强心甾类化合物在制备治疗脓毒症免疫麻痹药物中的用途
阅读：474发布：2020-09-23
专利汇可以提供强心甾类化合物在制备治疗脓毒症免疫麻痹药物中的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及具有强心甾烯类结构母核的化合物用于 治疗 脓毒症免疫麻痹的用途。本发明采用 植物 来源的哇巴因，经实验表明，该化合物能明显逆转小鼠盲肠结扎穿孔+沙 门 氏菌二次打击所致的模拟临床脓毒症免疫麻痹小鼠存活率，抑制免疫麻痹小鼠脾脏与淋巴结CD4+与CD8+细胞的减少。在临床重症脓毒症病人血液单核细胞上，哇巴因能逆转脓毒症导致的单核细胞 抗原 提呈现能 力 降低与TNF-α、GM-CSF、IFN-γ等TH1免疫刺激因子表达 水 平的降低。在脂多糖LPS所致正常人单核细胞内毒素耐受模型上，哇巴因能有效逆转二次脂多糖打击所致单核细胞TNFα表达能力的降低。在目前临床上缺乏有效治疗脓毒性免疫麻痹的药物，尤其是小分子药物的情况下，该类化合物有很好的开发价值与应用前景。，下面是强心甾类化合物在制备治疗脓毒症免疫麻痹药物中的用途专利的具体信息内容。
强心甾类化合物在制备治疗脓毒症免疫麻痹药物中的用途
技术领域
[0001] 本发明涉及将强心甾类化合物用于制备治疗脓毒症免疫麻痹药物的新用途。
背景技术
[0002] 脓毒症发生率高，全球每年有超过1800万严重脓毒症病例，美国每年有75万例脓毒症患者，并且这一数字还以每年1.5%～8.0%的速度上升。脓毒症的病情凶险，病死率高，全球每天约14000人死于其并发症，美国每年约21.5万人死亡。据国外流行病学调查显示，脓毒症的病死率已经超过心肌梗死，成为重症监护病房内非心脏病人死亡的主要原因。近年来，尽管抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的进步，脓毒症的病死率仍高达20%～80%。脓毒症治疗花费高，医疗资源消耗大，严重影响人类的生活质量，已经对人类健康造成巨大威胁。
[0003] 单核细胞、巨噬细胞及中性粒细胞受到感染及非感染性刺激时释放出大量细胞因子等炎性介质，参与促进脓毒症发生发展的促炎反应阶段，这些炎性介质的过度释放可诱发脓毒症、SIRS及脓毒性休克。脓毒症早期全身炎症反应是炎性细胞因子尤其是TNF-α、IL-6、IL-1以及IFN-γ作用的结果(Immunomodulatory therapies in sepsis.Intensive care medicine26,S124-S128,Kox et al.,2000)。当人们认识到TNF-α、IL-6和IL-1所致的炎症反应参与了SIRS、脓毒症及多器官功能障碍综合征(MODS)的致病过程后，便设计了各种针对这些炎症介质的外源性免疫制剂的抗炎治疗。这些抗炎物质包括抗体、可溶性受体、受体拮抗剂等阻抑TNF-α、IL-1等细胞因子作用的特异性物质，以及非甾体类抗炎药、糖皮质激素等非特异性抗炎药物。尽管应用抗炎药物治疗动物脓毒症取得了良好的效果，但有关人体脓毒症的临床抗炎治疗试验却未获成功，甚至使病死率增加(Immunoparalysis as a cause for invasive aspergillosis?Intensive care medicine29,2068-2071.,Hartemink et al.,2003)。
[0004] 有人认为脓毒症抗炎治疗失败的原因之一是对脓毒症的发展过程缺乏精确的免疫监控。研究表明，在脓毒症早期发生促炎反应后机体会迅速出现强烈的抗炎反应，同时伴有大量的抗炎介质的释放，而且有一部分脓毒症患者表现出明显的免疫抑制状态(Sepsis and immune response.World J Emerg Med2,88-92.,Chen et al.,2011)。Kox等也证实在脓毒症早期及后期存在两种免疫状态,即早期的高炎症状态被机体的抗炎机制所拮抗，导致继发的低炎症状态。Bone等也强调，在脓毒症炎症反应的早期出现了代偿性炎症反应综合征(CARS)以抑制炎症反应的发展，这一反应在一些患者中占主导地位并诱导“免疫麻痹”的出现。免疫麻痹是一种获得性免疫缺陷状态，可见于大手术、烧伤、多发性损伤等脓毒症患者，主要表现为脓毒症发展过程中单核细胞人类白细胞分化抗原DR(HLA-DR)表达水平降低，单核细胞所诱导的抗原特异性T淋巴细胞活性降低,单核细胞释放多种细胞因子能力的改变以及多形核白细胞无反应性(Schultz et al.,2000)，其危害在于诱发继发性院内感染，使患者预后不良。