用于癌症治疗的改良同种异体树突状细胞
阅读：542发布：2020-05-11
专利汇可以提供用于癌症治疗的改良同种异体树突状细胞专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开一种促炎性树突状细胞，具有通过同种异体辨识的直接途径激活同种异体T细胞的能 力 。所述树突状细胞被一腺 病毒感染 。进一步，所述促炎性树突状细胞通过以下方法获得：提供一未成熟的树突状细胞；用一腺病毒感染所述树突状细胞；以及使所述未成熟的树突状细胞成熟为一促炎性树突状细胞，其中所述成熟是通过添加一TLR3-配体聚肌苷：聚胞苷、一TLR7/8-配体，例如瑞喹莫德和一干扰素γ诱导所述未成熟树突状细胞成熟而执行。，下面是用于癌症治疗的改良同种异体树突状细胞专利的具体信息内容。
1.一种促炎性树突状细胞，具有通过同种异体辨识的直接途径激活同种异体T细胞的能力，所述树突状细胞被一腺病毒感染，其特征在于：所述促炎性树突状细胞通过以下方法获得：
提供一未成熟的树突状细胞；
用一腺病毒感染所述树突状细胞；以及
使所述未成熟的树突状细胞成熟为一促炎性树突状细胞，其中所述成熟是通过添加一TLR3-配体聚肌苷：聚胞苷、一TLR7/8-配体和一干扰素γ诱导所述未成熟树突状细胞成熟而执行。
2.根据权利要求1所述的促炎性树突状细胞，其特征在于：所述腺病毒是一血清型5腺病毒，具有来自一血清型35腺病毒的纤维轴和/或端节，代替所述血清型5腺病毒的纤维轴和/或端节。
3.根据权利要求1或2所述的促炎性树突状细胞，其特征在于：所述腺病毒的六邻体蛋白被修饰为包含来自人类免疫缺陷病毒的转录反式激活子的至少一种蛋白转导结构域。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的促炎性树突状细胞，其特征在于：所述腺病毒是一E1缺失的腺病毒。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的促炎性树突状细胞，其特征在于：所述腺病毒不包括编码一肿瘤抗原的任何基因，从而所述促炎树突状细胞被感染但未被转导。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的促炎性树突状细胞，其特征在于：所述腺病毒确实包含编码一肿瘤相关或肿瘤特异性抗原的至少一基因，从而将所述被感染的树突状细胞转导以表达所述肿瘤相关或肿瘤特异性抗原；优选地，所述肿瘤抗原选自癌病毒抗原，例如人类乳头瘤病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、卡波西斯肉瘤病毒或默克尔细胞多瘤病毒，以及源自突变的新抗原所组成的一群组。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的促炎性树突状细胞，其特征在于：所述腺病毒的成熟和感染分别同时进行。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的促炎性树突状细胞，其特征在于：所述TLR7/8-配体是瑞喹莫德。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的促炎性树突状细胞，其特征在于：使所述未成熟的树突状细胞成熟为所述促炎性树突状细胞的所述步骤还包括添加至少一种物质以诱导激活，选自TLR2-配体、TLR4-配体、TLR9-配体、干扰素α、白介素1β和肿瘤坏死因子α所组成的一群组；以及/或者
使所述未成熟的树突状细胞成熟为所述促炎性树突状细胞的所述步骤不包括添加前列腺素E2。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的促炎性树突状细胞，其特征在于：通过使用白介素4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子将单核细胞分化为所述未成熟树突状细胞来提供所述未成熟树突状细胞，所述单核细胞已经从外周血白细胞中分离出来。
11.一种药物组合物，其特征在于：所述组合物包括根据权利要求1至10中任一项所述的促炎性树突状细胞和至少一种药学上可接受的载体。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的促炎性树突状细胞，或根据权利要求11所述的组合物，用于治疗或预防一对象的癌症的用途，其特征在于：所述促炎性树突状细胞对所述对象是同种异体的。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的促炎性树突状细胞，用于根据权利要求12的用途，其特征在于：所述促炎性树突状细胞在肿瘤内施用。
14.根据权利要求1至10中任一项所述的促炎性树突状细胞，用于根据权利要求12或13的用途，其特征在于：所述用途还包括给予降低免疫抑制性肿瘤环境或者激活免疫系统的药物；优选地，所述药物选自舒尼替尼、纳武利尤单抗、帕博利珠单抗、匹立单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、阿维鲁单抗和5-氟尿嘧啶；更优选地，所述药物选自舒尼替尼、纳武利尤单抗、帕博利珠单抗和匹立单抗；甚至更优选地，所述药物是舒尼替尼。
15.根据权利要求1至4和7至10中任一项的促炎性树突状细胞，用于根据权利要求12至
14中任一项所述的用途，其特征在于：所述腺病毒确实包含编码一肿瘤相关或肿瘤特异性抗原的至少一基因，从而将所述被感染的树突状细胞转导以表达所述肿瘤相关或肿瘤特异性抗原；优选地，所述肿瘤抗原选自癌病毒抗原，例如人乳头瘤病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、卡波西斯肉瘤病毒或默克尔细胞多瘤病毒，以及源自突变的新抗原所组成的一群组，并且其中所述促炎性树突状细胞是皮内、皮下或结节内施用的。
16.一种提供根据权利要求1至10中任一项所述的促炎性树突状细胞的方法，所述促炎性树突状细胞具有通过同种异体辨识的直接途径激活同种异体T细胞的能力，所述树突状细胞被一腺病毒感染，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
提供多个未成熟的树突状细胞；
用一腺病毒感染所述树突状细胞；以及
使所述未成熟的树突状细胞成熟为一促炎性树突状细胞，其中所述成熟是通过添加一TLR3-配体聚肌苷：聚胞苷、一TLR7/8-配体和一干扰素γ诱导所述未成熟树突状细胞成熟而执行。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于：所述腺病毒是一血清型5腺病毒，具有来自一血清型35腺病毒的纤维轴和/或端节，代替所述血清型5腺病毒的纤维轴和/或端节。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其特征在于：所述腺病毒的六邻体蛋白被修饰为包括来自人类免疫缺陷病毒的转录反式激活子的至少一种蛋白转导结构域。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其特征在于：所述腺病毒是一E1缺失的腺病毒。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其特征在于：所述腺病毒不包含编码一肿瘤抗原的任何基因，由此所述促炎树突状细胞被感染但未被转导。
21.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其特征在于：所述腺病毒确实包含编码一肿瘤相关或肿瘤特异性抗原的至少一基因，从而将所述被感染的树突状细胞转导以表达所述肿瘤相关或肿瘤特异性抗原；优选地，所述肿瘤抗原选自癌病毒抗原，例如人乳头瘤病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、卡波西斯肉瘤病毒或默克尔细胞多瘤病毒，以及源自突变的新抗原所组成的一群组。
22.根据权利要求16至21中任一项所述的方法，其特征在于：所述腺病毒的成熟和感染分别同时进行。
23.根据权利要求16至22中任一项所述的方法，其特征在于：所述TLR7/8-配体是瑞喹莫德。
24.根据权利要求16至23中任一项所述的方法，其特征在于：使所述未成熟的树突状细胞成熟为所述促炎性树突状细胞的所述步骤还包括添加至少一种物质以诱导激活，选自TLR2-配体、TLR4-配体、TLR9-配体、干扰素α、白介素1β和肿瘤坏死因子α所组成的一群组；
以及/或者
使所述未成熟的树突状细胞成熟为所述促炎性树突状细胞的所述步骤不包括添加前列腺素E2。
25.根据权利要求16至24中任一项所述的方法，其特征在于：通过使用白介素4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子将单核细胞分化为所述未成熟树突状细胞来提供所述未成熟树突状细胞，所述单核细胞已经从外周血白细胞中分离出来。
用于癌症治疗的改良同种异体树突状细胞
技术领域
[0001] 本发明涉及多个促炎症树突状细胞(pro-inflammatory dendritic cells,pro-inflammatory DCs)，具有通过同种异体辨识的直接途径激活同种异体T细胞的能力，以及这种促炎症树突状细胞在癌症治疗中的用途。
背景技术
[0002] 传统的癌症疗法，例如外科手术、放射疗法和化学疗法，通常不足以治疗癌症患者，并且通常会引起严重的副作用。免疫疗法已显示出作为副作用少的替代治疗方法的希望。
[0003] 最近由于引入了检查点封锁抗体(check point blockade antibodies)，尤其是阻断PD-1(程序性细胞死亡蛋白1，programmed cell death protein 1)和PD-1配体(PD-L1)相互作用的抗体，癌症免疫疗法取得了巨大进展。但是，只有一小部分癌症患者会从这种治疗中受益。此外，它仅对某些形式的癌症有效。由于所述领域仍有改进的空间，因此癌症免疫疗法发展才更加有效和稳靠。拒绝
[0004] 现已公认，免疫系统具有细胞，尤其是CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，可以辨识并可能杀死肿瘤细胞。然而主要的问题是在癌症患者中这些T细胞的杀伤能力未被诱导或是微弱地被诱导。一种可能性是，树突状细胞(dendritic cells，DC)不足以引起肿瘤患者的功能性和肿瘤特异性T细胞免疫，而肿瘤抗原呈递(presentation)和共刺激(co-stimulation)不足。因此，开发用于“开启”免疫系统，以使其识别并杀死肿瘤细胞的免疫疗法策略是令人感兴趣的。
[0005] 涉及CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CD8+cytotoxic T lymphocytes，CTL)激活的现有癌症免疫疗法策略主要集中于抗原加载的源自患者的自体树突状细胞，这些树突状细胞已被分化并进行了抗原加载。这种方法的基本前提是，通过离体操作树突状细胞来提供效率和控制，以产生具有强大的抗原呈递和共刺激能力的树突状细胞。T细胞反应的质量取决于这些自体树突状细胞在引流淋巴结中以MHC限制的方式将肿瘤抗原呈递给T细胞的能力(树突状细胞和T细胞必须来自同一个体，即自体)，因此产生肿瘤特异性T细胞反应。
[0006] 源自患者的体外修饰树突状细胞旨在通过针对肿瘤相关或肿瘤特异性的抗原的T细胞进行直接教育，从而诱导肿瘤特异性T细胞免疫。尽管在一些临床研究中已经观察到自体树突状细胞疫苗的原理证明，但临床反应仍不是最佳的(Anguille，S.，等人2014临床使用树突状细胞进行癌症治疗LancetOncol 15：e257-267)。此外临床结果的变化似乎与疫苗树突状细胞的激活状态相关，因此目前在所述领域的共识推动了生产免疫增强剂的优化和标准化过程，所述免疫增强剂能够诱导树突状细胞介导的T型辅助1型(DC-mediated T-helper type-1，Thl)的极化免疫反应。
