一种反式肉桂酸-4-羟化酶及其编码基因与应用
阅读：673发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种反式肉桂酸-4-羟化酶及其编码基因与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及反式 肉桂酸 ‑4‑羟化酶及其编码基因与应用。本发明首次揭示了石蒜属 植物 忽地笑的反式肉桂酸‑4‑羟化酶，其具有良好的底物专一性和区域选择性，可以催化反式肉桂酸的4位C的羟基化生成对‑香豆酸。本发明还揭示了编码所述反式肉桂酸‑4‑羟化酶的多核苷酸，表达所述反式肉桂酸‑4‑羟化酶的载体与宿主细胞，以及生产对‑香豆酸的方法。，下面是一种反式肉桂酸-4-羟化酶及其编码基因与应用专利的具体信息内容。
1.一种反式肉桂酸-4-羟化酶，其特征在于，所述的反式肉桂酸-4-羟化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.编码权利要求1所述的反式肉桂酸-4-羟化酶的多核苷酸；
所述的多核苷酸包括分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。
4.权利要求3所述的载体的用途，其特征在于：
(a)表达权利要求1所述的反式肉桂酸-4-羟化酶；或
(b)抑制权利要求1所述的反式肉桂酸-4-羟化酶的表达；或
(c)抑制权利要求2所述的多核苷酸的表达。
5.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述的载体或基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。
6.权利要求1所述的反式肉桂酸-4-羟化酶的用途，其特征在于，催化反式肉桂酸合成对-香豆酸。
7.一种表达构建物，其特征在于，所述表达构建物包括以下酶的基因表达盒：
(a)权利要求1所述的反式肉桂酸-4-羟化酶；和
(b)细胞色素P450还原酶。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中包括权利要求7所述的表达构建物。
9.根据权利要求8所述的一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为大肠杆菌。
10.根据权利要求8所述的一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是包含有反式肉桂酸-4-羟化酶的底物的细胞。
11.根据权利要求8所述的一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是内源存在反式肉桂酸或其前体的细胞。
12.权利要求7所述的表达构建物或权利要求8-11任一项所述的宿主细胞的用途，其特征在于，催化反式肉桂酸合成对-香豆酸。
13.一种生产对-香豆酸的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的反式肉桂酸-4-羟化酶生产对-香豆酸；
所述的方法包括：以权利要求3所述的载体或权利要求7所述的表达构建物转化宿主细胞，培养转化的宿主细胞，合成对-香豆酸。
14.根据权利要求13所述的一种生产对-香豆酸的方法，其特征在于，所述的宿主细胞为大肠杆菌。
15.根据权利要求13所述的一种生产对-香豆酸的方法，其特征在于，所述宿主细胞是包含有反式肉桂酸-4-羟化酶的底物的细胞。
16.根据权利要求13所述的一种生产对-香豆酸的方法，其特征在于，所述宿主细胞是内源存在反式肉桂酸或其前体的细胞。
17.一种反式肉桂酸-4-羟化酶突变体LaC4H(ΔN28)，其特征在于，所述突变体LaC4H(ΔN28)的核苷酸序列为SEQ ID NO：2中85-1518位核苷酸。
一种反式肉桂酸-4-羟化酶及其编码基因与应用
技术领域
背景技术
[0002] 植物细胞色素P450酶(Cytochrome P450enzymes，CYPs)参与大量植物天然产物的生物合成，是天然产物生物合成的关键酶之一，属于亚铁血红素单加氧酶超大家族，催化多种类型的氧化还原反应，具有结构选择性、区域选择性和立体选择性。CYPs的催化活性依赖于细胞色素P450还原酶。细胞色素P450还原酶可以将电子供体(还原力)中的电子传递给CYPs，协助CYPs进行一系列的结构专一性、区域专一性和立体专一性生物反应。
[0003] 反式肉桂酸-4-羟化酶是植物细胞色素P450酶，属于CYP73亚家族，催化反式肉桂酸4位C的羟基化生成对-香豆酸。对-香豆酸是一种优良的食品抗氧化剂。作为一种苯酚衍生物，对-香豆酸是植物苯丙素类天然产物，具有抗氧化、抑菌、降血脂等多种生物医药活性，用于临床及医药、食品和化妆品等行业。作为一个多功能的药效基团和平台化合物，对-香豆酸还可以衍生出大量具有医药活性的化合物。例如，对-香豆酸是农药溴敌隆等、祛痰药杜鹃素、抗肾上腺素药物艾司洛尔等物质合成的中间体，还可以用于临床上治疗轻、中度老年痴呆症的药物-加兰他敏的合成。对-香豆酸具有广泛的应用和需求。
