吡唑化合物436
阅读：712发布：2021-06-05
专利汇可以提供吡唑化合物436专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了式(Ia)或(Ib)所示新型化合物、或其药学上可接受的盐、其制备方法、包含它们的药物组合物及其在 治疗 中的应用。，下面是吡唑化合物436专利的具体信息内容。
1.一种式(Ia)或(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐：
2.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物为式(Ib)所示化合物：
3.如权利要求2所述的式(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐，用作药物。
4.如权利要求2所述的式(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗的药物中的应用。
5.如权利要求2所述的式(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗如下疾病的药物中的应用：黑素瘤；甲状腺乳头状瘤；胆管癌；结肠癌；卵巢癌；肺癌；白血病；淋巴恶性肿瘤；多发性骨髓瘤；肝、肾、膀胱、前列腺、乳腺和胰腺中的癌和肉瘤；和皮肤、结肠、甲状腺、肺和卵巢的原发和复发实体瘤。
6.一种在需要治疗的温血动物如人中产生FGFR抑制效果的方法，所述方法包括给予所述动物有效量的如权利要求2所述的式(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐。
7.一种在需要治疗的温血动物如人中产生抗癌效果的方法，所述方法包括给予所述动物有效量的如权利要求2所述的式(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐。
8.一种药物组合物，所述药物组合物包含与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的如权利要求2所述的式(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐。
9.一种治疗需要治疗的温血动物如人的如下疾病的方法：黑素瘤；甲状腺乳头状瘤；
胆管癌；结肠癌；卵巢癌；肺癌；白血病；淋巴恶性肿瘤；多发性骨髓瘤；肝、肾、膀胱、前列腺、乳腺和胰腺中的癌和肉瘤；和皮肤、结肠、甲状腺、肺和卵巢的原发和复发实体瘤，所述方法包括给予所述动物有效量的如权利要求2所述的式(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐。
10.如权利要求8所述的药物组合物，其中，式(1b)所示化合物为晶体形式。
11.如权利要求8所述的药物组合物，其中，式(1b)所示化合物为晶体形式，称为晶型A。
吡唑化合物436
[0002] 蛋白激酶是一类调节各种细胞功能的蛋白(酶)。这通过磷酸化蛋白底物上特定的氨基酸，从而导致所述底物蛋白构象变化来实现。构象变化调节底物的活性或其与其它结合伴侣相互作用的能力。蛋白激酶的酶活性是指所述激酶将磷酸根基团加到底物上的速率。可对其进行检测，例如通过测定转化成产物的底物量与时间的函数关系。底物的磷酸化在蛋白激酶的活性部位进行。
[0004] 已认识到成纤维细胞生长因子(FGF)为许多生理过程(如发育和血管发生过程中的形态发生)的重要介质。目前FGF家族的已知成员超过25个。成纤维生长因子受体(FGFR)家族由四个成员组成，各自由胞外配体结合结构域、单跨膜结构域和胞内细胞质蛋白酪氨酸激酶结构域组成。用FGF刺激后，FGFR经历二聚合和转磷酸作用，这导致受体活化。受体活化足以募集和激活参与不同过程如细胞生长、细胞代谢和细胞存活的调节的特定下游信号转导伴侣(Reviewed in Eswarakumar，V.P.等，Cytokine & Growth FactorReviews 2005，16，第139-149页)。因此，FGF和FGFR有可能引起和/或促进肿瘤发生。
[0005] 现在有相当多证据将FGF信号转导与人癌症直接联系在一起。已有报道说各种FGF在不同种肿瘤类型，如膀胱、肾脏细胞和前列腺(等)癌中表达升高。FGF还被描述成强大的血管生成因子。FGFR在内皮细胞中的表达也已见诸报道。已将各种FGFR的活化突变与膀胱癌和多发性骨髓瘤(等)相联系，同时还在前列腺和膀胱癌等中证明有受体表达(Reviewed in Grose，R.等，Cytokine & Growth Factor Reviews 2005，16，第179-186页和Kwabi-Addo，B.等，Endocrine-Related Cancer 2004，11，第709-724页)。由于这些原因，FGF信号转导系统是吸引人的治疗目标，特别是因为靶向FGFR和/或FGF信号转导的治疗可影响肿瘤细胞(直接地)和肿瘤血管生成。