CARS假说似乎能够解释抗炎治疗“失败”的原因，并且在一定程度上得到了临床研究的支持。1996年Volk等(Monocyte deactivation-rationale for a new therapeutic strategy in sepsis.Intensive care medicine22,S474-S481,Volk +et al.,1996)报告，CD14 单核细胞HLA-DR水平能够可靠地鉴别脓毒症免疫抑制状态。
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以30%的HLA-DR/CD14 作为阈值，患者预后明显不同。此外，用免疫刺激剂γ-干扰素+
(IFN-γ)治疗能够有效改善免疫状态，在HLA-DR/CD14 被提升的同时，也观察到促炎细胞因子TNF-α释放增加(Interferon gamma-1b in the treatment of compensatory anti-inflammatory response syndrome:a new approach:proof of principle.Archives of internal medicine157,389.,Kox et al.,1997)。显然，这项研究是CARS假说最有力的佐证。
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以30%的HLA-DR/CD14 作为阈值，患者预后明显不同。此外，用免疫刺激剂γ-干扰素+
(IFN-γ)治疗能够有效改善免疫状态，在HLA-DR/CD14 被提升的同时，也观察到促炎细胞因子TNF-α释放增加(Interferon gamma-1b in the treatment of compensatory anti-inflammatory response syndrome:a new approach:proof of principle.Archives of internal medicine157,389.,Kox et al.,1997)。显然，这项研究是CARS假说最有力的佐证。
[0005] 为了逆转脓毒症免疫麻痹，提高存活率，基于细胞因子如GM-CSF、IFN-γ、TNF-α的重新激活免疫系统是可行性策略之一。
[0006] 集落刺激因子CSF是一种调节造血干细胞复制、增殖、分化的细胞因子，其中G-CSF和GM-CSF对中性粒细胞、单核巨噬细胞、淋巴细胞都有正向调节作用，可延迟中性粒细胞凋亡，上调CD11b和CD14分子的表达，增强了黏附趋化性和吞噬杀菌力。临床研究已证明G-CSF和GM-CSF可改善术后严重感染者的单核细胞功能缺陷，增加TNF-α分泌和HLA-DR的表达，及增加淋巴细胞数量、调节T细胞增殖分化、增强Th1的免疫活性等，从而逆转免疫麻痹。Orozco等(Molgramostim(GM-CSF)associated with antibiotic treatment in nontraumatic abdominal sepsis:a randomized,double-blind,placebo-controlled clinical trial.Archives of surgery141,150.Orozco et al.,2006)报道58例非创伤性腹部脓毒症病人，应用莫拉司亭（GM-CSF）联合抗生素治疗，可以降低感染并发症发生率、减少住院时间和费用。
[0007] 临床研究表明IFN-γ可使血浆中IL-6、TNF-α水平以及单核细胞HLA-DR的表达164
增加，从而改善脓毒症患者的免疫状态，提高其存活率 。IFN-γ作为免疫激活剂，给药时间有着严格的控制，因为任何免疫调节治疗都应基于免疫功能的监视。当患者的单核细胞HLA-DR表达较低时,表现出抗炎应答时，低剂量的IFN-γ治疗安全而且有效；而在那些处于促炎反应阶段的患者中使用IFN-γ则是有害的。
增加，从而改善脓毒症患者的免疫状态，提高其存活率 。IFN-γ作为免疫激活剂，给药时间有着严格的控制，因为任何免疫调节治疗都应基于免疫功能的监视。当患者的单核细胞HLA-DR表达较低时,表现出抗炎应答时，低剂量的IFN-γ治疗安全而且有效；而在那些处于促炎反应阶段的患者中使用IFN-γ则是有害的。