[0004] 忽地笑(Lycoris aurea)是多年生草本球根药用植物，属于石蒜科石蒜属，能够合成对-香豆酸等具有重要生物活性和应用价值的大量植物天然产物。但是，石蒜属植物反式肉桂酸-4-羟化酶及其编码基因尚未被分离与克隆。因此，本领域有必要开发石蒜属植物忽地笑的反式肉桂酸-4-羟化酶。该蛋白及其编码基因可通过植物转基因和异源表达的方式进行对-香豆酸的生物转化与生物合成。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种石蒜科植物的反式肉桂酸-4-羟化酶，所述的反式肉桂酸-4-羟化酶选自：
[0007] (b)将SEQ ID NO：1氨基酸序列经过一个或多个(如1-30个)氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的，且具有反式肉桂酸-4-羟化酶活性的由(a)衍生的蛋白质；或[0008] (c)与SEQ ID NO：1氨基酸序列有至少90％序列相同性，且具有反式肉桂酸-4-羟化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
[0009] 本发明SEQ ID NO：1所示的蛋白质是从忽地笑(Lycoris aurea)中分离得到的一种新的反式肉桂酸-4-羟化酶(trans-Cinnamic acid-4-Hydroxylase)。为便于表述，将SEQ ID NO：1所示的蛋白质命名为LaC4H。
[0010] 在一个优选例中，所述的反式肉桂酸-4-羟化酶活性是指以反式肉桂酸为底物合成对-香豆酸。
[0012] 本发明的另一目的在于提供分离的多核苷酸，该多核苷酸是编码所述反式肉桂酸-4-羟化酶的多核苷酸。
[0013] 在一个优选例中，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0014] 应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏好性，本领域技术人员可以根据需要使用合适特定物种表达的密码子。因而，本发明反式肉桂酸-4-羟化酶的多核苷酸还包括由SEQ ID NO：2所示核苷酸序列经取代和/或缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到的编码具有反式肉桂酸-4-羟化酶活性的核苷酸序列。
[0015] 本发明的又一目的是提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。所述的载体是将本发明的编码所述反式肉桂酸-4-羟化酶的多核苷酸与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明所述反式肉桂酸-4-羟化酶的重组表达载体或抑制本发明所述反式肉桂酸-4-羟化酶编码多核苷酸表达的基因沉默载体。
[0016] 在一个优选例中，该载体是含有编码所述反式肉桂酸-4-羟化酶的SEQ ID NO：2所示序列的重组表达载体pET28a-LaC4H。
[0017] 在另一个优选例中，该载体是含有编码所述反式肉桂酸-4-羟化酶的SEQ ID NO：2所示序列中第85-1518位多核苷酸的重组表达载体pET28a-LaC4H(ΔN28)。
[0018] 本发明的又一目的是提供一种宿主细胞，它含有所述的载体或基因组中整合有所述的多核苷酸。所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌、运动假单胞菌和乳酸菌等；常用的真核宿主细胞包括真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。所述的真菌细胞包括酵母细胞。将所述的重组表达载体或者基因沉默载体导入所述的适当宿主细胞中，获得表达本发明所述反式肉桂酸-4-羟化酶的基因工程菌株、转基因细胞系、转基因愈伤、转基因组织、转基因植株或者基因工程植株。
[0019] 本发明的又一目的是提供所述的反式肉桂酸-4-羟化酶的用途，用于合成对-香豆酸。
[0020] 在一个优选例中，所述的底物是反式肉桂酸。
[0021] 本发明的又一目的是提供一种表达构建物。所述表达构建物包括以下酶的编码基因和/或基因表达盒：
[0022] (a)所述的反式肉桂酸-4-羟化酶；和
[0023] (b)细胞色素P450还原酶；和/或
[0024] (c)反式肉桂酸-4-羟化酶底物的生物合成酶。
[0025] 所述基因表达盒是酶在宿主细胞中表达与调控所需要的生物学元件，包括启动子、增强子、衰减子、核糖体结合位点、Kozak序列、内含子和/或转录终止子等；此外，还可包括标签编码序列和/或信号(肽)编码序列等。
[0026] 在一个优选例中，所述的表达构建物还包括：细胞色素P450还原酶(CPR)的编码基因。
[0027] 在另一个优选例中，所述的表达构建物还包括：细胞色素P450还原酶(CPR)的编码基因和苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL)的编码基因。