[0006] 2007年12月20日提交的PCT申请号PCT/GB2007/004917中描述了可作为FGFR用于靶向FGFR和/或FGF信号转导的治疗中的吡唑酰胺。具体地讲，将描述的某些吡唑酰胺制备成外消旋混合物。现在已经发现：对于某些对映体，一种或多种可能有益的生物学和/或生理学性能可能存在差异。
[0007] 本发明提供式(Ia)或(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐：
[0008]
[0009] 本发明另一方面提供式(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐：
[0010]
[0011] 本发明化合物的合适的药学上可接受的盐为，例如本发明化合物的酸加成盐(其为足够碱性)，例如，与例如无机或有机酸，如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、三氟乙酸、柠檬酸或马来酸的酸加成盐。此外，本发明化合物的足够酸性的合适的药学上可接受的盐为碱金属盐，例如钠或钾盐，碱土金属盐，例如钙或镁盐，铵盐或与有机碱(提供生理学可接受的阳离子)的盐，例如与甲胺、二甲胺、三甲胺、哌啶、吗啉或三-(2-羟乙基)胺的盐。
[0012] 本发明涉及具有FGFR抑制活性的式(Ia)和(Ib)所示化合物的任何和所有互变异构形式。例如，式(IA)所示化合物为式(Ia)所示化合物的互变异构体。
[0013]
[0014] 例如，式(IB)所示化合物为式(Ib)所示化合物的互变异构体。
[0015]
[0017] 在本发明的另一方面，本发明的具体化合物为任一实施例或其中任何一种的药学上可接受的盐。
[0018] 本发明还提供制备本文定义的式(Ia)或(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括使式(IIa)或(IIb)所示化合物与式(III)所示化合物反应：
[0019]
[0020] 其中Z表示 离去基团 (例如，卤素，如氯、-CN、-N3、-OH 或-OR、-OC(O)a b a bR、-OCR(NRR)2或-OC(＝NR)NRR 基团，其中R为任选取代的烷基、芳基、杂芳基或烷芳基，a b
R、R 各自独立为氢或任选被取代的烷基、芳基或烷芳基)，
R、R 各自独立为氢或任选被取代的烷基、芳基或烷芳基)，
[0021]
[0022] 其中Q为氢或保护基团(例如t-Bu或BOC基团或如′Protective Groups inOrganic Synthesis′，第2版，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Wiley-Interscience(1991)中所述)，已产生式(Ia)或(Ib)所示化合物，
[0023] 并任选进行以下的一个或多个步骤：
[0024] ·将获得的化合物转化成本发明化合物
[0025] ·形成该化合物的药学上可接受的盐。
[0026] 合适的式(IIa)或(IIb)所示化合物包括羧酸或羧酸的反应性衍生物。羧酸或羧酸的反应性衍生物包括酰基卤，如通过酸与无机酰基氯(inorganic acidchloride)例如亚硫酰氯反应形成的酰基氯；混合酸酐，例如通过酸与氯甲酸酯如氯甲酸异丁酯反应形成的酸酐；活性酯，例如通过羧酸与苯酚如五氟苯酚、与酯如三氟乙酸五氟苯酯、与醇如甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇或N-羟基苯并三唑反应形成的酯；酰基叠氮化物，例如通过酸与叠氮化物如二苯基磷酰基叠氮化物反应形成的叠氮化物；酰基氰，例如通过酸和氰化物如二乙基磷酰基氰化物反应形成的氰化物；或酸与碳二亚胺如二环己基碳二亚胺或与脲鎓(uronium)化合物如六氟磷酸(V)2-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓反应的产物。
[0027] 该反应可在有合适的惰性溶剂或稀释剂，例如卤代溶剂，如二氯甲烷、氯仿或四氯化碳，醇或酯，如甲醇、乙醇、异丙醇或乙酸乙酯，醚，如四氢呋喃或1，4-二噁烷，芳族溶剂，如甲苯存在下方便地进行。该反应还可在偶极非质子溶剂，如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷-2-酮或二甲基亚砜存在下进行。根据所进行的反应和离去基团Z的性质，该反应可在例如-20℃至100℃，优选0℃至室温的温度范围内方便地进行。
