一种球状节杆菌CNA9及其应用
阅读：100发布：2020-11-11
专利汇可以提供一种球状节杆菌CNA9及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一株节杆菌属球状节杆菌(Arthrobacterglobiformis)CNA9，从小麦实验田中分离得到，该菌株保藏编号为CGMCC No.4217。该菌株具有稳定的产IAA的能 力 ，在提供前体物质色 氨 酸的培养基中培养时最高产IAA量可达109g/mL。 温室 和大田检测试验结果表明，CNA9对 植物 具有显著的促生效果，本发明可为 微 生物 菌肥的研发提供一株新型优良菌株。，下面是一种球状节杆菌CNA9及其应用专利的具体信息内容。
一种球状节杆菌CNA9及其应用
技术领域
[0002] 由于传统农业生产中粗放的种植模式下化学农药，杀虫剂，生长调节剂的过量 使用，使环境背负了巨大压力，继而引起的水土流失，土壤退化，农产品安全等问题也 严重影响到人们的生产和生活。同时随着经济社会的发展，人们对高安全高品质农产品 需求的增加，使得在农业生产中高环境亲和力的生物源制剂的需求越趋旺盛，特别是对 微生物肥料和微生物源药剂的需求巨大。
[0003] 目前，国际上的生物源制剂一般分为：动物，植物，微生物。但是在我国农 业实际应用中，可以进行大规模工业化生产的植物源农药、微生物源农药和微生物源肥 料。微生物生长调节剂是介于微生物源农药和肥料间的一种，是利用微生物的生理活性 物质等来调节植物的生长发育，有益于植物生长和产量。这类微生物通常是附生于根际 中的菌，称为植物根际促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)。
[0004] 产IAA菌作为植物根际促生菌（PGPR)中的一种，附着在植物根系或叶表面， 利用植物代谢产生分泌物的同时产生IAA和少量GA等植物激素来影响植物的生理过程 和形态变化。具体表现为可直接促进根的伸长，从而增大了与土壤中营养物质接触的机 会；可提高植物体内内源IAA的含量；诱导植物防卫基因的表达，提高植物体抗病，抗 旱等抗逆性。目前，国际上研究较多的是固氮螺菌（Azospirillumbrasilense)，恶臭假单胞 菌(Pseudomonas putida)禾口根瘤菌（Bradyrhizobiumjaponicum)。2008 年 Spaepen 通过实验 证明巴西固氮螺菌有改变根形态的作用，表现为该菌产生的IAA显著促进了小麦根毛的 形成。恶臭假单胞菌不仅在兰花种子共生萌发中起到了促进作用，而且可以在温室条件 下显著促进番茄的产量。2009年B.AK等从植物根际，叶际中分离出的五种产IAA菌， 它们可使小麦幼苗上株高提高29.16%，分蘖数可提高97.35%，穗长提高25.2%，种子重 量提高13.7%。已有报道中其它对植株有直接促生效果的产IAA菌还有：嗜麦芽黄单胞 菌，蜡状芽胞杆菌，深绿木霉，埃希式菌属，微球菌属，葡萄球菌属等。本发明中提到 的球状节杆菌种在1962年由Katznelson等人在Nature上发表文章指出其产IAA和GA特 性，但有关该菌属菌种在农作物上的研究应用未见报道。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一株球状节杆菌新菌株及其应用。
[0006] 本发明菌株CNA9是从山东省桓台县小麦实验田中分离得到，已于2010年10月 11号在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区大屯路甲3 号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为球状节杆菌CNA9，保藏 号为 CGMCCNo.4217。