[0028] 在另一个优选例中，当转化大肠杆菌细胞时，所述的表达构建物中，还包含大肠杆菌启动子、大肠杆菌核糖体结合位点和/或大肠杆菌转录终止子等基因表达盒。
[0029] 本发明的又一目的是提供一种宿主细胞。所述的宿主细胞中包括所述的表达构建物。所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌、运动假单胞菌和乳酸菌等；常用的真核宿主细胞包括真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。较佳地，所述的宿主细胞是内源存在反式肉桂酸-4-羟化酶的底物或其底物前体的细胞。
[0030] 本发明的又一目的是提供所述的表达构建物的用途，用于合成对-香豆酸。
[0031] 本发明的又一目的是提供一种生产对-香豆酸的方法。
[0032] 在一个优选例中，所述方法包括：以所述的表达构建物转化宿主细胞，利用转化的宿主细胞催化反式肉桂酸合成对-香豆酸；所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌、运动假单胞菌和乳酸菌等；常用的真核宿主细胞包括真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。所述的真菌细胞包括酵母细胞。
[0033] 在另一个优选例中，所述方法包括：以所述的表达构建物转化宿主细胞，培养转化的大肠杆菌细胞，利用简单的碳水化合物(葡萄糖)合成对-香豆酸。该宿主细胞是包含有反式肉桂酸-4-羟化酶的底物的细胞；较佳地，该宿主细胞是内源存在反式-肉桂酸或其前体的细胞。
[0034] 本发明首次揭示了石蒜科植物忽地笑来源的反式肉桂酸-4-羟化酶LaC4H，其具有良好的底物专一性和区域选择性。本发明还揭示了编码所述反式肉桂酸-4-羟化酶的多核苷酸、表达所述反式肉桂酸-4-羟化酶的表达载体及宿主细胞。本发明应用石蒜科植物来源的反式肉桂酸-4-羟化酶，可以进行植物天然产物对-香豆酸的生物转化以及生物合成。附图说明
[0035] 图1是引物对SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的聚合酶链式反应(PCR)扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
[0036] 图2是重组表达载体pET28a-LaC4H的菌落PCR验证电泳图(引物为T7和T7ter)。
[0037] 图3是重组表达载体pET28a-LaC4H(ΔN28)的菌落PCR验证电泳图(引物为T7和T7ter)。
[0038] 图4是重组表达载体pET28a-CPR-LaC4H的菌落PCR验证电泳图(引物为T7和SEQ ID NO：10)。
[0039] 图5是重组表达载体pET28a-CPR-LaC4H(ΔN28)的菌落PCR验证电泳图(引物为T7和SEQ ID NO：10)。
[0040] 图6是重组表达载体pET28a-CPR的菌落PCR验证电泳图(引物为T7和T7ter)。
[0041] 图7是重组菌株EcR-LaC4H、EcR-CPR、EcR-CPR-LaC4H和EcR-CPR-LaC4H(ΔN28)生物转化图。
[0042] 图8是重组表达载体pET28a-CPR-LaC4H(ΔN28)-rbsPAL的菌落PCR验证电泳图(引物为SEQ ID NO：13和T7ter)。
具体实施方式
[0044] 以下结合具体实施例并附图，进一步阐述本发明。
[0046] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0047] 实施例1、反式肉桂酸-4-羟化酶LaC4H编码基因的克隆
[0049] 以从忽地笑中提取的RNA反转录获得的cDNA为模板，利用如上两条引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4进行PCR。DNA聚合酶选用南京诺唯赞生物科技有限公司的Super-Fidelity DNA聚合酶。PCR扩增程序为：95℃5min；94℃ 45s，56℃45s，72℃ 2min，共30个循环；72℃ 10min，降至10℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1。
[0050] 在紫外灯照射下，切下目标DNA条带。然后采用多功能DNA纯化试剂盒(离心柱型)(北京百泰克生物技术有限公司)从琼脂糖凝胶中回收DNA即为扩增出的反式肉桂酸-4-羟化酶编码基因的DNA片段。利用宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)的pMD19-T克隆试剂盒，将回收的PCR产物克隆到pMD19-T载体，所构建的载体命名为pMDT-LaC4H。经测序获得LaC4H的编码基因序列。
