一种防治水稻稻瘟病的特基拉芽孢杆菌S12及其应用
阅读：418发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种防治水稻稻瘟病的特基拉芽孢杆菌S12及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种防治 水 稻稻瘟病的特基拉芽孢杆菌S12及其应用，具体公开了一种特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)菌株S12，以及S12菌株在防治水稻稻瘟病中的应用，该菌株已保藏于中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18347。本发明所述特基拉芽孢杆菌S12菌株及其代谢产物对稻瘟病菌有强烈的拮抗作用，可显著抑制稻瘟病菌的致病 力 ，进而有效防治水稻稻瘟病的发生，因此本发明所得特基拉芽孢杆菌S12菌株及其代谢产物可用于水稻稻瘟病的 生物防治 。此外，本发明所述生防菌剂对人、畜安全，不存在环境污染等问题，并且其制备方法简单、成本低，使用简单。，下面是一种防治水稻稻瘟病的特基拉芽孢杆菌S12及其应用专利的具体信息内容。
1.一种特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)菌株，已于2019年7月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18347，该菌株命名为S12。
2.权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌菌株在防治水稻稻瘟病中的应用。
3.权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌菌株在制备防治水稻稻瘟病药物中的应用。
4.一种利用权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌菌株生产的生防菌剂。
5.根据权利要求4所述的生防菌剂，其特征在于，所述剂型为液体制剂。
6.一种制备权利要求5所述的生防菌剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将特基拉芽孢杆菌S12菌株在PDA平板培养基上活化，挑取单菌落在PDA斜面培养基上培养，得到培养后菌株；
(2)将所述培养后菌株接种至PDB培养液中培养，获得特基拉芽孢杆菌S12菌株的种子菌液；
(3)将所述特基拉芽孢杆菌S12菌株的种子菌液在PDB培养液中进行扩大发酵培养，得到所述生防菌剂。
7.根据权利要求6所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述PDA培养液的pH值为7.0～7.2，所述PDA培养液的组份包括：20％马铃薯煮熟过滤液、2％葡萄糖、2％琼脂、76％纯净水；所述活化温度为28-34℃，所述活化时间为20-24h；所述培养的时间为
12-18h，所述培养温度为25-35℃；
步骤(2)和(3)中，所述PDB培养液的pH值为7.0～7.2，所述PDB培养液的组份包括：20％马铃薯煮熟过滤液、2％葡萄糖、78％纯净水；
所述马铃薯煮熟过滤液的制备方法为：将马铃薯切块，加入4-5倍质量的水煮制20-
30min，过滤得到所述马铃薯煮熟过滤液。
8.根据权利要求6所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述培养为摇床震荡培养，所述摇床震荡速率为180～200rpm，所述培养温度为28～30℃，所述培养时间为20-28h；
步骤(3)中，所述特基拉芽孢杆菌S12菌株的种子菌液与所述PDB培养液的体积比为1:
(90-110)；所述培养为摇床震荡培养，所述摇床震荡速率为180～200rpm，所述培养温度为
28～30℃，所述培养时间为40～56h。
9.根据权利要求6所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于，所述生防菌剂的有效成分为特基拉芽孢杆菌S12菌体和/或其代谢产物，所述生防菌剂中特基拉芽孢杆菌S12的活菌的浓度为0.5～1×109CFU/mL。
10.权利要求4或5所述的生防菌剂在防治水稻稻瘟病中的应用。
