具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料或医疗器械及制备方法
阅读：740发布：2020-05-11
专利汇可以提供具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料或医疗器械及制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种具有内皮细胞选择性基因递送表面的 生物 材料 或医疗器械及制备方法，制备：(1)生物材料或医疗器械表面 氨 基化；(2)生物材料或医疗器械表面功能化修饰；(3)制备链霉亲和素修饰的生物材料或医疗器械；(4)得到具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料或医疗器械。本 发明 在生物材料或医疗器械表面原位 转染 内皮细胞，促进细胞在生物材料或医疗器械表面的增殖和迁移，实现快速 内皮化 。方法操作简单易行；本发明所使用的多肽和基因复合物具有 生物相容性 和 生物可降解性 ，所用材料安全无毒，无免疫原性；带有生物素的多肽 接触 到内皮细胞表面的蛋白酶类，酶促降解，利于基因复合物的响应性释放，进而高效转染内皮细胞，实现表面转染。，下面是具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料或医疗器械及制备方法专利的具体信息内容。
1.一种具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料或医疗器械的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)生物材料或医疗器械表面氨基化；
(2)生物材料或医疗器械表面功能化修饰：
采用两种方法之一进行：
方法一：将邻二硫吡啶衍生物和带有生物素的多肽在水或中性缓冲溶液中反应，得到反应液，将步骤(1)获得的材料加入到所述反应液中，调节pH为8-10，获得表面功能化修饰的生物材料或医疗器械；
方法二：将邻二硫吡啶衍生物和步骤(1)获得的材料加入到水或pH为8-10的缓冲溶液中，反应0.5-24小时，加入与带有生物素的多肽，反应，获得表面功能化修饰的生物材料或医疗器械；
(3)将步骤(2)获得的表面功能化修饰的生物材料或医疗器械置于浓度为1～5mg/mL链霉亲和素的磷酸盐缓冲溶液溶液中，磷酸盐缓冲溶液pH为7-9，20～40℃孵育2～8h，去离子水清洗，获得链霉亲和素修饰的生物材料或医疗器械；
(4)将步骤(3)获得的材料置于浓度为1～5mg/mL修饰有生物素的基因复合物的胶束溶液中孵育2～8h，用pH＝7-9的磷酸盐缓冲溶液清洗，得到具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料或医疗器械。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述生物材料为不锈钢、钛、铁、钛合金、镁合金、铁合金、金、聚氨酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚四氟乙烯、聚己内酯、聚丙交酯、聚乙交酯、聚丙交酯-共-乙交酯或聚甲基丙烯酸甲酯。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述医疗器械为人工血管、人工心血管、人工心脏、冠脉支架、脑血管支架、肾动脉支架、大动脉支架、输血管或输血袋。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤(2)所述邻二硫吡啶衍生物和带有生物素的多肽为等摩尔。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征是所述邻二硫吡啶衍生物为：3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、邻二硫吡啶-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺戊酸酯或邻二硫吡啶-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺羧甲基酯，所述邻二硫吡啶-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺戊酸酯或邻二硫吡啶-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺羧甲基酯的聚乙二醇分子量为2000、
3500、5000或7000。
6.根据权利要求1或4所述的方法，其特征是所述带有生物素的多肽为：
生物素-Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Trp-Gly-Gln-Cys、
生物素-Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Trp-Gly-Gln-Gln-Cys、
生物素-Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Trp-Gly-Gln-Gln-Gln-Cys或