[0008] 另外，动物实验研究表明在脓毒症免疫麻痹期给药重组TNF-α，能显著增加动物的存活率，并增强动物肝、脾清除病原微生物能力，表明TNF-α对脓毒症免疫麻痹治疗具有积极意义。然而，重组TNF-α的治疗作用受到很大局限，依赖于动物所感染病原微生物的类型、动物机体自身产生TNF-α的能力以及重组TNF-α给药时间(Treatment of experimental sepsis-induced immunoparalysis with TNF.Immunobiology208,381-389.,Echtenacher et al.,2003)。
[0009] 目前，也有报道使用胸腺肽α1治疗脓毒症，它是一种蛋白多肽激素，属于体内存在的生理物质。胸腺肽α1可以调节严重感染病人的TNF-α、IL-6和IL-10等细胞因子的水平，减轻炎性反应，改善病人的免疫功能。胸腺肽α1作为免疫调节剂在调整病人自身免疫的前提下可以延缓TNF-α、IL-6等促炎细胞因子上升趋势，减轻炎症介质所致的损伤反应，同时能提高抗炎因子IL-10水平，促进抗炎因子和促炎因子保持平衡。尽管胸腺肽α1对脓毒症治疗有积极作用，但不是在脓毒症的任何状态给药都有效。随着对脓毒症免疫状态了解的深入，同时考虑到GM-CSF、IFN-γ或TNF-α蛋白质药物半衰期短、副作用大，寻找具有免疫调节作用的小分子药物是脓毒症治疗有前景的研究方向。
[0010] 强心甾类化合物是一种指在临床上用来治疗心衰的一类小分子化合物，其结构核心为一个甾环，甾环的3位和17位分别被糖链和一个不饱和的内酯还取代。17位内酯环通常是一个五元的丁酯环。3位的糖基常见的有葡萄糖基，半乳糖基，鼠李糖基和地高辛糖基。3位的糖基可以显著地影响强心甙的药物效力和代谢动力学。强心甾类化合物主要从植物中分离获得。近年来，从动物体内发现内源的强心甾类化合物，被称作内源性洋地黄物质（endogenous digoxin-like substances,EDLS），主要包括内源性的哇巴因ouabain、内源性地高辛digoxin、等，进一步研究表明，体内的强心甾类物质主要由肾上腺和下丘脑分泌合成，其前体物质为胆固醇和黄体酮，受肾素、血管紧张素、内皮素和肾上腺素等激素调控。
发明内容
[0011] 本发明的的目的是提供强心甾类化合物用于制备治疗脓毒血免疫麻痹药物的用途。采用本发明所述的强心甾类化合物如哇巴因能有效逆转免疫麻痹小鼠死亡率与脾脏、淋巴结CD4+T细胞下降，并提高临床重症脓毒症病人单核细胞抗原提呈能力与免疫刺激因子的表达水平，逆转脂多糖LPS二次打击所致人单核细胞内毒素耐受。在目前临床上缺乏有效治疗脓毒症免疫麻痹的手段的情况下，应用前景很好。
[0012] 本发明的技术方案是：
[0013] 强心甾烯类化合物在制备治疗脓毒症免疫麻痹药物中的应用。
[0014] 所述强心甾烯类化合物的通式为：
[0015]
[0016] 本发明所述强心甾类化合物如哇巴因。
[0018] 根据药学上所知的构效关系认为强心甾烯类化合物与哇巴因在逆转脓毒症免疫麻痹方面可具有相同（或相似）的生物活性。
[0019] 本发明所述的强心甾类化合物用于治疗脓毒症免疫麻痹的药物，可经注射剂或输液形式给药，给药量因药物不同而各有不同，
[0020] 上述强心甾烯类化合物可通过药学领域熟知的天然药物提取分离方法从洋地黄类植物中获得，药学领域内的技术人员也能够理解强心类化合物也可以通过化学合成的方法获得。
[0021] 本发明人首次采用采用植物来源的哇巴因，经实验表明，该化合物能明显逆转小鼠盲肠结扎穿孔+沙门氏菌二次打击所致的模拟临床脓毒症免疫麻痹小鼠存活率，抑制免疫麻痹小鼠脾脏与淋巴结CD4+与CD8+细胞的减少。在临床重症脓毒症病人血液单核细胞上，哇巴因能逆转脓毒症导致的单核细胞抗原提呈现能力降低与TNF-α、GM-CSF、IFNγ等TH1免疫刺激因子的降低。在脂多糖（LPS）所致正常人单核细胞内毒素耐受模型上，哇巴因能有效逆转二次LPS打击所致单核细胞TNF-α表达能力的降低。在目前临床上缺乏有效治疗脓毒性免疫麻痹的药物，尤其是小分子药物的情况下，强心甾烯类化合物有很好的开发价值与应用前景。附图说明
[0022] 图1：哇巴因的化学结构式。