一种防治水稻稻瘟病的特基拉芽孢杆菌S12及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 水稻是世界上年产量超过五千万吨的三种禾谷类作物之一，它是世界上(尤其是亚洲)30多亿人每天基本食物的主要来源。稻瘟病(rice blast disease)是最严重的水稻病害之一，世界各水稻产区均有发生，每年可造成水稻减产10～30％。水稻各组织部位皆可发病，如叶部发病形成叶瘟，是最为常见的病症，严重时可导致叶片死亡；除叶片外，茎上也可以发病，形成节瘟，该部位患病后植株易倒伏和枯萎；在抽穗期发病则易形成穗茎瘟，发病率高时能严重影响灌浆，造成水稻品质及产量下降，另外，稻穗上还可发生谷粒瘟。
[0003] 稻瘟病的发生对温湿度要求比较严格，尤其是后者。一般而言，水稻种植区多雨的季节，日平均气温在24～32℃之间，稻田深水灌溉且通风透气性较差，再加上田间荫蔽，相对湿度经常超过90％，这样的温湿度特别适宜稻瘟病发生和流行。水稻各生长发育阶段皆可感病，相比较而言有两个易感期，一是苗期，因为组织幼嫩，抗病性弱，易于侵染，形成叶瘟或茎瘟；二是抽穗期，此发育阶段常多雨，抽穗部位多有水珠聚集，分生孢子易于吸附，多诱发穗茎瘟。
[0004] 稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae或Pyricularia oryzae)是稻瘟病的病原菌，它是一种丝状真菌，有性世代属于子囊菌。稻瘟病菌分生孢子从分生孢子梗末端分化形成，成熟后多由三个细胞构成，呈梨形(pyriform)，经风吹或雨水冲刷落到水稻组织表面后，被诱导形成一种特化的侵染细胞－附着胞(appressorium)，该细胞通过在细胞壁内侧沉淀一层厚厚的黑色素，并在胞内合成大量甘油，产生巨大的膨压，并籍此侵入水稻组织，在其中生长扩展，导致病斑的发生。侵染菌丝可以从病斑部位向空气中伸展形成分生孢子梗，并[0005] 在末端分化出分生孢子，进行再一轮侵染。除侵染水稻外，该丝状真菌还可以侵染其它植物如：大麦、小麦以及禾本科的一些杂草。
[0006] 与治理其它病害类似，稻瘟病菌同样遵循“预防为主，综合治理”的原则。如选育抗病品种，迄今为止，已经有多个水稻抗稻瘟病基因得到克隆；目前，化学防治仍旧是治理稻瘟病的常规防治方法，常用的化学农药有三环唑、氰菌胺等，主要是通过抑制黑色素的生物合成途径来抑制稻瘟病的发生。由于化学防治可能会造成农药残留，存在危及人类健康及生态环境的风险，近年来，以生物防治为主的绿色防控技术获得广泛认可，亟需大力发展。
[0007] 主要的微生物源农药有细菌类、放线菌类和真菌类。张海霞等从采自全国各地的48份土样中分离到403株放线菌，30株对稻瘟病有抑制作用，其中鲜黄链霉素WM2-4对稻瘟病的抑制效果最好，抑菌率达到89.35％。王巧兰等的研究也表明，几种木霉属的真菌对稻瘟病菌有很好的抗生效果。近年来，有科研工作者开始研究真菌病毒在防控稻瘟病中的应用并取得了初步结果。用于稻瘟病防治的微生物源农药以细菌类为主，其中芽孢杆菌居多。
游春平等筛选到枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌，可显著抑制稻瘟病菌的分生抱子萌发及附着胞形成。彭化贤等从水稻根部分离获得对稻瘟病菌防治效果较好的蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。另外，科研工作者发现一种短杆类芽孢杆菌的发酵液对叶瘟的田间防效达到
57％～64％，具有较好的商业应用潜力。
游春平等筛选到枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌，可显著抑制稻瘟病菌的分生抱子萌发及附着胞形成。彭化贤等从水稻根部分离获得对稻瘟病菌防治效果较好的蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。另外，科研工作者发现一种短杆类芽孢杆菌的发酵液对叶瘟的田间防效达到
57％～64％，具有较好的商业应用潜力。
[0008] 采用生物农药防治稻瘟病的研究与应用是水稻生产可持续发展的需要，可以满足人们对水稻这种主要粮食作物安全生产的要求。尽管植物保护工作者目前已分离到多株可显著抑制稻瘟病菌生长及发育的生防菌株，但距离大田有效防控稻瘟病仍有较大差距，本领域中还缺少对水稻稻瘟病具有高效防控能力且易于在稻田中定殖的生防菌株，寻找新的高效生防菌株将有助于水稻稻瘟病的绿色防控。
发明内容
