ml)， 100μL IPTG(24mg/ml)和200μL X-gal溶液(20mg/ml)，混匀后倒制平板，置 于4℃避光保存。
[0059] 1.2检测仪器
[0060] T100TM Thermal Cycler PCR仪(Bio-Rad，USA)，电泳仪(六一仪器厂， 中国)，凝胶成像仪(Bio-Rad，USA)，NanoDrop 1000UV/Vis spectrophotometer (Thermo Scientific，USA)，荧光定量PCR仪：Rotor Gene Q(Qiagen,Germany) 和CFX ConnectTM Real-time System(Bio-Rad,USA)，恒温水浴箱(瑞华公司， 中国)，无菌超净
工作台(苏州
净化有限公司，中国)，离心机(Thermo scentific， USA)，低温高速离心机(Heraeus,Germany)。
[0061] 1.3检测原理
[0062] 本发明采用RPA技术对mts90进行扩增检测的检测原理。该扩增技术主要依 赖于重组酶、单链DNA结合蛋白(Single-stranded DNA-binding Protein,SSB) 和链置换DNA聚合酶。在常温条件下，它们也有活性，最佳的反应温度是37℃ 度左右，本发明经过预实验选择的反应温度是39℃。引物和重组酶结合形成DNA- 蛋白的复合物，可在靶标中寻找同源序列。找到同源序列后进行链交换反应并开 始DNA合成，对靶标区域进行扩增放大。SSB和被替换的DNA链相结合，防止被 进一步的替换。RPA可结合探针，实现特异性检测。当探针结合靶序列形成DNA 双链时，具有DNA修复酶功能的ExonucleaseⅢ能识别THF位点的间隙并切割， 分离淬灭基团，释放出荧光信号。整个扩增检测过程进行非常快，20分钟内可 完成，原理图如图1所示。
[0063] 2.MTB新靶标mts90的高灵敏、快速检测方法的使用
[0064] (1)基于电泳分析结果和荧光染料实时监测的RPA反应使用的
试剂盒是 Twistfpg kit(TwistDx Inc.)。
[0065] (2)基于电泳分析结果的RPA反应体系是50μL，先配制47.5μL预
混合液， 包括自行设计的上下游引物(10nM)各2.1μL，29.5μL buffer，13.2μL的模板和 ddH2O。
[0066] (3)将预混合液加到反应管，水化TwistAmp fpg lyophilized enzyme pellets，在管盖加2.5μL
醋酸镁溶液(280mM)
[0067] (4)反应混合液被快速转移到39℃水浴箱中恒温孵育20min完成反应， 下述的加样操作相同。
[0068] (5)基于荧光染料实时监测的RPA反应是在Rotor Gene Q中执行，设 置的程序是：每个循环39℃孵育15s，Green通道读取荧光值5s，至少60个循 环以上。
[0069] (6)其中50μL体系包括上下游引物(10nM)各2.1μL，29.5μL buffer， 2.5μL 20×Dye(Biotum)，10.7μL的模板和ddH2O，2.5μL醋酸镁溶 液((280mM)。
[0070] (7)采用探针的实时RPA检测，使用的是 exo kit(TwistDx Inc.)试剂盒。
[0071] (8)它的体系是50μL，包括上下游引物(10nM)各2.1μL，0.6μL探针 (10nM)，29.5μL buffer，13.2μL的模板和ddH2O，2.5μL醋酸镁溶液((280mM)。
[0072] (9)反应混合液被快速转移到CFX ConnectTM Real-time System进行 扩增检测，设置的程序是：每个循环39℃孵育15s，FAM通道读取荧光值5s，共 60个循环。
[0073] (10)最后所获产物采用电泳分析，即采用2.5％的琼脂糖凝胶，500bp 的DNA Maker，样本的上样量均为4μL，120v×25min～30min后紫外成像分析。 其中，RPA扩增产物使用Roche公司的High Pure PCR Product Purification Kit 试剂盒纯化后，再进行电泳分析。