[0007] CNA9菌株具体的可通过如下方法分离得到：[0008] 从小麦实验田中采集土样，取5g的土溶解到在45ml无菌生理盐水的三角瓶中， 28°C、120rpm振荡15min后静止lmin，取100 μ 1的上清液加入到装有900 μ 1生理盐水 的Eppendorf管中，进行连续梯度稀释，即稀释成10_2，10_3，10_4倍。分别取以上土 壤悬浮液和10_2，ΙΟ"3, 10_4倍土壤悬浮液稀释液ΙΟΟμΙ在NA培养基（牛肉膏5g/L， 蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L,琼脂15g/L)平板上均勻涂板，超净工作台内吹干，每个浓 度重复3次，28°C温箱内培养36h，无菌牙签挑取细菌单菌落划线纯化后，接种到含有 150mlDF+Trp培养基的500ml容积三角瓶中（蛋白胨5.0g/L，酵母抽提物1.5g/L，牛肉膏 1.5g/L，NaCl 5.0g/L,色氨酸 0.5g/L)的试管中 28°C 培养 7 天后，12000rpm 离心 5min， 取 Iml 上清液于试管中，加入 50 μ 1 Solution KlOmM 磷酸)及 2ml Solution II (lml 0.5M FeCl3溶于50ml 35% HClO4),混勻后于室温中反应25min，显示红色为产IAA菌株。根 据颜色深浅对菌株进行分级，“+++”颜色最深，“++”次之，“ + ”再次。根据颜色 的深浅对产IAA菌进行了初步筛选，对获得的菌株再进行温室促生效果的初步检查，最 终筛选出促生性状良好且产IAA量高的菌株CNA9。
[0009] CNA9具有如下特性：
[0011] 本发明的CNA9菌株的16S rDNA序列与目前发表的节杆菌属（Arthrobacter Sp.W17)16SrDNA(GenBanK登录号：EU596424.1)相似度最高，同源性达100%。综合 生理生化特征鉴定与16S rDNA序列鉴定CNA9为球状节杆菌（Arthrobacter globiformis)。
[0012] 促生试验表明该产IAA菌株CNA9具有稳定的促生能力，可显著提高玉米植株 的生物量和黄瓜、小麦和玉米产量。
[0013] 本发明还提供含有CNA9菌株的菌剂。
[0014] 温室检测试验中，分别以玉米和黄瓜做为指示植物检测了该菌株的促生效 果，结果表明CNA9均表现出显著的促生效果，其中玉米和黄瓜的干鲜重分别增加了 32.53%, 32.86%和75.76%，210% ；大田检测试验中，大豆，小麦和玉米产量的增产效 果分别为8〜12%，10〜15%和10〜13%。本发明可为微生物菌肥的研发提供一株新 型优良菌株。附图说明
[0015] 图1为CNA9菌群数量的日变化。
[0016] 图2为CNA9产IAA量的日变化。
[0017] 图3为温室条件下CNA9对玉米的促生效果。
[0018] 图4为温室条件下CNA9对黄瓜的促生效果。
具体实施方式
[0019] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0020] 实施例1CNA9菌株的鉴定
[0021] 1.1生理生化测定
[0022] 将分离到的菌株（保藏号为CGMCCNo.4217)进行鉴定，生理生化测定的方法按照标准方法（中国科学院微生物研究所细菌分类组，1978;东秀珠、蔡妙英 等，2001)，鉴定指标参考了 Yi-Guang Chenet al. (2009)、Dorothy Jones and Ronald M.Keddie(2006)、G.S.N.Reddyet al. (2002)等的文献报道。如表1 (部分生理生化性状)中所示。
[0023] 表1菌株生理生化鉴定
[0024]
[0025] 注：“ + ”表示阳性，“_”表示阴性，“W”表示弱，“NA”表示为获得数据。
[0026] 1.216S rDNA 序列分析
[0027] 将菌株CNA9接种于液体LB培养基中摇培24h后，取ImL菌液于1.5mL离心 管中，12000r/min离心3min后收集菌体；
[0028] 将菌体加567 μ L TE缓冲液震荡充分悬浮细胞；加入30 μ L 10%的SDS，3 μ L 20mg/mL蛋白酶K倒管并充分混勻，37°C水浴lh，每隔20min颠倒混勻一次；
[0029]力口 100 μ L 5M 的 NaCl 混勻，力口 80 μ L CTAB/NaCl (10% /0.7M)溶液轻混，65°C 水浴20min，每隔4分钟颠倒混勻一次；
[0030] 加入750 μ L的氯仿/异戊醇（24 ： 1)，混勻后12000rpm离心5min ；
[0031] 取上清加入750 μ L的苯酚/氯仿/异戊醇（25 ： 24 ： 1)，混勻后12000rpm离 心 5min ；