[0009] 为了解决目前生产上存在的上述问题，本发明提供了一种防治水稻稻瘟病的特基拉芽孢杆菌S12及其应用，所述特基拉芽孢杆菌S12对稻瘟病菌有强烈的拮抗作用，可显著抑制稻瘟病菌的致病力，进而有效防治水稻稻瘟病的发生。
[0010] 生物样品保藏信息：
[0011] 特基拉芽孢杆菌S12，分类名为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)，于2019年7月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC No.18347。
[0012] 本发明所采用的技术方案为：
[0013] 一种特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)菌株，已于2019年7月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18347，该菌株命名为S12；建议的分类命名为：特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis；拉丁学名为：Bacillus tequilensisS12。
[0014] 所述特基拉芽孢杆菌菌株S12在防治水稻稻瘟病中的应用。
[0015] 所述特基拉芽孢杆菌菌株S12在制备防治水稻稻瘟病药物中的应用。
[0016] 利用所述特基拉芽孢杆菌菌株S12生产的生防菌剂。
[0017] 进一步地，所述生防菌剂的剂型为液体制剂。
[0018] 所述生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：
[0019] (1)将特基拉芽孢杆菌S12菌株在PDA平板培养基上活化，挑取单菌落在PDA斜面培养基上培养，得到培养后菌株；
[0021] (3)将所述特基拉芽孢杆菌S12菌株的种子菌液在PDB培养液中进行扩大发酵培养，得到所述生防菌剂。
[0022] 进一步地，步骤(1)中，所述PDA培养液的pH值为7.0～7.2，所述PDA培养液的组份包括：20％马铃薯煮熟过滤液、2％葡萄糖、2％琼脂、76％纯净水；所述活化温度为28-34℃，所述活化时间为20-24h；所述培养的时间为12-18h，所述培养温度为25-35℃。
[0023] 进一步地，步骤(2)和(3)中，所述PDB培养液的pH值为7.0～7.2，所述PDB培养液的组份包括：20％马铃薯煮熟过滤液、2％葡萄糖、78％纯净水。
[0025] 进一步地，步骤(2)中，所述培养为摇床震荡培养，所述摇床震荡速率为180～200rpm，所述培养温度为28～30℃，所述培养时间为20-28h。
[0026] 进一步地，步骤(3)中，所述特基拉芽孢杆菌S12菌株的种子菌液与所述PDB培养液的体积比为1:(90-110)；所述培养为摇床震荡培养，所述摇床震荡速率为180～200rpm，所述培养温度为28～30℃，所述培养时间为40～56h。
[0027] 进一步地，所述生防菌剂的有效成分为特基拉芽孢杆菌S12菌体和/或其代谢产物。
[0028] 进一步地，所述生防菌剂中特基拉芽孢杆菌S12的活菌的浓度为0.5～1×109CFU/mL。
[0029] 利用所述特基拉芽孢杆菌菌株S12生产的所述生防菌剂在防治水稻稻瘟病中的应用。
[0030] 本发明的有益效果为：
[0031] (1)本发明所述特基拉芽孢杆菌S12分离自吉林省某水稻田土壤，能在水稻田中定殖，对水稻生长无不良影响。固体培养基对峙培养表明，S12菌株对稻瘟病菌有强烈的拮抗作用，抑菌圈直径可达到46mm；离体接种实验显示，S12菌株可显著抑制稻瘟病菌的致病力；温室接种及大田试验均表明，S12可有效防治水稻稻瘟病，对叶瘟和穗颈瘟均有优异的防治作用，因此本发明所述特基拉芽孢杆菌S12菌株可用于水稻稻瘟病的生物防治。
[0032] (2)本发明得到的特基拉芽孢杆菌，培养条件容易获得，商业化潜力巨大，具有很好的开发应用前景。
[0033] (3)本发明涉及的特基拉芽孢杆菌S12菌株，是专门针对水稻稻瘟病开发的生防制剂。由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于水稻的无公害生产，农民可以在保证稻米产量和品质的前提下，减少或不用其他化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于生产绿色产品，提高效益。另外由于S12菌株分离自水稻田，可预见其能与水稻长期共存，互惠共生，将其喷施到水稻植株上用于病害防治，不改变稻米营养品质，对稻米的食用及其加工产品来说安全可靠。
