刚毛柽柳COL转录因子编码基因及其应用
阅读：200发布：2020-05-11
专利汇可以提供刚毛柽柳COL转录因子编码基因及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及刚毛柽柳COL转录因子编码基因及其应用，属于 植物 基因工程育种技术领域。为解决无法利用刚毛柽柳的COL转录因子编码基因培育出耐盐能 力 优良的木本植物的问题，本发明提供了刚毛柽柳COL转录因子编码基因及其应用。本发明的刚毛柽柳COL基因，cDNA全长1296bp，cDNA序列编码的 氨 基酸序列包括431个氨基酸，可用于培育耐盐转基因植物品种。构建ThCOL基因的过表达和抑制表达载体，通过瞬时侵染获得转基因刚毛柽柳。通过组织化学 染色 和生理指标测定等试验发现刚毛柽柳ThCOL基因过表达株系具有明显的耐盐能力，因此刚毛柽柳COL转录因子编码基因是用于林木耐盐基因工程育种的优良基因。，下面是刚毛柽柳COL转录因子编码基因及其应用专利的具体信息内容。
1.刚毛柽柳COL转录因子编码基因，即刚毛柽柳ThCOL基因，其特征在于，所述刚毛柽柳ThCOL基因的cDNA序列如SEQ ID No：1所示。
2.如权利要求1所述刚毛柽柳ThCOL基因，其特征在于，所述cDNA序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种含有权利要求1所述刚毛柽柳ThCOL基因的植物过表达载体。
4.一种含有权利要求3所述植物过表达载体的重组基因工程菌。
5.如权利要求4所述重组基因工程菌，其特征在于，将含有刚毛柽柳ThCOL基因的植物过表达载体导入宿主菌构建而成，所述宿主菌为大肠杆菌或农杆菌。
6.如权利要求1所述的刚毛柽柳ThCOL基因在提高植物耐盐性或选育耐盐性转基因植物中的应用。
7.如权利要求6所述刚毛柽柳ThCOL基因的应用，其特征在于，所述应用包括构建含有刚毛柽柳ThCOL基因的植物过表达载体，将所构建的植物过表达载体转化到木本植物中，培育得到耐盐性转基因木本植物。
8.如权利要求7所述刚毛柽柳ThCOL基因的应用，其特征在于，所述木本植物为杨树或白桦树。
刚毛柽柳COL转录因子编码基因及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 盐碱、低温和干旱等一些非生物性胁迫会导致植物发生一系列形态学、生理学、生物化学和分子水平的变化，严重影响植物的生长发育，甚者导致植物死亡。植物为了适应周围的环境，当受到高盐、低温、干旱等胁迫时，细胞迅速感知外界胁迫信号通过一系列信号传递过程，产生应激信号并汇集到细胞核内，最终激活特定转录调控因子。转录因子通过功能区域进入细胞核，直接与特定基因启动子中的顺式作用元件相结合，或与其他转录因子的功能区域相互作用来调控特异基因的表达。由于转录因子能调控多个下游基因的表达，因此，在植物基因工程育种中，与转入一个功能基因相比，转入一个转录因子可能更能提高植物的抗逆能力。
[0003] Putterill等通过图位克隆的方法首先在拟南芥开花延迟突变体中分离到CO基因，随后，人们又在拟南芥中分离到16个CONSTANS-LIKE(COL)基因，这些基因共同组成一个COL转录因子家族。COL蛋白由N-端的B-box结构域和C-端的CCT结构域组成。已有研究表明COL转录因子在植物中参与很多生理和生化过程，如在开花时间、分支、避荫响应、光形态发生或根伸长方面发挥着一定的作用。
[0004] 刚毛柽柳(Tamarix hispida)是一种抗逆能力非常优良的木本盐生植物，能在含盐量达1％的土壤中形成天然林，因此是研究耐盐机理和进行耐盐基因克隆的理想材料。目前对刚毛柽柳的COL转录因子的耐盐功能了解较少，还无法深入了解其耐盐机理，无法利用刚毛柽柳的COL转录因子编码基因培育出耐盐能力优良的木本植物。
发明内容
[0005] 为解决无法利用刚毛柽柳的COL转录因子编码基因培育出耐盐能力优良的木本植物的问题，本发明提供了刚毛柽柳COL转录因子编码基因及其应用。
[0006] 本发明的技术方案：
[0007] 刚毛柽柳COL转录因子编码基因，即刚毛柽柳ThCOL基因，所述刚毛柽柳ThCOL基因的cDNA序列如SEQ ID No：1所示。
[0008] 进一步的，所述cDNA序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0009] 一种含有所述刚毛柽柳ThCOL基因的植物过表达载体。
[0010] 一种含有所述植物过表达载体的重组基因工程菌。
[0011] 进一步的，将含有刚毛柽柳ThCOL基因的植物过表达载体导入宿主菌构建而成，所述宿主菌为大肠杆菌或农杆菌。