[0051] LaC4H编码基因具有序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列。自SEQ ID NO：2的5’-端第1-1518位核苷酸为LaC4H的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，自SEQ ID NO：2的5’-端的第1-3位核苷酸为LaC4H编码基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO：2的5’-端的第
1516-1518位核苷酸为LaC4H编码基因的终止密码子TAA。反式肉桂酸-4-羟化酶编码基因编码一个含有505个氨基酸的蛋白质LaC4H，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为58.1KDa，等电点pI为9.04。
1516-1518位核苷酸为LaC4H编码基因的终止密码子TAA。反式肉桂酸-4-羟化酶编码基因编码一个含有505个氨基酸的蛋白质LaC4H，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为58.1KDa，等电点pI为9.04。
[0052] 实施例2、LaC4H基因的重组表达载体的构建
[0053] (1)合成分别具有序列表中SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7核苷酸序列的两条引物。在合成的引物SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7的5’-端分别设置NdeI和XhoI两个酶切位点及其保护碱基序列，以忽地笑的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增程序同实施例1。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、分离、切胶回收后经NdeI和XhoI双酶切，利用宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)的T4DNA连接酶连接同样经NdeI和XhoI双酶切的pET28a载体(Novagen)中。
连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)感受态细胞，并涂布于添加25μg/mL卡那霉素的LB平板上。通过菌落PCR验证获得阳性转化子，菌落PCR产物的琼脂糖电泳结果如图2。通过测序进一步验证重组质粒pET28a-NdeI-LaC4H-XhoI构建成功，并在NdeI和XhoI酶切位点之间含有SEQ ID NO：2的全长多核苷酸序列。所获得的重组质粒命名为pET28a-LaC4H。
连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)感受态细胞，并涂布于添加25μg/mL卡那霉素的LB平板上。通过菌落PCR验证获得阳性转化子，菌落PCR产物的琼脂糖电泳结果如图2。通过测序进一步验证重组质粒pET28a-NdeI-LaC4H-XhoI构建成功，并在NdeI和XhoI酶切位点之间含有SEQ ID NO：2的全长多核苷酸序列。所获得的重组质粒命名为pET28a-LaC4H。
[0054] (2)合成分别具有序列表中SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7核苷酸序列的两条引物。在合成的引物SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的5’-端分别设置NdeI和XhoI两个酶切位点及其保护碱基序列，以忽地笑的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增程序同实施例1。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、分离、切胶回收后经NdeI和XhoI双酶切，利用T4DNA连接酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))连接同样经NdeI和XhoI双酶切的pET28a载体(Novagen)中。连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)感受态细胞，并涂布于添加卡那霉素(终浓度为25μg/mL)的LB平板上。通过菌落PCR验证阳性转化子，菌落PCR产物的琼脂糖电泳结果如图3。测序进一步验证重组质粒pET28a-NdeI-LaC4H(ΔN28)-XhoI构建成功，并在NdeI和XhoI酶切位点之间含有SEQ ID NO：2多核苷酸序列中85-1518位核苷酸。所获得的重组质粒命名为pET28a-LaC4H(ΔN28)。
[0055] 实施例3、LaC4H和LaC4H(ΔN28)功能性表达载体的构建
