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一种优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法和系统

阅读:999发布:2020-05-12

专利汇可以提供一种优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法和系统专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法和系统。一种优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法,包括步骤:S1、构建多药物-化合物-靶点-途径- 疾病 相互作用网络模型:整合肝复乐的所有组方药物的小分子化合物 数据库 、抗肝癌靶点蛋白数据库、 信号 通路数据库、相关疾病数据库,搭建方剂抗肝癌活性物质筛选平台,筛选得到最佳分子组;S2、优化组方。本方法构建了原发性肝癌的药材-化合物-靶点-途径-疾病复杂网络模型,初步阐明肝复乐 治疗 肝癌的活性成分与作用机制,建立临床病例与用药规律之间的内在关联,并根据最佳分子组,匹配最佳药材组,优化组方。,下面是一种优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法和系统专利的具体信息内容。

1.一种优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法,其特征在于,包括步骤:
S1、构建多药物-化合物-靶点-途径-疾病相互作用网络模型:整合肝复乐的所有组方药物的小分子化合物数据库、抗肝癌靶点蛋白数据库、信号通路数据库、相关疾病数据库,搭建方剂抗肝癌活性物质筛选平台,筛选得到最佳分子组;
S2、优化组方:根据所述最佳分子组在所述小分子化合物数据库中匹配对应药材,根据所述对应药材组成优化组方。
2.根据权利要求1所述的优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法,其特征在于,所述步骤S1包括:
S11、构建靶点-途径-疾病网络:获取药物靶点标基因和蛋白相关信息,并对靶标基因和蛋白进行标准化命名,靶点蛋白与靶点蛋白的相互利用网络数据库在线分析,建立靶点数据库、信号通道数据库、疾病数据库;
S12、构建多药材-化合物网络:获取肝复乐单方中每个药材的对应化合物的化学结构、相对分子质量,构建小分子化合物数据库;
S13、筛选:对所述小分子化合物数据库进行类药性筛选合利用度筛选,筛选候选分子组;
S14、对接测试:对所述候选分子组的每个候选分子进行化学结构优化,进行加氢、赋予电荷、施加场、生成多种构象,然后使用配体快速对接算法对所述候选分子与所述靶点数据库中的靶点蛋白进行对接,对所述对接进行一致性打分,形成药物-化合物-靶点-途径-疾病网络,筛选最佳分子组。
3.根据权利要求2所述的优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法,其特征在于,所述配体快速对接算法为遗传算法或模拟退火算法。
4.根据权利要求2所述的优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法,其特征在于,所述一致性打分为使用binding energy算法、libdockscore算法、ligscore-1算法、ligscore-2算法、PLP-1算法和ligscore PLP-2算法中的两种以上共同进行打分。
5.根据权利要求4所述的优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法,其特征在于,所述步骤S14中,所述筛选为:根据多个一致性打分的分数进行排序,以分数都高的小分子化合物组成所述最佳分子组。
6.根据权利要求1所述的优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法,其特征在于,还包括步骤:
S3、优化组方的药效学验证:以所述优化组方和对照组方分别配置实验药剂,分别检测对肝癌靶标细胞的增殖、迁移、侵袭的表达影响平及靶标蛋白表达影响水平,并验证所述优化组方的功效。
7.根据权利要求6所述的优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法,其特征在于,所述实验药剂为采用水蒸气提取法、水提醇沉法对所述优化组方和所述对照组方分别分离成以挥发油部位、醇溶部位、醇沉部位制备成的若干个具有潜在药效活性的浸膏。
8.根据权利要求1-7任一所述的优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法,其特征在于,所述优化组方包括健脾理气组、活血化瘀组、清热解毒组。
9.一种用于权利要求1-8任一所述的方法的优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析系统,其特征在于,包括:数据网络、筛选模块、对接模块;
所述数据网络模块包括抓取单元、疾病数据库、靶点数据库、信号通道数据库、多分子数据库;
所述筛选模块包括类药性筛选单元、利用度筛选单元;
所述对接模块用于分子数据与靶点数据对接测试。