生物素-Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Trp-Gly-Gln-Gln-Gln-Gln-Cys。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤(4)所述基因为血管内皮生长因子基因或ZNF580基因。
8.权利要求1-7之一的方法制备的一种具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料或医疗器械。
具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料或医疗器械及
制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于医用高分子材料技术领域，具体涉及一种具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料或医疗器械及制备方法。
背景技术
[0002] 血液接触性医疗器械如人工血管移植物和冠状动脉支架已广泛应用于生物医学领域。然而，这些血液接触性医疗器械在临床使用中经常面临血栓形成、内膜增生和再狭窄等问题。这与血液接触性医疗器械表面缺乏活性内皮细胞层密切相关。天然血管内表面的内皮细胞层不仅提供适当的血液相容性表面，以确保血液流动，而且能够调节血管平滑肌细胞的行为，从而减少血栓形成和内膜增生。材料表面的内皮层可有效防止血栓形成和内膜增生，有效提高血管移植物的长期通畅性。因此，材料表面的快速内皮化对于提高血液接触性医疗器械的长期使用性能具有重要意义。
[0003] 利用基因治疗技术可以促进内皮细胞的快速增殖和迁移。然而，基因复合物(基因载体和基因经自组装而形成基因复合物)通常在培养液体系中对细胞进行转染，而内皮化则需要在生物材料表面形成一层连续的功能内皮层。因此，如何将基因治疗和表面改性有效结合，从而促进材料表面的内皮化，具有非常重要的研究意义和实用价值。研究人员将基因复合物通过物理吸附、包埋或者化学固定的方法修饰在材料表面，利用材料表面的基因复合物对细胞进行转染，这种策略虽然在内皮化和组织工程领域具有重要意义。然而，这种物理包埋基因复合物修饰材料表面的方法存在一些缺陷，例如材料表面释放出的基因复合物进入培养液，降低了利用率，而且被转染的细胞没有粘附在材料表面等。为了提高基因复合物的利用率，我们采用共价键方法将基因复合物固定在材料表面，然而，细胞转染效果不够理想。分析其原因，基因复合物和材料表面之间有连接链，它可能对细胞活性有影响，而且基因复合物即使被细胞摄取，受到连接链的影响而被胞吐，从而降低了基因复合物的细胞内化，导致转染效率低，无法有效促进内皮细胞在材料表面的增殖和迁移，最终无法实现材料表面的快速内皮化。现有的转染技术通常只能在培养液中转染细胞，导致基因复合物的利用率低，细胞无法有效在材料表面生长，从而不利于材料表面的内皮化。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料或医疗器械。
[0005] 本发明的第二个目的是提供一种具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料或医疗器械的制备方法。
[0006] 本发明的技术方案概述如下：
[0007] 一种具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料或医疗器械的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0008] (1)生物材料或医疗器械表面氨基化；
[0009] (2)生物材料或医疗器械表面功能化修饰：
[0010] 采用两种方法之一进行：
[0011] 方法一：将邻二硫吡啶衍生物和带有生物素的多肽在水或中性缓冲溶液中反应，得到反应液，将步骤(1)获得的材料加入到所述反应液中，调节pH为8-10，获得表面功能化修饰的生物材料或医疗器械；
[0012] 方法二：将邻二硫吡啶衍生物和步骤(1)获得的材料加入到水或pH为8-10的缓冲溶液中，反应0.5-24小时，加入与带有生物素的多肽，反应，获得表面功能化修饰的生物材料或医疗器械；
[0013] (3)将步骤(2)获得的表面功能化修饰的生物材料或医疗器械置于浓度为1～5mg/mL链霉亲和素的磷酸盐缓冲溶液溶液中，磷酸盐缓冲溶液pH为7-9，20～40℃孵育2～8h，去离子水清洗，获得链霉亲和素修饰的生物材料或医疗器械；
[0014] (4)将步骤(3)获得的材料置于浓度为1～5mg/mL修饰有生物素的基因复合物的胶束溶液中孵育2～8h，用pH＝7-9的磷酸盐缓冲溶液清洗，得到具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料或医疗器械。
[0016] 医疗器械为人工血管、人工心血管、人工心脏、冠脉支架、脑血管支架、肾动脉支架、大动脉支架、输血管或输血袋。
[0017] 步骤(2)所述邻二硫吡啶衍生物和带有生物素的多肽为等摩尔。