[0023] 图2：小鼠CLP手术48小时后开始出现免疫麻痹状态，检测CLP后不同时间点小＊ ＊＊ ＊＊＊鼠脾脏中CD4+和CD8+T细胞凋亡情况（n=5）；p<0.05， p<0.01， p<0.001与对照组相比。
[0024] 图3：CLP手术后不同时间点小鼠PBMC中TNF-αmRNA和IL-10mRNA表达变化（n=6）。
[0025] 图4：哇巴因免疫麻痹期给药提高脓毒症小鼠的存活率，哇巴因给药剂量为0.1mg/kg，n=8-12。
[0026] 图5：哇巴因免疫麻痹期给药提高脓毒症小鼠血液细菌清除率，沙门氏菌二次感染48小时后，取血液进行细菌涂板实验。
[0027] 图6：哇巴因免疫麻痹期给药提高脓毒症小鼠脾脏细菌清除率，沙门氏菌二次感染48小时后，取脾脏进行细菌涂板实验。
[0028] 图7：哇巴因免疫麻痹期给药抑制脾脏CD4+和CD8+T细胞数量的减少。沙门氏菌二次感染48小时后，流式细胞检测不同处理组小鼠脾脏中CD4+和CD8+T细胞的比例。
[0029] 图8：哇巴因上调人单核细胞HLA-DRαmRNA的表达，LPS明显下调脓毒症病人和正常人单核细胞中HLA-DRαmRNA的表达。
[0030] 图9：哇巴因上调人单核细胞HLA-DRβmRNA的表达，LPS下调脓毒症病人和正常人单核细胞中HLA-DRβmRNA的表达。
[0031] 图10：哇巴因逆转正常人外周血单核细胞中LPS导致的HLA-DRα/βmRNA下调。＊＊ ＊＊＊
p<0.01， p<0.001与ouabain未处理组相比。
p<0.01， p<0.001与ouabain未处理组相比。
[0032] 图11：脓毒症病人单核细胞对哇巴因刺激更敏感。在50nM哇巴因刺激下，脓毒症＊＊病人单核细胞TNF-αmRNA表达高于正常对照组；N.S.表示没有显著差异， p<0.01与对照组相比。
[0033] 图12：脓毒症病人单核细胞在50nM哇巴因刺激下，TNF-αprotein表达高于正常＊ ＊＊＊对照组，p<0.05， p<0.001，与对照组相比。
[0034] 图13：哇巴因刺激脓毒症病人单核细胞产生GM-CSF mRNA
[0035] 图14：哇巴因刺激脓毒症病人单核细胞产生interferonγmRNA，＊p<0.05，＊＊p<0.01与对照组相比。
[0036] 图15：哇巴因逆转内毒素耐受。
具体实施方式
[0037] 下面的实施例可详细地说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
[0038] 实施例1：免疫麻痹小鼠模型的建立
[0039] 1.1实验方法
[0040] 1.1.1小鼠盲肠结扎穿孔脓毒症模型建立
[0041] 6-8周龄C57/b16雄性小鼠，来源于扬州大学动物实验中心。实验分组：盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture,CLP）组（实验组）和假手术组（sham组），CLP组又根据盲肠的结扎部位和穿孔次数建立不同程度的脓毒症；sham组仅进行开腹、关腹程序。麻醉采用戊巴比妥钠（1%，200-250μl）腹腔注射，腹部正中线切开腹壁进入腹腔，钝性解剖镊分离盲肠并由腹腔托出，避免损伤肠系膜血管，特别是回盲肠动脉的盲肠分支。按预先设计好的严重程度的位置进行结扎，确保不要结扎回盲瓣以保持小肠的连续性。用5ml注射器针头在盲肠结扎的中间位置全层穿透（穿透次数也决定脓毒症程度），并轻挤出少许粪便以保证穿孔处的开放性。盲肠还纳腹腔，连续缝合关腹。6小时后用预热到37℃的无菌盐水皮下注射复苏动物（1mL/只），增加动物脓毒症早期的高血流动力学状态。所有动物手术在10分钟之内完成，保持一致性(Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture.Nature protocols4,31-36,Rittirsch et al.,2008)。
[0042] 1.1.2小鼠外周血单个核细胞（PBMC）分离
[0043] 小鼠眼球取血，收集血液于EDTA-K2抗凝血无菌管中，并与组织稀释液1:1混匀；将混合液置于等体积的细胞分离液液面上，以400g（约1500转/分）离心15分钟；收集第二层环状乳白色单个核细胞，使用4-5ml细胞洗涤液进行洗涤，并以500g（约1800转/分）离心20分钟，弃去上清、留沉淀细胞，并向细胞中加入1ml Trizol，待后续实验研究。
