一种免疫荧光共定位成像平台的制备方法及应用
专利汇可以提供一种免疫荧光共定位成像平台的制备方法及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种免疫 荧光 共 定位 成像平台的制备方法和应用，该检测平台通过 电子 束 光刻 技术生成金纳米阵列图案，在其表面通过金硫键偶联带有荧光基团FAM的HER2（人表皮生长因子受体-2）核酸适配体。该平台能够特异性捕获HER2高表达的 肿瘤 细胞分泌的外泌体；成像链为带有另一种荧光基团Cy5的HER2核酸适配体探针；两种探针均具有荧光闪烁特性，可用于超分辨单分子定位成像（SMLM）；通过SMLM成像技术，即可对捕获的外泌体进行超分辨光学成像；结合双色荧光共定位技术，可以在单分子 水 平上判断 假阳性 事件，提高三明治免疫检测技术的准确性。，下面是一种免疫荧光共定位成像平台的制备方法及应用专利的具体信息内容。
1.一种免疫荧光共定位成像平台的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：以电子束光刻技术在涂有光刻胶的石英片上制备图样化纳米阵列图案，以蒸镀的方法依次蒸镀金属铬层和金层，经过lift-off工艺获得最终的金纳米阵列，将带有巯基和FAM荧光基团的HER2核酸适配体通过金硫键固定在金纳米阵列上，与带有荧光基团Cy5的HER2核酸适配体及特异性捕获了外泌体的金纳米荧光阵列形成三层夹心结构，即可获得可特异性捕获肿瘤细胞外泌体进行免疫荧光共定位成像的平台。
2.根据权利要求1所述一种免疫荧光共定位成像平台的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
（1）将边长为1.5cm的石英片放置于光刻胶旋涂机上，在石英片上滴加适量的光刻胶，设置旋涂机的参数进行旋涂并烘干，即可得到涂有80nm厚的光刻胶的石英片；
（2）将步骤（1）得到的涂有光刻胶的石英片放入电子束光刻机的样品槽中，利用电子束进行纳米阵列的图案化处理，再将其浸泡在铬刻蚀液中，并用去离子水冲洗干净，然后依次放入显影液和定影液中浸泡，最后用去离子水冲洗，用氮气吹干，即可得到图案化的石英片；
（3）将步骤（2）所得的石英片固定在载玻片上，并将载玻片固定于镀膜机上，采用热蒸发蒸镀的方法，依次镀铬层和金层，将镀好膜的石英片置于丙酮溶液中，加热使石英片表面的光刻胶脱离干净，即可得到带有金纳米阵列的石英片;
（4）将步骤（3）得到的石英片用氧等离子体清洗机使其表面羟基化，通过气相沉积法用硅烷进行疏水处理，并加热除去多余的硅烷，用无水乙醇冲洗干净并用氮气吹干，即可得到疏水处理过的石英片；
（5）将靶向HER2抗原的核酸适配体探针FAM-HER2-SH滴加在步骤（4）得到的金纳米阵列上，4℃过夜，用PBS冲洗干净，并用BSA 4℃封闭，即得到可特异性捕获HER2过表达的肿瘤细胞外泌体的金纳米荧光阵列；
（6）将提取的外泌体溶液适当稀释，滴加在步骤（5）所得的金纳米阵列上，常温反应，用PBS冲洗干净并用氮气轻轻吹干；
（7）将适量浓度的检测探针Cy5-HER2核酸适配体滴加在捕获了外泌体的金纳米阵列上，常温反应1h，用去离子水冲洗并用氮气轻轻吹干，即可得到带有两种不同荧光分子的外泌体金纳米阵列检测样品，用于共定位成像。
3.根据权利要求2所述的一种免疫荧光共定位成像平台的制备方法一种免疫荧光共定位成像平台的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中真空旋涂即的参数设置如下：首先转速为500rpm，增速为2，转动时间9s，然后速度提升到4000rpm，增速为5，时间60s；烘干的温度为180℃，时间为2min。
4.根据权利要求2所述一种免疫荧光共定位成像平台的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）的显影液由异丙醇和甲基异丁酮以体积比3：1的比例配置，定影液为异丙醇；石英片在铬刻蚀液中的浸泡时间为30s，显影和定影的时间均为60s。
5.根据权利要求2所述的一种免疫荧光共定位成像平台的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中蒸镀的速度为0.3埃/s，其中铬的厚度为5nm，金的厚度为15nm；在丙酮溶液中先浸泡10-15min，再加热至沸腾直至表面的光刻胶和多余的金属剥离干净；所得的金纳米阵列中，单个金纳米柱的尺寸为底面直径为120nm左右、高20nm。
