一种枯草芽孢杆菌及其应用
阅读：997发布：2021-04-13
专利汇可以提供一种枯草芽孢杆菌及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37，在中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.4277，保藏日期为2010年10月27日。所述的枯草芽孢杆菌主要用于杨木变色病的 生物防治 。本发明枯草芽孢杆菌B37对杨木上的多种变色 真菌 具有抑制作用，该拮抗细菌对多种 植物 病害也有很好的防治效果；繁殖速度快；能够人工培养，易于操作，便于生产应用；抗逆能 力 强等优点，尤其是对真菌引起的杨木变色病的防治具有重要意义；培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。，下面是一种枯草芽孢杆菌及其应用专利的具体信息内容。
1.一种枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.4277，保藏日期为2010年10月27日。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在防治杨木变色病中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37接种于发酵培养基中，在28℃-37℃下发酵培养48-72小时，得到的发酵液作为防治杨木变色真菌的菌剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏2-5g，蛋白胨5-10g，氯化钠5g，pH6.5-7.5。
一种枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于木材保护领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌及其在防治杨木变色病中的应用。
背景技术
[0002] 杨树是世界重要的速生用材树种之一，更是我国速生丰产主栽树种，具有适应性广、生长速度快等特点，受到杨树栽培者欢迎。目前，我国杨树林面积已经超过800万ha，蓄3
积量达到4.29亿m，居世界首位，超过其他国家的杨树人工林面积的总和，其中杨树用材林面积为309万ha，占全国杨树人工林面积的40％左右，在华东地区杨木加工业已成为当地
3
的经济支柱。仅江苏省泗阳县有杨树人工林60多万亩(约4万ha)，年总生产量100万m，森
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林覆盖率42％，活立木蓄积量550万m。但在杨树砍伐后运输、储存和加工过程中，易受到变色菌和霉菌的侵染，致使木材变色、发霉，影响了木材表观和实用价值，变色对木材物理力学性能的影响与引起变色的真菌及木材种类有关，木材变色3个月以后，由Ophiostoma属的一些种引起针叶材的重量损失为14％，阔叶材重量损失可高达25％。虽然边材变色不严重改变木材的强度，但也有影响，严重变色松木韧性降低30％，比重损失1-2％，表面硬度下降2-10％，弯曲强度和抗压强度下降1-5％。
积量达到4.29亿m，居世界首位，超过其他国家的杨树人工林面积的总和，其中杨树用材林面积为309万ha，占全国杨树人工林面积的40％左右，在华东地区杨木加工业已成为当地
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的经济支柱。仅江苏省泗阳县有杨树人工林60多万亩(约4万ha)，年总生产量100万m，森
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林覆盖率42％，活立木蓄积量550万m。但在杨树砍伐后运输、储存和加工过程中，易受到变色菌和霉菌的侵染，致使木材变色、发霉，影响了木材表观和实用价值，变色对木材物理力学性能的影响与引起变色的真菌及木材种类有关，木材变色3个月以后，由Ophiostoma属的一些种引起针叶材的重量损失为14％，阔叶材重量损失可高达25％。虽然边材变色不严重改变木材的强度，但也有影响，严重变色松木韧性降低30％，比重损失1-2％，表面硬度下降2-10％，弯曲强度和抗压强度下降1-5％。
[0003] 由真菌引起木材变色是一种生物变色，严重影响木材材色。自Hartig(1878)首次报道木材变色是由具有深色菌丝的真菌引起后，开启了木材变色菌研究的先河，随后各国的学者对变色菌进行了大量的研究。从20世纪20、30年代起在北温带地区着重研究由真菌引起的针叶材变色。Uzrnovie等人(1999)从加拿大香脂冷杉(Abies balsamea)等六种针叶树中分离到1863个变色菌株，并依据其形态和生理学特性及交配亲和性，将其鉴定为5属13种，其中长喙壳属(Ophiostoma)包含了9种。
[0004] 从上世纪90年代，人们开始研究用生物的手段来防治木材色变。大多是利用一些拮抗菌或优势菌，如细菌、木腐菌、菌根真菌、蓝变菌的白化菌株、放线菌等抑制变色菌的生长，试图达到防治木材蓝变的目的。用于防治蓝变的微生物可以从自然界中筛选或用变色菌进行杂交，或进行单孢分离得到一些基因突变的无色菌株，或改变变色菌的基因，使其突变得到不产生色素的无色菌株。长喙壳属(Ceratocystis&Ophiostoma)的一些种是重要的针叶材变色菌，所筛选出来的一些潜在生物防治真菌大多都是针对长喙壳属的不同种，如Phialemonium curuatum W. Gams and W.B.Cooke，Sporomiellasimiles Khan and Cain，柱孢葡萄穗霉(Stachybotrys cylindrospora)对3种长喙壳有较强的抑制作用。我国的研究者用从红脂大小蠹19个伴生真菌菌株分别对Grosmanniakoreanum和Leptographium smoprocerum进行了拮抗试验，筛选出了具生防潜力的生防菌株。长喙壳(Ophiostoma piliferum albino strain)是该菌的基因突变菌系，即菌丝缺少黑色素的无色菌系，已成功应用中松木防变色，该生防剂(Cartapip 97)已进行商业化生产。
