防治大豆胞囊线虫病的菌株及其制剂
专利汇可以提供防治大豆胞囊线虫病的菌株及其制剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种用于防治大豆胞囊 线虫 病的菌株，其名称为淡紫拟青霉CGMCC0241。一种用于防治大豆胞囊线虫病的菌株液体制剂，它是用上述菌株接种，经过三级 发酵 并加入复合添加剂而制成。发酵过程 温度 为24-30℃；pH值为5-8；最终发酵结束时间的条件为镜检观察到的液生孢子数在5×108个/ml以上，菌丝干重在2％以上。也可制成 固体制剂 ，该制剂使用后可长期保持杀灭胞囊线虫的能 力 。，下面是防治大豆胞囊线虫病的菌株及其制剂专利的具体信息内容。
1、一种用于防治大豆胞囊线虫病的菌株，其特征在 于，它是淡紫拟青霉CGMCC0241。
2、一种用于防治大豆胞囊线虫病的菌株液体制剂， 它是采用真菌菌株接种，通过液体三级发酵工艺而制成， 其特征在于，
用于接种的菌株为淡紫拟青霉CGMCC0241；
液体发酵的温度一般控制为24-30℃；PH值为 5-8；
所说三级发酵最终结束时间的掌握条件是镜检观察到 的菌株液生孢子浓度达到5×108个/ml以上，并且 菌丝干重达到2％(W/V)以上。
3、如权利要求2所述的菌株液体制剂，其特征在于， 在制备该制剂时的发酵过程中使用的培养基组合物的成分 如下： 培养基成分 含量 蔗糖 2-5％(W/V，下同) NaCl 0.2-2％ KNO3 0.1-0.8％ K2HPO4 0.02-0.2％ CaCO3和/或CaCl2 0.1-0.8％ FeSO4·7H2O 50-300ppm ZnSO4 50-300ppm MgSO4·7H2O 200-1000ppm CuSO4 2-10ppm NaMoO4·2H2O 2-10ppm H3BO4 5-30ppm 水 余量(补足100％)
4、如权利要求2所述的菌株液体制剂，其特征在于， 在该制剂中还含有0.2-0.5％(W/V)富含几丁 质、胶原蛋白的物质。
5、如权利要求2所述的菌株液体制剂，其特征在于， 在该制剂中还含有2-5％(W/V)的蒜汁和/或大麻 汁。
6、如权利要求2所述的菌株液体制剂，其特征在于， 在该制剂中还含有0.1-0.3％(w/v)的甲基纤 维素。
7、如权利要求2所述的菌株液体制剂，其特征在于， 在该制剂中还含有0.2-0.5％(W/V)富含几丁 质、胶原蛋白的物质；2-5％(W/V)的蒜汁和/或 大麻汁及0.1-0.3％(w/v)的甲基纤维素。
8、如权利要求2所述菌株液体制剂，其特征在于， 其中所说的菌株发酵液经减压浓缩，然后再加入权利要求 7中所述添加剂的一种或多种进行复配而制成。
9、如权利要求2所述菌株液体制剂，其特征在于， 其中所说的菌株发酵液经过过滤，将固、液组分分别处理、 包装，制成待播种时混合施用的制剂。
10、一种用于防治大豆胞囊线虫病的固体菌株制剂， 其特征在于，它是由液体菌剂与固体填充物按(0.5- 1.3)∶1(W/W)混合，阴干和粉碎而制成。
本发明涉及微生物领域，更确切地说，涉及用于防治 植物根部病害，特别是用于防治大豆胞囊线虫病的菌株及 其制剂。