[0032] 取上清加入750 μ L的氯仿/异戊醇（24 ： 1)，混勻后12000rpm离心5min ；将 水相转移到新的离心管，加0.6倍体积的异丙醇，轻轻混勻，13000rpm离心15min ；
[0033] 去上清，力Π ImL无水乙醇，轻混，12000rpm离心5min ；
[0034] 去上清，超净工作台吹干，加200 μ L TE溶液溶解沉淀（可在50°C水浴条件下 助溶）；[0035] 加1 μ L 20mg/mL的RNaseA，37°C水浴2h ；加入200 μ L的苯酚：氯仿：异戊 醇（25 ： 24 ： 1)，混勻后 12000rpm 离心 5min ；
[0036] 取水相，加200 μ 1的氯仿：异戊醇（24 ： 1)，混勻，12000r/min离心5min ； 取水相，加20yL 3M的NaAc(pH5.2)，混勻，加二倍体积的无水乙醇，轻轻混勻， 13000rpm 离心 15min ；
[0037] 去上清，加lmL70%乙醇，轻混，12000rpm离心5min ；去上清，超净工作台吹 干，加50 μ L TE溶液溶解沉淀获得CNA9基因组DNA。
[0038] PCR扩增获得 CNA916SrDNA。其中，引物序列如 SEQ ID No.2 和 SEQ ID No.3所示。
[0039] 50yL反应体系为：双蒸灭菌水41.2yL，10XPCR缓冲液5.0 μ L，IOmM dNTP 2 μ L，上、下游引物（10 μ mol/L)各 0.5 μ L，Taq 酶 1U，模板 1 μ L ； PCR 反应 条件：94°C预变性IOmin ；主循环94°C 40s, 56°C 40s, 72°C Imin,循环34次；终延伸 720C IOmin ； 4°C保存。
[0040] PCR扩增产物用的琼脂糖凝胶电泳分析，将所获得的PCR产物用Gel Extraction Kit(OMEGA)回收后由北京诺塞基因组研究中心有限公司测序，其核苷酸序列 如SEQIDNo.l所示。测序结果用DNAman处理后，在NCBI上比对，同源性最高的为 节杆菌属（Arthrobacter Sp.W17)，(GenBanK 登录号：EU596424.1)。[0041 ] 实施例2CNA9菌株产IAA量和菌株生长情况检测
[0042] 2.1菌株的培养：
[0043] 将在LB培养基上活化后的菌株接种于IAA检测培养基DF+Trp中，于28 V， 170r/min摇陪8天。每天从中取定量菌液测菌群数和产IAA的量。
[0044] 2.1.1菌群数测定：
[0045] 取菌液原液于分光光度计600nm下检测吸光度，菌群数随着培养天数的增多而 增多，需要稀释原液到一定倍数，使600nm下的吸光度值在0.1-1之间，保证其准确性， 结果如图1所示。
[0046] 结果表明，菌群数量在第2天达到最高，达109CFU/mL，随着时间的增长， 数量依次降低，在第8天时基本已降至刚接种时的水平，认为菌群基本完成一个生命周期。
[0047] 2.1.2产IAA量的测定：
[0048] 取DF+Trp菌液原液1.5mL于离心管中，12000rpm离心5min，取ImL上清液于 试管中，加入50 μ L Solution I及2mL Solution II反应液，混勻后于室温中反应25min，检 测530nm处吸光度，在标准曲线上比对并计算IAA产量，结果如图2所示。
[0049] 结果表明，产IAA量在第2天骤然增多，认为是菌株达到对数期后开始大量合 成分泌IAA，以后随着时间的增长，IAA积累量变化不大，最高的IAA产量达109g/mLo
[0050] 其中，标准曲线的制作：称取0.0Ig IAA纯品（Sigma)溶于ImL无水乙醇中，混 勻后吸取100 μ 1加去离子水稀释至lmL，混勻后再吸取100 μ 1加去离子水稀释至lmL， 得100yg/mLIAA母液。然后分别配制下列浓度梯度IAA水溶液：5，10，15，20， 25，30μ§/ιιΛ。以去离子水做空白对照。检测不同浓度IAA溶液在530nm处吸光值，绘制IAA含量标准曲线。[0051 ] 实施例3CNA9菌剂的制备
[0052] 3.1菌种活化
[0053] 使用LB培养基，培养基配方为：酵母提取物10g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 1 Og/ L，pH 7.0-7.2。将球状节杆菌（Arthrobacter globiformis) CNA9接种于LB固体培养基斜面上，28°C培养24小时。