[0028] 该反应通常可在碱存在下进行。根据所进行的反应和离去基团Z的性质，合适的碱包括有机胺碱如吡啶、2，6-二甲基吡啶、N，N-二异丙基乙胺、可力丁、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、吗啉、N-甲基吗啉或二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯，碱或碱土金属碳酸盐或氢氧化物如碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、氢氧化钠或氢氧化钾，碱金属酰胺如六甲基二硅叠氮钠(NaHMDS)，或碱金属氢化物如氢化钠。
[0030] 式(IIa)、(IIb)或(III)所示化合物可商品化购得、是文献中已知的或可采用已知技术制备。
[0031] 通过文献中已知的方法采用其中Z为-OH的式(II)所示化合物制备其中Z为卤素或-OR的式(II)所示化合物。例如，可采用从羧酸制备酰氯或酯的已知方法。
[0032] 可通过2-甲基哌嗪与4-氟苯甲酸酯反应得到4(3-甲基哌嗪基)苯甲酸酯，接着N-甲基化来制备其中Z为-OR的式(II)所示化合物。
[0033] 可通过使式(IV)所示化合物与式(V)所示肼反应来制备式(III)所示化合物：
[0034]
[0035] 该反应可在溶剂如乙醇中在60-80℃的温度范围下方便地进行。
[0036] 式(IV)和(V)所示化合物为可商品化购得的化合物，或它们是文献中已知的，或它们通过本领域中已知的标准方法制备。
[0037] 本领域技术人员会理解：本发明方法中，起始试剂或中间体化合物中的某些官能团如羟基或氨基可能需要被保护基团保护。因此，式(Ia)或(Ib)所示化合物的制备在各阶段可包括加入和除去一个或多个保护基团。
[0038] 官能团的保护和脱保护已在′有机化学中的保护基团(Protective Groupsin Organic Chemistry)′，J.W.F.McOmie编，Plenum Press(1973)和′有机合成中的保护基团(Protective Groups in Organic Synthesis)′，第2版，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Wiley-Interscience(1991)中描述。
[0039] 以上式(Ia)或(Ib)所示化合物可转化成药学上可接受的盐，例如酸加成盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、乙酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、甲磺酸盐或对甲苯磺酸盐，或碱金属盐如钠或钾盐。
[0040] 互变异构体及其混合物的应用也形成本发明的一个方面。
[0041] 式(1b)所示化合物可以一种或多种晶体形式存在。本发明的一个具体方面中，式(1b)所示化合物为晶体形式，称为晶型A。
[0042] 本发明的另一方面提供本文中所定义的药物组合物，其中式(1b)所示化合物为晶体形式。
[0043] 本发明的另一方面提供本文中所定义的药物组合物，其包含基本上为晶型A的(1b)所示化合物。
[0044] 基本上为晶型A指存在大于95％的晶型A。尤其存在大于96％的晶型A。尤其存在大于97％的晶型A。尤其存在大于98％的晶型A。尤其存在大于99％的晶型A。尤其存在大于99.5％的晶型A。尤其存在大于99.8％的晶型A。
[0045] 一个实施方式提供式(1b)所示化合物的晶体形式，其XRD图谱包含在2θ 5.288、17.935、18.011、20.513和20.753的峰。
[0046] 另一实施方式提供式(1b)所示化合物的晶体形式，其XRD图谱包含在2θ 5.288、17.935、18.011、18.766、19.628、19.667、20.513、20.753 和
23.892的峰。
23.892的峰。
[0047] 另一实施方式提供式(1b)所示化合物的晶体形式，其XRD图谱包含在2θ 5.288、17.761、17.935、18.011、18.766、19.094、19.628、19.667、
20.513、20.753、22.264和23.892的峰。
20.513、20.753、22.264和23.892的峰。
[0048] 另一实施方式提供式(1b)所示化合物的晶体形式，其XRD图谱包含在2θ 5.288、10.483、11.388、11.912、14.086、15.671、16.322、17.761、
17.935、18.011、18.766、19.094、19.628、19.667、20.513、20.753、21.765、22.264、22.766、
22.793和23.892的峰。
17.935、18.011、18.766、19.094、19.628、19.667、20.513、20.753、21.765、22.264、22.766、
22.793和23.892的峰。
[0049] 另一实施方式提供式(1b)所示化合物的晶体形式，其XRD图谱包含在2θ 3.642、4.357、5.288、7.226、9.062、9.482、10.483、11.388、11.85、