大豆是我国的重要栽培作物之一，其经济价值较高。 近年来由于种植面积不断扩大，重迎茬耕作问题突出，因 而导致大豆病虫害发病面积增加，危害日益严重。在诸多 病虫害中，以大豆胞囊线虫(Hetero dera g1ycines)病的危害最大，其发病面积约占大豆 种植面积的70％以上，一般损失达10-40％，严重 的甚至可造成大豆绝产。对于大豆根部的病害，目前多数 是采用呋喃丹、多福合剂与乙基硫磷等化学农药以及各种 化学种衣剂。这类药物虽然在大豆生长前期有一定防效， 但是由于这类化学农药的大量使用，导致环境的严重污染。 另外，由于药物在土壤中长期积累，降低了土壤肥力，而 且易使病菌及害虫产生抗药性，降低了药物对病虫害的防 治效果。鉴于化学农药的诸多弊病，使得利用生物方法来 防治植物寄生线虫病日益受到关注。在生物防治的过程中， 最关键的问题是要找到并分离出对特定的病虫害有足够杀 灭能力的微生物菌株及用该菌株配制出适于使用的制剂。 迄今为止，用淡紫拟青霉(Paccilomyces lilacinus)来防治根结线虫(Meloido gyne spp.)国外已做过不少试验，例如，菲律 宾已有商品制剂(商品名BIOCON)投放市场，此制 剂通过浸泡马铃薯块茎来防治其根结线虫病的效果很好。 然而这种制剂对于防治大豆胞囊线虫病的效果却很不理想， 所以迄今为止尚未发现有利用深紫拟青霉制剂来防治大豆 胞囊线虫病的报导。这是因为，对于大多数植物而言，其 生活环境十分复杂，菌剂与植物本身、病害虫、土壤等各 方面的条件互相影响。以往的生防菌剂多是作用方式和作 用位点单一，因而防治效果有限，尤其是对用于植物根部 病害的生防菌剂，由于土壤抑菌作用[即土壤抑制真菌孢 子(也包括细菌、放线菌的繁殖体)萌发]的普遍存在，严 重影响了菌剂实际应用于大田中的病害虫防治。特别是对 大面积种植的大豆来说，至今仍未发现一种能有效地防治 大豆胞囊线虫病的生物防治方法。
本发明的目的是要提供一种适用于防治大豆胞囊线虫 病的菌株及其制剂。
本发明人经过多年对各种有关菌株的筛选分离工作， 90年在黑龙江省华楠县孟家岗的大豆连作四年的田块土 壤中，测得每100g土中平均含有胞囊数67.5个。 共检测了128个胞囊，完全寄生的占9.5％。其中发 现了一个胞囊很特别，胞囊内的物质全部被消解掉，而真 菌孢子充满了整个体腔，将孢子转移到PDA平板上培养 繁殖，经鉴定为淡紫拟青霉的特异菌株。另外对50余种 土样一万多个胞囊测定的结果，发现虽有一些寄生菌属于 淡紫拟青霉，但均未发现象上述菌株能在大豆胞囊线虫雌 虫体内产生大量孢子的现象，只是在胞囊内产生菌丝，寄 生或缠绕在卵上。因而本发明人确定，上述分离出的特异 菌株是一种新菌株。将得到的菌株转入含多菌灵(从0. 1ppm至50ppm，逐渐增大浓度)的PDA培养基 中，结果筛选出一种可耐50ppm多菌灵的生防菌株。 多次转代后，该菌株的产孢能力会有所下降，但可通过紫 外诱导的方法使其复壮，即在20w紫外灯下15-20 cm处，隔日辐照一次，每次约15min，一般辐照3 -4次后即可挑选菌落中的回复部分，进行单孢分离，即 可实现菌株复壮。该菌株在PDA培养基上培养时，菌落 正面呈暗紫红色，背面为黑褐色。培养两周后，其菌落直 径即达到79±4mm，产生大量分生孢子，其大小为( 2.4±1.1)×(2.2±0.3)μm。该种菌可 耐50ppm的多菌灵，可寄生于大豆胞囊线虫的卵中及 雌虫体内并能消解利用其中的物质，最终使其分生孢子充 满整个雌虫体腔并导致雌虫死亡，从而使大豆胞囊线虫由 于无法繁殖而很快被消灭。而所测定的淡紫拟青霉中的其 他菌株均未发现上述效果。于是，本发明人将这一特异的 新菌株送往北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心(CGMCC)保藏，其保藏日期为1995年10 月23日，保藏号为CGMCC0241，其名称为淡紫 拟青霉CGMCC0241。另外，如果将本发明的淡紫 拟青霉CGMCC0241采用液体发酵的三级发酵工艺， 并加入复合添加剂制成该菌株的制剂，则更方便于在大面 积的大豆种植田上用于大豆胞囊线虫病的防治。