[0035] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0036] 图1是特基拉芽孢杆菌S12在LB培养基平板上的菌落形态图；
[0037] 图2是特基拉芽孢杆菌S12的16s rDNA的ITS序列扩增电泳图谱；
[0038] 图3是特基拉芽孢杆菌S12与稻瘟病菌的对峙培养图片；
[0039] 图4是特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂抑制稻瘟病菌分生孢子萌发的显微镜图；
[0040] 图5是特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂在不同时间点对稻瘟病菌致病力的抑制效果图；
[0041] 图6，特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂对稻瘟病防治效果的温室测试图片。
具体实施方式
[0042] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
[0043] 实施例1
[0044] 本实施例提供一种马铃薯煮熟过滤液的制备方法：取马铃薯200g，洗净、去皮、切块，加入800g水煮制20min，过滤后得到所述马铃薯煮熟过滤液；
[0045] 还提供了一种pH值为7.0的PDA培养液：组份包含有20％马铃薯煮熟过滤液、2％葡萄糖、2％琼脂和78％纯净水；
[0046] 还提供了一种pH值为7.0的PDB培养液：组份包含有20％马铃薯煮熟过滤液、2％葡萄糖和78％纯净水。
[0047] 本实施例还提供一种有效防治水稻稻瘟病的生防菌剂的制备方法，具体步骤包括：
[0048] (1)将特基拉芽孢杆菌S12菌株在PDA平板培养基上于28℃下活化24h，挑取单菌落在PDA斜面培养基上于25℃下培养18h，得到培养后菌株；
[0049] (2)将所述培养后菌株接种至PDB培养液中在28℃下，并且以速率为180rpm进行摇床震荡培养20h，获得特基拉芽孢杆菌S12菌株的种子菌液；
[0050] (3)将所述特基拉芽孢杆菌S12菌株的种子菌液以体积比为1:90接种于PDB培养液中，28℃下以速率为180rpm进行摇床震荡扩大发酵培养，培养40h后得到所述生防菌剂。
[0051] 实施例2
[0052] 本实施例提供一种马铃薯煮熟过滤液的制备方法：取马铃薯200g，洗净、去皮、切块，加入1000g水煮制30min，过滤后得到所述马铃薯煮熟过滤液；
[0053] 还提供了一种pH值为7.2的PDA培养液：组份包含有20％马铃薯煮熟过滤液、2％葡萄糖、2％琼脂和78％纯净水；
[0054] 还提供了一种pH值为7.2的PDB培养液：组份包含有20％马铃薯煮熟过滤液、2％葡萄糖和78％纯净水。
[0055] 本实施例还提供一种有效防治水稻稻瘟病的生防菌剂的制备方法，具体步骤包括：
[0056] (1)将特基拉芽孢杆菌S12菌株在PDA平板培养基上于34℃下活化20h，挑取单菌落在PDA斜面培养基上于35℃下培养12h，得到培养后菌株；
[0057] (2)将所述培养后菌株接种至PDB培养液中在30℃下，并且以速率为200rpm进行摇床震荡培养28h，获得特基拉芽孢杆菌S12菌株的种子菌液；
[0058] (3)将所述特基拉芽孢杆菌S12菌株的种子菌液以体积比为1:110接种于PDB培养液中，30℃下以速率为200rpm进行摇床震荡扩大发酵培养，培养56h后得到所述生防菌剂。
[0059] 实施例3
[0060] 本实施例提供一种马铃薯煮熟过滤液的制备方法：取马铃薯200g，洗净、去皮、切块，加入900g水煮制25min，过滤后得到所述马铃薯煮熟过滤液；
[0061] 还提供了一种pH值为7.1的PDA培养液：组份包含有20％马铃薯煮熟过滤液、2％葡萄糖、2％琼脂和78％纯净水；
[0062] 还提供了一种pH值为7.1的PDB培养液：组份包含有20％马铃薯煮熟过滤液、2％葡萄糖和78％纯净水。
[0063] 本实施例还提供一种有效防治水稻稻瘟病的生防菌剂的制备方法，具体步骤包括：
[0064] (1)将特基拉芽孢杆菌S12菌株在PDA平板培养基上于31℃下活化22h，挑取单菌落在PDA斜面培养基上于30℃下培养15h，得到培养后菌株；
[0065] (2)将所述培养后菌株接种至PDB培养液中在29℃下，并且以速率为190rpm进行摇床震荡培养24h，获得特基拉芽孢杆菌S12菌株的种子菌液；