[0056] (1)合成分别具有序列表中SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9核苷酸序列的两条引物，以忽地笑的cDNA为模板进行PCR扩增CPR编码基因。PCR扩增程序同实施例1。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET28a-LaC4H载体NdeI酶切位点两侧同源的序列。利用NdeI限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET28a-LaC4H载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将CPR编码基因导入pET28a-LaC4H载体的NdeI酶切位点中，利用通用测序引物T7与合成的具有序列表中SEQ ID NO：10核苷酸序列的引物进行菌落PCR验证，获得重组表达质粒pET28a-CPR-LaC4H，结果如图4。进一步测序证实重组质粒中CPR和LaC4H进行了基因的融合表达。
[0057] (2)合成分别具有序列表中SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：11核苷酸序列的两条引物，以忽地笑的cDNA为模板进行PCR扩增CPR编码基因。PCR扩增程序同实施例1。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET28a-LaC4H(ΔN28)载体NdeI酶切位点两侧同源的序列。利用NdeI限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET28a-LaC4H(ΔN28)载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将CPR编码基因导入pET28a-LaC4H(ΔN28)载体的NdeI酶切位点中，利用通用测序引物T7与合成的具有序列表中SEQ ID NO：10核苷酸序列的引物进行菌落PCR验证，获得重组表达质粒pET28a-CPR-LaC4H(ΔN28)，结果如图5。进一步测序证实重组质粒中CPR和LaC4H(ΔN28)进行了基因的融合表达。
[0058] (3)合成分别具有序列表中SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：12核苷酸序列的两条引物，以忽地笑的cDNA为模板进行PCR扩增CPR编码基因。PCR扩增程序同实施例1。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET28a载体NdeI酶切位点上游、XhoI酶切位点下游同源的序列。利用NdeI和XhoI限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET28a载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将CPR编码基因导入pET28a载体的NdeI和XhoI酶切位点间，利用通用测序引物T7与T7ter进行菌落PCR验证，获得重组表达质粒pET28a-CPR，结果如图6。
[0059] 实施例4、LaC4H催化反式肉桂酸合成对-香豆酸
[0060] (1)配制培养基。诱导培养基(1L)：31g Na2HPO4，15g KH2PO4，2.5g NaCl，5.0g NH4Cl，0.24g MgSO4，0.01g CaCl2，10g Glucose，1mL微量元素母液。生物转化培养基(1L)：31g Na2HPO4，15g KH2PO4，2.5g NaCl，0.24g MgSO4，0.01g CaCl2，20g Glucose，1mL微量元素母液。微量元素母液配方为(1L)：0.15mM(NH4)6Mo7O24，20.0mM H3BO3，1.5mM CoCl2，0.5mM CuSO4，4.0mM MnCl2，0.5mM ZnSO4，100mM HCl。
[0061] (2)将重组质粒pET28a-LaC4H、pET28a-CPR、pET28a-CPR-LaC4H和pET28a-CPR-LaC4H(ΔN28)分别转化进入大肠杆菌Rosseta(DE3)细胞，获得重组菌株Rosseta(DE3)/pET28a-LaC4H、Rosseta(DE3)/pET28a-CPR、Rosseta(DE3)/pET28a-CPR-LaC4H和Rosseta(DE3)/pET28a-CPR-LaC4H(ΔN28)，分别命名为菌株EcR-LaC4H、EcR-CPR、EcR-CPR-LaC4H和EcR-CPR-LaC4H(ΔN28)。每个菌株各挑取单克隆接种添加卡那霉素(终浓度为25μg/ml)的LB培养基于37℃、200rpm过夜培养。
[0062] (3)将过夜培养菌液按100倍稀释于含卡那霉素(终浓度为25μg/mL)的50mL诱导培养基中培养。待菌液生长至600nm波长下吸光度为0.6-0.8时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(终浓度为0.1mmol/L)进行诱导培养，诱导时间为12h，诱导温度为25℃。