说明书全文

一种优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法和系统

技术领域

[0001] 本发明涉及中药药理学领域,尤其涉及一种优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法和系统。

背景技术

[0002] 中药复方“肝复乐”是国家级第一个治疗肝病的中药三类新药(国药准字Z10940066),曾获1992年国家中医药管理局科技进步一等奖,2004年被列入国家基本保险医疗药品目录抗肿瘤药物。目前肝复乐已上市20年,临床用药以汤剂、片剂和胶囊剂为主,年销售达2.0亿元。该方由半枝莲、白术、黄芪、党参、陈皮、大黄、茯苓、薏苡仁、香附、柴胡、沉香、木通、鳖甲、土鳖虫、桃仁、苏木牡蛎、郁金、重楼、败酱草、茵陈等21味中药组成,具有健脾理气,化瘀软坚,清热解毒的中药复方。它用于肝瘀脾虚为主证的原发性肝癌,症见上腹肿,胁肋疼痛,神疲乏,食纳呆,脘腹胀满,心烦易怒,口苦咽干等。
[0003] 虽然肝复乐作为名医验方,治疗肝癌具有明确的疗效,但是发挥作用的药效物质基础、作用机制与作用靶点的相关研究长期以来处于薄弱地位,国内外相关方面研究较少。化学物质基础和药效物质基础不明确,作用靶点与机制不清晰,组方科学内涵未能解释清楚,这已成为制约肝复乐进一步开发的关键技术瓶颈
[0004] 中药整合药理学是药理学研究的新领域,中药方剂物质实体与机体交互作用规律是整合药理学研究的关键科学问题之一,是中药化学、药代动力学、药理学、系统生物学、计算科学等多学科融合的交叉学科。整合药理学作为研究多成分药物与机体相互作用及其整合规律和作用原理的一学科,为中药复杂作用体系解析提供了解决策略、方法与技术。整合药理学策略的提出,有利于克服中药现代研究中“化学成分—体内过程—药理活性—病证效应”之间关联性不足和研究“碎片化”倾向等问题,形成具有中药特色的药理学评价体系和研究方法。
[0005] 申请号为201310031897.X的专利文献公开了一种中药系统药理学分析平台及分析方法,但是不能实现将多药材多配比的中药配比的药方进行优化。因此,本领域存在问题,亟需发明人提供一种根据复方中药具有多靶点、多途径的作用机制特征,提出一种新的研究思路并以实践经验和成果佐证,建立符合中药多成分、多靶点、多途径的特点的高通量筛选体系,从肝复乐中筛选新的高效治疗肝癌的药效物质基础,明确肝复乐抗肝癌细胞的有效化学成分与生物活性成分,研究有效化学组分群之间的相互作用关系,筛选抑制肝癌活性的关键组分,并且,能够以此优化组方的优化方法。