[0007] 不过有趣的是最近的发现表明，经体外修饰的疫苗树突状细胞实际上需要内源性旁观者树突状细胞(bystander-DC)的帮助才能启动CD8+ T细胞特异性免疫(Yewdall，A.W.等人2010年)。通过树突状细胞疫苗所启动的CD8+ T细胞需要抗原转移至内源性抗原呈递细胞(PLoS One 5：el 1144；Liu，C，等人2008)。浆细胞样树突状细胞(Plasmacytoid dendritic cells)诱导小鼠的NK细胞依赖性，肿瘤抗原特异性T细胞交叉启动以及肿瘤消退(J Clin Invest 118：1165-1175)。许多人发现旁观者树突状细胞的这种间接引发取决于所施用的树突状细胞主动分泌的免疫细胞募集因子和免疫细胞激活促炎因子。
[0008] 当被诸如Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)配体和IFN-γ的混合刺激时，未成熟的单核细胞衍生的人类树突状细胞可以分泌大量的T辅助-1细胞因子(T-helper-I cytokines)和趋化因子(chemokines)[Napolitani，G.A.等人2005，选定的Toll样受体激动剂的组合协同启动在树突状细胞中T辅助型1-极化程序(Selected Toll-like receptor agonist combinations synergistically trigger a T helper type 1-polarizing program in dendritic cells.)；Nat Immunol 6：769-776；Lovgren，T.，D.等人2017，通过在干扰素-γ(interferon gamma，IFN-γ)和多种Toll样受体激动剂的存在下成熟的树突状细胞，增强的人类肿瘤特异性T细胞的刺激(Enhanced stimulation of human tumor-specific T cells by dendritic cells matured in the presence of interferon-gamma and multiple Toll-like receptor agonists)(Cancer Immunol Immunother)]。此外内源性旁观者树突状细胞的间接启动作用意指，通过所谓的“同种异体辨识的直接途径”，同种异体树突状细胞(allogeneic DC，alloDC)的局部施用可产生丰富的促炎因子环境，通过招募和激活的同种反应性T细胞释放的促炎因子，随后导致增强的内源性旁观者树突状细胞的招募和激活(Wallgren，A.C等人2005，直接的同种异体辨识促进旁观者树突状细胞的激活，并允许其用于Thl启动反应：直接和间接的同种异体敏化反应之间的功能联系，Scand J Immunol 62：234-242)。这种异体辨识的直接途径，即被移植的受体中多达
10％的T细胞可通过直接辨识存在于移植物异体树突状细胞上的完整异体MHC/肽复合物而被激活的现象，(参见Lombardi G等人，来自DR4/DRwl3应答者的T细胞对DR1的同种异体辨识模拟了自我限制的内源肽辨识，Allorecognition of DR1 by T cells from a DR4/DRwl3 responder mimics selfrestricted recognition of endogenous peptides，Proc Natl Acad Sci USA 1989；86：4190-4)，这是一种强烈的反应，似乎违反了自我MHC限制的规则，并且主要是由抗原模拟引起的(参见Lechler R等人的“树突状细胞在移植中-朋友还是敌人”，Dendritic cells in transplantation-friend or foe？，Immunity 2001；14：
357-68)。
10％的T细胞可通过直接辨识存在于移植物异体树突状细胞上的完整异体MHC/肽复合物而被激活的现象，(参见Lombardi G等人，来自DR4/DRwl3应答者的T细胞对DR1的同种异体辨识模拟了自我限制的内源肽辨识，Allorecognition of DR1 by T cells from a DR4/DRwl3 responder mimics selfrestricted recognition of endogenous peptides，Proc Natl Acad Sci USA 1989；86：4190-4)，这是一种强烈的反应，似乎违反了自我MHC限制的规则，并且主要是由抗原模拟引起的(参见Lechler R等人的“树突状细胞在移植中-朋友还是敌人”，Dendritic cells in transplantation-friend or foe？，Immunity 2001；14：
357-68)。
[0009] 同种异体树突状细胞(allogeneic DC，alloDC)的使用已经在本领域中先前进行了描述(参见EP 1509244 B1和EP 2534242 B1)。此外根据Laurell，A等人报导，在转移性肾细胞癌(mRCC)患者的I/II期临床试验中已成功测试了使用肿瘤内注射促炎性同种异体树突状细胞(alloDC)的alloDC方法(参见肿瘤内注射促炎性同种异体树突状细胞作为免疫增强剂：在不良风险的转移性肾细胞癌患者中的首次人类研究。Journal for Immuno Therapy of Cancer，2017，5：52)，并且目前正在诊断为mRCC的患者中进一步进行随机多中心的II期的临床研究(NCT02432846)。来自mRCC患者的I/II期临床试验数据表明，在大多数接受治疗的患者中，同种异体树突状细胞的肿瘤内施用可诱导肿瘤特异性T细胞激活，并在肿瘤内强力的或大量的扩散CD8+ T细胞。此外与舒尼替尼(sunitinib)结合，观察到协同抗肿瘤作用。假设alloDC引起肿瘤特异性T细胞反应，并且舒尼替尼(sunitinib)的添加使肿瘤更易受肿瘤特异性T细胞反应的影响，因为已经证明舒尼替尼会影响并减少髓样来源的抑制细胞和调节性T细胞的数量。Karlsson-Parra等人最近发表了用作为抗癌免疫引物的同种异体树突状细胞的概述(Ilixadencel–一种用于肿瘤内施用的根据同种异体细胞的抗癌免疫引物，Pharm Res(2018)35：156)。
[0010] 虽然本领域中alloDC的使用似乎提供了一种有前途的免疫治疗策略，但仍然能够令人感兴趣的是能够进一步提高alloDC在改善影响肿瘤细胞的肿瘤特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞的数量和功能方面的能力。
发明内容
[0011] 因此本发明通过根据本发明的第一方面，本发明试图单独地或以任意组合地减轻、减轻、消除或避免本领域中上述一种或多种潜在的不足和缺陷，通过提供一种促炎性树突状细胞，具有通过同种异体辨识的直接途径激活同种异体T细胞的能力。所述树突状细胞被一腺病毒感染。进一步，所述促炎性树突状细胞通过以下方法获得：
[0012] -提供一未成熟的树突状细胞；
[0013] -用一腺病毒感染所述树突状细胞；以及
[0014] -使所述未成熟的树突状细胞成熟为一促炎性树突状细胞，其中所述成熟是通过添加一TLR3-配体聚肌苷：聚胞苷(或Toll样受体3-配体聚肌苷：聚胞苷，Toll-like receptor 3(TLR3)-ligand poly-I:C)、一TLR7/8-配体和一干扰素γ(interferon gamma，IFN-γ)诱导所述未成熟树突状细胞成熟而执行。
[0015] 促炎性树突状细胞被一腺病毒感染，并通过添加一TLR3-配体聚肌苷：聚胞苷(或Toll样受体3-配体聚肌苷：聚胞苷，Toll-like receptor3(TLR3)-ligand poly-I:C)、一TLR7/8-配体(如瑞西默德，Resiquimod)和一干扰素γ(interferon gamma，IFN-γ)而成熟，与目前流行的观点相反，相比于未被腺病毒感染的对相应促炎性树突状细胞，它具有增强的刺激同种异体T细胞的同种异体辨识的直接途径的能力，如在一混合白细胞反应中的体外测定(mixed leukocyte reaction，MLR)。重要的是，这样的促炎性树突状细胞因此还具有增强的能力，最终能够通过抗原装载的旁观者树突状细胞的激活/成熟来增加自体(相对于旁观者树突状细胞)的CD8+细胞毒性T淋巴细胞的数量和功能，从而能够特异性地识别肿瘤细胞。因此这些腺病毒感染的促炎性树突状细胞可用作为基于细胞的改良的同种异体免疫增强剂，用于治疗或预防癌症。
[0016] 本发明通过根据本发明的另一方面，本发明一种方法，所述方法提供一种促炎性树突状细胞，所述促炎性树突状细胞具有通过同种异体辨识的直接途径激活同种异体T细胞的能力。所述树突状细胞被一腺病毒感染。所述方法包括以下步骤：
[0017] -提供多个未成熟的树突状细胞；
[0018] -用一腺病毒感染所述树突状细胞；以及
[0019] -使所述未成熟的树突状细胞成熟为一促炎性树突状细胞，其中所述成熟是通过添加一TLR3-配体聚肌苷：聚胞苷(或Toll样受体3-配体聚肌苷：聚胞苷，Toll-like receptor 3(TLR3)-ligand poly-I:C)、一TLR7/8-配体和一干扰素γ(interferon gamma，IFN-γ)诱导所述未成熟树突状细胞成熟而执行。
[0020] 根据本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，其包含所述被腺病毒感染的促炎性树突状细胞和至少一种药学上可接受的载体。类似地，这样的组合物也可用作为为基于细胞的改良的同种异体免疫增强剂，用于治疗或预防癌症。
[0021] 根据本发明的另一方面，提供了一种被腺病毒感染的促炎性树突状细胞，或一种药物组合物，包含这种被腺病毒感染的促炎性树突状细胞和至少一种药学上可接受的载体，用于在一对象中治疗或预防癌症，其中所述促炎性树突状细胞对受试者是同种异体的。
[0022] 根据本发明的另一方面，提供了一种在有此需要的受试者中治疗或预防癌症的方法。所述方法包括将被腺病毒感染的促炎性树突状细胞或包含这种被腺病毒感染的促炎性树突状细胞和至少一种药学上可接受的载体给予需要其的受试者。此外，促炎性树突状细胞对受试者是同种异体的。
具体实施方式
[0024] 在基于患者来源的免疫治疗中(即自体的)，树突状细胞(dendritic cells，DC)通常离体修饰以表达或包含肿瘤抗原(肿瘤相关或肿瘤特异性抗原)。如本领域所公知，有多种手段可用于修饰，即自体的以表达或包含肿瘤抗原。这些手段包括用病毒载体感染，例如腺病毒(adenovirus)、腺关联病毒、慢病毒(lentivirus)和逆转录病毒载体(retrovirus vectors)，并带有编码肿瘤抗原的基因。
[0025] 如上所述，促炎同种异体树突状细胞也可以用于免疫疗法，因为已经发现它们激活旁观者树突状细胞。肿瘤内施用的同种异体树突状细胞不需要装载抗原(即表达或包含肿瘤抗原)，因为无论如何在施用部位都存在有用于由激活的内源性旁观者树突状细胞处理的肿瘤抗原。在癌症免疫疗法中使用同种异体树突状细胞作为基于细胞的免疫增强剂仰赖于在混合白细胞反应(mixed leukocyte reaction，MLR)中同种异体T细胞的同种异体辨识的直接途径的刺激，从而导致促炎因子的额外产生(Wallgren等人，2005，Scand J Immunol 62：234-242)。