[0018] 邻二硫吡啶衍生物为：3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、邻二硫吡啶-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺戊酸酯或邻二硫吡啶-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺羧甲基酯，所述邻二硫吡啶-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺戊酸酯或邻二硫吡啶-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺羧甲基酯的聚乙二醇分子量为2000、3500、5000或7000。
[0019] 带有生物素的多肽为：
[0020] 生物素-Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Trp-Gly-Gln-Cys、
[0021] 生物素-Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Trp-Gly-Gln-Gln-Cys、
[0022] 生物素-Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Trp-Gly-Gln-Gln-Gln-Cys或
[0023] 生物素-Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Trp-Gly-Gln-Gln-Gln-Gln-Cys。
[0024] 步骤(4)所述基因为血管内皮生长因子基因或ZNF580基因。
[0025] 上述方法制备的一种具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料或医疗器械。
[0026] 本发明的优点：
[0027] 现有的转染技术通常只能在培养液中转染细胞，导致基因复合物的利用率低，细胞无法有效在材料表面生长，从而不利于材料表面的内皮化，本发明能够在生物材料或医疗器械表面原位转染内皮细胞，促进细胞在生物材料或医疗器械表面的增殖和迁移，实现快速内皮化。本发明的方法操作简单易行；本发明所使用的多肽和基因复合物具有生物相容性和生物可降解性，所用材料安全无毒，无免疫原性；带有生物素的多肽接触到内皮细胞表面的蛋白酶类，发生酶促降解，有利于基因复合物的响应性释放，并进而高效转染内皮细胞，实现真正的表面转染；基因复合物在材料表面高效转染内皮细胞，能够有效促进血管内皮细胞在生物材料或医疗器械表面的快速增殖，铺展和迁移，有利于生物材料或医疗器械表面的快速内皮化；本发明的具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料或医疗器械具有原位促进内皮细胞快速增殖和迁移的能力，能够实现材料表面的快速内皮化。附图说明
[0028] 图1为内皮细胞选择性基因递送表面的累积释放量。
[0029] 图2为转染实验结果，其中：
[0030] (1)为表面转染的内皮细胞的荧光图像，
[0031] (2)表面转染的内皮细胞中的相对蛋白表达水平，
[0032] (3)为表面转染的内皮细胞中的ZNFF580信使RNA的相对表达水平；
[0033] A为空白材料，B为链霉亲和素修饰的生物材料，C为内皮细胞选择性基因递送表面。
[0034] 图3细胞增殖实验结果，其中：
[0035] (1)为荧光图像；(2)为细胞密度；
[0036] A为空白材料，B为链霉亲和素修饰的生物材料，C为内皮细胞选择性基因递送表面。
[0037] 图4为细胞迁移实验结果，其中：
[0038] (1)迁移荧光图像；(2)平均迁移距离(％)；
[0039] A为空白材料，B为链霉亲和素修饰的生物材料，C为内皮细胞选择性基因递送表面。
具体实施方式
[0040] 为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例对本说明作进一步的说明。
[0041] 以下实施例中高纯金片购买于北京亿品川成科技有限公司，CAS号7440-57-5，纯度99.999％，其它企业出售的，与此公司出售的纯度相似的高纯金片也可以用于本发明。
[0042] 本发明以重组人血管内皮生长因子基因(VEGF165)或ZNF580基因为例，是为了说明利用本发明的方法可以制备出具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料或医疗器械，但并不对基因进行限定，与这两种基因之一的性质相近的基因都可以用于本发明。
[0043] VEGF165和ZNF580基因均为人工合成。
[0044] VEGF，Genbank注册号:AB021221.1
[0045] “VEGF165”为该Gene的开放阅读框部分，共576bp，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0046] ZNF580，Genbank注册号:AF184939。