[0066] (3)将所述特基拉芽孢杆菌S12菌株的种子菌液以体积比为1:100接种于PDB培养液中，29℃下以速率为190rpm进行摇床震荡扩大发酵培养，培养48h后得到所述生防菌剂。
[0067] 实验例
[0068] 一、特基拉芽孢杆菌S12菌株的筛选与鉴定
[0069] (1)样品采集：采集样品为初冬休眠季节水稻大田土壤，地点为吉林省松原市；取表层5～20cm的冻土块，用聚乙烯塑料袋装好，带回实验室分离。
[0070] (2)菌株分离：用100mL的三角瓶装50mL灭菌水，称取5g土样(去除残枝碎叶)，在摇床上震荡30min，取出静置10min，吸取上清液，用无菌水进行梯度稀释，稀释的浓度有10-3、10-4、10-5及10-6，分别吸取100μL至LB培养基(每升含：胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠5g、琼脂粉15g)，涂布均匀，每个浓度设三个重复。28℃培养24～48h，根据形态和颜色等不同，挑取单菌落，在LB培养基上划线纯化，将纯化好的菌株放置到斜面培养基上备用。S12菌株是通过上述方法所获得细菌中的一株。发明人已将本菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年7月29日,保藏编号为CGMCC No.18347。
[0071] (3)生防菌株S12的菌落特征：在LB固体平板上划线，28℃培养48h，显微镜下可观察到S12菌株的菌落粗糙，不规则圆形，菌落外缘呈现放射状波纹，白色，不透明，无润泽度(如图1所示)，S12菌株为革兰氏阳性菌，菌体杆状，芽孢椭圆到柱状，无荚膜，可运动。
[0072] (4)生防菌株S12的分子鉴定：提取S12菌株的基因组DNA，采用细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)与1429R(5’-GCTACCTTGTTACGACTT-3’)扩增S12菌株的16SrDNA片段。反应体系为：10mmol/LdNTP Mixture，0.5μL；10×PCRbuffer，2.5μL；上下游引物各1μL(10μmol/mL)；模板DNA，1μL；Ex-Taq，0.2μL(5U)；ddH2O，18.8μL；扩增程序为：94℃预变性3min；然后94℃，变性30s，56℃，退火30s，72℃，延伸60s，循环30次；72℃延伸
6min。扩增片段通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分离(如图2所示，M(DNA Marker)为DL2000)。纯化后委托生工生物工程(上海)股份有限公司测序，对于所测序列在NCBI网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列比对，获得鉴定信息。通过16S rDNA基因片段序列分析，将S12菌株鉴定为Bacillus tequilensis，即特基拉芽孢杆菌(如表1所示)，两者是一种细菌。
6min。扩增片段通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分离(如图2所示，M(DNA Marker)为DL2000)。纯化后委托生工生物工程(上海)股份有限公司测序，对于所测序列在NCBI网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列比对，获得鉴定信息。通过16S rDNA基因片段序列分析，将S12菌株鉴定为Bacillus tequilensis，即特基拉芽孢杆菌(如表1所示)，两者是一种细菌。
[0073] 表1.生防菌株S12的16S rDNA序列比对结果
[0074]
[0075] 二、特基拉芽孢杆菌S12对稻瘟病菌的抑制活性测定
[0076] 采用平板对峙培养进行该项测试，固体平板为PDA培养基(每升含：200g马铃薯煮熟过滤液、20g葡萄糖、15g琼脂粉，pH值为7.0～7.2)。在PDA培养基一侧接种稻瘟病菌JJ88，在相对的另一侧通过划线方式接入制备好的特基拉芽孢杆菌S12菌株，置于28℃进行对峙培养，测定S12菌株对稻瘟病菌生长的抑制能力，以无菌水作为对照(CK)。每种处理设三次重复，7天后观察并测量稻瘟病菌生长情况。对峙培养结果显示，稻瘟病菌朝向S12菌株接种的一边菌落扩展非常缓慢，后期则完全被抑制住，无法继续扩展，即使延长观察时间至14天，菌落也不再扩展，而对照的菌落扩展良好(如图3所示)。经测量，对稻瘟病菌的抑菌圈直径可达到46±2.4mm。该项测试表明，特基拉芽孢杆菌S12菌株可极显著抑制稻瘟病菌菌丝的生长。