[0026] 通常通过离体将分离的单核细胞分化为未成熟的树突状细胞，然后离体使其成熟为促炎性树突状细胞，来提供促炎性树突状细胞。如本领域所公认的，特定的成熟方案将影响表现型。因此表面标记物的表达以及分泌，例如细胞因子和趋化因子，在不同成熟方案所提供的促炎性树突状细胞之间会有所不同。此外其他性质也可能不同。例如，在存在前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)的情况下成熟对于提供迁徙性的树突状细胞是必不可少的(参见Boullart IAC等人：“单核细胞衍生的树突状细胞具有TLR受体3和7/8配体与前列腺素E2结合而成熟，导致白介素12(interleukin-12)高量产生和细胞迁移”，Maturation of monocyte-derived dendritic cells with Toll-like receptor 3and 7/8ligands combined with prostaglandin E2 results in high interleukin-12production and cell migration，CANCER IMMUNOLOGY,IMMUNOTHERAPY vol.57(11),2008,p.1589-1597)。相反地，据报导在干扰素-γ(interferon gamma，IFN-γ)存在下成熟会损害树突状细胞的迁移能力(参见Alder J等人：“干扰素-γ剂量依赖性地抑制前列腺素E2介导的树突状细胞向次级淋巴器趋化因子的迁移”，Interferon-gamma dose-dependently inhibits prostaglandin E2-mediated dendritic-cell-migration towards secondary lymphoid organ chemokines，VACCINE,vol.24(49-50),2006,p.7087-7094)。
[0027] 先前已经显示(参见EP 2 534 242B1)，同种异体树突状细胞通过使用TLR3-配体聚肌苷：聚胞苷(或Toll样受体3-配体聚肌苷：聚胞苷，Toll-like receptor 3(TLR3)-ligand poly-I:C)、瑞西莫特(Resiquimod，TLR7/8-配体：1-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]-2-甲基丙烷-2-醇)TLR7/8-ligand：l-[4-amino-2-(ethoxymethyl)imidazo[4,5-c]quinolin-1-yl]-2-methylpropan-2-ol)和一干扰素γ(interferon gamma，IFN-γ)的一组合来成熟为促炎性树突状细胞，并提供一组合物，可用于肿瘤内治疗，例如转移性肾细胞癌。
[0028] 在评估提供带有肿瘤抗原的树突状细胞的各种方法时，如所预期的，已确认用腺病毒感染未成熟的树突状细胞不会损害混合物(包含TLR3-配体聚肌苷：聚胞苷(或Toll样受体3-配体聚肌苷：聚胞苷，Toll-like receptor 3(TLR3)-ligand poly-I:C)、瑞西莫特(Resiquimod，TLR7/8-配体)和一干扰素γ(interferon gamma，IFN-γ))诱导未成熟的树突状细胞成熟为被腺病毒感染的促炎性树突状细胞的能力。被腺病毒感染的促炎性树突状细胞分泌的炎症因子的量对应于于未感染的促炎性树突状细胞之一者，因此证实了先前的报导。
[0029] 然而考虑到腺病毒感染会损害被感染的树突状细胞激活混合白细胞反应(MLR)中的同种异体T细胞的能力，因此认为它们在同种异体环境中没有作用或几乎没有作用。
[0030] 特别是，早在2002年，Jonleit等人(参见Jonuleit等人，Gene Therapy(2000)7，249-254)报告说说明，一种用El取代的，E3缺失的腺病毒感染树突状细胞以及使用促炎因子的成熟，在高树突状细胞对T细胞比率下，使所得的树突状细胞刺激同种异体T细胞(CD4+和CD8+)的增殖能力受损。类似地，Tan等人(参见BLOOD，(2005)，105(10)，3823-4832)报导了用腺病毒感染成熟的(TNF-α，IL-1β，IL-6和PGE2)单核细胞来源的树突状细胞抑制了树突状细胞激活混合白细胞反应(MLR)中同种异体T细胞的能力。此外Newton等人已报导(参见Immunology(2008)，125，469-479)，被腺病毒感染的树突状细胞，用促炎因子(TNF-α、IL-
1β、IL-6和PGE2)而成熟，大大降低了促进同种异体T细胞增殖的能力。据Newton所述，这种作用对腺病毒感染是特有的，因为用被模拟感染(mock-infected)的或被慢病毒(lentivirus)感染的树突状细胞不能看到相同的作用。
1β、IL-6和PGE2)而成熟，大大降低了促进同种异体T细胞增殖的能力。据Newton所述，这种作用对腺病毒感染是特有的，因为用被模拟感染(mock-infected)的或被慢病毒(lentivirus)感染的树突状细胞不能看到相同的作用。
[0031] 被腺病毒感染的促炎性树突状细胞激活混合白细胞反应(MLR)中同种异体T细胞的能力也得到了评估。与普遍观点形成鲜明对比的是，非常令人惊讶地发现，只要树突状细胞已使用TLR3-配体聚肌苷：聚胞苷(或Toll样受体3-配体聚肌苷：聚胞苷，Toll-like receptor3(TLR3)-ligand poly-I:C)、TLR7/8-配体(瑞西莫特，Resiquimod)和一干扰素γ(interferon gamma，IFN-γ)的组合而成熟，腺病毒感染就不会损害激活混合白细胞反应(MLR)中同种异体T细胞的能力。
[0032] 实际上，甚至发现被腺病毒感染的促炎性树突状细胞具有改良的刺激同种异体辨识的直接途径的能力，这是由混合白细胞反应(MLR)中共培养的同种异体T细胞的激活和IFN-γ产生的增加所测定的。此外被腺病毒感染的促炎性树突状细胞不仅改良了刺激同种异体辨识的直接途径的能力，而且还提高了同种异体旁观者树突状细胞的成熟度，从而导致这些旁观者树突状细胞激活自体(相对于旁观者树突状细胞)抗原特异性T细胞的能力增强。因此被腺病毒感染的促炎性树突状细胞可用作用为癌症治疗的基于细胞的改良的同种异体免疫增强剂，其中作用方式取决于同种异体辨识的直接途径。
[0033] 因此本发明的一实施例涉及被腺病毒感染的促炎性树突状细胞。与未被腺病毒感染的相应的促炎性树突状细胞相比，被腺病毒感染的促炎性树突状细胞通过同种异体辨识的直接途径，具有改良的激活同种异体T细胞的能力。此外通过以下方法获得被腺病毒感染的促炎性树突状细胞：
[0034] -提供多个未成熟的树突状细胞；
[0035] -用一腺病毒感染所述树突状细胞；以及
[0036] -使所述未成熟的树突状细胞成熟为一促炎性树突状细胞。
[0037] 通过添加一TLR3-配体聚肌苷：聚胞苷(或Toll样受体3-配体聚肌苷：聚胞苷，Toll-like receptor 3(TLR3)-ligand poly-I:C)、一TLR7/8-配体，例如瑞喹莫德(Resiquimod)，和一干扰素γ(interferon gamma，IFN-γ)来使所述未成熟树突状细胞成熟为促炎性述突状细胞。
[0038] 本发明的成熟混合物鸡尾酒包括一TLR3-配体聚肌苷：聚胞苷(或Toll样受体3-配体聚肌苷：聚胞苷，Toll-like receptor 3(TLR3)-ligand poly-I:C)、瑞喹莫德(Resiquimod，一种TLR7/8-配体)，和干扰素γ(interferon gamma，IFN-γ)的组合，已在世界知识产权组织的专利公开号WO 2011/098516中被描述。TLR3-配体聚肌苷：聚胞苷(或Toll样受体3-配体聚肌苷：聚胞苷，Toll-like receptor 3(TLR3)-ligand poly-I:C)是dsRNA的合成类似物，它包含一条黏合至(anealling)poly(C)链的poly(I)链。股链的大小可能会有所不同。大小可以是200个碱基对至8000个碱基对，例如200到1500或1500到8000个碱基对。TLR7/8-配体R848在本领域中也表示为瑞喹莫德。作为瑞喹莫德(Resiquimod)的替代，加迪莫莫(Gardiquimod，1-(4-氨基-2-乙基氨基甲基咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙烷-2-醇，l-(4-Amino-2-ethylaminomethylimidazo[4,5-c]quinolin-l-yl)-2-methylpro pan-2-ol))，或咪喹莫特(Imiquimod，1-异丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺，l-isobutyl-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amine)可以用作TLR7/8-配体。通常，将未成熟的树突状细胞暴露于激活因子8至24小时，例如18小时。
[0039] 根据一实施例，使用的成熟因子为一TLR3-配体聚肌苷：聚胞苷(或Toll样受体3-配体聚肌苷：聚胞苷，Toll-like receptor 3(TLR3)-ligand poly-I:C)、瑞喹莫德(Resiquimod，TLR7/8-配体)，和干扰素γ(interferon gamma，IFN-γ)。
[0040] 尽管不是必需的，但是根据替代实施例，激活可以进一步包括添加至少一物质，选自以下所组成的一群组：TLR2-配体、TLR4-配体、例如细菌脂多醣(bacterial lipopolysaccharide)和单磷酰基脂质A(monophosphoryl lipid A)、TLR9-配体，例如如CpG寡核苷酸(CpG oligonucleotides，ODN)序列，其将微生物DNA与哺乳动物DNA区分开、干扰素α(Interferon alpha,IFN-α)、白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)。此外优选地，所述激活不包括添加前列腺素E 2(prostaglandin E2，PGE 2)，以防止成熟的树突状细胞变成迁移性树突状细胞，其将迅速离开注射部位(肿瘤)，这在本发明的内容中是不利的。
[0041] 所述激活之后，可以洗涤所得的被腺病毒感染的促炎性树突状细胞，以本质上除去所有的激活因子。因此通常在使用被腺病毒感染的促炎性树突状细胞作为癌症免疫疗法中的免疫增强剂之前将激活因子洗掉。激活因子的去除避免了激活因子的共同施用(添加以诱导离体促炎性树突状细胞)。激活因子的共同施用最有可能导致肿瘤内强而持久的激活所招募的未成熟的树突状细胞，从而导致它们分化为促炎性成熟的树突状细胞，而不是分化为所需的迁移性成熟的树突状细胞。
[0042] 为了提高通过同种异体辨识的直接途径激活同种异体T细胞的能力(由混合白细胞反应(MLR)确定)，以腺病毒感染树突状细胞。
[0043] 各种腺病毒是本领域已知的。在美国专利US 9,017,672中，公开一种优选类型的腺病毒，其为具有增强的基因递送效率的六邻体(hexon)TAT(转录反式激活子，transactivator of transcription)-PTD(转导结构域，transduction domain)修饰的腺病毒。Yu,D.已对所述载体进行了进一步研究，如2013年在PLoS One 8：e54952中报导。