[0005] 利 用长 喙 壳(Ophiostoma piliferum albino srain)不 产 生 色 素 的 菌株预防木材变色的研究很多，已经发现了一些效果好的生防菌株，如：Ophiostoma piliferum“Cartapip”。白化菌株是通过杂交及蓝变菌子囊孢子的单孢分离获得的，它不合成黑色素。研究证明，在室内条件下，Ophiostoma piliferum白化菌株可以替代化学药剂，用于暂时性的保护木材，它显示了高水平的群体竞争能力，可抑制由真菌生长引起的蓝变，同时在野外环境下也具有较好的防治功效。加拿大Forintek公司分离得到一株白化蓝变菌Cartapip97TM，已经获得专利，并在Alberta和British Columbia两地进行了野外试验，效果良好。
[0006] 另外还可以通过改变变色菌基因的方法，使其突变，得到无色菌株。Peter et al.(2003)采用根癌土壤杆菌(Agrobaterium tumefaciens)介导方法将自行设计的一段抗潮霉素基因导入长喙壳(Ceratocystis resinifera)得到无色菌株。并对突变菌株和正常菌株在培养基上的色素沉积进行比较，表明了突变菌株在培养基上呈白色，而正常菌株则呈黑色。
[0007] 除真菌外，细菌也是极佳的潜在防治木材变色的微生物之一。目前，从自然界中筛选出的、可用于防治木材蓝变的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)和假单胞菌(Pseudomonascepacia)和链霉菌(Streptomyces rimosus)等微生物，能够抑制各种主要木材蓝变菌的生长，但作用机理还不清楚。目前，木材变色的生物防治研究还只处于试验阶段。
发明内容
[0009] 发明目的：为了克服现有技术的不足，本发明的第一目的在于提供一种对杨木变色真菌具有拮抗作用的枯草芽孢杆菌。
[0010] 本发明的第二目的在于提供一种枯草芽孢杆菌在防治杨木变色病中的应用。
[0011] 技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，其保藏编号为：CGMCCNo.4277，保藏日期为2010年10月27日。
[0012] 所述的枯草芽孢杆菌在防治杨木变色病中的应用。
[0015] 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37的生理活性特征如下：
[0016] 所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37在牛肉膏蛋白胨培养基平板上菌落较大，乳白色，直径一般3-5mm，表面隆起，干燥，有皱褶，边缘较规则，菌体杆状，两端钝圆，具鞭毛，大小为2.41-1.83×1.02-0.56μm，平均2.1×0.74μm；芽孢中生，椭圆形，大小为1.08-0.62×0.66-0.44μm，平均0.86×0.51μm，周生鞭毛。
[0018] 枯草芽孢杆菌的16SrDNA序列如SEQ ID No.1所示。将所测16SrDNA序列通过BLAST比对，鉴定其为枯草芽孢杆菌。
[0019] 有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：
[0020] (1)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37对杨树多种变色真菌具有抑制作用，在拮抗细菌对植物病害生物防治中起到非常重要的作用，例如种类和数量众多；对病原菌的作用方式多样化；繁殖速度快；能够人工培养，易于操作，便于生产应用；抗逆能力强等优点，尤其是对真菌引起的杨木变色病的防治具有重要意义；
[0022] 图1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37形态图；
[0023] 图2a为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37对长喙壳(Ceratocystis adiposa(Butl.)C.Moreau，Hz91)的抑制作用；
[0024] 图2b为.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37对镰刀菌(Fusarium sp.，YM05)的抑制作用；
[0025] 图2c、图2d为 枯草芽 孢杆 菌(Bacillus subtilis)B37对可可 球二 孢[Lasiodiplodiatheobromae(Pat.)Griffon&Maubl.，YM0737，Fx46]的抑制作用；
[0026] 图3a为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37对Hz91的作用；
[0027] 图3b为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37对Fx46的作用；
[0028] 图3c为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37对Ym05的作用；
[0029] 图3d为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37对Ym0737的作用；
具体实施方式
[0030] 下面结合实验例详细阐述本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37的应用。
[0031] 实验例1：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37对杨木变色真菌长喙壳 [Ceratocystisadiposa(Butl.)C.Moreau，Hz91]、可 可 球 二 孢 [Lasiodiplodia theobromae(Pat.)Griffon&Maubl.，YM0737，Fx46]、镰刀菌(Fusarium sp.，YM05))平板抑菌作用。
[0032] 将用LB斜面活化的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37菌株划线接种于PDA平板一侧，再将杨树变色真菌PDA平板培养物用直径5mm的打孔器打取同质同量的菌块，点接于平板另一侧。28℃培养2天观察抑菌带的有无，并记录其宽度(如表1)，实验效果如图2a至图2d所示。试验结果表明，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37对四种病原菌均有拮抗作用。
[0033] 表1B37对4种杨树变色真菌的抑制