[0047] “ZNF580”为该Gene的开放阅读框部分，共519bp，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0048] 生物素-Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Trp-Gly-Gln-Cys简称生物素-序列1。
[0049] 生物素-Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Trp-Gly-Gln-Gln-Cys简称生物素-序列2。
[0050] 生物素-Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Trp-Gly-Gln-Gln-Gln-Cys简称生物素-序列3。
[0051] 生物素-Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Trp-Gly-Gln-Gln-Gln-Gln-Cys简称生物素-序列4。
[0052] 邻二硫吡啶衍生物中：
[0053] 3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯简称邻二硫吡啶衍生物A；
[0054] 邻二硫吡啶-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺戊酸酯简称邻二硫吡啶衍生物B；
[0055] 邻二硫吡啶-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺羧甲基酯简称邻二硫吡啶衍生物C；
[0056] 邻二硫吡啶-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺戊酸酯或邻二硫吡啶-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺羧甲基酯的聚乙二醇分子量为2000、3500、5000或7000。
[0057] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0058] 实施例1
[0059] 浓度为1mg/mL修饰有生物素的基因复合物(mPEG-b-PLGA-g-PEI-g-PEG-Biotin/pDNA)的胶束溶液，其制备方法如下：
[0060] 将丙交酯(4.5g，31mmol)，乙交酯(0.50g，4.3mmol)，辛酸亚锡的甲苯溶液(0.40mL，0.25M)，甲氧基聚乙二醇(mPEG，数均分子量为2000，2.0g，1.0mmol)加入到干燥的充满氮气的聚合管中，密封后，在110℃，反应24h。产物溶于氯仿，在冰正己烷沉出，反复两次。然后，在37℃真空干燥至恒重，得到mPEG-b-PLGA-OH；
[0061] 将mPEG-b-PLGA-OH(5.0g，0.72mmol)溶于20mL1,4-二氧六环，三乙胺200μL、二甲氨基吡啶(0.89g，7.2mmol)和丁二酸酐(0.73g，7.2mmol)在25℃下反应24h，反应混合物在冰的正己烷中沉出获得粗产物，再经过二氯甲烷溶解、盐酸溶液(5％)、饱和氯化钠水溶液洗涤，分离有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，冰正己烷沉出，干燥得到MPEG-b-PLGA-COOH；
[0062] 将MPEG-b-PLGA-COOH(0.50g,0.070mmol)溶解在5.0mLDMSO中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.067g，0.35mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(0.040g,0.35mmol)，在25℃条件下，和聚乙烯亚胺(PEI1.8kDa，0.38g)的DMSO溶液反应24h。通过透析和冻干得到mPEG-b-PLGA-g-PEI共聚物。
[0063] 将mPEG-b-PLGA-g-PEI(100mg)和带有生物素和N-羟基琥珀酰亚胺的聚乙二醇(16.5mg,分子量2400)溶解于6mLPBS和DMSO的混合溶液(2：1)中，在40℃避光反应4h后，经过透析、冷冻干燥得到mPEG-b-PLGA-g-PEI-g-PEG-Biotin。
[0064] 取2mLmPEG-b-PLGA-g-PEI-g-PEG-Biotin的DMSO溶液(5mg/mL)逐滴滴加到20mL的PBS中，将20mLpEGFP-ZNF580(pDNA)质粒基因溶液(50μg/mL)缓慢滴入，经过透析，调节溶液体积，制备得到1mg/mL修饰有生物素的基因复合物mPEG-b-PLGA-g-PEI-PEG-Biotin/pDNA的胶束溶液。
[0065] (浓度为3mg/mL修饰有生物素的基因复合物(mPEG-b-PLGA-g-PEI-g-PEG-Biotin/pDNA)的胶束溶液，经过调节水的加入量，就可以得到相应浓度的溶液)
[0066] (浓度为5mg/mL修饰有生物素的基因复合物(mPEG-b-PLGA-g-PEI-g-PEG-Biotin/pDNA)的胶束溶液，经过调节水的加入量，就可以得到相应浓度的溶液)