[0044] 根据一实施例，本发明的腺病毒是血清型5腺病毒(adenovirus serotype-5，Ad5)。血清型5腺病毒(Ad5)可以是血清型5腺病毒(Ad5)，具有来自一血清型35(Ad35)腺病毒的纤维轴(shaft)和/或端节(knob)，代替所述血清型5腺病毒的纤维轴和/或端节(knob)。如技术人员所知，腺病毒的几种血清型，包括Ad5和Ad35，在本领域中是已知的。通过用Ad35的纤维轴和/或端节替换Ad5纤维轴和/或端节，可以提高转换效率。此外优选的是将腺病毒载体的六邻体蛋白修饰为包含来自人免疫缺陷病毒(HIV)的转录反式激活子(transactivator of transcription，TAT)的至少一蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)。通过修饰腺病毒载体的六邻体蛋白以包含来自人免疫缺陷病毒(HIV)的转录反式激活子(transactivator of transcription，TAT)的至少一蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)，提高了转导效率。TAT-PTD序列可以被引入到六邻体蛋白的高度可变区5(hyper variable region 5，HV5R)中。根据一实施例，腺病毒载体的六邻体蛋白因此包含根据SEQ ID No.1(YGRK.K.RRQRRR)的氨基酸序列。此外根据SEQ ID No.1的氨基酸序列可以侧接短连接物(short linker)，因此可以包含根据SEQ ID No.2的氨基酸序列(AGGGAGGGYGRK RRQRRRGGGAGGGA)。在PLoS One(2013)8(1)：e54952中公开优选的腺病毒(Ad5PTDf35)的实例。此外腺病毒可以是E1缺失的腺病毒。如本领域技术人员所认识的，E1缺失意味着腺病毒是复制缺陷的。为了在被施用的对象内更好地控制病毒，优选腺病毒是复制缺陷的。根据一例实施例，所述腺病毒因此是复制缺陷的，例如El缺失。腺病毒也可以是E3缺失的腺病毒，例如E1/E3缺失的腺病毒。此外腺病毒可以是一腺病毒，其表达编码人类乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)型16的E6和E7型蛋白(Ad-HPV16E6E7)的基因。表达编码人类乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)16型的E6和E7蛋白的基因的血清型5腺病毒(Ad5)的一腺病毒可以表示为Ad5-HPV16E6E7。
[0045] 尽管腺病毒在本领域中用作为基因递送载体，但是本发明的基础作用并不取决于腺病毒载体中是否包含编码肿瘤抗原的任何基因，而是取决于腺病毒本身的感染。因此根据一实施例，被腺病毒感染的促炎性树突状细胞不包含任何编码肿瘤抗原的基因，即树突状细胞被腺病毒感染，但未被编码肿瘤抗原的基因转导。
[0046] 尽管这对在肿瘤内施用同种异体促炎性树突状细胞并非必要，但在某些应用中(例如当难以通过注射达到肿瘤或肿瘤较小时)，提供被腺病毒感染的促炎性树突状细胞，而所述腺病毒编码在肿瘤中表达的肿瘤抗原仍是有好处的，即被感染和转导的树突状细胞，并因此表达肿瘤相关或肿瘤特异性抗原。因此根据一实施例，被腺病毒感染的促炎性树突状细胞可以包含至少一编码肿瘤相关或肿瘤特异性抗原的基因。通过提供被腺病毒感染的促炎性树突状细胞，所述腺病毒包含至少一编码肿瘤相关或肿瘤特异性抗原的基因，被感染的树突状细胞被转导以表达肿瘤相关或肿瘤特异性抗原。通过被转导促炎性树突状细胞以表达肿瘤抗原的实施例，包括癌病毒抗原(oncoviral antigen)，例如人类乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)，即HPV-16或HPV-18、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)、卡波西斯肉瘤病毒(Kaposis sarcoma virus)或默克尔细胞多瘤病毒(Merkel cell polyoma virus)，以及衍生于突变的新抗原。
[0047] 在提供此被腺病毒感染的促炎性树突状细胞中，未成熟的树突状细胞将被感染并成熟为促炎性树突状细胞。本文已经描述感染以及成熟的一方面。根据一实施例，分别同时进行感染和成熟。根据一替代实施例，首先感染未成熟的树突状细胞以提供未成熟的被腺病毒感染的树突状细胞，然后成熟为被腺病毒感染的促炎性树突状细胞。
[0048] 提供不成熟的树突状细胞在本领域中是公知的。通常首先从外周血白细胞(peripheral blood leukocytes)分离单核细胞，例如通过全血白细胞去除术(leukapheresis of whole blood)。分离出的单核细胞然后可以分化为未成熟的树突状细胞，通过使用白介素4(interleukin-4，IL-4)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor，GM-CSF)。单核细胞可以在补充有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4(interleukin-4，IL-4)的细胞培养基中培养2至7天，例如约5天，以将单核细胞分化为不成熟的树突状细胞。此外在世界知识产权组织的专利公开号WO 2014/096033中，公开一种用于提供未成熟的树突状细胞的过程。
[0049] 在激活后通过冷冻促炎性树突状细胞，它们可以被储存。通常将促炎性树突状细胞冷冻在含有二甲基亚砜(dimethylsulphoxide，DMSO)和血清或血浆的培养基中。使用前将冷冻细胞融化，然后将DMSO洗掉。或者直接使用解冻的细胞。
[0050] 为了用于治疗癌症，可以将被腺病毒感染的促炎性树突状细胞配制成药物组合物。所述药物组合物可包含至少一种药学上可接受的载体，例如磷酸盐缓冲盐溶液、水或乳剂，例如油/水或水/油乳剂。所述药物组合物可以进一步包括润湿剂。此外药物组合物可以包括药学上可接受的佐剂、赋形剂、稳定剂、防腐剂和/或本领域已知的其他组分。
[0051] 例如载体可以是包含人类血清白蛋白的盐溶液。此外载体可以是保存冷冻细胞的培养基。例如如上所述，可以将被腺病毒感染的促炎性树突状细胞冷冻在包含二甲基亚砜(DMSO)的热灭活的通用供体血浆中，以允许对其进行存储。这种包含被腺病毒感染的促炎性树突状细胞的培养基可以直接使用，例如一旦融化在肿瘤内注射。可选择地，可以在施用之前，例如肿瘤内注射，将在这种培养基中冷冻的细胞融化、洗涤并重新悬浮在包含人类血清白蛋白的盐水中。
[0052] 可以将药学上可接受的组合物配制用于肠胃外施用，例如肿瘤内、皮内、皮下或结节内(intranodal administration)施用。根据一实施例，将药学上可接受的组合物配制用于肿瘤内施用。在肿瘤内施用中，将药学上可接受的组合物直接注射入肿瘤。如已经描述的(参见国际专利WO 2011/098516)，促炎性树突状细胞可用于治疗癌症，因为它们可在施用部位，通过一混合白细胞反应(MLR)诱导促炎性反应，招募和激活患者自身的树突状细胞(在此称为旁观者树突状细胞)以发展为负载肿瘤的迁徙性树突状细胞。
[0053] 因此另一实施例涉及被腺病毒感染的促炎性树突状细胞，或包含此类被腺病毒感染的促炎性树突状细胞的组合物，用于治疗或预防癌症。在这样的用途中，被腺病毒感染的促炎性树突状细胞对所述对象是同种异体的，以便能够诱导一混和白细胞反应(MLR)，激活所述对象的自身的同种异体的反应性T细胞，而其与所施用的被腺病毒感染的促炎性树突状细胞是同种异体的。被腺病毒感染的促炎性树突状细胞治疗的癌症的例子包括但不限于肾细胞癌、肝细胞癌、胃肠道间质瘤、胆管癌、头颈癌、非小细胞癌肺癌、胃癌、子宫颈癌和恶性黑色素瘤。
[0054] 当用于治疗癌症时，可以将被腺病毒感染的促炎性树突状细胞与其他现有疗法联合使用。优选的替代方案是将被腺病毒感染的促炎性树突状细胞的施用与降低免疫抑制性肿瘤环境或激活免疫系统的药物联合使用。例如本发明的被腺病毒感染的促炎性树突状细胞可以与舒尼替尼(sunitinib)或类似或相关的受体酪氨酸激酶抑制剂(receptor tyrosine kinase inhibitors)组合。此外还可将针对PD-1(程序性细胞死亡蛋白1，programmed cell death protein 1)或针对PD-1配体的抗体与本发明的被腺病毒感染的促炎性树突状细胞组合。PD-1是一种细胞表面受体，已知在抑制免疫系统和通过抑制T细胞炎性活动以促进自身耐受性中起重要作用。针对PD-1的抗体包括，例如纳武利尤单抗(nivolumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、和匹立单抗(pidilizumab)。此外还靶向PD-1配体的抗体，例如阿特珠单抗(atezolizumab)和阿维鲁单抗(avelumab)可用于补充本发明的]被腺病毒感染的促炎性树突状细胞的治疗。此外本发明的被腺病毒感染的促炎性树突状细胞例如也可以与吉西他滨(gemcitabine)或5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)结合。
[0055] 类似地，一实施例涉及这种被腺病毒感染的同种异体促炎性树突状细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
[0056] 另一实施例涉及一种治疗癌症的方法，其中将被腺病毒感染的促炎性树突状细胞施用于需要这种治疗的患者。所施用的剂量应足以激活患者自身的树突状细胞，以发展为负载肿瘤的迁徙性树突状细胞。为了诱导混和白细胞反应，所施用的被腺病毒感染的促炎性树突状细胞对于患者是同种异体的。
[0057] 被腺病毒感染的促炎性树突状细胞通常不表达任何肿瘤抗原。因此其优选在肿瘤内施用。如本领域公认的那样(Laurell,A等人，瘤内注射促炎性同种异体树突状细胞作为免疫增强剂：在不利的转移性肾细胞癌风险患者中的首次人类研究Intratumorally injected pro-inflammatory allogeneic dendritic cells as immune enhancers:a first-in-human study in unfavourable risk patients with metastatic renal cell carcinoma.Journal for Immuno Therapy of Cancer,2017,5:52；Karlsson-Parra等人，Ilixadencel-同种异体的基于细胞的抗癌免疫引物，用于肿瘤内施用:an Allogeneic Cell-Based Anticancer Immune Primer for Intratumoral Administration,Pharm Res(2018)35:156)，同种异体的促炎性树突状细胞的施用在肿瘤内诱导了肿瘤特异性的T细胞的激活和CD8+ T细胞的肿瘤内浸润。可以在肿瘤内施用被感染的促炎性树突状细胞，而所述促炎性树突状细胞也已经被编码肿瘤抗原的基因所转导，但是优选地被施用到一般真皮或皮下组织或淋巴结中。
[0058] 另一实施例涉及提供如本文公开的此类促炎性树突状细胞的方法，即被腺病毒感染的促炎性树突状细胞，其具有通过同种异体辨识的直接途径以激活同种异体T细胞的改良的能力。此方法包括以下步骤：
[0059] -提供一未成熟的树突状细胞；
[0060] -用一腺病毒感染所述树突状细胞；以及
[0061] -使所述未成熟的树突状细胞成熟为一促炎性树突状细胞，其中所述成熟是通过添加一TLR3-配体聚肌苷：聚胞苷(或Toll样受体3-配体聚肌苷：聚胞苷，Toll-like receptor 3(TLR3)-ligand poly-I:C)、一TLR7/8-配体，例如瑞西默德(Resiquimod)和一干扰素γ(interferon gamma，IFN-γ)诱导所述未成熟树突状细胞成熟而执行。与未感染腺病毒的相应的促炎性树突状细胞相比，所提供的被腺病毒感染的促炎性树突状细胞，具有通过同种异体辨识的直接途径激活同种异体T细胞的改良的能力。
[0062] 在本文中已经描述与提供被腺病毒感染的树突状细胞有关的其他方面，并且同样适用于此实施例。