[0034]
[0035] 实验例2：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37代谢产物对杨木变色真 菌 [Ceratocystisadiposa(Butl.)C.Moreau，Hz91]、可 可 球 二 孢 [Lasiodiplodia theobromae(Pat.)Griffon&Maubl.，YM0737，Fx46]、镰刀菌(Fusarium sp.，YM05)平板抑菌作用。
[0036] 培养3天的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37的发酵液用细菌滤器过滤(滤膜孔径为0.25μm)；将杨树变色真菌PDA平板培养物用直径5mm的打孔器打取同质同量的菌块，点接于PDA平板一侧；再将PDA平板另一侧用直径5mm的打孔器打取同质同量的菌块，并将菌块取出点；将过滤后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37无菌滤液接于PDA平板另一侧空洞中100μl，28℃培养48小时，观察。以不接生防为对照，待对照菌丝长满平板后，观察拮抗活性(见表2)。试验结果表明，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37代谢产物对四种病原菌均有强拮抗作用。
[0037] 表2B37的代谢产物对4种杨树变色真菌的抑制
[0038]
[0039] 实验例3：验证枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37对杨木片上的变色真菌是否有抑制作用的试验。
[0041] 2、实验原理：
[0042] 将木片浸泡在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37的培养液中，取出，沥干，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37可以利用粘在木片上的培养基继续生长，产生代谢产物，从而抑制杨木变色真菌的生长。
[0043] 3、实验方法：
[0044] 1)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37菌液的培养：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37接种到含有50mlLB培养基的三角瓶中，120转，35℃培养60小时。
[0045] 2)带菌木片的制备：将已灭菌的5×2cm大小的木片放入培养好的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37菌液中浸泡，在35℃下保持12小时。
[0046] 3)对照木片的制备：将已灭菌的5×2cm大小的木片放入无菌水中浸泡，在35℃下保持12小时。
[0047] 4)拮抗实验：将步骤2)与步骤3)中浸泡好的木片沥水，分别放入含有灭菌蛭石的培养皿中的滤纸上(如图3a至图3d所示，每个图中的左木片是经处理过的，右木片为对照)，在35℃培养72小时，观察结果。
[0048] 4、实验结果
[0049] 1)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37对Hz91的作用：如图3a所示；
[0050] 2)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37对Fx46的作用：如图3b所示；
[0051] 3)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37对Ym0737的作用：如图3c所示；
[0052] 4)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37对Ym05的作用：如图3d所示；
[0053] 从上面的图片可以看出，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37对杨木片上生长的Fx46、Ym0737、Ym05三种菌有很好的抑制作用，对Hz91的抑制作用一般。
[0054] 下面是本发明的具体实施例：
[0055] 实施例1：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37菌剂的制备方法：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37接种于发酵培养基中，pH6.5，250ml三角瓶中装液量为150ml，28℃-37℃，摇床转速120转/分，48小时，得到的发酵液即为防治杨树变色真菌的菌剂。
[0056] 其中发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏2g，蛋白胨5g，氯化钠5g，pH6.5。
[0057] 实施例2：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37菌剂的制备方法：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37接种于发酵培养基中，pH7.5，250ml三角瓶中装液量为150ml，28℃-37℃，摇床转速160转/分，72小时，得到的发酵液即为防治杨树变色真菌的菌剂。
[0058] 其中发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，pH7.5。
[0059] 实施例3：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37菌剂的制备方法：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B37接种于发酵培养基中，pH 7，250ml三角瓶中装液量为150ml，28℃-37℃，摇床转速150转/分，55小时，得到的发酵液即为防治杨树变色真菌的菌剂。
[0060] 其中发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏3g，蛋白胨8g，氯化钠5g，pH 7。
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