[0012] 刚毛柽柳ThCOL基因在提高植物耐盐性或选育耐盐性转基因植物中的应用。
[0013] 进一步的，所述应用包括构建含有刚毛柽柳ThCOL基因的植物过表达载体，将所构建的植物过表达载体转化到木本植物中，培育得到耐盐性转基因木本植物。
[0014] 进一步的，所述木本植物为杨树或白桦树。
[0015] 本发明的有益效果：
[0016] 本发明的刚毛柽柳ThCOL基因，cDNA全长1296bp，cDNA序列编码的氨基酸序列包括431个氨基酸，可用于培育耐盐转基因植物品种。构建ThCOL基因的过表达和抑制表达载体，通过瞬时侵染获得转基因刚毛柽柳，通过组织化学染色和生理指标测定等试验发现刚毛柽柳ThCOL基因过表达株系具有明显的耐盐能力，因此，刚毛柽柳COL转录因子编码基因是用于林木耐盐基因工程育种的优良基因。
附图说明
附图说明
[0017] 图1为COL转录因子编码基因保守区预测图；
[0018] 图2为刚毛柽柳ThCOL蛋白与其它16种植物COL蛋白多序列比对图；
[0020] 图4为NaCl胁迫下瞬时转化柽柳ThCOL基因表达模式分析图；
[0021] 图5为NaCl胁迫下转ThCOL基因和对照刚毛柽柳组织化学染色分析图；
[0022] 图6为NaCl胁迫下转基因刚毛柽柳H2O2含量的测定分析图；
[0023] 图7为NaCl胁迫下转基因刚毛柽柳MDA含量的测定分析图；
[0024] 图8为NaCl胁迫下转基因刚毛柽柳相对电导率含量的测定分析图。
具体实施方式
[0026] 实施例1刚毛柽柳COL转录因子编码基因的克隆
[0027] 刚毛柽柳种子播种于泥炭土与沙按质量比2:1配制的人工土中，置于相对湿度为65～75％、光强为400μmol·m-2·s-1、平均温度为22±2℃的温室中生长。生长2个月后，用
0.3mol·L-1NaHCO3溶液浇灌根部，进行胁迫处理，分别在处理0h、12h、24h和48h取其叶和根放入液氮中速冻用于RNA的提取。
0.3mol·L-1NaHCO3溶液浇灌根部，进行胁迫处理，分别在处理0h、12h、24h和48h取其叶和根放入液氮中速冻用于RNA的提取。
[0028] CTAB法提取各胁迫处理时期柽柳苗的RNA，将提取的RNA样品送至深圳华大基因科技有限公司进行转录组文库的构建和测序。将获得的各处理时期的RNA测序结果进行对比拼接，对测序比对拼接后的结果用“CONSTANS-LIKE transcription factor”作为关键词进行查找，对查找后的序列进一步利用BLASTX软件进行比对确认，结合ORF founder程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf.html)确定是否具有完整的开放读码框。选择具有完整ORF的COL基因。
[0029] 根据COL转录因子编码基因的特征，设计了如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的特异性上下游引物—ThCOL-F和ThCOL-R，以柽柳cDNA为模板，进行COL转录因子编码基因RT-PCR克隆。
[0030] RT-PCR反应体系为20μL，其中包括模板2μL，ThCOL-F和ThCOL-R引物(10μmol/L)各1μL，dNTP Mix(10mmol/L)0.4μL，10×LA Taq PCR buffer 2.0μL，LA Taq(5U/μL)0.25μL。
反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。
反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。
[0031] 将通过胶回收获得的目的基因连接到pMD18-T载体，随后将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆分别用基因引物-ThCOL-F和ThCOL-R和如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的载体引物-pMD18-T-F和pMD18-T-R进行PCR验证并进一步测序验证，得到如SEQ ID No：1所示的刚毛柽柳COL转录因子编码基因的全长cDNA序列。
[0032] 实施例2利用生物信息学软件和在线网络资源对刚毛柽柳COL转录因子编码基因进行序列分析
[0033] 如SEQ ID No：1所示实施例1克隆得到的刚毛柽柳COL转录因子编码基因编码区长1296bp。编码如SEQ ID NO：2所示的431个氨基酸。