[0063] 无需进一步阐述，相信本领域技术人员可以使用前面的描述和下面的实验部分来最大程度地利用本发明。因此本文所描述的优选的具体实施方式应被解释为仅仅是说明性的，而不以任何方式限制说明书的其余部分。此外尽管上面已经参考特定实施例描述了本发明，但是本发明并不旨在限于这里阐述的特定形式。然而本发明仅由所附权利要求书限制，并且除了以上具体描述之外而在以上所附权利要求书的范围内，的其他实施例同样是可能的，例如与上述不同。
[0064] 在权利要求中，术语“包括/包含(comprises/comprising)”不排除其他元件或步骤的存在。另外，尽管各个特征可以被包括在不同的权利要求项中，但是可以将这些特征有利地组合，并且包括在不同的权利要求中并不意味着这样的特征组合是不可行和/或不利的。
[0065] 此外单数引用不排除多个。术语“一”、“一个”、“第一”、“第二”等不排除多个。
[0067] 图1：COMBIG/Ad5M成熟的树突状细胞(matured DC)表现出成熟的表型和Th1极化的细胞因子分泌特征。(数据显示为平均值±SEM(n.s.p>0.05；*P<0.05；**P<0.01；***PO.001；****PO.0001))。
[0068] (A)从健康供体PBMC中分离CD14+单核细胞，通过GM-CSF/IL-4分化为未成熟的树突状细胞(imDC)5天，在不同条件下成熟18小时，洗涤并进一步培养24小时并进行分析。
[0069] (B)通过流式细胞术表征树突状细胞的HLA-DR、CD40、CD80、CD86和CD83表达。显示由八个供体产生的树突状细胞DC(CD14"CDla+)上各个标记物的平均荧光强度(MFI)。
[0070] (C)使用ELISA来测量各个PBMC供体的IL-12p70、IL-6和CXCL10分泌。
[0071] 图2：Allo-COMBIG/Ad5M-DC在体外激活先天性和适应性免疫细胞。(数据显示为平均值±SEM(n.s.p>0.05；*P<0.05；**P<0.01；***PO.001；****PO.0001))
[0072] (A)成熟18小时并洗涤后(如图1A所示的样品)，将树突状细胞(此处称为alloDC)与同种异体PBMC(来自不同供体)共培养。
[0073] 共培养24小时后，PBMC库中T细胞的激活以CD69的表达为特征。
[0074] (B)显示来自8个不相关供体的16个个体组合的T细胞(CD3+CD56”)上的CD69的平均荧光强度。
[0075] (C)来自alloDC-PBMC共培养物的MLR(混合白细胞反应)上清液(allo-SN)作为旁观者未成熟(im)树突状细胞(来自与PBMC相同供体的树突状细胞)的成熟刺激，以模拟宿主的“旁观者”未成熟树突状细胞(imDC)的情境。如平均荧光强度(MFI)散点图所示，对旁观者树突状细胞DC(CD14“CDla+)上的各个标记，通过上调HLA-DR、CD40、CD80、CD86和CD83来评估旁观者树突状细胞DC的成熟。评估来自3个无关供体的6个个体组合。
[0076] 图3：由来自PMBC allo-COMBIG/Ad5M-DC共培养物的MLR上清液(allo-SN)使得自体旁观者树突状细胞成熟，交叉呈递(cross presentation)抗原引起的抗原特异性T细胞的激活和扩增。
[0077] (A)以表达CMV-pp65抗原(A549(pp65))的肿瘤细胞裂解液，对从HLA-A2+供体的旁观者未成熟树突状细胞(bystander-DC/bystander-imDC)进行脉冲处理2小时，并通过来自各种共培养物的all-SN进行成熟反应38小时(图2A)。然后将交叉呈递(cross presentation)的旁观者树突状细胞与自体T细胞混合18小时，这些T细胞经过针对HLA-A2限制性CMV-pp65495-503肽的TCR工程改造。
[0078] (B)ELISA用于测量由工程改造的抗原特异性T细胞释放到上清液中的IFN-γ的浓度。检查了来自3个无关供体的6个个体组合。
[0079] (C)如上所述准备了来自CMV血清反应阳性的HLA-A2+供体的旁观者树突状细胞DC，并用于在低剂量IL-2(20IU/毫升)。存在下刺激自体(相对于旁观者DC)非工程化的T细胞12天。
[0080] (D)使用PE-共轭的HLA-A*0201/pp65495-503四聚体，通过流式细胞术定量未工程化的T细胞的CM V-pp65特异性扩增。显示了使用来自PBMC allo-COMBIG/Ad5M-DC共培养物的allo-SN作为成熟刺激，四种代表性个体组合中的一者的FACS图。
[0081] (E)然后通过暴露于装载有CMV-pp65495-503肽(相关标靶)或TARP4-13肽(无关标靶)的T2细胞，来重新刺激所述扩增的非工程化T细胞。用ELISA测量重新刺激后18小时收获的上清液中IFN-γ的浓度。虚线表示由未成熟旁观者述凸状细胞刺激的T细胞所释放的背景IFN-γ。数据显示为平均值±SEM(*PO.05；**P<0.01；****PO.0001)。
[0082] 图4：用编码gp-100间接引发gp-100特异性T细胞的Ad5M载体转导的COMBIG-DC进行预防性接种
[0083] (A)评估了用编码肿瘤抗原pg100的Ad5M载体(Ad5M(gp100)-alloDC)所转导的COMBIG DC(alloDC)间接刺激非肿瘤小鼠中的gp100-特异性T细胞的能力，其通过结合皮下(s.c.)注射Ad5M(gpl00)-alloDC(第0日)以及静脉注射(i.v.)g100特异性Thy 1.1+pmel-1脾细胞的过继细胞转移(第2天)。5日后通过Thy 1.1染色(第7日)进行T细胞读取。
[0084] (B)显示因应于来自两只小鼠的alloDC或Ad5M(gp100)-alloDC，Thy 1.1+pmel-1T细胞(Thyl.l+)的特异性增殖的代表性散点图。
[0085] 图5.用编码gp-100的Ad5M载体所转导的COMBIG-DC进行治疗性疫苗接种可减少肿瘤生长并延长生存期
[0086] (A)在治疗环境中，首先对C57BL/6NRj小鼠进行皮下注射1x 105B 16-F 10细胞(第0天)进入后侧腹，并接受1x 107pmel-1脾细胞(第8天)。所述治疗与i.t.注射1×106Ad5M(gp100)-alloDC(第8和14天)或PBS作为阴性对照。通过卡尺测量监测肿瘤的生长。
[0087] (B)呈现每种治疗的平均肿瘤生长(每组n＝8)。
[0088] (C)通过Kaplan-Meier存活曲线显示小鼠存活，并通过对数秩检验(log-rank test)进行比较(每组n＝8)(*P＜0.05)。
[0089] 图6：COMBIG/Ad5-HPV16E6E7成熟的DC表达成熟的表型。
[0090] (A)从健康供体PBMC中分离CD14+单核细胞，通过GM-CSF/IL-4分化为未成熟的树突状细胞(imDC)5天，在不同条件下成熟18小时，洗涤并进一步培养24小时并进行分析。
[0091] (B)通过流式细胞术表征树突状细胞DC的CD40、CD80、CD86和HLA-DR表达。显示了由八个供体产生的树突状细胞DC(CD 14"CDla+)上各个标记物的平均荧光强度(MFI)。
[0092] 图7：Allo-COMBIG/Ad5-HPV16E6E7-DC在体外(in vitro)激活先天性和适应性免疫细胞。
[0093] (A)成熟18小时并洗涤后(如图6A所示的样品)，将树突状细胞(此处称为alloDC)与同种异体PBMC(来自不同供体)共培养。共培养24小时后，PBMC库中T细胞的激活以CD69的表达为特征。
[0094] (B)显示来自8个不相关供体的16个个体组合的T细胞(CD3+CD56”)上的CD69的平均荧光强度。
[0095] (C)来自alloDC-PBMC共培养物的MLR(混合白细胞反应)上清液(allo-SN)作为旁观者未成熟(im)树突状细胞(来自与PBMC相同供体的树突状细胞)的成熟刺激，以模拟宿主的“旁观者”未成熟树突状细胞(imDC)的情境。如平均荧光强度(MFI)散点图所示，对旁观者树突状细胞DC(CD14“CDla+)上的各个标记，通过上调CD40、CD80、CD86和HLA-DR来评估旁观者树突状细胞(bystander DC)的成熟。评估来自3个无关供体的6个个体组合。
[0096] 实验性：
[0097] 以下实施例仅是示例，决不应解释为限制本发明的范围。相反本发明仅由所附权利要求书限制。
[0098] 实施例1-用没有任何转基因的腺病毒载体转导的COMBIG-DC：
[0099] 在示例1中，评估了用空的腺病毒载体(Ad5M)感染未成熟的树突状细胞(DC)，对单独Combig鸡尾酒(Poly-I：C，R848和IFN-γ)诱导的激活/成熟的影响(例如研究了表型成熟和分泌炎症因子，例如IL-6、IL-12和CXCL10)。简而言之，已经发现Ad5M感染不损害Combig鸡尾酒诱导促炎性树突状细胞(DC)成熟的能力(参见图1)。这些数据与普遍观点一致。然而与普遍观点相反的是，发现Ad5M的感染可以改善而不损害(参见例如Jonuleit等人in Gene Therapy(2000)7,249-254；Tan等人in BLOOD,(2005),105(10),3824-3832；and Newton等人in Immunology,125,469-479)Combig-DC刺激同种异体辨识的直接途径的能力，如推测的那样，通过在混合白细胞反应(MLR)过程中同种异体T细胞的激活(CD69表达)来衡量(参见图2B)。
[0100] 此外，发现从COMBIG-Ad5M同种异体树突状细胞和PBMC共培养的MLR-上清液中，旁观者树突状细胞的激活/成熟度增加(图2C)，从而提高了旁观者树突状细胞激活自体抗原特异性T细胞的能力，自体抗原特异性T细胞产生Thl相关细胞因子IFN-γ(参见图3B和3D)表明，用Ad5M载体转导的COMBIG-DC可作为改良的基于细胞的同种异体免疫增强剂，其中作用方式至关重要等位基因识别的直接途径。
[0101] 材料和方法：
[0102] 细胞系：
[0103] 将K562(Luc)，A549(pp65)和T2细胞(ATCC)培养RPMI-1640中，其在补充了10％热灭活的FBS，1％PeSt和1％HEPES。所有成分和培养基均来自Thermo Fisher Scientific。用慢病毒载体改造K562(Luc)细胞以表达萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)，并用A549(pp65)细胞改造以表达巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)-pp65抗原。所有细胞均在37℃，5％CO2大气下的潮湿培养箱中培养。
[0104] 重组病毒的产生：
[0105] 如前所述构建和产生Ad5M载体(Yu,D.,C.Jin,J.Leja,N.Majdalani,B.Nilsson,F.Eriksson,and M.Essand.2011.具有六邻体Tat蛋白转导结构域修饰的腺病毒在实验性神经母细胞瘤和神经内分泌肿瘤中显示出更高的治疗效果Adenovirus with hexon Tat-protein transduction domain modification exhibits increased therapeutic effect in experimental neuroblastoma and neuroendocrine tumors.J Virol 85:13114-13123)。Ad5M是一种El缺失的人类血清型5腺病(Ad5)载体，具有来自血清型35的纤维轴和端节(knob)，并经过六邻体修饰以增强转导功效(Yu,D.等人2013.血清型5腺病毒载体，具有经Tat-PTD修饰的六邻体和血清型35纤维，显示出大大增强原代细胞培养物的转导能力Adenovirus serotype 5vectors with Tat-PTD modified hexon and serotype