[0044] 1.1.3细胞凋亡测定
[0045] 细胞收集后，采用Annexin V/PI双染，流式细胞仪检测Annexin V(+)/PI(-)细胞确定为凋亡细胞。
[0046] 1.1.4逆转录PCR测定
[0047] 1.1.4.1总RNA提取
[0048] 所有物品均提前用DEPC处理并灭菌。细胞或组织中加入200μl的氯仿/ml Trizol，振荡15秒后放置5min，12000g离心15min，4℃。吸取上层400-500μl，转移到干净eppendorf管中，加入500μl异丙醇（细胞量少时同时加50μl3M醋酸钠和20μg糖原），室温放置10min，12000g离心10min，4℃。可见RNA沉淀。弃去上清，加入1ml70％乙醇洗涤沉淀，7500g离心5min，eppendorf管放置于酒精灯旁晾干RNA沉淀，加入30μl DEPC处理的DDW，55℃溶解10min。
[0049] 1.1.4.2.RNA逆转录
[0051] 1.1.4.3RT-PCR反应
[0052] 取等量的cDNA做模板做PCR扩增，采用20μl PCR反应体系，PCR条件为95℃5min，95℃30秒，55-65℃30秒，72℃30-90秒共20-35个循环，然后72℃延伸10min，PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳，EB显色。
[0053] 1.1.4.4q-PCR反应
[0054] 取逆转录的cDNA作为模板，稀释20-100倍，q-PCR反应体系为SYBR Green是10μL，Forward primer（10μM）1μL，Reverse primer(10μM)1μL，cDNA模板（稀释后）
8μL，每个样品加样3个孔。PCR条件为95℃10min，95℃30秒，60℃60秒共40个循环。
8μL，每个样品加样3个孔。PCR条件为95℃10min，95℃30秒，60℃60秒共40个循环。
[0055] 1.2.实验结果
[0056] 文献研究表明小鼠盲肠结扎穿孔脓毒症模型能够有效模拟临床脓毒症病人的免疫状态，CLP建模48小时后，伴随着细胞因子（包括促炎和抑炎细胞因子）产生能力水平的降低，类似免疫麻痹状态开始显现，并且CLP小鼠对细菌二次感染更加敏感。
[0057] 免疫细胞凋亡、TH1细胞因子向TH2细胞因子的漂移、Treg细胞的激活等是免疫麻痹重要特征，通过建立CLP模型，并考察模型建立后24、48、72小时后脾脏CD4+和CD8+T细胞凋亡情况，发现CLP24小时两种细胞凋亡明显，随着时间凋亡比例逐渐增加（图2）。同时，CLP建模6小时后，小鼠外周血PBMC中TNF-αmRNA的表达到达峰值，然后逐渐下降；而PBMC中IL-10mRNA水平24小时内迅速上升，直到48小时略有下降（图3）。
[0058] 为了进一步模拟临床脓毒症免疫麻痹状态病人易于发生二次感染的病理状态，在小鼠CLP基础上进行沙门氏菌二次打击实验。CLP48小时后，免疫抑制细胞因子大量表达和T细胞大量凋亡等现象表明小鼠已进入免疫麻痹期，因此设定该时间进行腹腔注射一系列cfu的沙门氏菌（S.tm.）进行二次打击，结果表明S.tm.二次打击加速CLP小鼠的死亡（图3
4）。而注射高于2×10cfu的沙门氏菌会使小鼠在很短的时间内快速死亡，不利于后续实
3
验观察，因此将二次打击S.tm.的cfu定为2×10，打击时间定为CLP手术后48小时。该免疫麻痹模型的成功建立为脓毒症免疫麻痹的后续研究奠定基础。
4）。而注射高于2×10cfu的沙门氏菌会使小鼠在很短的时间内快速死亡，不利于后续实
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验观察，因此将二次打击S.tm.的cfu定为2×10，打击时间定为CLP手术后48小时。该免疫麻痹模型的成功建立为脓毒症免疫麻痹的后续研究奠定基础。
[0059] 实施例2：哇巴因提高免疫麻痹小鼠的存活率、细菌清除率以及CD4+和CD8+T细胞数量
[0060] 2.1实验方法
[0061] 2.1.1脓毒症二次感染模型的建立
[0062] 建立CLP脓毒症模型，48小时后腹腔注射200μl含2×103CFU的沙门氏菌(S.tm.，ATCC14028s)菌液进行二次感染。使用GraphPad Prism5.0的生存曲线进行分析，并结合log-rank检验进行显著性比较。