11.912、13.078、14.086、14.559、15.671、16.156、16.179、16.322、17.761、17.935、18.011、
18.766、19.094、19.628、19.667、20.513、20.753、21.765、22.264、22.766、22.793、23.892、
26.257和36.269的峰。
11.912、13.078、14.086、14.559、15.671、16.156、16.179、16.322、17.761、17.935、18.011、
18.766、19.094、19.628、19.667、20.513、20.753、21.765、22.264、22.766、22.793、23.892、
26.257和36.269的峰。
[0050] 本领域技术人员会理解本文中提供的衍射图谱数据不应理解为绝对的(更多信息参见Jenkins，R和Snyder，R.L.‘X-射线粉末衍射学介绍(Introduction to X-Ray Powder Diffractometry)’John Wiley & Sons，1996)。因此，应该理解晶体形式不局限于X-射线粉末衍射图谱与本文中所述X-射线粉末衍射图谱相同的晶体。本发明还包括X-射线粉末衍射图谱与本文中所述的那些基本相同的任何晶体。X-射线粉末衍射领域的技术人员能判断X-射线粉末衍射图谱的实质相似度并会理解差异可能由如下各种因素导致：例如测试条件(如设备、样品制备或所用的机器)产生的测试误差；测试条件和样品制备产生的强度变化；晶体大小或非归一化高径比(non-unitary aspectratio)的变化产生的峰的相对强度变化；和可受到样品在衍射仪中的精确高度影响的反射位置和衍射仪的零点校正，和样品的表面平坦度。
[0053] (2)淋巴谱系的造血肿瘤(hematopoietic tumor)，包括急性淋巴细胞性白血病、B-细胞淋巴瘤和伯基特氏(Burketts)淋巴瘤；
[0054] (3)骨髓谱系的造血肿瘤，包括急性和慢性粒细胞性(骨髓性myelogenous leukaemias)白血病和前髓细胞性白血病；
[0055] (4)间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；和
[0056] (5)其它肿瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌(tetratocarcinoma)、成神经细胞瘤和神经胶质瘤。
[0057] 在一个实施方式中，本发明化合物可用于治疗膀胱肿瘤、乳腺瘤和前列腺瘤和多发性骨髓瘤。
[0058] 因此，本发明提供本文定义的式(Ia)或(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗。
[0059] 本发明的另一方面提供如上文定义的式(Ia)或(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐，用于通过治疗来治疗人或动物身体的方法。
[0060] 本发明的另一方面提供本文定义的式(Ia)或(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗的药物中的应用。
[0062] 本发明还提供治疗癌症的方法，包括给予有此需要的患者治疗有效量的本文定义的式(Ia)或(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐。
[0063] 我们还发现本文定义的化合物或其药学上可接受的盐是有效的抗癌药剂，据信该性能来自于调节或抑制FGFR活性。因此，预计本发明化合物可用于治疗由FGFR单独或部分介导的疾病或医学病症，即所述化合物可用于在需要此类治疗的温血动物内产生FGFR抑制效果。
[0064] 因此，本发明化合物提供治疗癌症的方法，其特征为抑制FGFR，即所述化合物可用于产生通过FGFR抑制单独或部分介导的抗癌效果。
[0065] 由于在许多人癌症(包括但不限于乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌和多发性骨髓瘤)中观察到FGFR的激活突变，预计本发明的这种化合物具有宽的抗癌性能。因此，预计本发明化合物会具有抵御这些癌症的抗癌活性。此外，还预计本发明化合物会具有抵御各种白血病、淋巴恶性肿瘤和实体瘤，如肝、肾、膀胱、前列腺、乳腺和胰腺等组织中的癌和肉瘤的活性。在一个实施方式中，预计本发明有利地减缓如皮肤、结肠、甲状腺、肺和卵巢等的原发和复发实体瘤的生长。更具体地讲，预计本发明的这种化合物或其药学上可接受的盐抑制与FGFR相关的这些肿瘤(特别是其生长和传播显著依赖于FGFR的那些肿瘤，包括例如膀胱、前列腺、乳腺的某些肿瘤和多发性骨髓瘤)的生长。