[0067] 实施例2制备和实施例1类似的修饰有生物素的基因复合物的胶束溶液[0068] 将聚乙烯亚胺(PEI25KDa,数均分子量为25000)和带有生物素和N-羟基琥珀酰亚胺的聚乙二醇(16.5mg,分子量2400)溶解于6mLPBS和DMSO的混合溶液(2：1)中，在40℃避光反应4h后，经过透析、冷冻干燥得到PEI-g-PEG-Biotin。
[0069] 取2mLPEI-g-PEG-Biotin的DMSO溶液(5mg/mL)逐滴滴加到20mL的PBS中，将20mLpEGFP-ZNF580(pDNA)质粒基因溶液(50μg/mL)缓慢滴入，经过透析，调节溶液体积，制备得到修饰有生物素的基因复合物PEI-g-PEG-Biotin/pDNA。(浓度经调节溶液体积，胶束溶液浓度控制在1-5mg/mL)
[0070] 后面实施例中，可以用PEI-g-PEG-Biotin/pDNA等同于mPEG-b-PLGA-g-PEI-PEG-Biotin/pDNA。
[0071] 实施例3
[0072] 一种具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料的制备方法，包括以下步骤：
[0073] (1)生物材料(高纯金片)表面氨基化：
[0074] 将高纯金片置于浓度为50mM的2-氨基乙硫醇盐酸盐的甲醇溶液中，在氮气保护氛围下，在恒温气浴震荡器中于30℃反应条件下反应48h，使金片表面氨基化，得到氨基化的金片；
[0075] (2)生物材料表面功能化修饰：
[0076] 将邻二硫吡啶衍生物A和生物素-序列1按照等摩尔混合得混合物，在相当混合物质量200倍的水中反应0.5小时，得到反应液，将步骤(1)获得的表面氨基化的金片加入到反应液中，调节pH为9，反应8小时，获得表面功能化修饰的生物材料；
[0077] (3)将步骤(2)获得的表面功能化修饰的生物材料置于浓度为3mg/mL链霉亲和素(商品)的磷酸钠缓冲溶液溶液中，磷酸钠缓冲溶液pH为8，30℃孵育5h，去离子水清洗，获得链霉亲和素修饰的生物材料；
[0078] (4)将步骤(3)获得的材料置于浓度为3mg/mL修饰有生物素的基因复合物的胶束溶液(实施例1制备)中孵育5h，用pH＝8的磷酸钠缓冲溶液清洗，得到具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料。
[0079] 用实施例2制备的修饰有生物素的基因复合物的胶束溶液替代步骤(4)中的实施例1制备的L修饰有生物素的基因复合物的胶束溶液，其它同本实施例，制备出相应的具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料。
[0080] 实施例4
[0081] 一种具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料的制备方法，包括以下步骤：
[0082] (1)生物材料(聚氨酯片)表面氨基化：
[0083] 将聚氨酯片置于浓度为50mM的2-氨基乙硫醇盐酸盐的甲醇溶液中，在氮气保护氛围下，在恒温气浴震荡器中于30℃反应条件下反应48h，使聚氨酯片表面氨基化，得到表面氨基化的聚氨酯片；
[0084] (2)生物材料表面功能化修饰：
[0085] 将邻二硫吡啶衍生物B(聚乙二醇分子量为2000，也可以用3500、5000或7000替代2000)和生物素-序列2按照等摩尔混合得混合物，在相当混合物质量500倍的中性缓冲溶液中反应1小时，得到反应液，将步骤(1)获得的表面氨基化的聚氨酯片加入到反应液中，调节pH为8，反应8小时，获得表面功能化修饰的生物材料；
[0086] (3)将步骤(2)获得的表面功能化修饰的生物材料置于浓度为1mg/mL链霉亲和素的磷酸钾缓冲溶液溶液中，磷酸钾缓冲溶液pH为7，20℃孵育8h，去离子水清洗，获得链霉亲和素修饰的生物材料；
[0087] (4)将步骤(3)获得的材料置于浓度为1mg/mL修饰有生物素的基因复合物的胶束溶液(实施例1制备，也可以用实施例2制备的)中孵育2h，用pH＝7的磷酸钾缓冲溶液清洗，得到具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料。
[0088] 实施例5
[0089] 一种具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料的制备方法，包括以下步骤：
[0090] (1)生物材料(聚四氟乙烯片)表面氨基化：
[0091] 将聚四氟乙烯片置于浓度为50mM的2-氨基乙硫醇盐酸盐的甲醇溶液中，在氮气保护氛围下，在恒温气浴震荡器中于30℃反应条件下反应48h，使聚四氟乙烯片表面氨基化，得到表面氨基化的聚四氟乙烯片；
[0092] (2)生物材料表面功能化修饰：
[0093] 将邻二硫吡啶衍生物C(聚乙二醇分子量为2000，也可以用3500、5000或7000替代2000)和生物素-序列3(也可以选用生物素--序列4)按照等摩尔混合得混合物，在相当混合物质量1000倍的中性缓冲溶液中反应2小时，得到反应液，将步骤(1)获得的表面氨基化的聚四氟乙烯片加入到反应液中，调节pH为10，反应8小时，获得表面功能化修饰的生物材料；