[0034] 利用网址为(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)的ProtParam软件计算推导刚毛柽柳COL转录因子编码基因编码的蛋白质分子量及理论等电点，结果表明该基因编码蛋白分子量为47.75kDa，理论等电点为5.78。
[0035] 通过网址为(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastx&BLAST_PROG RAMS＝blastx&PAGE_TYPE＝BlastSearch&SHOW_DEFAULTS＝on&LINK_LOC＝blasthome)的BLASTx数据库对刚毛柽柳COL转录因子编码基因进行相似性分析，比对结果如图1所示，实施例1获得的刚毛柽柳COL转录因子编码基因含有保守的B-BOX结构域，因此命名为ThCOL基因。
[0036] 利用网址为(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)的Blast程序进行序列同源性搜索，选择与其相似程度高的其它16种不同植物的COL基因氨基酸序列，然后通过BioEdit软件进行多序列比对。所选择的16种植物的COL基因分别为：
[0037] Herrania umbratica(XP_021296421.1)、Durio zibethinus(XP_022727938.1)、[0038] Theobroma cacao(XP_007032965.2)、Gossypium darwinii(AJR28657.1)、[0039] Gossypium australe(KAA3461084.1)、Thespesia populneoides(AJR28659.1)、[0040] Gossypium raimondii(XP_012436773.1)、Populus trichocarpa(XP_006373513.2)、
[0041] Populus alba(TKS00140.1)、Oxybasis rubra(ACB36911.2)、
[0042] Populus euphratica(XP_011021143.1)、Hibiscus syriacus(KAE8659347.1)、[0043] Malus domestica(XP_008341828.2)、Hevea brasiliensis(XP_021680019.1)、[0044] Juglans regia(XP_018834143.1)、Arabidopsis thaliana(AT5G24930.1)。
[0045] 进一步通过Clustal软件对该基因编码蛋白序列与其他相似程度高的16种植物的COL基因的序列同源性比较发现，结果如图2所示，刚毛柽柳COL蛋白与其他各植物中COL蛋白的同源性不高，但都具有保守的B-BOX结构域。
[0046] 实施例3ThCOL基因在不同非生物胁迫和激素处理下的表达模式分析[0047] ThCOL转录因子在植物抗逆调控中起重要的作用。克隆获得1个单一并具有完整开放读码匡的柽柳ThCOL基因，并对其序列进行分析后，为研究柽柳ThCOL基因功能，进一步通过实时荧光定量RT-PCR，分析其在不同非生物胁迫：高盐-400mmol NaCl、干旱-20％PEG、重金属-150μmol CdCl2和激素胁迫：ABA-100μmol、GA3-50μmol处理条件下的表达谱。
[0048] 图3所示为刚毛柽柳ThCOL蛋白在不同非生物胁迫和激素处理下的表达模式分析图，结果表明，在三种非生物胁迫和两种激素处理下，ThCOL在柽柳根和叶中的表达至少在一个胁迫处理时间点发生了变化，表明ThCOL转录因子能响应上述三种非生物胁迫：NaCl，PEG，CdCl2和两种激素胁迫：ABA，GA3，特别是在NaCl胁迫下几乎所有研究的时间点柽柳根和叶中的表达均显着上调，表明ThCOL基因可能与盐胁迫有关。
[0049] 实施例4构建刚毛柽柳ThCOL基因的过表达载体
[0050] 根据植物过表达载体pROKII的多克隆位点及BioEdit软件对目的基因的特征分析，在目的基因5’端和3’端分别引入BamHI和KpnI限制性内切酶位点。以未胁迫处理柽柳的叶和根组织反转录获得的cDNA为模板，以SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的基因特异性上下游引物pROKII-ThCOL-F和pROKII-ThCOL-R为引物进行PCR扩增。
[0051] PCR反应体系如表1所示：
[0052] 表1
[0053]
[0054] PCR反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸7min。