[0066] 因此，本发明的该方面提供本文定义的式(Ia)或(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐，用作药物。
[0067] 本发明的另一方面提供本文定义的式(Ia)或(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐在制备用于在温血动物如人体内产生FGFR抑制效果的药物中的应用。
[0068] 本发明的该方面提供本文定义的式(Ia)或(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐在制备用于在温血动物如人体内产生抗癌效果的药物中的应用。
[0069] 本发明的另一特征是提供本文定义的式(Ia)或(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗如下疾病的药物中的应用：黑素瘤；甲状腺乳头状瘤(papillary thyroid tumour)；胆管癌；结肠癌；卵巢癌；肺癌；白血病；淋巴恶性肿瘤；多发性骨髓瘤；肝、肾、膀胱、前列腺、乳腺和胰腺中的癌和肉瘤；和皮肤、结肠、甲状腺、肺和卵巢的原发和复发实体瘤。
[0070] 本发明的另一方面提供本文定义的式(Ia)或(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐在温血动物如人体内产生FGFR抑制活性的应用。
[0071] 本发明的该方面提供本文定义的式(Ia)或(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐在温血动物如人体内产生抗癌效果的应用。
[0072] 本发明的另一特征是提供本文定义的式(Ia)或(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐在治疗如下疾病中的用途：黑素瘤；甲状腺乳头状瘤；胆管癌；结肠癌；卵巢癌；肺癌；白血病；淋巴恶性肿瘤；多发性骨髓瘤；肝、肾、膀胱、前列腺、乳腺和胰腺中的癌和肉瘤；和皮肤、结肠、甲状腺、肺和卵巢的原发和复发实体瘤。
[0073] 本发明该方面的另一特征是提供在需要此类治疗的温血动物如人体内产生FGFR抑制效果的方法，包括给予所述动物有效量的本文定义的式(Ia)或(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐。
[0074] 本发明该方面的另一特征是提供在需要此类治疗的温血动物如人体内产生抗癌效果的方法，所述方法包括给予所述动物有效量的本文定义的式(Ia)或(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐。
[0075] 本发明该方面的另一特征是提供治疗需要此类治疗的温血动物如人体的如下疾病的方法：黑素瘤；甲状腺乳头状瘤；胆管癌；结肠癌；卵巢癌；肺癌；白血病；淋巴恶性肿瘤；多发性骨髓瘤；肝、肾、膀胱、前列腺、乳腺和胰腺中的癌和肉瘤；和皮肤、结肠、甲状腺、肺和卵巢的原发和复发实体瘤，所述方法包括给予所述动物有效量的本文定义的式(Ia)或(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐。
[0076] 本发明的另一方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含与药学上可接受的稀释剂或载体组合的本文定义的式(Ia)或(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐以用于在温血动物如人体内产生FGFR抑制效果。
[0077] 本发明的另一方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含与药学上可接受的稀释剂或载体组合的本文定义的式(Ia)或(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐以用于在温血动物如人体内产生抗癌效果。
[0078] 本发明的另一方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含与药学上可接受的稀释剂或载体组合的本文定义的式(Ia)或(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐以用于治疗温血动物如人体内的如下疾病：黑素瘤；甲状腺乳头状瘤；胆管癌；结肠癌；卵巢癌；肺癌；白血病；淋巴恶性肿瘤；多发性骨髓瘤；肝、肾、膀胱、前列腺、乳腺和胰腺中的癌和肉瘤；和皮肤、结肠、甲状腺、肺和卵巢的原发和复发实体瘤。