35fiber show greatly enhanced transduction capacity of primary cell cultures.PLoS One 8:)。Ad5M不编码任何转基因。通过定量PCR确定滴度，确定为衣壳化(encapsidated)的病毒基因组(evg)/毫升(Yu,D.等人2013.血清型5腺病毒载体，具有经Tat-PTD修饰的六邻体和血清型35纤维，显示出大大增强原代细胞培养物的转导能力Adenovirus serotype 5vectors with Tat-PTD modified hexon and serotype 35fiber show greatly enhanced transduction capacity of primary cell cultures.PLoS One
8:e54952)。
35fiber show greatly enhanced transduction capacity of primary cell cultures.PLoS One 8:)。Ad5M不编码任何转基因。通过定量PCR确定滴度，确定为衣壳化(encapsidated)的病毒基因组(evg)/毫升(Yu,D.等人2013.血清型5腺病毒载体，具有经Tat-PTD修饰的六邻体和血清型35纤维，显示出大大增强原代细胞培养物的转导能力Adenovirus serotype 5vectors with Tat-PTD modified hexon and serotype 35fiber show greatly enhanced transduction capacity of primary cell cultures.PLoS One
8:e54952)。
[0106] 人类PBMC的分离和DC的产生：
[0107] 来自健康供体的血沉棕黄层(Buffy coats)是从瑞典乌普萨拉乌普萨拉大学医院的血库获得的。通过Ficoll-Paque Premium分离法(GE Healthcare Life Science)分离PBMC，并在RPMI-1640中培养，所述RPMI-1640补充有10％热灭活的FBS、1％PeSt、0.5％L-谷氨酰胺、1％HEPES和20mMβ-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)(DC基质)。
[0108] DC的生成和处理：
[0109] 通过CD14+正磁选择(Miltenyi Biotec)从PBMC中分离出的单核细胞分化为未成熟的树突状细胞(imDC)，使用20纳克/毫升的人类IL-4和100纳克/毫升的GM-CSF(Gentaur)处理5天。每2天更换一次培养基。在第5天，将细胞(imDCs)置于未处理状态或用成熟刺激的混合物鸡尾酒使其成熟18小时[Napolitani，G.A.等人2005，选定的Toll样受体激动剂的组合协同启动在树突状细胞中T辅助型1-极化程序(Selected Toll-like receptor agonist combinations synergistically trigger a T helper type 1-polarizing program in dendritic cells.)；Nat Immunol 6：769-776；Lovgren，T.，D.等人2017，通过在干扰素-γ(interferon gamma，IFN-γ)和多种Toll样受体激动剂的存在下成熟的树突状细胞，增强的人类肿瘤特异性T细胞的刺激(Enhanced stimulation of human tumor-specific T cells by dendritic cells matured in the presence of interferon-gamma and multiple Toll-like receptor agonists)(Cancer Immunol Immunother)]，由2微克/毫升的R848(InvivoGen)，20微克/毫升的聚肌苷酸：聚胞苷酸(polyinosinic:polycytidylic，polyLC)(Sigma-Aldrich)和1000IU/毫升的IFN-γ(Shenandoah Biotechnology)所述组成。所述成熟混合物鸡尾酒被命名为“Toll样受体配体与IFN-γ的结合”(Combined Toll-like receptor ligands with IFN-γ，COMBIG)。以COMBIG成熟的树突状细胞而作为同种异体(allogeneic)刺激物，称为allo-COMBIG-DC。用Ad5M(2000evg/细胞)处理18小时的未成熟的树突状细胞称为allo-Ad5M-DC，而al lo-COMBIG/Ad5M-DC则是进行了COMBIG和Ad5M两种处理18小时。洗涤后，将细胞在新鲜的树突状细胞培养基中进一步培养。
[0110] 人类细胞因子阵列和细胞因子释放测定：
[0111] 收集来自树突状细胞培养物的上清液(在48孔板中为2.5-5×105个细胞/孔)。使用ELISA试剂盒以研究IL-12p70(Mabtech)、IL-6(BioLegend)和CXCL 10(BioLegend)的产生。
[0112] 流式细胞仪：
[0113] 人类树突状细胞表型。抗CD1a-BV510(BD Biosciences)、抗CD14-APC/Cy7、抗HLA-DR-perCP(MHC II类)、抗CD40-FITC、抗CD80-PE，抗CD83-APC和抗CD86-BV421，以用于评估树突状细胞。
[0114] 同种异体混合白细胞反应中T细胞的激活：
[0115] AlloDC与来自无关供体(MLR)的PBMC以1:5(alloDC：PBMC)的比例共培养24小时。24小时后通过抗CD3-FITC和抗CD69-BV510的流式细胞术评估激活。ELISA用于检测同种异体共培养物的上清液(allo-SN)中的IFN-γ(Mabtech)。
[0116] 激活旁观者未成熟的树突状细胞：
[0117] AlloDC与PBMC以1:5(alloDC：PBMC)的比例共培养24小时，并将allo-SN作未成熟的旁观者树突状细胞(Bystander-DC)的成熟刺激物。与之前一样，在48小时后通过流式细胞术评估了旁观者树突状细胞成熟度。
[0118] 除非另有说明，否则所有抗体均购自BioLegend。使用FACSCanto II(BD Biosciences)流式细胞仪进行数据采集，并使用Flow Jo软件(版本7.6.5；Tree Star)进行分析。
[0119] 树突状细胞抗体交叉呈递(cross presentation)和T细胞刺激试验：
[0120] 通过树突状细胞的CMV-pp65的交叉呈递(cross presentation)，以特异性刺激自体CMV-pp65495-503 TCR修饰的T细胞。
[0121] 将未成熟的树突状细胞(HLA-A2+)与来自A549(pp65)肿瘤细胞的冻融细胞裂解液一起在37℃下培养2小时，这是外源地向树突状细胞提供CMV-pp65蛋白的一种手段。树突状细胞随后在来自alloDC/PBMC(allo-SN)的上清液中成熟38小时。自体T细胞经工程改造以表达针对CMV-pp65495-503表位(epitope)的HLA-A*0201限制性T细胞受体(TCR)(Hillerdal,V.等人2016.以新颖而成熟的方法基因工程改造的T细胞的亲和力表征Avidity characterization of genetically engineered T-cells with novel and established approaches.BMC Immunol17:)，所述自体T细胞与CMV-pp65交叉呈递的树突状细胞混合，比例为5：1(T细胞：树突状细胞)，并在新鲜培养基中培养18小时。通过IFN-γ的分泌评估TCR特异性T细胞激活。
[0122] 通过交叉呈递树突状细胞以扩增和重新刺激T细胞：
[0123] 将CMV血清阳性，HLA-A2+供体的T细胞(未修饰)与按上述比例制备的自体CMV-pp65交叉呈递的树突状细胞混合，比例为20：1(T细胞：树突状细胞)，并在新鲜培养基中培养以共12天。7天后，更换含有30IU/毫升的IL-2(Proleukin，诺华公司)和20纳克/毫升IL-7(Nordic Biosite)的培养基。用HLA-A*020l/pp65495-503四聚体(Beckman Coulter)检测到CMV-pp65特异性的T细胞扩增。
[0124] 用5微克/毫升CM V-pp65495-503肽或用与HLA-A2结合无关的TARP(P5L)4i3肽对T2细胞(HLA-A2+)进行脉冲处理。脉冲过的T2细胞用于再刺激扩增的CMV-pp65特异性T细胞18小时。测量IFN-γ释放作为T细胞激活的指标。
[0125] 统计：
[0126] 数据报导为平均值±SEM。统计分析通过GraphPad棱镜软件6.01版(La Jolla)进行。使用带有Holm-Sidak检验的参数单向方差分析进行统计分析，以进行多重比较校正。仅对两组进行评估时，使用学生t检验。P<0.05的值被认为具有统计学意义。
[0127] 结果和讨论：
[0128] COMBIG成熟的和COMBIG/Ad5M成熟的树突状细胞表现出与T辅助细胞(Thl)极化相关的表型和细胞因子分泌特征
[0129] 树突状细胞的成熟状态对于在自体树突状细胞癌症疫苗接种中诱导最佳效应反应至关重要(Sabado,R.L.,and N.Bhardwaj.2010.指导树突状细胞免疫疗法走向成功的癌症治疗Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment.Immunotherapy 2:37-56)。有趣的是，还发现它对于同种异体T细胞的激活很重要(Jonuleit,H.et al 2000.通过用同种异体未成熟人类树突状细胞反复刺激，诱导具有调节特性的产生白介素10的非增殖CD4(+)T细胞Induction of interleukin 10-producing,nonproliferating CD4(+)T cells with regulatory properties by repetitive stimulation with allogeneic immature human dendritic cells.J Exp Med 192:1213-1222)。在我们的实验中，未成熟的树突状细胞(imDC)未被COMBIG、Ad5M或它们的组合处理，或者被成熟18小时。使用感染增强型腺病毒载体Ad5M可以促进树突状细胞装载肿瘤抗原，这是修饰衍生于患者树突状细胞的标准体外实施方法(Tacken,P.J.,and C.G.Figdor.2011.体内靶向抗原的递送和树突状细胞的激活：开发具有成本效益的疫苗的步骤Targeted antigen delivery and activation of dendritic cells in vivo:steps towards cost effective vaccines.Semin Immunol 23:12-20.)为了有一简单的系统来评估Ad5M对树突状细胞的成熟效果，在本研究中使用了不带转基因的Ad5M。洗涤细胞，并在不添加任何细胞因子的新鲜树突状细胞培养基中再培养24小时。通过流式细胞术评估树突状表型变化，并收集上清液(SN)以绘制分泌表征(图1A)。
[0130] 单独的或与Ad5M组合的COMBIG成熟诱导HLA-DR、CD40、CD80、CD86和CD83的上调，暗示成熟的和激活的表型(图1B)。成熟的COMBIG和成熟的COMBIG/Ad5M树突状细胞也显示出促炎性细胞因子和趋化因子的分泌增加。因此确认转导不会损害不成熟的树突状细胞(imDC)向促炎性树突状细胞(DC)的成熟。