[0063] 2.1.2细菌涂板计数实验
[0064] 取对照组和CLP二次感染小鼠的抗凝血5μl和脾脏匀浆稀释液25μl（使用生理盐水进行梯度稀释）进行涂板，培养基为胰蛋白胨大豆琼脂培养基，过夜培养，并进行细菌计数。
[0065] 2.1.3流式细胞检测CD4+和CD8+T细胞比例
[0066] 取出对照组和CLP组小鼠的脾脏和淋巴结（包括小鼠腋下、胯下、肠系膜淋巴结）于含有2ml预冷PBS的器皿中，将脾脏和淋巴结置于载玻片毛面上，两块载玻片相互摩擦，尽量将细胞挤成单个，再经滤器（70μm孔径）过滤成单个细胞悬液。将脾脏和淋巴结的单个细胞悬液进行分装，每100μl一个样；脾脏悬液需要红细胞裂解液处理，加入1ml红细胞裂解液，室温裂解5min，室温离心2000rpm5min；用1ml预冷PBS重悬脾脏细胞，并将淋巴结悬液用PBS补足到1ml，2000rpm4℃离心5min；接着用1%BSA包被FITC-CD4和PE-Cy5-CD8a抗体（以下步骤都要避光操作），冰上放置20-30min；2000rpm4℃离心5min，弃上清，500μl PBS重悬细胞；将细胞置于流式专用试管中，上流式机器检测。
[0067] 2.2实验结果
[0068] 一定浓度范围的哇巴因（0.05-0.5mg/kg）能够有效提高CLP后免疫麻痹小鼠的存活率(图4)。但值得注意的是，哇巴因在不同时间给药效果明显不同，且给药次数也需严格控制。如图4所示，小鼠CLP6小时后腹腔给药哇巴因（0.1mg/kg），期间第30小时再重复给药一次，第48小时接受S.tm.二次打击，结果发现小鼠在CLP84小时之内全部死亡；在另一方案中，小鼠于CLP48小时接受S.tm.二次打击后，第54小时和78小时两次腹腔给药哇巴因，发现哇巴因能够显著提高小鼠的存活率。这些数据表明哇巴因特异性在免疫麻痹期给药才能提高CLP小鼠的存活率。
[0069] 细菌清除率是免疫功能的重要指标，本研究发现单次S.tm.打击与CLP手术处理，细菌都能够进入小鼠血液与脾脏，而CLP结合S.tm.二次打击能够大量增加血液与脾脏中细菌数目。同样地，CLP免疫麻痹期给药哇巴因也能够显著性提高小鼠对血液（图5）与脾脏（图6）中细菌的清除率。上述结果表明哇巴因在小鼠脓毒症免疫麻痹期能显著增强宿主清除病原微生物能力。
[0070] 另外，脾脏中T淋巴细胞比例明显下降说明脾脏T淋巴细胞发生了过度凋亡，这与机体免疫麻痹状态的发生密切相关。本研究发现哇巴因在免疫麻痹期给药能够抑制CLP结合S.tm.二次打击导致的脾脏中CD4+和CD8+T细胞比例的减少（图7）。结果表明哇巴因在小鼠脓毒症免疫麻痹期可能抑制T细胞凋亡。
[0071] 实施例3：哇巴因提高脓毒症免疫麻痹病人单核细胞抗原提呈能力[0072] 实验方法：
[0073] 3.1实验材料
[0074] 3.1.1脓毒症病例收集
[0075] 患者来自2012年9月～2013年4月期间收住于第二军医大学第一附属医院麻醉科中心ICU确诊为重症脓毒症的患者。本试验通过第二军医大学第一附属医院伦理委员会审批，患者或患者家属获得充分告知，均已签署知情同意书。
[0076] 3.1.2试剂和材料
[0077] LPS和ouabain购自美国Sigma公司；人和小鼠单个核细胞分离液购自天津灏洋生物公司；胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）和胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）购自青岛海博生物公司；TNF-αELISA试剂盒购自美国R＆D公司；Trizol购自美国Invitrogen公司；FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)购自瑞士Roche公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸胺、TEMED购自美国Ameresco公司；PVDF（聚偏二氟乙烯）膜购自美国Pall公司；EDTA-K2抗凝血无菌管购自美国BD公司；流式细胞用红细胞裂解液购自美国BD公司；逆转录试剂盒PrimeScript RT Reagent Kit、PrimeStar高保真DNA合成酶、Taq酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶购自日本Takara公司；胶回收试剂盒购自上海申能博彩生物公司。