6.根据权利要求2所述的一种免疫荧光共定位成像平台的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中氧等离子体清洗剂的处理时长为1分钟，氧气的流量为50sccm，功率为70w；疏水处理的时间为30min。
7.根据权利要求2所述的一种免疫荧光共定位成像平台的制备方法，其特征在于：所述步骤（5）和步骤（7）中，核酸适配体探针FAM-HER2-SH的浓度为1nM，核酸适配体Cy5-HER2的浓度为1.25nM。
8.根据权利要求2所述的一种免疫荧光共定位成像平台的制备方法，其特征在于：所述步骤（5）中，封闭用的BSA溶液溶解在10mM的PBS缓冲液中，BSA的质量浓度为1%（w/v），封闭时间为1.5h。
9.根据权利要求2所述的一种免疫荧光共定位成像平台的制备方法，其特征在于：所述步骤（6）中的外泌体使用超高速冷冻型离心机对SK-BR-3肿瘤细胞的培养液进行提取得到的，外泌体提纯后分散在PBS中；外泌体与金纳米阵列反应时间为1h。
10.根据权利要求1-9所制备的一种免疫荧光共定位成像平台的；其特征在于：应用于免疫检测上；其具体步骤如下：
1）将制备的样品倒置置于贴有超薄防水双面胶的盖玻片上;
3
形成一个体积为0.1125μm的腔室；
2）向步骤1）的腔室中加入成像缓冲液；所述成像缓冲液的成分包含巯基乙醇、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、葡萄糖以及Tris-NaCl buffer；并将腔室密封起来;
3）将加入了成像缓冲液的样品放于单分子定位显微镜下进行成像，激发光波长分别为
488 nm和642nm，收集495-575nm和>655nm之间的荧光信号进行双色荧光共定位成像，同时能够检测到FAM和Cy5荧光信号的金纳米阵列才是有效的外泌体结合位点。
一种免疫荧光共定位成像平台的制备方法及应用
技术领域
背景技术
发明内容
（2）将步骤（1）得到的涂有光刻胶的石英片放入电子束光刻机的样品槽中，利用电子束进行纳米阵列的图案化处理，再将其浸泡在铬刻蚀液中，并用去离子水冲洗干净，然后依次放入显影液和定影液中浸泡，最后用去离子水冲洗，用氮气吹干，即可得到图案化的石英片；
（3）将步骤（2）所得的石英片固定在载玻片上，并将载玻片固定于镀膜机上，采用蒸镀的方法，依次镀铬层和金层，将镀好膜的石英片置于丙酮溶液中，加热使石英片表面的光刻胶脱离干净，即可得到带有金纳米阵列的石英片。
（6）将提取的外泌体溶液适当稀释，滴加在步骤（5）所得的金纳米阵列上，常温反应，用PBS冲洗干净并用氮气轻轻吹干；
（7）将适量浓度的检测探针Cy5-HER2核酸适配体滴加在捕获了外泌体的金纳米阵列上，常温反应1h，用去离子水冲洗并用氮气轻轻吹干，即可得到带有两种不同荧光分子的外泌体金纳米阵列检测样品，用于超分辨共定位成像。
加热完毕迅速取出来一次放入常温的丙酮、去离子水、甲醇中，并吹干备用。
3
m的腔室；
2）向步骤1）的腔室中加入成像缓冲液；所述成像缓冲液的成分包含巯基乙醇、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、葡萄糖以及Tris-NaCl buffer；
3）将加入了成像缓冲液的样品放于单分子定位显微镜下进行成像，激发光波长分别为
488 nm和642nm，收集495-575nm和>655nm之间的荧光信号进行双色荧光共定位成像。
附图说明
具体实施方式
2、FAM-HER2-SH与Cy5-HER2核酸适配体均由生工生物工程（上海）公司合成；
3、BSA购自Sigma公司；
4、其余材料均为市售所得。
将石英片在食人鱼溶液中超声清洗30min，之后用清水冲洗并吹干。将石英片放置于旋涂机上，滴加适量的PMMA，以转速为500rpm，增速为2，转动时间9s，然后速度提升到
4000rpm，增速为5，时间60s；烘干的温度为180℃，时间为2min，再利用蒸镀的方法镀上8nm厚的铬层以使石英片可以导电。将涂有光刻胶的石英片放置在电子束刻蚀机中进行图案化处理，经过铬刻蚀液、去离子水、显影液、定影液和去离子水依次浸泡，即可得到图案化的石英片。
上述免疫荧光共定位免疫检测平台在超分辨中的应用为：先利用盖玻片、超薄双面胶、载玻片制备一个观测用的腔室，在腔室中加入成像缓冲液以用于基于单分子定位的超分辨成像。成像缓冲液的配方为巯基乙醇（10μL/mL）、葡萄糖氧化酶（50μg/mL）、过氧化氢酶（50μg/mL）、葡萄糖（100mg/mL）。激发光波长分别为488 nm和642nm，收集495-575nm和>655nm之间的荧光信号进行双色荧光共定位分析。
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