[0055] 使用胶回收试剂盒对对PCR获得的ThCOL目的基因进行回收纯化。用BamHI和KpnI限制性内切酶对回收纯化的ThCOL目的基因片段和pROKII载体质粒分别进行双酶切，37℃反应4～6h，酶切体系如表2所示：
[0056] 表2
[0057]
[0058] 将酶切产物分别用胶回收试剂盒进行回收纯化。回收纯化后的经双酶切的ThCOL目的基因片段和pROKII载体片段于16℃连接8～12h，构建重组载体pROKII-ThCOL，连接体系见表3。
[0059] 表3
[0060]
[0061]
[0062] 将所构建的重组载体pROKII-ThCOL转化到大肠杆菌感受态细胞，挑取6个阳性单克隆菌斑扩大培养。
[0063] 使用如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示的基因特异性上下游引物pROKⅡ-ThCOL-F、pROKⅡ-ThCOL-R和SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10所示的过表达载体pROKII的上下游引物pROKⅡ-F、pROKⅡ-R进行菌液PCR检测，反应体系见表4：
[0064] 表4
[0065]
[0066] PCR反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸7min。
[0067] 选取2个能扩增出特异目的条带的克隆进行测序，正确的即为植物过表达载体pROKII-ThCOL，保存菌株并提取pROKII-ThCOL大肠杆菌质粒备用。
[0068] 实施例5转化根瘤农杆菌及阳性克隆PCR检测
[0069] 用液氮冻融法转化EHA105，具体步骤如下：
[0070] (1)使用CaCl2法制备EHA105感受态，取实施例4所得pROKII-ThCOL质粒0.1～1μg(5-10μL)于50μL农杆菌感受态EHA105，混合后冰浴30min；
[0071] (2)放入液氮中5min，迅速转移至37℃水浴锅，水浴5min，再冰浴静置2min；
[0072] (3)加入500μL不含任何抗生素的LB液体培养基，置于28℃摇床，200rpm震荡2～4h；
[0073] (4)取上述转化混合液150-300μL，均匀的涂于含50mg/L Rif和50mg/L Kan的LB固体培养基上，28℃恒温培养2d。
[0074] 随机挑取6个阳性单克隆，接种于含50mg/L Kan和50mg/L Rif的LB液体培养基中，28℃，200rpm摇床过夜培养。
[0075] 取10μL菌液，98℃变性5min。以变性菌液为模板，使用如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示的基因特异性上下游引物pROKⅡ-ThCOL-F、pROKⅡ-ThCOL-R和SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10所示的过表达载体pROKII的上下游引物pROKⅡ-F、pROKⅡ-R进行菌液PCR检测阳性克隆。
[0076] 用1％琼脂糖凝胶电泳检测，若目的条带特异且大小正确，保存pROKII-ThCOL农杆菌菌种备用。
[0077] 对比例1：构建刚毛柽柳ThCOL基因的抑制表达载体
[0078] 1、构建pFGC5941-ThCOL-Cis
[0079] 根据植物干扰载体pFGC5941的多克隆位点，及BioEdit软件对目的基因的特征分析。在目的基因5’端和3’端分别引入NcoI、AscI限制性内切酶位点。
[0080] 以pROKII-ThCOL质粒为模板，如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的pFGC5941-ThCOL-Cis-F/R为引物进行PCR，扩增带有NcoI、AscI限制性内切酶位点的目的基因。PCR体系如表5所示：
[0081] 表5
[0082]
[0083] PCR反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。
[0084] 用胶回收试剂盒对PCR产物ThCOL-Cis目的片段进行回收纯化。用NcoI、AscI限制性内切酶分别双酶切ThCOL-Cis目的基因片段和植物干扰载体pFGC5941质粒。
[0085] 双酶切反应体系如表6所示：
[0086] 表6
[0087]
[0088] 37℃温育4h后，将获得的酶切产物分别进行回收纯化。
[0089] 用T4 DNA ligase将纯化好的ThCOL-Cis双酶切目的片段与植物干扰载体pFGC5941双酶切大片段进行连接，T4 DNA ligase连接体系，如表7所示：
[0090] 表7
[0091]