[0078] 3.1.3缓冲液
[0079] 10×PBS：2.294g NaH2PO4·H2O，28.96g Na2HPO4·12H2O，85g NaCl溶解于1L DDW中，定容至1L。使用前稀释至1×PBS。
[0080] 10×PBST：2.294g NaH2PO4·H2O，28.96g Na2HPO4·12H2O，85g NaCl溶解于1L DDW中，加5‰Tween20。使用前稀释至1×PBST。
[0081] 3.1.4使用仪器
[0082] 20/20n Luminometer荧光检测仪购自美国Turner Biosystems Instrument公司；FACS Calibur流式细胞仪购自美国BD公司；多功能酶标仪购自美国宝特（Bio-Tek)公司；
实时定量PCR仪购自美国BioRad公司。
实时定量PCR仪购自美国BioRad公司。
[0083] 3.1.5CD14+单核细胞表面HLA-DR的检测
[0084] 收集重症脓毒症病人血液中单核细胞，取流式细胞仪专用试管，并做好标记及相应的顺序编号，每份标本四管，分别为1号管（空白对照管)、2号管（CD14单标管)、3号管（CD14/同型对照双标管)和4号管（CD14/HLA-DR双标管)；在各管中分别加入100μl混匀的抗凝血；接着，向管2中加入CD14(APC)5μl，管3中加入CD14(APC)和同型对照抗体Mouse IgG1PerCP-Cy5.5各5μl，管4中加入CD14(APC)和HLA-DR(PE-Cy5)各5μl，轻轻混匀，室温避光反应15～30min；然后，在各试管中加入流式细胞专用红细胞裂解液(1×)2ml，颠倒混匀，室温避光放置10min；室温条件下300g离心5min，弃上清，再加入2ml PBS洗涤，颠倒混匀，300g离心5min，弃上清；最后，500μl PBS重悬细胞，可立即进行FACS检测。
[0085] 3.1.6逆转录PCR（RT-PCR）和实时定量PCR（q-PCR）
[0086] 方法同1.1.4
[0087] 表1.PCR引物序列如下
[0088]
[0089] 3.2实验结果
[0090] 在先天性免疫应答中，CD14+单核细胞能把经吞噬处理的抗原提呈给T辅助细胞，继而激活T细胞、B细胞和吞噬细胞在内的其它免疫细胞的活性，分泌IL-12、TNF-α等促炎性因子，激活先天性与特异性免疫反应，抵抗病原微生物的入侵。单核细胞抗原呈递能力可通过细胞表面HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD80/86等分子的表达水平体现，其中最主要的是HLA-DR，足够的HLA-DR表达对维持特异性和非特异性免疫功能均十分重要。研究表明，脓毒症病人单核细胞的分泌能力和抗原呈递能力明显受到抑制，并且与病人预后关系密切，该方面以Volk等于1996年开始的研究最具代表性。他们对器官移植合并脓毒症的研究中提出单核细胞表面HLA-DR表达低于30%（相对于正常人组）可以作为临床上免疫麻痹的指标。Kox等使用免疫刺激因子IFN-γ治疗免疫麻痹的脓毒症病人，结果发现HLA-DR表达明显恢复，血浆TNF-α和IL-6水平明显增加。可见HLA-DR可以作为免疫状态的判断指标，根据HLA-DR给予一定的免疫刺激剂有利于免疫平衡的改善。
[0091] 本发明收集了ICU脓毒症病人的血液样本，通过流式细胞检测外周血CD14+单核细胞表面HLA-DR的表达，选取HLA-DR表达低于30%的血液样本，分离得到单核细胞，体外培养并进行药物刺激。结果发现，LPS明显下调脓毒症病人和正常人单核细胞中HLA-DRα/βmRNA的表达，但哇巴因能够一定程度上调HLA-DRα/βmRNA的表达（图8，9）。另外，在正常人单核细胞中，联用哇巴因和LPS处理能够显著逆转由LPS单用导致的HLA-DRα/βmRNA表达下调（图10）。以上结果表明哇巴因能明显改善由LPS介导的人单核细胞抗原提呈能力的降低。
[0092] 实施方案4哇巴因逆刺激脓毒症病人单核细胞表达TNF-α、GM-CSF与interferonγ
[0093] 4.1实验方法
[0094] 4.1.1.人单核细胞的分离