从而，本发明提供了一种用于防治大豆胞囊线虫病的 菌株，其特征在于，它是淡紫拟青霉CGMCC0241。
另外，本发明还提供了一种用于防治大豆胞囊线虫病 的菌株液体制剂，它是采用真菌菌株接种，通过液体三级 发酵工艺而制成，其特征在于，
用于接种的菌株为淡紫拟青霉CGMCC0241；
液体发酵的温度一般控制在24-30℃，优选为2 6-28℃；PH值一般控制在5-8，优选PH6-7；
所说三级发酵最终结束时间的掌握条件是镜检观察到 的菌株液生孢子浓度达到5×108个/ml以上，优选 是达到7×108个/ml以上，并且菌丝干重达到2％ (W/V)以上。
上述三级发酵工艺是指从试管原种开始，经过三角摇 瓶、种子罐、发酵罐的三级发酵，接种量一般为5-10 ％，这些是现有技术，但对本发明的淡紫拟青霉来说，在 发酵过程中的温度、PH值和发酵时间皆应限定在上述范 围内。发酵时间一般与培养基的组成、发酵温度、发酵罐 的体积、通气条件等有关。通常摇瓶和种子罐的发酵时间 各为1.5-2.5天，发酵罐的发酵时间为2-4天， 总发酵时间约为一周。
上述的液体发酵所用的培养基设有严格限制，它可以 采用现有技术中一般的真菌培养基，但本发明人通过研究 后发现，根据大豆营养需求及我国大豆主产区土壤矿质元 素的分布规律，应适当添加一定比例(从数个ppm至数 百个ppm)的微量元素(如硼、钼等)。在培养基中加 入一定氯化钠和钙盐(0.1-2％)，可明显地增加产 孢率和抑制杂菌生长。
因此，本发明采用的培养基成分如下： 培养基成分 含量 蔗糖 2-5％(W/V，下同) NaCl 0.2-2％ KNO3 0.1-0.8％ K2HPO4 0.02-0.2％ CaCO3和/或CaCl2 0.1-0.8％ FeSO4·7H2O 50-300ppm ZnSO4 50-300ppm MgSO4·7H2O 200-1000ppm CuSO4 2-10ppm NaMoO4·2H2O 2-10ppm H3BO4 5-30ppm 水 余量(补足100％)
在上述成分中，一些元素(氯和钙)具有抑制有害细 菌生长的效果。同时，适量钙盐可在一定程度上提高植株 耐病性。另外，由于我国大豆种植地区的土壤中缺少钼和 硼，因此适当补充这两种微量元素十分重要。其他各种成 分都是有利于淡紫拟青霉的繁殖或有利于大豆生长的成分。
在菌株液体发酵的基础上，控制发酵液PH值，并复 合多种添加剂研制成具有多种作用方式，多位点的新型生 防菌剂-大豆保根菌剂。首先，为利于真菌的生长繁殖， 将发酵液PH值调至微酸性条件(PH6.0-6.5)。 几丁质成分一方面在分解后可释放出杀线物质，同时又可 以刺激加强生防菌对线虫的侵染，而且还能够给微生物、 植株提供丰富的营养，克服土壤对真菌菌剂的抑制作用， 增强植株耐病性。在发酵生产结束后，选择加入0.2- 0.5％(W/V)富含几丁质、胶原蛋白的物质(主要 为虾、蟹等动物的甲壳)。另外，一些植物具有良好的杀 线虫效果，选择在发酵液中加入2-5％(W/V)的蒜 汁和/或大麻汁。另外，在菌液中加入0.1-0.3％ (w/v)的甲基纤维素，以增加菌液粘稠度和均匀度， 同时使菌剂更牢固地包衣在大豆种子上。
上述的三类添加剂，既可单独使用其中的任一类，也 可以使用其中的任两类或者三类结合使用。