发明内容

[0006] 鉴于上述现有技术的不足之处,本发明的目的在于提供一种优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法和系统,能够构建多药材-化合物-靶点-途径-疾病的药理学网络,并能够使用药理学网络匹配最佳药材,优化肝复乐配方。
[0007] 为了达到上述目的,本发明采取了以下技术方案:
[0008] 一种优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法,包括步骤:
[0009] S1、构建多药物-化合物-靶点-途径-疾病相互作用网络模型:整合肝复乐的所有组方药物的小分子化合物数据库、抗肝癌靶点蛋白数据库、信号通路数据库、相关疾病数据库,搭建方剂抗肝癌活性物质筛选平台,筛选得到最佳分子组;
[0010] S2、优化组方:根据所述最佳分子组在所述小分子化合物数据库中匹配对应药材,根据所述对应药材组成优化组方。
[0011] 优选的所述的优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法,所述步骤S1包括:
[0012] S11、构建靶点-途径-疾病网络:获取药物靶点标基因和蛋白相关信息,并对靶标基因和蛋白进行标准化命名,靶点蛋白与靶点蛋白的相互利用网络数据库在线分析,建立靶点数据库、信号通道数据库、疾病数据库;
[0013] S12、构建多药材-化合物网络:获取肝复乐单方中每个药材的对应化合物的化学结构、相对分子质量,构建小分子化合物数据库;
[0014] S13、筛选:对所述小分子化合物数据库进行类药性筛选合利用度筛选,筛选候选分子组;
[0015] S14、对接测试:对所述候选分子组的每个候选分子进行化学结构优化,进行加氢、赋予电荷、施加力场、生成多种构象,然后使用配体快速对接算法对所述候选分子与所述靶点数据库中的靶点蛋白进行对接,对所述对接进行一致性打分,形成药物-化合物-靶点-途径-疾病网络,筛选最佳分子组。
[0016] 优选的所述的优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法,所述配体快速对接算法为遗传算法或模拟退火算法。
[0017] 优选的所述的优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法,所述一致性打分为使用binding energy算法、libdockscore算法、ligscore-1算法、ligscore-2算法、PLP-1算法和ligscore PLP-2算法中的两种以上共同进行打分。
[0018] 优选的所述的优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法,所述步骤S14中,所述筛选为:根据多个一致性打分的分数进行排序,以分数都高的小分子化合物组成所述最佳分子组。
[0019] 优选的所述的优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法,还包括步骤:
[0020] S3、优化组方的药效学验证:以所述优化组方和对照组方分别配置实验药剂,分别检测对肝癌靶标细胞的增殖、迁移、侵袭的表达影响平及靶标蛋白表达影响水平,并验证所述优化组方的功效。
[0021] 优选的所述的优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法,所述实验药剂为采用水蒸气提取法、水提醇沉法对所述优化组方和所述对照组方分别分离成以挥发油部位、醇溶部位、醇沉部位制备成的若干个具有潜在药效活性的浸膏。
[0022] 优选的所述的优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法,所述优化组方包括健脾理气组、活血化瘀组、清热解毒组。
[0023] 一种用于所述的方法的优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析系统,其特征在于,包括:数据网络模块、筛选模块、对接模块;
[0024] 所述数据网络模块包括抓取单元、疾病数据库、靶点数据库、信号通道数据库、多分子数据库;
[0025] 所述筛选模块包括类药性筛选单元、利用度筛选单元;
[0026] 所述对接模块用于分子数据与靶点数据对接测试。
[0027] 相较于现有技术,本发明提供的一种优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法和系统,构建了原发性肝癌的药材-化合物-靶点-途径-疾病复杂网络模型,初步阐明肝复乐治疗肝癌的活性成分与作用机制,建立临床病例与用药规律之间的内在关联,并根据最佳分子组,匹配最佳药材组,优化组方。附图说明
[0028] 图1是本发明提供的优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法流程图
[0029] 图2是本发明提供的优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析系统的结构框图
[0030] 图3是本发明提供的肝复乐的网络药理学研究策略;
[0031] 图4是本发明提供的多药物-化合物-靶点-途径-疾病的网络示意图;
[0032] 图5是本发明提供的不同浓度的肝复乐醇溶部位作用48h的HepG-2细胞形态变化(×200, n=3);
[0033] 图6是本发明提供的肝复乐醇溶部位对HepG-2细胞增殖的影响(×200, n=3);
[0034] 图7是本发明提供的肝复乐醇溶部位对HepG-2细胞迁移的影响(×200, n=3);
[0035] 图8是本发明提供的肝复乐醇溶部位对HepG-2细胞的侵袭影响(×200, n=3)。