[0095] 取正常人或脓毒症病人外周血，EDTA抗凝，先以200g离心20分钟弃去血浆。接着，向弃去血浆的血细胞中加入两倍于血浆体积的全血及组织匀浆稀释液并小心混匀。将混合液小心叠加于细胞分离液之液面上（混合液：分离液=2：1），再以600g离心15分钟。收集第二层环状乳白色细胞放入离心管中，并加入4倍体积的RPMI-1640培养液，充分混匀后，以500g离心10分钟，弃去上清留沉淀细胞，再重新悬起细胞，重复洗涤2次即得外周血单个核细胞。使用台盼兰染料进行细胞计数，活细胞百分率在95％以上。将分离的单个核
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细胞以4×10/ml数目倾于无菌洁净的塑料培养板内，置37℃、5%CO2培养箱中过夜，用毛细吸管轻轻吸去悬液，再用适量的PBS洗涤两次，贴壁的即为单核细胞。
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细胞以4×10/ml数目倾于无菌洁净的塑料培养板内，置37℃、5%CO2培养箱中过夜，用毛细吸管轻轻吸去悬液，再用适量的PBS洗涤两次，贴壁的即为单核细胞。
[0096] 4.1.2ELISA检测TNF-α含量
[0097] 将不同浓度的TNF-α标准品和实验样品（包括细胞培养上清和血浆）加入到R&D ELISA试剂盒96孔板中，每孔100μl，用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2h；每孔加入洗涤液300μl，洗涤4次，接着加入200μl酶标检测抗体，用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2h；洗涤4次，并在每个孔内加入200μl显色底物，室温避光孵育30min；最后，在每个孔内加入50μl终止液，使用酶标仪测量450nm吸光度值，设540nm作为校正波长。通过标准曲线换算实验样品中TNF-α的含量。
[0098] 4.1.3RT-PCR法检测TNF-α,GM-CSF,interferonγmRNA
[0099] 方法同1.1.4
[0100] 表2.PCR引物序列
[0101]
[0102] 4.2实验结果
[0103] 为了进一步确认哇巴因通过细胞因子TNF-α激活免疫系统，从而逆转免疫麻痹，收集ICU脓毒症免疫麻痹病人的血液和正常人血液样本，分离得到单核细胞，体外培养并进行药物刺激。结果发现脓毒症病人单核细胞比正常人单核细胞对50nM哇巴因更敏感，表现为对TNF-αmRNA（图11）和protein上调更高，而此时脓毒症病人单核细胞对LPS刺激敏感性明显降低（图12），同样地，哇巴因也能刺激脓毒症病人单核细胞GM-CSF（图13）与interferonγ式mRNA表达（图14）。表明哇巴因在免疫麻痹状态下，能够更有效刺激单核细胞免疫激活细胞因子的表达，促进免疫功能恢复。
[0104] 实施方案5.哇巴因逆转LPS诱导的内毒素耐受
[0105] 5.1实验方法
[0106] 5.1.1.人单核细胞的分离
[0107] 方法同4.1.1
[0108] 5.1.2RT-PCR法检测TNF-α
[0109] 方法同4.1.3
[0110] 5.1.3人外周血单核细胞分离和LPS耐受细胞模型的建立
[0111] 使用人外周血单核细胞建立内毒素耐受细胞模型：1μg/ml LPS第一次处理细胞16小时后，PBS洗涤细胞两次，接着使用1μg/ml LPS二次处理细胞，此时细胞表现为对第二次刺激的LPS耐受(LaRue and McCall,1994)。
[0112] 5.2实验结果
[0113] 为了继续验证哇巴因通过TNF-α逆转免疫麻痹，使用人外周血单核细胞建立了内毒素耐受模型进行体外研究，因为脓毒症患者均具有内毒素耐受的特征，并且该模型能够有效的模拟体内免疫麻痹状态。在第一次1μg/ml LPS刺激单核细胞16小时后，接着使用同样浓度LPS进行二次打击，发现此时TNF-αmRNA表达不再上调，从而表明模型建立成功。本研究中发现：在第一次LPS刺激的同时加入50nM哇巴因，并共同处理16小时后，TNF-αmRNA更新量比单用LPS刺激组高，并且对第二次LPS打击表现敏感，此时TNF-αmRNA表达也有所上调（图15）。数据表明哇巴因也能够在细胞水平抑制内毒素耐受。
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