[0092] 16℃连接12～16h，重组为载体pFGC5941-ThCOL-Cis。
[0093] pFGC5941-ThCOL-Cis连接液热击法转化大肠杆菌感受态细胞，随机挑取6个阳性单克隆，接种于含50mg/L Kan的LB液体培养基中，37℃摇床，200rpm过夜。
[0094] 取10μL菌液，98℃变性5min。以菌液为模板，分别以SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的Cis-F/R和SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的pFGC5941-ThCOL-Cis-F/R为引物进行菌液PCR检测阳性克隆，PCR反应体系如表8所示：
[0095] 表8
[0096]
[0097]
[0098] 用1％琼脂糖凝胶电泳检测，若条带大小正确，保存菌种，用质粒(小量)提取试剂盒提取质粒并测序验证。
[0099] 2、构建pFGC5941-ThCOL-Anti
[0100] 以pROKII-ThCOL质粒为模板，如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的pFGC5941-ThCOL-Anti-F/R为引物进行PCR扩增带有XbaI、BamHI限制性内切酶位点的目的基因。
[0101] PCR反应体系如表9所示：
[0102] 表9
[0103]
[0104] PCR反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min。用胶回收试剂盒回收PCR产物即ThCOL-Anti目的片段进行纯化。
[0105] 用XbaI、BamHI限制性内切酶分别双酶切ThCOL-Anti目的基因片段和重组载体pFGC5941-ThCOL-Cis。双酶切反应体系如表10所示：
[0106] 表10
[0107]
[0108] 37℃温育2h。将获得的酶切产物分别进行回收纯化，用T4 DNA ligase将纯化好的ThCOL-Anti双酶切目的片段与pFGC5941-ThCOL-Cis双酶切大片段进行连接，[0109] T4 DNA ligase连接体系，如表11所示：
[0110] 表11
[0111]
[0112] 16℃催化连接12～16h，重组载体pFGC5941-ThCOL。将pFGC5941-ThCOL转化到大肠杆菌感受态细胞。
[0113] 随机挑取6个阳性单克隆，接种于含50mg/L Kan的LB液体培养基中，37℃摇床，200rpm过夜培养。
[0114] 取10μL菌液，98℃变性5min。以变性菌液为模板，分别以SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的Anti-F/R和SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的pFGC5941-ThCOL-Anti-F/R为引物进行菌液PCR检测阳性克隆。
[0115] PCR反应体系如表12：
[0116] 表12
[0117]
[0118] 用1％琼脂糖凝胶电泳检测，若目的条带特异且大小正确，保存pFGC5941-ThCOL大肠杆菌菌种，提取质粒并测序验证，转农杆菌菌株EHA105。
[0119] 随机挑取6个阳性单克隆，接种于含50mg/L Kan和50mg/L Rif的LB液体培养基中，28℃摇床，200rpm过夜培养。
[0120] 取10μL菌液，98℃变性5min。以变性菌液为模板，分别以SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的Cis-F/R、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的pFGC5941-ThCOL-Cis-F/R、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的Anti-F/R和pFGC5941-ThCOL-Anti-F/R为引物进行菌液PCR检测阳性克隆。
[0121] 用1％琼脂糖凝胶电泳检测，若目的条带特异且大小正确，保存pFGC5941-ThCOL农杆菌菌种备用。
[0122] 实施例6：刚毛柽柳ThCOL基因的瞬时转化
[0123] 本实施例利用瞬时转化技术将实施例4构建完成的过表达载体pROKII-ThCOL(OE)和对比例1构建完成的抑制表达载体pFGC5941-ThCOL(SE)分别转入刚毛柽柳中，使ThCOL基因瞬时过表达或抑制表达。同时，将空pROKII载体转入刚毛柽柳作为对照(CON)。