[0094] (3)将步骤(2)获得的表面功能化修饰的生物材料置于浓度为5mg/mL链霉亲和素的磷酸钠缓冲溶液溶液中，磷酸钠缓冲溶液pH为9，40℃孵育2h，去离子水清洗，获得链霉亲和素修饰的生物材料；
[0095] (4)将步骤(3)获得的材料置于浓度为5mg/mL修饰有生物素的基因复合物的胶束溶液(实施例1制备，也可以用实施例2制备的)中孵育8h，用pH＝9的磷酸钠缓冲溶液清洗，得到具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料。
[0096] 用不锈钢片、钛片、铁片、钛合金片、镁合金片、铁合金片、聚对苯二甲酸乙二醇酯片、聚己内酯片、聚丙交酯片、聚乙交酯片、聚丙交酯-共-乙交酯片或聚甲基丙烯酸甲酯片替代本实施例的聚四氟乙烯片，其它同本实施例，制备出相应的具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料。
[0097] 实施例6
[0098] 一种具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料的制备方法，包括以下步骤：
[0099] (1)同实施例3步骤(1)；
[0100] (2)将邻二硫吡啶衍生物A和步骤(1)获得的材料加入到水，反应10小时，加入生物素-序列1，反应8小时，获得表面功能化修饰的生物材料；
[0101] (3)、(4)同实施例3的(3)、(4)。
[0102] 实施例7
[0103] 一种具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料的制备方法，包括以下步骤：
[0104] (1)同实施例4步骤(1)；
[0105] (2)将邻二硫吡啶衍生物B(聚乙二醇分子量为2000，也可以用3500、5000或7000替代2000)和步骤(1)获得的材料加入到pH为8的缓冲溶液中，反应0.5小时，加入生物素-序列2，反应8小时，获得表面功能化修饰的生物材料；
[0106] (3)、(4)同实施例4(3)、(4)。
[0107] 实施例8
[0108] 一种具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料的制备方法，包括以下步骤：
[0109] (1)同实施例5步骤(1)；
[0110] (2)将邻二硫吡啶衍生物C(聚乙二醇分子量为2000，也可以用3500、5000或7000替代2000)和步骤(1)获得的材料加入到pH为10的缓冲溶液中，反应24小时，加入生物素-序列3(也可以是生物素-序列4)，反应8小时，获得表面功能化修饰的生物材料；
[0111] (3)、(4)同实施例5(3)、(4)。
[0112] 实施例9
[0113] 一种具有内皮细胞选择性基因递送表面的医疗器械的制备方法，包括如下步骤：
[0114] (1)人工血管表面氨基化：
[0115] 将人工血管置于浓度为50mM的2-氨基乙硫醇盐酸盐的甲醇溶液中，在氮气保护氛围下，在恒温气浴震荡器中于30℃反应条件下反应48h，使人工血管表面氨基化，得到氨基化的人工血管；
[0116] (3)人工血管表面功能化修饰：
[0117] 将邻二硫吡啶衍生物A和生物素-序列1按照等摩尔混合得混合物，在相当混合物质量200倍的水中反应0.5小时，得到反应液，将步骤(1)获得的表面氨基化的金片加入到反应液中，调节pH为9，反应8小时，获得表面功能化修饰的人工血管；
[0118] (3)将步骤(2)获得的表面功能化修饰的人工血管置于浓度为3mg/mL链霉亲和素(商品)的磷酸钠缓冲溶液溶液中，磷酸钠缓冲溶液pH为8，30℃孵育5h，去离子水清洗，获得链霉亲和素修饰的人工血管；
[0119] (4)将步骤(3)获得的材料置于浓度为3mg/mL修饰有生物素的基因复合物的胶束溶液(实施例1制备)中孵育5h，用pH＝8的磷酸钠缓冲溶液清洗，得到具有内皮细胞选择性基因递送表面的人工血管。
[0120] 实施例10
[0121] 一种具有内皮细胞选择性基因递送表面的医疗器械的制备方法，包括以下步骤：
[0122] (1)人工心血管表面氨基化：
[0123] 将人工心血管置于浓度为50mM的2-氨基乙硫醇盐酸盐的甲醇溶液中，在氮气保护氛围下，在恒温气浴震荡器中于30℃反应条件下反应48h，使人工心血管表面氨基化，得到表面氨基化的人工心血管；
[0124] (2)人工心血管表面功能化修饰：
[0125] 将邻二硫吡啶衍生物B(聚乙二醇分子量为2000，也可以用3500、5000或7000替代2000)和生物素-序列2按照等摩尔混合得混合物，在相当混合物质量500倍的中性缓冲溶液中反应1小时，得到反应液，将步骤(1)获得的表面氨基化的人工心血管加入到反应液中，调节pH为8，反应8小时，获得表面功能化修饰的生物材料；
[0126] (3)将步骤(2)获得的表面功能化修饰的人工心血管置于浓度为1mg/mL链霉亲和素的磷酸钾缓冲溶液溶液中，磷酸钾缓冲溶液pH为7，20℃孵育8h，去离子水清洗，获得链霉亲和素修饰的人工心血管；
[0127] (4)将步骤(3)获得的材料置于浓度为1mg/mL修饰有生物素的基因复合物的胶束溶液(实施例1制备，也可以用实施例2制备的)中孵育2h，用pH＝7的磷酸钾缓冲溶液清洗，得到具有内皮细胞选择性基因递送表面的人工心血管。