另外，本发明菌株液体制剂的另一种优选方案的特征 在于，其中所说的菌株发酵液经减压浓缩，然后再加入上 述各种添加剂中的一种或多种进行复配而制成。其中所述 的添加剂包括富含几丁质、胶原蛋白的物质；蒜汁和/或 大麻汁；甲基纤维素。该方案的优点是便于贮存和运输。
另外，本发明菌株液体制剂的另一种优选方案的特征 在于，其中所说的菌株发酵液经过过滤，将固、液组分分 别处理、包装，制成待播种时混合施用的制剂。该方案的 优点也是便于贮存和运输。
另外，本发明还提供了一种用于防治大豆胞囊线虫病 的固体菌珠制剂，其特征在于，它是由上述液体菌珠制剂 与固体填充物按(0.5-1.3)∶1(w/w)混合、 阴干和粉碎而制成。
上述的固体填充物最好是由硅藻土70重量％和草炭 30重量％混合而成。
本发明的液体菌株制剂的使用方法如下：按播种每亩 所用的大豆种子量(约5-6kg大豆)加100ml的 液体菌剂混合，包衣种子，待晾干后即可进行正常播种。 此外根据不同的耕作条件及生产规模，还可以采用其他后 处理工艺，例如将液体菌剂浓缩后复配，或将发酵液过滤， 将固、液组分分别处理包装，待播种时再混合施用。
本发明的固体菌株制剂的使用方法是将该制剂的粉碎 细粒或其成形颗粒剂与大豆种子混合均匀后再进行正常的 播种。
与现有技术的化学农约或类似生物农约相比，本发明 的用于防治大豆胞囊线虫病的液体或固体菌株制剂具有如 下优点：1、可以寄生于线虫的胞囊、雌虫体内及卵中， 抑制其发育和繁殖，从而显著地减少土壤中线虫种群数量； 2、淡紫拟青霉在液体发酵过程中产生的代谢物可抑杀胞 囊线虫的2龄幼虫；3、能有效地克服土壤的抑菌作用， 可以长期地保持淡紫拟青霉的杀线虫的能力；4、可定殖 于大豆植株的根际，拮抗线虫及根腐菌的浸染；5、可调 节根际微环境(包括酶活性及微生物群落)，有利于大豆 生长；6、增加大豆须根量，并增加根瘤数量和体积；7、 促进大豆生长，增加大豆耐病性；8、制剂中的有机添加 物分解后能释放出抑杀线虫及病菌的物质，即通过多个位 点、多种方式作用于线虫生活史的各个阶段，从而能长期 地保持杀线虫和抑制病菌的能力。
下面通过具体实施例来进一步解释本发明。
实施例1
采用试管培养的淡紫拟青霉CGMCC 0241原 种，再按三角摇瓶→种子罐→发酵罐的三级发酵工艺培养， 接种量为7％，采用的培养基组合物成分如下： 培养基成分 含量 蔗糖 3％(W/V，下同) NaCl 1％ KNO3 0.3％ K2HPO4 0.1％ CaCO3 0.3％ FeSO4·7H2O 100ppm ZnSO4 100ppm MgSO4·7H2O 500ppm CuSO4 5ppm NaMoO4·2H2O 5ppm H3BO4 10ppm 水 余量(补足100％)
控制发酵温度在26-28℃；PH6.5±0.5一、 二级发酵时间各定为2天，三级发酵结束时间定为发酵液 中液生孢子浓度达到6×108个/ml，整个发酵时间 为7天。发酵结束后测得的菌丝干重为2％(W/V)。调 节菌液PH值为6.0，往该发酵液中加入0.25％(W /V)的蟹壳粉、3％(W/V)的蒜汁和0.2％(W/V) 的甲基纤维素，混合均匀后按每100ml制剂与3kg 大豆种子(一亩的用量)混合拌种，共试验100亩地。 另外，为了对比起见，在同一地区划出10亩地未使 用本发明的制剂。结果表明，在使用本发明制剂的100 亩大豆中，胞囊线虫病明显减轻，较对照减少65％，对 根腐病防效40％以上，大豆的平均亩产要比未使用本发 明制剂的平均亩产高出约20％。
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