[0077] 三、特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂的制备及其抑菌活性检测
[0078] (1)特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂的制备
[0079] S12种子菌液的培养：上述对峙培养测试已表明，在PDA上培养的S12菌株，可产生抑制稻瘟病菌生长的化合物。因此，本发明进一步采用配方类似的PDB液体培养基(每升含：200g马铃薯煮熟过滤液、20g葡萄糖，pH为7.0～7.2)，对S12生防菌株进行发酵培养。挑取划线培养的S12新鲜菌落，接种至PDB培养液中，在28～30℃，摇床震荡速率为180～200rpm条件下培养24h左右。16h后在超净工作台中每隔3h取样测量600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零，直到种子菌液OD值达到0.5～0.8时结束培养，获得S12的种子菌液。
[0080] S12生防菌剂的制备：将S12种子菌液以1:100体积比在PDB中进行扩大发酵培养。在28～30℃，摇床震荡速率为180～200rpm条件下培养48h，获得生防菌剂，活菌浓度为0.5～1×109CFU/mL。
[0081] (2)特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂的抑菌活性测定
[0082] 采用牛津杯法，对S12生防菌剂的抑菌活性进行测试。具体地，依照上述方法获得S12发酵生防菌剂，用0.22μm滤膜过滤获得无菌发酵液，备用。在PDA培养基四周接种稻瘟病菌JJ88，在中央已事先插入的无菌牛津杯中接入100μl特基拉芽孢杆菌S12菌株无菌发酵液，置28℃进行对峙培养，测定S12发酵液对稻瘟病菌生长的抑制能力。以PDB作为对照，以含有S12细胞的发酵液作为平行处理。每处理设三次重复，7天后观察并测量稻瘟病菌生长情况。
[0083] 表2.特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂对稻瘟病菌生长的抑制活性测定
[0084] S12生防菌剂 S12生防菌剂过滤液 对照抑菌圈直径(mm) 47±3.1a 39±1.9ab 0c
[0085] 注：数值＝均值±标准误，不同小写字母表示差异显著性(p<0.05)；a、ab、c均为“心法”标注方法中的标准误差表示。
[0086] 如表2所示，对峙培养结果显示，稻瘟病菌朝向S12发酵液一边的菌落扩展受到极显著抑制，经测量，抑菌圈直径可达到39±1.9mm。含有S12细胞的发酵液抑菌效果与“二、特基拉芽孢杆菌S12对稻瘟病菌的抑制活性测定”一致，抑菌圈直径可达到47±3.1mm。统计分析(t检验)表明，s12生防菌剂及其过滤液，与对照相比，抑菌效果均极其显著(ab与c)，另外，含有s12细胞的菌剂比其无菌过滤液抑菌活性高，差异显著(a与b)，即特基拉芽孢杆菌S12菌株的PDB发酵生防菌剂中，不仅活菌细胞具有抑制稻瘟病菌效果，去除活菌细胞的发酵液也可极显著抑制稻瘟病菌菌丝的生长。
[0087] 四、特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂对稻瘟病菌分生孢子萌发的抑制活性测定[0088] 稻瘟病菌通过分生孢子进行传播为害，后者附着到水稻表面后，萌发并发育出附着胞，侵入水稻，导致病害发生。抑制分生孢子的萌发可从一开始即阻断侵染进程。
[0089] 本部分测定了S12生防菌剂对稻瘟病菌分生孢子萌发的抑制活性。取10μl稻瘟病菌JJ88分生孢子液(浓度为5×104CFU/mL)滴加至载玻片上，加入2μl特基拉芽孢杆菌S12菌9
株的PDB发酵生防菌剂(0.5～1×10 CFU/mL)，以加入2μl PDB作为对照(CK)，置28℃保湿培养12h，然后分析S12对稻瘟病菌分生孢子萌发的抑制情况。显微镜观察发现，S12生防菌剂可极显著抑制稻瘟病菌分生孢子的萌发，其中81％的分生孢子无法萌发，并出现形态不完整现象，偶尔萌发的少量孢子长出的芽管短且多弯曲，失去了继续生长的能力，而对照的稻瘟病菌分生孢子萌发良好(如图4所示)。该测试表明，特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂对稻瘟病菌分生孢子具有破坏作用，可极显著抑制其萌发及芽管伸长。