[0131] 两者合计，我们的数据表明Ad5M/COMBIG的成熟被人类单核细胞衍生的树突状细胞很好地耐受，并导致了完全成熟和促炎性树突状细胞表型的产生。
[0132] 树突状细胞与COMBIG混和物鸡尾酒结合并被Ad5M感染而成熟，增加了其激活同种异体T细胞的能力：
[0133] 与COMBIG-DC或COMBIG/Ad5M-DC共培养，在同种异体PBMC库中的T细胞激活由早期激活蛋白CD69的上调来评估。有趣的是，与流行观点形成鲜明对比的是，与未感染的allo-COMBIC-树突状细胞相比，在用被Ad5M病毒载体感染的allo-COMBIG的共培养物中，T细胞激活更高。
[0134] 来自allo-COMBIG VAd5M-DC和PBMC共同培养的上清液诱导旁观者树突状细胞的有效成熟：
[0135] 发现来自PBMC与allo-COMBIG-DC或allo-COMBIG/Ad5M-DC的共培养物的MLR上清液(Allo-SN)显著诱导未成熟旁观者树突状细胞上的CD40上调。符合allo-COMBIG/Ad5-DC激活同种异体T细胞的能力增加，来自PBMC allo-COMBIG/Ad5M-DC共培养物的MLR上清液，而不是来自PBMC未感染的allo-COMBIG-DC共培养物的MLR上清液额外还导致其显著上调旁观者树突状细胞上的成熟标记物CD80和CD86(图2E)。
[0136] 旁观者树突状细胞被来自PMBC allo-COMBIG/Ad5M-DC的共培养物的MLR上清成熟，可有效交叉呈递抗原以促进T细胞扩增：
[0137] 除了树突状细胞成熟外，抗原摄取和抗原呈递在诱导适应性肿瘤免疫方面也起着重要作用。(Vandenberk,L.et al 2015.利用免疫原性癌细胞改善树突状细胞疫苗的潜力Exploiting the Immunogenic Potential of Cancer Cells for Improved Dendritic Cell Vaccines.Front Immunol 6:663)。
[0138] 为了测试抗原摄取和抗原呈递，我们使用了体外模型系统，其中将HLA-A2+供体的树突状细胞(旁观者树突状细胞)与来自肿瘤细胞(A549(pp65))的细胞裂解液一起孵育，所述肿瘤细胞表达pp65蛋白全长，模拟裂解的肿瘤细胞的状况(图3A和图3C)。然后将这些负载抗原的未成熟旁观者树突状细胞使用PBMC-allo DC共培养物中的MLR上清液而成熟。外源性pp65抗原需要被旁观者树突状细胞加工成pp65495-503肽，并交叉呈递到HLA-A2(MHC I类)上，以刺激用自体T细胞，所述自体T细胞以TCR工程修饰，其对于CMV-pp65495-503有特异性。我们发现，在MLR上清液中成熟而负载抗原的旁观者树突状细胞可以有效地交叉呈递抗原，并刺激工程修饰过的CMV-pp65495-503 TCR特异性T细胞(图3A)，分泌大量的IFN-γ，并且与未转导的allo-COMBIG-DC共培养物的PBMC的MLR上清液相比，来自PBMC allo-COMBIG/Ad5M-DC共培养物的上清液所产生的激活明显更好(图3B)。
[0139] 接下来，我们要测试是否可以激活和扩增内源性CMV-pp65特异性T细胞(非工程修改过)。在这种情况下，我们从HLA-A2+CMV血清反应阳性供体的旁观者树突状细胞开始，其中装载了含pp65的肿瘤细胞裂解物，并使用来自PBMC allo-COMBIG/Ad5M-DC共培养物的allo-SN而成熟(图3C)。这些旁观者树突状细胞产生了来自CMV血清反应阳性供体的自体CMV-pp65特异性T细胞的5倍扩增(图3D)。在重新刺激测定中测试了那些T细胞辨识其标靶并其发挥效应功能的能力。将扩增的T细胞暴露于T2细胞，所述T2细胞用HLA-A2-限制的pp65495-503肽或无关的HLA-A2-限制的肽进行脉冲，并测量IFN-γ的释放。在用pp65阳性标靶细胞重新刺激后，可以从pp65扩增的T细胞中检测到IFN-γ高度释放，这表明PBMC allo-COMBIG/Ad5M-DC共培养物中的allo-SN使得旁观者树突状细胞成熟(图3E)。还证实了扩增的T细胞是抗原特异性的，因为暴露于以无关的肽进行脉冲的T2细胞仅导致背景量的IFN-γ释放(图3E)。
[0140] 总而言之，我们假设使用感染腺病毒Ad5M的allo COMBIG DCs(allo COMBIG/Ad5M DCs)作为免疫增强剂，诱导旁观者树突状细胞成熟并随后引发抗原特异性T细胞。与未感染的COMBIG-DC相比，令人惊讶地发现，感染了Ad5M病毒的COMBIG-DC(COMBIG/Ad5M DC)与同种异体PBMC共培养时，会产生促炎环境，具有增强旁观者树突状成熟的能力。当外源地提供模型抗原时，模拟肿瘤细胞裂解物，使用来自allo COMBIG/Ad5M DC和PBMC的共培养物中的MLR上清液使旁观者树突状细胞成熟，可以有效地消化和交叉呈递模型抗原并引起抗原特异性细胞毒性T-细胞扩增和激活。
[0141] 实施例2-使用编码与肿瘤相关的抗原(糖蛋白100)的腺病毒载体，以感染并转导的小鼠COMBIG DC进行的体内小鼠研究：
[0142] 在实施例2中，评估了用被Ad5M病毒感染的allo DC，所述Ad5M病毒具有编码肿瘤抗原gp100的基因。发现在预防环境中皮下施用Ad5M(gp100)-allo DC刺激了过继转移(adoptively transferred)的pmel-1(gp-100定向)CD8+ T细胞的增殖。此外在治疗环境中Ad5M(gp100)-allo DC的肿瘤内施用导致肿瘤生长延迟和生存期延长。
[0143] 材料和方法：
[0144] 重组病毒的产生：
[0145] 如先前所述构建和生产Ad5M(MOCK)和Ad5M(gp100)载体(Yu,D.具有六邻体Tat蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)修饰的腺病毒在实验性神经母细胞瘤和神经内分泌肿瘤中显示出更高的治疗效果Adenovirus with hexon Tat-protein transduction domain modification exhibits increased therapeutic effect in experimental neuroblastoma and neuroendocrine tumors.J Virol；85(24):13114-23doi10.1128/JVI.05759-11)。它们是E1缺失的血清型5腺病毒(Ad5)载体，其纤维轴和端节(knob)被血清型35对应物替代。它们的六邻体蛋白(主要衣壳蛋白，capsid protein)的高变环中还含有来自HIV Tat的细胞穿透肽。它们是感染增强型载体，具有转导包括树突状细胞(DC)在内的大多数造血细胞的能力(Yu D等人，具有六邻体Tat蛋白转导结构域修饰的腺病毒在实验性神经母细胞瘤和神经内分泌肿瘤中显示出更高的治疗效果Adenovirus serotype 5vectors with Tat-PTD modified hexon and serotype 35fiber show greatly enhanced transduction capacity of primary cell cultures.PLoS One
2013；8(l):e54952 doi10.1371/journal.pone.0054952)。Ad5M(MOCK)不编码任何转基因，而Ad5M(gp100)编码人黑素瘤抗原糖蛋白100(human melanoma antigen glycoprotein
100，gp100，氨基酸25-33)。通过定量聚合酶链反应确定滴度为衣壳化的病毒基因组(evg)/每毫升(Yu D等人，具有六邻体Tat蛋白转导结构域修饰的腺病毒在实验性神经母细胞瘤和神经内分泌肿瘤中显示出更高的治疗效果。PLoS One 2013；8(l):e54952 doi10.1371/journal.pone.0054952)。
2013；8(l):e54952 doi10.1371/journal.pone.0054952)。Ad5M(MOCK)不编码任何转基因，而Ad5M(gp100)编码人黑素瘤抗原糖蛋白100(human melanoma antigen glycoprotein
100，gp100，氨基酸25-33)。通过定量聚合酶链反应确定滴度为衣壳化的病毒基因组(evg)/每毫升(Yu D等人，具有六邻体Tat蛋白转导结构域修饰的腺病毒在实验性神经母细胞瘤和神经内分泌肿瘤中显示出更高的治疗效果。PLoS One 2013；8(l):e54952 doi10.1371/journal.pone.0054952)。
[0146] 细胞系：
[0147] 用于腺病毒生产的911细胞系(Crucell，莱顿，荷兰)在DMEM中培养，所述DMEM中添加了10％热灭活的FBS，1％青霉素/链霉素(PeSt)和1％丙酮酸钠。将小鼠黑素瘤细胞系B16-F10(ATCC，Rockville，MD)在补充有10％热灭活的FBS，1％PeSt和1％丙酮酸钠的DMEM中培养。小鼠黑素瘤细胞系Hcme和Hcmell2源自原发性HGF-CDK4(R24C)黑素瘤模型(Bald T等人，紫外线辐射诱导的炎症促进黑色素瘤的血管生长和转移Nature 2014；507(7490):109-13；Landsberg J等人，黑色素瘤通过炎症诱导的可逆去分化来抵抗T细胞疗法Melanomas resist T-cell therapy through inflammation-induced reversible
dedifferentiation.Nature 2012；490(7420):412-6)，是马格德堡大学医院的Thomas Tilting教授的馈赠。HcmeB和Hcmell2均在补充有10％热灭活的FBS的RPMI-1640中培养。所有成分和培养基均来自赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific，卡尔斯巴德Carlsbad，加利福尼亚州CA)。所有细胞均在37℃，5％CO2大气的潮湿培养箱中培养。
dedifferentiation.Nature 2012；490(7420):412-6)，是马格德堡大学医院的Thomas Tilting教授的馈赠。HcmeB和Hcmell2均在补充有10％热灭活的FBS的RPMI-1640中培养。所有成分和培养基均来自赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific，卡尔斯巴德Carlsbad，加利福尼亚州CA)。所有细胞均在37℃，5％CO2大气的潮湿培养箱中培养。
[0148] 小鼠骨髓来源的同种异体树突状细胞的分离与成熟：
[0149] 从雌性7-8周大的野生型(wt)BALB/c小鼠(H-2Dd)的股骨和胫骨产生了骨髓树突状细胞，(Janvier Labs，法国)，使骨髓暴露并用无菌注射器冲洗细胞。将收获的细胞在补充有10％热灭活的FBS、1％的PeSt、1％的HEPES、50μMβ-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)的IMDM中培养。培养基中补充了20钠克/毫升的重组鼠IL-4和20纳克/毫升重组鼠GM-CSF(Nordic BioSite，斯德哥尔摩，瑞典)。将骨髓细胞铺在未处理的培养皿(Sarstedt，Numbrecht，德国)上。每3天更换一次培养基。在第7天，收获非粘附的未成熟的树突状细胞(imDC)，并用结合Toll样受体配体(Toll-like receptor ligands)以及IFN-γ(COMBIG)的混合物鸡尾酒处理18小时，其含有2.5微克/毫升R848(InvivoGen，Sam Diego，CA)，20微克/毫升聚肌苷酸：聚胞苷酸(polyinosinic:polycytidylic acid，polyLC)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和1000IU/毫升的IFN-γ(Nordic Biosite)(Napolitani G，Rinaldi A，Bertoni F，Sallusto F，Lanzavecchia A.Toll样受体激动剂组合可协同触发树突状细胞中的T辅助1型极化程序Toll-like receptor agonist combinations synergistically trigger a T helper type 1-polarizing program in dendritic cells.Nat Immunol 2005；6(8):769-76doi 10.1038/nil223)，以获得成熟的allo DC。通过在37℃下用