[0063] (4)收集诱导12h的细菌培养液于8000rpm、4℃离心5min，弃上清后用40mL生物转化培养基洗涤菌体1次。菌体用40ml生物转化培养基重悬后全部转移到250ml无菌三角瓶中，加入反式肉桂酸(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)二甲基亚砜(DMSO)母液至终浓度为100μM，于25℃、250rpm震荡培养60h。
[0064] (5)取生物转化液1ml于4℃冻融，加入等体积的甲醇，振荡混匀。室温下，12000rpm，离心5min。取上清用0.22μm孔径滤膜过滤，滤液上样高效液相色谱仪(HPLC)进行分析。分析条件为：采用LC-20A高效液相色谱仪(岛津，日本)，InertSustain C18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)，30℃柱温，二极管阵列检测器，278nm和314nm波长，10μl进样量，1.5％(v/v)乙酸水溶液为流动相A，100％乙腈为流动相B，0.9mL/min流速，梯度洗脱。分析结果如图7，结果表明：在CPR的存在下，LaC4H和LaC4H(ΔN28)能够催化底物反式肉桂酸合成产物对-香豆酸。
[0065] 实施例5、重组大肠杆菌Ec31884-CPR-LaC4H(ΔN28)-PAL的构建
[0066] (1)合成分别具有序列表中SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14核苷酸序列的两条引物，以忽地笑的cDNA为模板进行PCR扩增苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL)编码基因。PCR扩增程序为：95℃ 5min；94℃ 45s，56℃ 45s，72℃ 3.5min，共30个循环；72℃ 10min，降至10℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET28a-CPR-LaC4H(ΔN28)载体XhoI酶切位点两端同源的序列，并且PAL基因起始密码子上游12bp处添加了核糖体结合位点(rbs)序列(AGGAG)。利用XhoI限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET28a-CPR-LaC4H(ΔN28)载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将PAL编码基因导入pET28a-CPR-LaC4H(ΔN28)载体的XhoI酶切位点中，利用合成的具有序列表中SEQ ID NO：13核苷酸序列的引物与通用测序引物T7ter进行菌落PCR验证，获得重组表达质粒pET28a-CPR-LaC4H(ΔN28)-rbsPAL，结果如图8。进一步测序证实重组质粒中PAL与CPR-LaC4H(ΔN28)形成了多顺反子基因结构。
[0067] (2)利用λDE3溶原化试剂盒(购自Novagen)按照试剂盒说明书操作，将λDE3原噬菌体插入到大肠杆菌苯丙氨酸生产菌株ATCC31884(购自ATCC)基因组中，获得溶原化的宿主菌株大肠杆菌ATCC31884(DE3)。
[0068] (3)将重组质粒pET28a-CPR-LaC4H(ΔN28)-rbsPAL转化进入大肠杆菌ATCC31884(DE3)细胞，获得重组菌株ATCC31884(DE3)/pET28a-CPR-LaC4H(ΔN28)-rbsPAL，命名为菌株Ec31884-CPR-LaC4H(ΔN28)-PAL。
[0069] 实施例6、重组大肠杆菌Ec31884-CPR-LaC4H(ΔN28)-PAL发酵合成对-香豆酸[0070] (1)配制发酵培养基(1L)：31g Na2HPO4，15g KH2PO4，2.5g NaCl，5.0g NH4Cl，0.24g MgSO4，0.01g CaCl2，30g Glucose，1mL微量元素母液。微量元素母液配方同实施例4。
[0071] (2)挑取菌株Ec31884-CPR-LaC4H(ΔN28)-PAL单克隆接种添加卡那霉素(终浓度为25μg/ml)的LB培养基于37℃、200rpm过夜培养。
[0072] (3)将过夜培养菌液按100倍稀释于含卡那霉素(终浓度为25μg/mL)的50mL发酵培养基中培养。待菌液生长至600nm波长下吸光度为0.6-0.8时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(终浓度为0.1mmol/L)进行诱导。培养温度转变为25℃，发酵时间为72h。
[0073] (4)取发酵液1ml于4℃冻融，加入等体积的甲醇，振荡混匀。室温下，12000rpm，离心5min。取上清用0.22μm孔径滤膜过滤，滤液上样高效液相色谱仪(HPLC)进行分析。分析条件同实施例4。分析结果如图9，结果表明：所构建的大肠杆菌菌株能够合成对-香豆酸，产物的量为400mg/L。可以理解为，基于能够合成LaC4H的底物及其上游代谢产物的微生物菌株，在分子伴侣CPR的存在下，LaC4H(ΔN28)能够进行对-香豆酸的生物合成。
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