具体实施方式

[0036] 为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确,以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
[0037] 请一并参参阅图1-图8,一种优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析方法,包括步骤:
[0038] S1、构建多药物-化合物-靶点-途径-疾病相互作用网络模型:整合肝复乐的所有组方药物的小分子化合物数据库、抗肝癌靶点蛋白数据库、信号通路数据库、相关疾病数据库,搭建方剂抗肝癌活性物质筛选平台,筛选得到最佳分子组;
[0039] S2、优化组方:根据所述最佳分子组在所述小分子化合物数据库中匹配对应药材,根据所述对应药材组成优化组方。
[0040] 作为优选方案,本实施例中,所述步骤S1包括:
[0041] S11、构建靶点-途径-疾病网络:获取药物靶点标基因和蛋白相关信息,并对靶标基因和蛋白进行标准化命名,靶点蛋白与靶点蛋白的相互利用网络数据库在线分析,建立靶点数据库、信号通道数据库、疾病数据库;
[0042] S12、构建多药材-化合物网络:获取肝复乐单方中每个药材的对应化合物的化学结构、相对分子质量,构建小分子化合物数据库;
[0043] S13、筛选:对所述小分子化合物数据库进行类药性筛选合利用度筛选,筛选候选分子组;
[0044] S14、对接测试:对所述候选分子组的每个候选分子进行化学结构优化,进行加氢、赋予电荷、施加力场、生成多种构象,然后使用配体快速对接算法对所述候选分子与所述靶点数据库中的靶点蛋白进行对接,对所述对接进行一致性打分,形成药物-化合物-靶点-途径-疾病网络,筛选最佳分子组。
[0045] 具体的,请着重参阅图2,本发明还提供了一种用于所述的方法的优化肝复乐抗肝癌组方药理学分析系统,包括:数据网络模1、筛选模块2、对接模块3;
[0046] 所述数据网络模块1包括抓取单元11、疾病数据库12、靶点数据库13、信号通道数据库14、多分子数据库15;
[0047] 所述筛选模块2包括类药性筛选单元、利用度筛选单元;
[0048] 所述对接模块3用于分子数据与靶点数据对接测试。
[0049] 以上述系统按照本发明提供的方法步骤构建所述多药物-化合物-靶点-途径-疾病,使用表1中的数据库和软件参与。
[0050] 表1本发明构建药理学网络需要的的主要数据库与软件
[0051] 数据库与软件 网址TCM-ID(中草药数据库) http://www.megabionet.org/tcmid/
TCM Database@taiwan(中草药数据库) http://tcm.cmu.edu.tw/
NCBI PubChem(化合物结构数据库) http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
ChemSpider(化合物结构数据库) http://www.chemspider.com
OMIM(人类疾病基因数据库) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim
RCSB(蛋白晶体结构数据库) http://www.pdb.org
Uniprot(基酸序列信息数据库) http://www.uniprot.org
Swiss-Model(蛋白同源建模数据库) http://swissmodel.expasy.org/
STRING9.05(蛋白相互关系数据库) http://string-db.org/
Reactome(信号通路数据库) http://www.reactome.org/
KEGG(信号通路数据库) http://www.genome.jp
CambrigeSoft ChemOffice 2012 http://www.cambridgesoft.com/
Discovery Studio 2.55 http://accelrys.com/