[0124] 1.培养基的配制
[0125] 侵染液的配制：270mM甘露醇+40mM CaCl2+120μM AS+2％蔗糖+2mM MES/KOH+20μM 5-Azacytidine+200mg/L DTT+0.5mg/L NAA+2mg/L 6BA+0.02％Tween(PH＝5.6)[0126] 洗涤液的配制：40mM CaCl2+120μM AS+3％蔗糖+0.5mg/L NAA+2mg/L 6BA+200mg/L DTT
[0127] 其中AS、DTT、NAA、6BA、Tween不可高温灭菌，应高温灭菌后再加。
[0128] 共培养固体培养基：MS+0.5mg/L NAA+2mg/L 6BA+150μM AS+200mg/L DTT+7g/L琼脂+1％蔗糖
[0129] 胁迫培养基：MS+150mM NaCl
[0130] 2.侵染工程菌的制备
[0131] (1)将pROKII-ThCOL(OE)、pROKII(CON)、pFGC5941-ThCOL(RNAi)农杆菌菌种分别划线接种于含50mg/L Rif和50mg/L Kan的LB固体培养基上，28℃培养两天；
[0132] (2)挑取单菌落接种于含50mg/L Rif和50mg/L Kan的少量LB液体培养基中，28℃，200rpm过夜培养至OD＝0.8；
[0133] (3)取1mL小摇菌液于50mL液体LB培养基(含50mg/L Rif+50mg/L Kan+5mM SPD+20μM 5-Azacytidine+120μM AS+150mg/L DTT)进行二次活化，28℃，200rpm震荡培养至菌液OD600为0.7；
[0134] (4)将菌液转移至50mL灭菌离心管，放入低温高速大容量离心机3000rpm离心10min，收集菌体；
[0135] (5)将菌体重悬于相应体积的侵染液中。
[0136] 3.柽柳瞬时转化
[0137] (1)将柽柳幼苗均匀的分成三份，分别迅速转移至已加有菌种pROKII-ThCOL、pROKII或pFGC5941-ThCOL的侵染液；
[0138] (2)放入恒温振荡器25℃，90rpm侵染1h；
[0139] (3)加入1/2体积新鲜的侵染液(无菌的新鲜溶液)再放入恒温振荡器25℃，90rpm侵染1.5h；
[0140] (4)取出苗，用洗涤液快速洗1分钟，让植物复水，时间不能超过两分钟，无菌滤纸吸干水分，插入共培养固体培养基，分别共培养24，36，48，72h后直接用液氮迅速冷冻放于-80℃保存，用于定量分析是否成功获得瞬时过表达和抑制表达柽柳苗。
[0141] 为了进一步分析ThCOL基因在瞬时过表达和抑制表达刚毛柽柳中的表达情况，提取共培养24h、36h、48h、72h后瞬时侵染刚毛柽柳的总RNA，反转录为cDNA，利用qRT-PCR对ThCOL基因的表达量进行分析，结果如图3所示，与CON(对照)相比，ThCOL在OE中的表达量明显增高，而在RNAi抑制表达株系中明显减少，表明本实施例成功获得了ThCOL基因瞬时转化柽柳。
[0142] 实施例7NaCl胁迫下瞬时转基因刚毛柽柳苗的组织化学染色分析
[0143] 本实施例分析了实施例5瞬时侵染后的刚毛柽柳在150mM NaCl胁迫0h、2h后的NBT、DAB和Evans blue染色情况，以比较逆境胁迫后3种转基因植株中活性氧的含量和细胞膜受损情况。
[0144] 硝基四氮唑蓝(Nitroblue Tetrazolium，NBT)还原法可研究细胞内超氧离子水平，材料蓝色的深浅反映细胞内O2-的多少。本实施例中1mg/mL NBT染色液的具体配制方法为：称取50mg NBT粉末溶于50mL磷酸缓冲液(0.1M,pH7.0)。
[0145] 二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)染色通过颜色的深浅，可以反映胞内H2O2含量的多少。本实施例中1mg/mL DAB染色液的具体配制方法为：称取50mg DAB粉末溶于50mL磷酸缓冲液(0.1M,pH7.0)。
[0146] 伊文思蓝(Evans Blue)染色可通过染色深浅判断植物细胞膜是否完整。正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥伊文思蓝染色液，使之不能够进入胞内。而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，细胞膜的通透性增加，可被伊文思蓝染成蓝色。并且丧失活性或细胞膜不完整的细胞数量越多，伊文思蓝染色结果越深。本实施例中1mg/mL Evans blue染色液的具体配制方法为：称取50mg Evans blue溶于50mL蒸馏水。