[0128] 实施例11
[0129] 一种具有内皮细胞选择性基因递送表面的医疗器械的制备方法，包括以下步骤：
[0130] (1)人工心脏表面氨基化：
[0131] 将人工心脏置于浓度为50mM的2-氨基乙硫醇盐酸盐的甲醇溶液中，在氮气保护氛围下，在恒温气浴震荡器中于30℃反应条件下反应48h，使人工心脏表面氨基化，得到表面氨基化的人工心脏；
[0132] (2)人工心脏表面功能化修饰：
[0133] 将邻二硫吡啶衍生物C(聚乙二醇分子量为2000，也可以用3500、5000或7000替代2000)和生物素-序列3(也可以选用生物素--序列4)按照等摩尔混合得混合物，在相当混合物质量1000倍的中性缓冲溶液中反应2小时，得到反应液，将步骤(1)获得的表面氨基化的人工心脏加入到反应液中，调节pH为10，反应8小时，获得表面功能化修饰的人工心脏；
[0134] (3)将步骤(2)获得的表面功能化修饰的人工心脏置于浓度为5mg/mL链霉亲和素的磷酸钠缓冲溶液溶液中，磷酸钠缓冲溶液pH为9，40℃孵育2h，去离子水清洗，获得链霉亲和素修饰的人工心脏；
[0135] (4)将步骤(3)获得的材料置于浓度为5mg/mL修饰有生物素的基因复合物的胶束溶液(实施例1制备，也可以用实施例2制备的)中孵育8h，用pH＝9的磷酸钠缓冲溶液清洗，得到具有内皮细胞选择性基因递送表面的人工心脏。
[0136] 实施例12
[0137] 一种具有内皮细胞选择性基因递送表面的医疗器械的制备方法，包括以下步骤：
[0138] (1)同实施例9步骤(1)；
[0139] (2)将邻二硫吡啶衍生物A和步骤(1)获得的材料加入到水，反应10小时，加入生物素-序列1，反应8小时，获得表面功能化修饰的人工血管；
[0140] (3)、(4)同实施例3的(3)、(4)。
[0141] 实施例13
[0142] 一种具有内皮细胞选择性基因递送表面的医疗器械的制备方法，包括以下步骤：
[0143] (1)同实施例10步骤(1)；
[0144] (2)将邻二硫吡啶衍生物B(聚乙二醇分子量为2000，也可以用3500、5000或7000替代2000)和步骤(1)获得的材料加入到pH为8的缓冲溶液中，反应0.5小时，加入生物素-序列2，反应8小时，获得表面功能化修饰的人工心血管；
[0145] (3)、(4)同实施例4(3)、(4)。
[0146] 实施例14
[0147] 一种具有内皮细胞选择性基因递送表面的医疗器械的制备方法，包括以下步骤：
[0148] (1)同实施例11步骤(1)；
[0149] (2)将邻二硫吡啶衍生物C(聚乙二醇分子量为2000，也可以用3500、5000或7000替代2000)和步骤(1)获得的材料加入到pH为10的缓冲溶液中，反应24小时，加入生物素-序列3(也可以是生物素-序列4)，反应8小时，获得表面功能化修饰的人工心脏；
[0150] (3)、(4)同实施例5(3)、(4)。
[0151] 用冠脉支架、脑血管支架、肾动脉支架、大动脉支架、输血管或输血袋替代本实施例的人工心脏，其它同本实施例，制备出相应的具有内皮细胞选择性基因递送表面的医疗器械。
[0152] 实施例15具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料的基因递送[0153] 为了测定具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料的基因递送效果，利用荧光染料Cy5标记mPEG-b-PLGA-g-PEI-g-PEG-Biotin，并进行基因递送效果评价实验。
[0154] 将实施例3制备的具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料样品，在IV型胶原酶(50μg/mL，pH7.4)条件下，测定累积释放量。结果如图1所示，IV型胶原酶能够实现持续释放基因，24h时的累积释放量达到47.0±1.3％；而对比实验(没有IV型胶原酶)的情况下，基本没有基因释放。结果表明所制备的具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料能够选择性地递送基因复合物，这有利于内皮细胞的表面转染，有利于血液接触性医疗器械的表面内皮化。
[0155] 实施例16具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料的细胞转染实验[0156] 以实施例4所制备的具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料，进行体外细胞转染实验。