[0054] 3.2种子液的培养
[0055] 种子培养用改良523培养基，培养基配方为：蔗糖10g/L，KH2PO4 2.0g/L,酵 母膏 10g/L，CaCO3 5.0g/L，NaCl 0.2g/L，MgS04.7H20 0.3g/L，pH7.0_7.2。挑取活 化好的球状节杆菌（Arthrobacterglobiformis) CNA9单菌落用无菌生理盐水配制成IO8CFU/ mL的菌悬液，以的接种量接种于改良523液体培养基中，28°C摇床震荡培养，转速 为150rpm,培养时间为28h。
[0057] 发酵培养基组成为：葡萄糖8g/L，酵母膏3g/L，NaCl 1.5g/L, KH2PO4 0.5g/L，K2HPO4 0.5g/L, MgSO4JH2O 0.2g/L, (NH4) 2S045g/L, pH 7.0—7.2。把培养好的种子液以2%的接种量接入发酵罐中，28°C，搅拌速度为160rpm，通气量为 1 ： 0.7-0.9 (发酵液体积：每分钟通气量体积）、罐压1.2-1.8F/cm2。发酵54h，菌量达 到 5-10 X IO8CFUAnL 得到球状节杆菌（Arthrobacter globiformis) CNA9 菌株的菌剂。
[0058] 实施例4CNA9菌株温室中对玉米的促生效果检测
[0059] 将CNA9菌株在LB固体培养基上划线活化2天后，接种到含有150ml DF+Trp培养基的500ml容积的三角瓶中中摇培3天。在分光光度计上检测其IAA产量。
[0060] 选取健全的玉米种子，浸入70%酒精中消毒30s，用无菌水冲洗3遍，将种子用 两层纱布包好放入大培养皿中，清水浸湿，使纱布表面形成一层水膜。放入28°C培养箱 中，培养18h左右待种子露白，选取发芽一致的种子备用。
[0061] 取IO7CFUAnL摇培3天的CNA9菌液拌到灭菌沙中，每盆装6kg灭菌沙，同时设清水对照。共两组处理，每组处理10个重复。温室培养，隔天浇水，一个周后每周 浇一次Hoagland营养液，待四个周后收获植株，测量其株高，根长，干鲜重。其中，根 长结果用根系扫描分析系统（WinRHIZ050)进行了分级比较处理。
[0062] 结果如图3和表3，4所示，株高增加16.56%;鲜重增加32.86%;干重增加 32.53% ；接种了 CNA9菌株的玉米根系中，直径大于0.3cm的根的总长度比对照长增长 了 85.60%; O〜0.3cm的根差别不显著，可能是由于这部分根太细，在操作过程中损失 的部分不确定。
[0063] 表3温室条件下CNA9菌株对玉米植株的促生效果
[0064]
[0065] 实施例5CNA9菌株温室中对黄瓜的促生效果检测
[0066] 将黄瓜种子催芽到露白，方法同实施例4。选取发芽一致的种子，放入人工气 候箱（光照12h，黑暗12h; 26°C，相对湿度为80%)育苗，直到第一片子叶长出后，再 选取长势一致的黄瓜幼苗移栽到温室的花盆中，每盆装900g灭菌沙和蛭石混合物。设清 水对照和喷施菌液共两个处理，每个处理4个重复。其中菌液处理操作如下：待黄瓜苗 长到第一片真叶长出后开始喷施一次CNA9菌液，以后每隔一周喷施菌液一次，每天等 量浇水，期间两个处理都同时喷施等量杀虫剂，一个月后收获，分别测量黄瓜的株高， 茎粗，叶片数，叶面积，干鲜重。株高增加138.90%，茎粗增加43.21%，叶片数增加 70%,叶面积增加255.23%，鲜重增加210%，干重增加75.76%。如图4和表5所示。
[0067] 表5温室条件下CNA9对黄瓜的促生效果
[0068]
[0069] 实施例6CNA9菌株中对小麦、玉米、大豆的促生效果检测
[0070] 将培养3天的CNA9菌株发酵液稀释300倍后对小麦、玉米和大豆进行拌种，进 行田间增长促生效果测定，每个作物设置四个重复，收获后测定产量，CNA9对大豆、小 麦和玉米增产效果分别为8〜12%，10〜15%和10〜13%。
[0071] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进 和润饰也应视为本发明的保护范围。
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