[0147] 本实施例染色处理的转基因植株为瞬时转化过表达载体pROKII-ThCOL(OE)的刚毛柽柳植株、瞬时转化抑制表达载体pFGC5941-ThCOL(RNAi)的刚毛柽柳植株和瞬时转化空pROKII载体的空白(CON)对照刚毛柽柳植株。
[0148] 本实施例的染色方法为：分别将150mM NaCl胁迫0h、2h后的上述三种转基因刚毛柽柳置于10mL离心管中，分别加入不同染色液使叶片全部浸没在染色液中，室温放置适当时间，待染色结果明显后，用脱色液(冰乙酸：酒精＝1:3)脱色。
[0149] 染色结果如图5所示，未胁迫时，三种瞬时表达株系着色程度基本相同。胁迫2h后，3种转基因株系着色都加深。但NBT染色中IE株系着色最深，OE株系着色最浅，表明ThCOL的过表达能有效清除细胞体内O2-含量，而抑制表达则相反，导致胞内O2-的积累增多；同样，DAB染色中，OE株系着色也最浅，IE株系着色比CON更深。表明胁迫后OE株系H2O2含量最少，IE株系H2O2含量最多。进一步的Evans blue染色结果也显示ThCOL基因的过表达能明显改善NaCl胁迫后细胞膜受损情况。综上结果表明盐胁迫后ThCOL基因的过表达能提高植物的ROS清除能力，从而减轻胁迫对细胞的损伤。
[0150] 实施例8NaCl胁迫下瞬时转基因刚毛柽柳的生理生化指标分析
[0151] 本实施例将瞬时侵染后的刚毛柽柳置于150mM NaCl分别胁迫12和24h后测其生理指标，分析比较了3种转基因刚毛柽柳的H2O2含量、丙二醛(MDA)含量、电导率情况。
[0152] 本实施例染色处理的转基因植株为瞬时转化过表达载体pROKII-ThCOL(OE)的刚毛柽柳植株、瞬时转化抑制表达载体pFGC5941-ThCOL(RNAi)的刚毛柽柳植株和瞬时转化空pROKII载体的空白(CON)对照刚毛柽柳植株。
[0153] 本实施例中H2O2含量，MDA含量的测量采用了南京建成生物工程研究所生产的H2O2含量，MDA含量测定试剂盒；
[0154] 相对电导率测定具体方法如下：1)50ml玻璃三角瓶的准备：用去离子水洗净，灭菌，烘干，用灭菌的去离子水平衡24h，在烘箱内烘干备用；2)将植物材料用自来水洗去表面的灰尘，再用双蒸水和超纯水分别冲洗3次，用洁净滤纸吸净表面的水分。取面积相等的叶片分别放入烧杯内，加超纯水50ml，用抽真空仪器抽15min，用电导仪测其电导值，记录S1；3)然后放入90℃水浴中20min，冷却至室温，测其电导率，记录S2；4)计算公式：相对电导率＝S1/S2。
[0155] H2O2是细胞内的氧化代谢产物，植物抵御逆境胁迫能力越差，细胞的受损程度越严重，H2O2含量越高。图6显示了150mM NaCl分别胁迫0h、12和24h后三种转基因刚毛柽柳的H2O2含量测定结果，结果显示150mM NaCl胁迫下，OE株系在胁迫12h和24h后的H2O2含量均保持在较低水平，特别是胁迫24h时ThCOL的过表达株系OE的H2O2含量是CON的0.83倍，是RNAi的0.66倍。
[0156] 植物在逆境条件下，细胞会发生膜脂过氧化作用并产生丙二醛(MDA)。MDA通常作为脂质过氧化指标，表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。图7显示了150mM NaCl分别胁迫0h、12和24h后三种转基因刚毛柽柳的MDA含量测定结果，结果显示与
0h的MDA含量相比，胁迫后3个转基因刚毛柽柳株系的MDA含量均不同程度的增大且在各个胁迫时间点均为RNAi的MDA含量最高，CON次之，OE的MDA含量最低。由此可知RNAi株系中细胞受损程度高和死亡数量大，OE株系中细胞受损程度低和死亡数量较少。
0h的MDA含量相比，胁迫后3个转基因刚毛柽柳株系的MDA含量均不同程度的增大且在各个胁迫时间点均为RNAi的MDA含量最高，CON次之，OE的MDA含量最低。由此可知RNAi株系中细胞受损程度高和死亡数量大，OE株系中细胞受损程度低和死亡数量较少。
[0157] 相对电导率也是表明细胞膜受损的一个生理指标，胞膜受损导致电解质外渗增加。图8显示了150mM NaCl分别胁迫0h、12和24h后三种转基因刚毛柽柳的相对电导率，结果显示ThCOL基因的过表达株系OE的相对电导率低于CON和RNAi株系，说明OE植株的耐盐能力高于CON和RNAi株系。
[0158] 综上，通过瞬时转化的方法，分析了刚毛柽柳ThCOL基因的耐盐功能，结果表明刚毛柽柳ThCOL基因提高了转基因植物的耐盐能力，是能够提高植物耐盐能力的优良基因，因此将该基因用于制备转基因植物尤其是转基因林木具有非常重要的应用前景。
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