Cytoscape 3.1 http://www.cytoscape.org/
[0052] 构建靶点-途径-疾病网络:
[0053] 从疾病数据库(OMIM,http://www.omim.org/)、DisGeNET(http://www.disgenet.org/)“以Hepatocellular Carcinoma”作为疾病关键词进行搜索,获得药物靶标基因和蛋白相关信息,利用Uniprot(https://www.uniprot.org/)对靶标基因和蛋白进行标准化命名,得到表2。
[0054] 表2原发性肝癌靶点数据库
[0055]
[0056]
[0057] 请着重参阅图3,构建多药物-化合物网络:
[0058] 肝复乐按照整方功效进行分组,清热解毒组4味(败酱草、重楼、半枝莲、茵陈蒿),活血化瘀组7味(鳖甲、土鳖虫、桃仁、苏木、牡蛎、郁金、大黄),健脾理气组10味(党参、白术、黄芪、茯苓、薏苡仁、香附、陈皮、柴胡、沉香、木通)。21味药材分别以中文拼音方式输入中草药在线数据库,从TCM-ID(http://www.megabionet.org/tcmid/)、TCM Database@taiwan(http://tcm.cmu.edu.tw/)中药数据库搜集每味药材全部的小分子化合物,然后整理、规范与剔除重复数据,规范化中药名称,最终获得974个小分子化合物。最后,从NCBI PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库与ChemSpider(http://www.chemspider.com)获取整理后的小分子化合物的2D与3D化学结构(mol文件格式)。构建肝复乐小分子化合物数据库,肝复乐按照整方功效进行分组,清热解毒组4味(败酱草、重楼、半枝莲、茵陈蒿),活血化瘀组7味(鳖甲、土鳖虫、桃仁、苏木、牡蛎、郁金、大黄),健脾理气组10味(党参、白术、黄芪、茯苓、薏苡仁、香附、陈皮、柴胡、沉香、木通)。21味药材分别以中文拼音方式输入中草药在线数据库,从TCM-ID(http://www.megabionet.org/tcmid/)、TCM Database@taiwan(http://tcm.cmu.edu.tw/)中药数据库搜集每味药材全部的小分子化合物,然后整理、规范与剔除重复数据,规范化中药名称,最终获得974个小分子化合物。
最后,从NCBI PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库与ChemSpider(http://www.chemspider.com)获取整理后的小分子化合物的2D与3D化学结构(mol文件格式)。
[0059] 从Reactome、KEGG获取8个靶点蛋白相关的113条生物作用途径,从OMIM获取65种相关疾病。最后,利用Cytoscape3.12软件把肝复乐3个功效组、21种药材、69个小分子化合物、8个肝癌靶点蛋白、113条生物作用途径和65种相关疾病共同构建多药材-化合物-靶点-途径-疾病的复杂网络作用模型。
[0060] 筛选:
[0061] 对所述小分子化合物数据库进行类药性筛选合利用度筛选,筛选候选分子组;所述构建具有良好药物代谢性质的抗原发性肝癌潜在活性小分子数据库,在Discovery Studio软件运用Lipinski类药5规则对肝复乐三个功效拆方组的974个小分子化合物进行初步快速筛选,得到726个小分子化合物,然后对这些化合物进一步预测ADME性质,筛选了198个候选小分子化合物。
[0062] 具体的,所述类药性筛选为第一步筛选,类药性筛选条件包括分子量为160~480、logP为-0.4~5.6、氢键供体为0~5、氢键受体为0~5;所述利用度筛选为第二步筛选,利用度筛选的条件包括ADME预测,其筛选条件包括人体肠道吸收为6.1溶解度为-4.0
[0063] 对接测试:
[0064] 对所述候选分子组的每个候选分子进行化学结构优化,进行加氢、赋予电荷、施加力场、生成多种构象,然后使用配体快速对接算法对所述候选分子与所述靶点数据库中的靶点蛋白进行对接,对所述对接进行一致性打分,形成药物-化合物-靶点-途径-疾病网络,筛选最佳分子组。先用CambrigeSoft ChemOffice 2012对经过上述步骤筛选后的198个化合物进行化学结构优化,再用Discovery Studio 2.55软件的“Prepare Ligand”(配体分子预处理)协议对这些化合物结构进行加氢、赋予电荷、生成多种构象与施加力场等。然后,利用“Prepare Protein”(受体分子预处理)协议在对8个靶点蛋白结构加氢、补齐缺失侧链、调整氨基酸残基PH值为7.0等。最后,在Discovery Studio 2.55利用“Ligand Docking”(配体快速对接)协议对这些优化后的化合物与靶点蛋白进行分子对接,运行binding energy、libdockscore、ligscore-1、ligscore-2、PLP-1和ligscore PLP-2等多个打分函数进行一致性打分,选取亲和力最好的配体,筛选了69个可能具有潜在活性较强的小分子化合物组成所述最佳分子组。
[0065] 具体的,所述配体快速对接算法为遗传算法或模拟退火算法;所述一致性打分为使用binding energy算法、libdockscore算法、ligscore-1算法、ligscore-2算法、PLP-1算法和ligscore PLP-2算法中的两种以上共同进行打分。
[0066] 优化组方
[0067] 根据所述最佳分子组在所述小分子化合物数据库中匹配对应药材,根据所述对应药材组成优化组方利用筛选出来的最佳分子组;具体的是,使用所述最佳分子组在多药材-化合物网络中匹配对应药材,使用所述对应药材匹配优化组方。
[0068] 作为优选方案,本实施例中,还包括步骤:
[0069] S3、优化组方的药效学验证:以所述优化组方和对照组方分别配置实验药剂,分别检测对肝癌靶标细胞的增殖、迁移、侵袭的表达影响水平及靶标蛋白表达影响水平,并验证所述优化组方的功效。
[0070] 所述实验药剂为采用水蒸气提取法、水提醇沉法对所述优化组方和所述对照组方分别分离成以挥发油部位、醇溶部位、醇沉部位制备成的若干个具有潜在药效活性的浸膏。
[0071] 所述优化组方包括健脾理气组、活血化瘀组、清热解毒组。
[0072] 请着重参阅图5-图8,检测肝复乐全方组与功效拆方组对人肝癌HepG-2细胞的增殖、迁移和侵袭的表达影响及PIK3CA、CASP8蛋白的表达水平包括以下步骤:
[0073] 1)实验分组:实验设空白对照组(双蒸水5μl/mL、10μl/mL,以下简称KB)、阳性对照组(阿霉素5μg/mL、10μg/mL,以下简称AM),4个药物组分别为:清热解毒组醇溶部位(5μl/mL、10μl/mL,以下简称QR)、活血化瘀组醇溶部位(5μl/mL、10μl/mL,以下简称HX)、健脾理气组醇溶部位(5μl/mL、10μl/mL,以下简称JP)、整方组醇溶部位(5μl/mL、10μl/mL,以下简称ZF)。
[0074] 上述4个药物组分别按照一下步骤进行制备:
[0075] 所有药材均采用预处理,药材磨成粗粉(过10目筛),45℃恒温烘干30min后,与10倍水溶液进行充分混合,再超声冷浸0.5h。
[0076] 将白术(60g)、陈皮(60g)、败酱草(60g)、郁金(60g)、茵陈(60g)、香附(60g)、柴胡(30g)、沉香(12g)等8味药材采用水蒸气蒸馏法提取挥发油部位(G1,亮黄色油状液体),提取4~5h,蒸馏后的水溶液另存留用。
[0077] 药渣与剩余的薏苡仁(60g)、茯苓(60g)、苏木(60g)、川木通(60g)、党参(60g)、重楼(60g)、生牡蛎(60g)、黄芪(60g)、半枝莲(60g)、桃仁(40g)、鳖甲(20g)、土鳖虫(20g)、大黄(10g)等13味药材用电子控温电热套煎煮2次,保持微沸,第一次2h,第二次1.5h,合并煎液,过滤,滤液与提取挥发油后的蒸馏水溶液合并,再用真空旋转蒸发仪进行浓缩(水浴温度70℃,转速65RPM),得到清膏。