2000evg/细胞Ad5M(gp100)转导沉淀的未成熟的树突状细胞(imDC)2小时，以获得Ad5M(gp100)-allo DC，并如上所述使其成熟。将细胞在37℃，5％CO2大气的潮湿培养箱中培养。
2000evg/细胞Ad5M(gp100)转导沉淀的未成熟的树突状细胞(imDC)2小时，以获得Ad5M(gp100)-allo DC，并如上所述使其成熟。将细胞在37℃，5％CO2大气的潮湿培养箱中培养。
[0150] 小鼠免疫细胞表型：
[0151] 使用抗CD3-PB、抗CD8a-APC、抗Thyl.1-PE、抗VP-13-FITC、H-2Db/hgpl0025-33-PE四聚体，以流式细胞仪来对小鼠T细胞进行表型分析(Beckman Coulter,San Diego,CA)。所有抗体均购自BioLegend(San Diego,CA)。使用FACSCanto II(BD Biosciences)流式细胞仪，进行数据采集，并使用Flow Jo软件(版本7.6.5；Tree Star，Ashland，OR)进行分析。
[0152] 动物实验：
[0153] 乌普萨拉研究动物伦理委员会(C215/12)和北部斯德哥尔摩研究动物伦理委员会(N170/13，N164/15)批准了动物研究。所有体内实验都是对6-7周大的雌性C57BL/6NRj(H-2Db)小鼠进行的，这些小鼠接受了处理过的同种异体树突状细胞的疫苗(疫苗细胞)，这些细胞是从7-8周大的雌性BALB/c(H-2Dd)小鼠产生，并如上所述进行处理。所有小鼠均得自Janvier Labs。
[0154] pmel-1(gp100特异性)脾细胞的过继转移：
[0155] 以1x106疫苗细胞皮下注射小鼠。48小时后静脉内(i.v.)注射pmel-1脾细胞(每只小鼠10×106)。转基因pmel-1小鼠具有C57BL/6NRj(H-2Db)背景，其脾细胞中约20％为Thyl的l+CD8+ T细胞，带有gpl0025-33特异性TCR。Pmel-1小鼠最初是从杰克逊实验室(Bar Harbor,Maine,USA)获得的，并由我们小组饲养。pmel-1过继脾细胞转移后第7天收获引流(腹股沟)淋巴结，然后消化成单细胞悬液。
[0156] 瘤内注射allo DC后在B16黑色素瘤模型中的体内疗效评估：
[0157] 以1x 105个B16-F10肿瘤细胞皮下注射小鼠进入后侧。对于pmel-1T细胞转移实验，在第8天小鼠接受了1x 108个pmel-1脾细胞静脉内注射，以及在B16-F10肿瘤细胞接种后第8天和第14天，i.t.注射106个allo DC。用卡尺测量肿瘤，并按以下公式计算肿瘤大小：体积＝长度×宽度2×π/6。当肿瘤体积超过1厘米3或出现溃疡出血时，牺牲小鼠。B16-F10接种后第15天，从处死小鼠的脾脏、血液和淋巴结中获得细胞，并对Thyl.1和Υβ13pmel-1T细胞标记物进行染色。
[0158] 统计：
[0159] 数据报告为平均值和SEM。统计分析通过GraphPad棱镜软件6.01版(La Jolla,CA,USA)进行。使用参数单向方差分析(>2个实验组)和Holm-Sidak检验进行多重比较校正，并进行曼-惠特尼U检验(仅2个实验组)进行统计分析。gpl00-TCR+ T细胞与肿瘤负荷的关联通过计算Spearman相关性的线性回归模型进行评估。使用对数秩检验进行Kaplan-Meier生存曲线的统计比较。P<0.05的值被认为具有统计学意义。
[0160] 结果：
[0161] 小鼠黑素瘤模型中的Ad5M(gpl00)-allo DC疫苗接种可增加过继转移的pmel-1T细胞的增殖和持久性，延缓肿瘤的生长并延长生存期：
[0162] 我们试图检查Ad5M(gp100)-alloDC与从pmel-1脾细胞转移而来的过继性T细胞的结合是否在荷黑素瘤小鼠(melanoma-bearing mice)中具有积极的生存作用。给幼稚的C57BL/6NRj小鼠皮下注射右后肢lx l06 allo DC或Ad5M(gp100)-allo DC，然后静脉内过继转移10x106pmel-1脾细胞(图4A)。与未转染的COMBIG-DC相比，COMBIG/Ad5M(gp100)-DC能够刺激过继转移的gp100特异性Thyl.l+CD8+T细胞的增殖，在转移后五天维持其存在(图4B)。
[0163] 在用COMBIG/Ad5M(gp100)-DC疫苗接种后pmel-1T细胞仍然持续存在，我们接下来评估了在治疗环境中过继pmel-1脾细胞转移与i.t.注射COMBIG/Ad5M(gp 100)-DC的联合作用(图5A)。联合治疗延迟了肿瘤的生长(图5B)，并显著延长了荷瘤小鼠(tumor-bearing mice)的存活期(图5C)。
[0164] 讨论：
[0165] 综上所述，实施例表明使用感染了编码肿瘤抗原gp100的Ad5M的COMBIG DC，可以增强全身性gp100特异的T细胞反应，在小鼠黑素瘤模型中抑制肿瘤生长并延长生存期。通过免疫引物/疫苗来有效引发T细胞反应需要内源树突状细胞吸收抗原、成熟并迁移至dLN，在那里它们可以与自体T细胞有效相互作用(Dieu-Nosjean MC等人，在癌症中及超过的第三级淋巴结构Tertiary lymphoid structures in cancer and beyond.Trends Immunol 2014；35(11):571-80；Kleindienst P等人，体内扩增树突状细胞疫苗所诱导的T细胞反应需要内源性树突状细胞Endogenous dendritic cells are required for amplification of T cell responses induced by dendritic cell vaccines in vivo.J Immunol2003；
170(6):2817-3)，因此表明已经局部注射被编码肿瘤抗原的Ad5M病毒所感染的COMBIG-DC与被无编码的Ad5M病毒所感染的COBMIG DC相似(请参见示例1)，从而诱导促炎反应刺激内源性旁观者树突状细胞的成熟并随后有效引发肿瘤特异性T细胞。
170(6):2817-3)，因此表明已经局部注射被编码肿瘤抗原的Ad5M病毒所感染的COMBIG-DC与被无编码的Ad5M病毒所感染的COBMIG DC相似(请参见示例1)，从而诱导促炎反应刺激内源性旁观者树突状细胞的成熟并随后有效引发肿瘤特异性T细胞。
[0166] 实施例3-用腺病毒载体转导的COMBIG-DC，所述腺病毒具有编码HPV-16E6和E7蛋白的转基因：
[0167] 在实施例3中，单独评估用带有编码HPV-16E6和E7蛋白的转基因(Ad5-HPV16E6E7)的腺病毒载体(Ad5)感染未成熟树突状细胞对COMBIG鸡尾酒(Poly-I：C、R848和IFN-γ)诱导的表型激活/成熟的影响。简而言之，可见Ad5-HPV16E6E7感染，类似于用空载体Ad5M感染(参见实施例1)，不会损害COMBIG-混合物鸡尾酒诱导表型树突状细胞成熟的能力(参见图6A，图6B)。此外，通过在混合白细胞反应(MLR)期间以同种异体T细胞的激活(CD69的表达)来测量，COMBIG-DC刺激同种异体辨识的直接途径的能力提高了(参见图7B)。在实施例1中用空载体Ad5M(参见图2B)看到了相似的效果。
[0168] 此外，发现来自allo COMBIG-Ad5M DC和PBMC共同培养的MLR-上清液的旁观者树突状细胞的激活/成熟度增加(图7C)，这表明用Ad5-HPV16-E6E7载体来转导COMBIG-DC，以作为改良的基于细胞的同种异体免疫增强剂是有用的，其中作用方式主要取决于同种异体辨识的直接途径。
[0169] 材料和方法：
[0170] 生产Ad5-HPV16E6E7：
[0171] Ad5是E1缺失的人类血清型5腺病毒(Ad5)载体，其编码E6和E7转基因。通过定量PCR确定滴度，即衣壳病毒基因组(evg)/毫升(Yu,D.2013具有六邻体Tat蛋白转导结构域修饰的腺病毒在实验性神经母细胞瘤和神经内分泌肿瘤中显示出更高的治疗效果Adenovirus with hexon Tat-protein transduction domain modification exhibits increased therapeutic effect in experimental neuroblastoma and neuroendocrine tumors.8：e54952)。
[0172] 人类PBMC的分离和树突状细胞的产生、树突状细胞的产生和治疗、n流式细胞仪、人类树突状细胞表型、同种异体混合白细胞反应中T细胞的激活、旁观者未成熟树突状细胞的激活和统计。
[0173] 请参阅实施例1的材料和方法。
[0174] 结果和讨论：
[0175] C0MBIG/Ad5-HPV16E6E7刺激的树突状细胞表现出成熟的表型：
[0176] 为了评估Ad5-HPV-16-E6和E7对树突状细胞的成熟作用，通过流式细胞术研究了表型变化(图6A，图6B)。如图6B中所示，单独用COMBIG或与Ad5-HPV-16E6E7组合的刺激，诱导了CD40、CD80、CD86和HLA-DR的上调，暗示一成熟和激活的表型(图6B)。综上，这些数据表明，人类单核细胞衍生的树突状细胞很好地耐受Ad5-HPV-16-E6E7/COMBIG的成熟，并导致完全成熟的树突状细胞的表型的产生。
[0177] 用COMBIG鸡尾酒使树突状细胞成熟并结合被Ad5-HPV1 6E6E7感染的树突状细胞，而增加它们激活同种异体T细胞的能力：
[0178] 通过共培养的COMBIG-DC或COMBIG/Ad5-HPV16E6E7 DC，在同种异体的PBMC库中T细胞的激活通过早期激活蛋白CD69的上调来评估。有趣的是，与普遍观点形成鲜明对比的是，与未感染的allo-COMBIG-DC相比，在用被Ad5-HPV16E6E7病毒载体感染的allo-COMBIG-DC的共培养物中，T细胞激活更高(图7B)。
[0179] 来自同种异体COMBIG VAd5-HP′I6E6E7 DC和PBMC的共培养物的上清液诱导旁观者树突状细胞的有效率的成熟：
[0180] 发现来自PBMC与allo-COMBIG-DC和allo-COMBIG/Ad5-HPV16E6E7 DC的共培养物中的MLR上清液(Allo-SN)分别诱导未成熟的旁观者树突状细胞上的成熟标记物(CD40、CD80和CD86)的上调。与allo COMBIG/Ad5-HPV-16E6E7 DC激活同种异体T细胞的能力的增加(参见图7B)一致，与来自未感染的PBMC allo-COMBIG-DC共培养物的MLR上清液相比，来自PBMC allo-COMBIG/Ad5-HPV16-E6E7-DC共培养物的MLR上清液增加了成熟标记物(CD40、CD80和CD86)的上调(图7C)。
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