[0074] 实施例2MTB新靶标mts90的高灵敏、快速检测方法的灵敏度分析
[0075] 为了探究本发明是否能够快速的得出检测结果，我们通过检测构建的mts90 质粒标准品的连续稀释液，分析实时mts90RPA检测方法的灵敏度。结果显示通 过使用本发明，6×105～6×100copies/μL浓度范围的质粒稀释液均可在20min 内获得扩增信号，浓度最低的每个反应6个拷贝的质粒模板扩增后的荧光信号明 显高于空白对照产生的背景荧光信号，见图7。
[0076] 我们对不同浓度的反应进行了多次重复测试(n≥3)，其中6个拷贝的质粒 模板在5次检测中均得到阳性结果，反应开始8min左右后出现明显的阳性扩增 信号，起始模板浓度越高的反应，出现阳性扩增的时间越短，如图8所示。以上 结果表明该发明方法的灵敏度是每个反应可以检测低至6个拷贝的DNA模板。
[0077] 实施例2MTB新靶标mts90的高灵敏、快速检测方法的特异性分析 分子靶标mts90具有特异性识别MTB的优势，而本发明所建立的方法在检 测分子靶标mts90时具有重要的作用。以mts90的质粒为阳性对照，我们只在 MTB标准菌株H37Rv中观察到阳性扩增信号，而MTC内的非MTB菌株包括卡介苗 BCG和胃肠分枝杆菌，和空白对照一样，没有观察到阳性扩增信号。分枝杆菌以 外的其他细菌中也未见阳性扩增信号，见图9。
[0078] 阳性扩增信号可见组：人型结核分枝杆H37Rv(ATCC27294)
[0079] 阳性扩增信号不可见组：非洲结核分枝杆菌(CMCC95049)、胃肠结核分枝 杆菌(CMCC95006)、
牛型结核分枝杆菌卡介苗、常见的呼吸道病原体(如金黄色 葡萄球菌、
肺炎链球菌D39、
铜绿假单胞菌和大肠杆菌)
[0080] 实施例3实时mts90RPA方法的临床样本的准确性分析
[0081] 目前，受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic，ROC) 是分析评价诊断性试验的标准方法。为了评估实时mts90RPA方法的临床样本的 准确性，以临床鉴定检测方法为标准，对实时mts90RPA方法的临床样本检测结 果建立ROC曲线，并进行评价分析。
[0082] 用建立的实时mts90RPA检测方法对收集的疑似结核病患者的临床样本进 行DNA检测，一共检测了45例临床样本。样本的临床鉴定结果显示，有28例经 DNA微阵列芯片法鉴定为MTC阳性，1例鉴定为NTM，
鸟分枝杆菌。有16例经MGIT 培养法鉴定为分枝杆菌阴性。实时mts90RPA检测方法的曲线下面积(Area Under the Cure，AUC)为0.876(0.754～0.998)，对结核病的诊断具有较高的准确性。 同时利用ROC曲线确定实时mts90RPA检测方法的最佳诊断界点，如图11所示。
[0083] 综合上述评价指标，本发明所建立的实时mts90RPA检测方法具有良好的 检测准确性。
[0084] 实施例4实时mts90RPA方法的临床样本检测性能分析
[0085] 目前
分子诊断技术快速发展，其中以PCR技术在临床上应用最为广泛。以 临床鉴定检测方法为标准，我们对实时mts90RPA方法和qPCR方法的检测性能 进行比较分析。对收集的45例临床样本进行qPCR检测分析，其扩增的分子靶标 仍然是mts90。
[0086] qPCR检测方法的灵敏度和特异性分别是100％(28/28)和88.2％(15/17)。 实时mts90RPA方法的灵敏度(96.4％)和特异性(76.5％)与qPCR检测方法相 接近，如图13所示。
[0087] 然而在检测时间上，实时mts90RPA方法拥有明显的优势。如图14，在27 例均检测为阳性的临床样本中，实时mts90RPA方法的检出时间均值是11.8min， 其整个检测过程可在20min内完成，而qPCR检测方法的检出时间均值是26.1min， 完成检测需要73min。临床上的DNA微阵列芯片法以PCR技术基础，但操作步骤 繁琐，单次检测至少需要6个小时。
[0088] 以上结果表明，实时mts90RPA方法拥有与qPCR相似的灵敏度，但操作 简单，检测更加快速。