[0157] 将内皮细胞以1×105细胞/孔的细胞密度接种到含有具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料的24孔细胞培养板中，用DMEM培养基培养细胞4h，再用10％胎牛血清的DMEM细胞培养基继续培养24h。通过倒置荧光显微镜观察细胞中所表达出的绿色荧光蛋白(GFP)并记录拍照，利用蛋白质印记分析和实时定量PCR分析对经过转染的内皮细胞中特定蛋白和相应mRNA的表达水平进行了综合评价。结果如图2所示，A为空白材料，即未经反应处理的材料；B为链霉亲和素修饰的生物材料，即实施例4中步骤(3)获得的链霉亲和素修饰的生物材料，C为内皮细胞选择性基因递送表面；其中A和B作为对比材料。实验结果表明，[0158] 经过内皮细胞选择性基因递送表面转染的内皮细胞中的绿色荧光蛋白数量(图2-(1))、ZNF580蛋白的相对表达水平(图2-(2))和相应mRNA的表达水平(图2-(3))[0159] 显著提高，实验结果表明内皮细胞选择性基因递送表面能够高效地转染了内皮细胞，可以显著提高转染细胞的绿色荧光蛋白、ZNF580蛋白和相应mRNA的表达水平，结果证明在材料表面促进了内皮细胞转染。
[0160] 实施例17具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料的细胞增殖实验[0161] 荧光素二乙酸酯(FDA)细胞染色法用于研究内皮细胞在内皮细胞选择性基因递送表面上的细胞增殖情况。以实施例4所制备的具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料进行测定。用5mg/mLFDA的PBS溶液对转染的内皮细胞进行荧光染色20min,经PBS溶液洗涤细胞三次，利用荧光显微镜进行拍照和利用Image-ProPlus软件统计分析内皮细胞选择性基因递送表面上的细胞密度(细胞数/平方毫米)。实验结果如图3所示，相对于对比组(A组和B组)，内皮细胞选择性基因递送表面(C组)明显地促进了内皮细胞的增殖，这证明具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料可以有效地对内皮细胞进行转染并促进其增殖，促进材料表面的快速内皮化。
[0162] 实施例18具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料的细胞迁移实验[0163] 转染内皮细胞的迁移能力通过划痕实验进行测定，以实施例4所制备的具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料进行测定。将内皮细胞接种到6孔培养板中的样品表面上，培养至70-80％的融合，使用200μL微量移液器枪头在单层细胞中均匀划痕，用D-Hanks缓冲溶液洗涤细胞碎片，继续培养细胞24h后，利用荧光显微镜拍摄内皮细胞在表面的细胞迁移图像，利用Image-ProPlus软件统计分析内皮细胞的平均迁移距离(％)。实验结果如图4所示，具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料能够促进内皮细胞的快速铺展和迁移。这些实验结果说明，具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料能够在材料表面原位转染内皮细胞，提高基因复合物对内皮细胞转染，从而在材料表面的快速增殖、铺展和迁移，有利于材料表面的内皮化。
[0164] 用实施例5-14所制备的各个具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料或医疗器械替代实施例15的中提及的具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料，分别替代实施例16--18中的C组，得到相似实验结果。
[0165] 证明具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料或医疗器械能够在材料表面原位转染内皮细胞，提高基因复合物对内皮细胞转染，从而在材料表面的快速增殖、铺展和迁移，有利于材料表面的内皮化。这对于提高血液接触式医疗器械具有重要意义。
[0166] 实施例1和实施例2中，pEGFP-ZNF580(pDNA)质粒基因溶液被相同浓度的VEGF165(pDNA)质粒基因溶液代替，得到基因复合物mPEG-b-PLGA-g-PEI-PEG-Biotin/pDNA的胶束溶液，其中pDNA为VEGF165。所述基因复合物mPEG-b-PLGA-g-PEI-PEG-Biotin/pDNA的胶束溶液用于实施例3-14，得到具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料和医疗器械。经实施例16-18，结果证明，具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料或医疗器械能够在材料表面原位转染内皮细胞，提高基因复合物对内皮细胞转染，从而在材料表面的快速增殖、铺展和迁移，有利于材料表面的内皮化。
[0167] 对比实验结果证明，在实施例3中(2)步骤，用氢氧化钠调节溶液pH小于7，则获得不了表面功能化修饰的生物材料，最终得不到具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料和医疗器械。这说明本发明必须严格控制反应介质pH。
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