株的PDB发酵生防菌剂(0.5～1×10 CFU/mL)，以加入2μl PDB作为对照(CK)，置28℃保湿培养12h，然后分析S12对稻瘟病菌分生孢子萌发的抑制情况。显微镜观察发现，S12生防菌剂可极显著抑制稻瘟病菌分生孢子的萌发，其中81％的分生孢子无法萌发，并出现形态不完整现象，偶尔萌发的少量孢子长出的芽管短且多弯曲，失去了继续生长的能力，而对照的稻瘟病菌分生孢子萌发良好(如图4所示)。该测试表明，特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂对稻瘟病菌分生孢子具有破坏作用，可极显著抑制其萌发及芽管伸长。
[0090] 五、特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂对稻瘟病菌致病力的抑制活性测定
[0091] 以极易感病的大麦品种“千金一诺”为寄主，通过离体叶片接种实验，测定了特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂对稻瘟病菌致病力的抑制活性。本实验围绕稻瘟病菌接种时间点前后，设置多个处理，分别在不同时间点施加S12生防菌剂，用以分别测试S12对稻瘟病的预防与治疗作用。每接种点滴加8μl稻瘟病菌JJ88孢子液(浓度为1×105CFU/mL)，在不同时间点各施加2μl特基拉芽孢杆菌S12菌株的PDB发酵生防菌剂(0.5～1×109CFU/mL)，以加入2μl PDB作为对照(CK)，置25～28℃保湿培养7天，然后分析S12对稻瘟病菌致病力的抑制情况。实验结果显示，无论是在接种稻瘟病菌之前12h施加S12生防菌剂、同时施加、还是在接种稻瘟病菌后4～48h再施加S12生防菌剂，均可显著抑制稻瘟病的发生，接种部位只能形成针尖大小的病斑，无法扩展，而对照处理发病均正常(如图5所示)。
[0092] 表3.特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂对稻瘟病菌致病力的抑制活性测定
[0093] 施加S12时间点 12HBI 0 4HPI 12HPI 24HPI 48HPI稻瘟病菌致病力％ 4±2.1 1.6±0.8 5.1±2.5 8.3±2.9 8.9±3.1 12.5±3.7
防效％ 96±3.1 98.4±1.4 94.9±3.9 91.7±4.1 91.1±3.5 87.5±3.9
防效％ 96±3.1 98.4±1.4 94.9±3.9 91.7±4.1 91.1±3.5 87.5±3.9
[0094] 注：数值＝均值±标准误差；以接种部位病斑面积反映稻瘟病菌的致病力，与同一时间点对照处理的致病力比较计算相对值；HBI表示在接种稻瘟病菌之前接种生防菌剂的小时数；HPI表示在接种稻瘟病菌之后接种生防菌剂的小时数；0表示稻瘟病菌与生防菌剂同时接种。
[0095] 如表3所示，该测试表明，提前施用特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂，可有效预防稻瘟病菌的致病活性，防效超过90％，即使在稻瘟病菌侵染寄主48h再施用S12生防菌剂，仍可有效控制稻瘟病菌的进一步侵染为害，防效达到87.5％。因此，特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂对稻瘟病兼具预防与治疗作用。
[0096] 六、特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂对稻瘟病防治效果的温室测试
[0097] 本发明采用温室接种实验，测试了特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂对稻瘟病的防控效果。在温室育苗盘内播种水稻栽培品种吉粳88，待其生长至三叶期(约18天)，喷施特基拉芽孢杆菌S12菌株的PDB发酵生防菌剂(1～2×108CFU/mL)，以PDB培养基作为对照(CK)；36h后喷雾接种稻瘟病菌JJ88孢子液(浓度为5×105CFU/mL)，保温保湿培育，7d后分析发病情况。
[0098] 叶瘟病情分级标准：
[0099] 0级，无病；
[0100] 1级，病斑小而少，病斑面积占叶面积1％以下；
[0101] 2级，病斑小而多，或大而少，病斑面积占叶片面积的1％～5％；
[0102] 3级，病斑大而较多，病斑面积占叶片面积5％～10％；