[0078] 运用水提醇沉法处理清膏,超声处理,快速加入1:1的99.7%的无水乙醇,混匀,冷藏静置48h,取上清液,回收乙醇,浓缩成稠膏,待用。醇沉物进行离心后(3000RPM,5min),离心后的上清液与上述的上清液进行合并,得到醇溶部位,真空低温干燥(55℃,10h),得醇溶粗提物(G2,深褐色)。取下沉物,真空低温干燥(55℃,10h),得醇沉粗提物(G3,红棕色)。
[0079] 2)CCK-8法检测HepG-2细胞的增殖影响:取生长良好的对数生长期HepG-2细胞,接种于96孔板进行细胞培养。将HepG-2细胞分组,加入0.1%DMSO培养液进行培养,每组设置3个复孔,在培养0、24、48、72、96h等时间点,往各孔细胞中缓慢滴入10μl CCK-8溶液,使用细胞酶标仪测定450nm处的吸光度(OD值),计算各组细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。
[0080] 3)Transwell法检测HepG-2细胞的迁移能力:HepG-2细胞分组,孵育24h,常规消化,调整细胞密度至3×105个/mL;Transwell小室中分别接种细胞200μl,然后下室加入500μl10%FBS RPMI-1640培养基,孵育24h;使用倒置荧光显微镜,观察附着于小室底膜下表面的细胞形态;在450nm波长处,使用酶标仪检测(OD值,并间接计算迁移的细胞数目。细胞迁移率(%)=(对照组迁移细胞数-实验组迁移细胞数)/对照组迁移细胞数)×100%。
[0081] 4)Transwell法检测HepG-2细胞的侵袭能力:制备Transwell小室,细胞分组,将各组细胞常规消化,室温孵育,调整细胞浓度为1×105个/mL,Transwell下室加入800μl含有15%FBS的DMEM养基;孵育48h后用倒置显微镜(200倍)观察穿过聚酯纤维膜的细胞,每组随机选取3个不同的视野进行细胞计数。细胞侵袭率(%)=(1-实验组穿膜细胞数目/阴性对照组穿膜细胞数目)×100%。
[0082] 5)Western Blot法检测CASP8、PIK3CA蛋白的表达水平:实验分组,收集各组处理后48h的HepG-2细胞,裂解10min,提取细胞中总蛋白。使用BCA检测试剂盒对蛋白进行定量,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,以半干法转膜,将一抗用5%脱脂奶稀释至适当浓度(1:1000),二抗用TBST缓冲液稀释至适当浓度(1:5000),室温下孵育1~2h后,洗涤三次,进行化学发光反应,配置ECL检测液,育膜5min,显影、曝光。采用QuantityOne软件分析,以GAPDH(甘油-3-磷酸脱氢酶)标化,用凝胶图像处理系统进行灰度值分析(灰度值越低,蛋白在细胞的表达量越高)。
[0083] 首先,运用网络药理学和系统生物学的理论方法,表征肝复乐药物与机体多尺度网络的相互作用过程。首次构建了原发性肝癌的药材-化学成分-靶点-信号通路-疾病多药材-多成分-多靶点-多途径-多疾病的复杂网络模型,研究不同层次、不同对象之间的相互关系,初步阐明肝复乐治疗肝癌的活性成分与作用机制,建立临床病例与用药规律之间的内在关联,揭示了原发性肝癌病理过程的关键分子调控通路。
[0084] 其次,本发明人把肝复乐全方、拆方功效组提取制备成挥发油部位、醇溶部位、醇沉部位分别对12个不同极性部位进行药理、药效的对比研究,以肝复乐整方与功效组为研究载体,把计算机虚拟药理学实验与细胞、靶点蛋白两种水平的体外药效学实验结合,相互验证,并比较不同提取部位的最佳作用浓度与作用时间,以及肝复乐整方组与功效组之间的表达差异。
[0085] 本方案能为复方中药预测有效物质的网络靶标以及对机体的整体作用、机理研究方面开展探索性尝试,为复方中药作用机理的深入研究提供基础,并为复方中药二次升级开发和新药开发提供支撑
[0086] 可以理解的是,对本领域普通技术人员来说,可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
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