[0103] 4级，病斑大而多，病斑面积占叶片面积10％～50％；
[0104] 5级，病斑面积占叶片面积50％以上，全叶将枯死。
[0105] 计算公式：发病率％＝发病叶数/调查总叶数×100；病情指数＝∑(各级发病数×各级代表值)/(调查总叶数×最高级代表值)×100。
[0106] 表4.特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂对稻瘟病防治效果的温室测试
[0107]处理 发病率％ 病情指数 防效％
S12 9±2.1b 4.8±1.4b 87.9±3.5a
CK 100a 39.8±1.9a 0b
S12 9±2.1b 4.8±1.4b 87.9±3.5a
CK 100a 39.8±1.9a 0b
[0108] 注：数值＝均值±标准误，不同小写字母表示差异显著性(p<0.05)
[0109] 实验结果显示，提前喷施S12生防菌剂对水稻具有高效的保护作用，可极显著抑制稻瘟病的发生，病斑极少出现，发病率只有对照的9％，偶尔出现的病斑微小且难以扩展，S12生防菌剂防效可达到87.9％，而对照组发病率与病斑扩展均正常(如图6、表4所示)。该实验表明，特基拉芽孢杆菌生防菌株S12可有效防治水稻稻瘟病。
[0110] 七、特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂对稻瘟病防治效果的田间试验
[0111] 本发明最后采用田间稻田试验，测试了特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂对稻瘟病的防控效果。在吉林省永吉县一拉溪镇进行特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂的田间药效试验,栽培品种为长粒香，喷施S12菌株的PDB发酵生防菌剂(1～2×108CFU/mL)；对照药剂为三环唑·异稻瘟净可湿性粉剂(河北中保绿农作物科技有限公司生产)，施用量是100～150g/2
亩，兑水40～50kg。平均每个试验小区面积是50m ，不进行任何防治作为负对照。每处理设置3个重复。收获前3～4周分别调查特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂对叶瘟和穗瘟的防治效果。
亩，兑水40～50kg。平均每个试验小区面积是50m ，不进行任何防治作为负对照。每处理设置3个重复。收获前3～4周分别调查特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂对叶瘟和穗瘟的防治效果。
[0112] 叶瘟病情分级标准、发病率及病情指数计算方法见“六、特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂对稻瘟病防治效果的温室测试”。
[0113] 穗瘟病情分级标准：
[0114] 0级，无病；
[0115] 1级，个别枝梗发病；
[0116] 2级，1/3左右枝梗发病；
[0117] 3级，穗颈或主轴发病；
[0118] 4级，穗颈发病，大部分秕谷；
[0119] 5级，穗颈发病造成白穗。计算公式：发病率％＝发病穗数/调查总穗数×100；
[0120] 病情指数＝∑(各级发病数×各级代表值)/(调查总穗数×最高级代表值)×100。
[0121] 表5.特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂对稻瘟病防治效果的田间测试
[0122]
[0123] 说明：数值＝均值±标准误，不同小写字母表示差异显著性(p<0.05)
[0124] 如表5所示，田间试验结果显示，喷施特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂对水稻具有高效的保护作用，可极显著抑制稻瘟病的发生，对叶瘟和穗瘟均可有效防控，防效分别达到83.8％和82.8％，病斑均极少出现，偶尔出现的病斑小且不易扩展；S12生防菌剂的防治效果与对照药剂相比较，没有显著差异。该试验表明，特基拉芽孢杆菌S12生防菌剂可有效防治田间水稻稻瘟病的发生，可替代化学农药，用于水稻田稻瘟病的绿色、高效治理。
[0125] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
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