[0079] 式(Ia)或(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐可以其本身使用，但通常以药物组合物的形式给予，其中包含式(Ia)或(Ib)所示化合物或其盐(活性成分)与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体结合。根据给药方式，所述药物组合物可包含0.01-99％w(重量百分比)、0.05-80％w、0.10-70％w，或甚至0.10-50％w的活性成分，所有重量百分比以总组合物计。
[0080] 本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的本文定义的式(Ia)或(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐。
[0081] 本发明还提供制备本发明药物组合物的方法，所述方法包括将本文定义的式(Ia)或(Ib)所示化合物或其药学上可接受的盐与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体混合。
[0082] 所述药物组合物可以采用例如乳膏、溶液、悬浮剂、七氟烷烃气溶胶和干粉剂等形式局部给药(例如给予至皮肤或肺和/或呼吸道)；或全身性给药，例如以片剂、胶囊、糖浆、粉剂或粒剂的形式通过口服给药；或采用溶液或悬浮剂的形式胃肠外给药；或通过皮下给药；或通过栓剂形式直肠给药；或透皮给药。
[0084] 片剂的合适的药学上可接受的赋形剂包括，例如惰性稀释剂如乳糖、碳酸钠、磷酸钙或碳酸钙，造粒剂(granulating agent)和崩解剂如玉米淀粉或藻酸；粘合剂如淀粉；润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石；防腐剂如对羟基苯甲酸乙酯或丙酯，和抗氧剂如抗坏血酸。在任何情况下，片剂可无包衣或采用本领域中熟知的常规包衣剂和方法包衣以改变其崩解和随后活性成分在胃肠道内的吸收或改善其稳定和/或外观。
[0086] 水性悬浮液通常包含超细粉状的活性成分和一种或多种悬浮剂，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；分散或润湿剂如卵磷脂或烯化氧与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如十七乙氧基十六醇)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸与己糖醇肝的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯。所述水性悬浮液可还包含一种或多种防腐剂(如对羟基苯甲酸乙酯或丙酯)、抗氧剂(抗坏血酸)、着色剂、调味剂和/或甜味剂(如蔗糖、糖精或阿斯巴甜(aspartame))。
[0087] 油性悬浮液可通过将活性成分悬浮于植物油(如花生油、橄榄油、芝麻油或椰油)或矿物油(如液体石蜡)中来配制。所述油性悬浮液可还包含增稠剂如峰蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可加入甜味剂(如上面列出的那些)和调味剂来提供可口的口服制剂。这些组合物可通过加入抗氧剂，如抗坏血酸来保存。
[0088] 适合于通过加入水来制备水性悬浮液的可分散粉末和颗粒通常包含活性成分和分散或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂。合适的分散或润湿剂和悬浮剂的示例为上面已经提及的那些。还可存在其它赋形剂如甜味剂、调味剂和着色剂。
[0089] 本发明药物组合物还可为水包油乳液形式。油相可为植物油，如橄榄油或花生油，或矿物油，如例如液体石蜡或它们的任何混合物。合适的乳化剂可为例如天然树胶，如阿拉伯胶或黄芪胶，天然磷脂，如大豆、卵磷脂，衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯(例如脱水山梨糖醇单油酸酯)和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，如聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。所述乳液可还包含甜味剂、调味剂和防腐剂。
[0090] 糖浆和酏剂可采用甜味剂，如甘油、丙二醇、山梨糖醇、阿斯巴甜或蔗糖配制，还可还包含镇痛剂、防腐剂、调味剂和/或着色剂。
[0091] 所述药物组合物还可为无菌注射水性或油性悬浮液，其可按照已知方法采用上文述及的一种或多种合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂制备。无菌可注射制品还可以是胃肠外可接受的无毒稀释剂或溶剂配制的无菌溶液或悬浮液，例如1，3-丁二醇的溶液。
[0092] 可将活性成分与合适的无刺激性赋形剂混合来制备栓剂，所述赋形剂在普通温度下为固体但在直肠温度下为液体从而会在直肠内融化以释放所述药物。合适的赋形剂包括例如可可脂和聚乙二醇。
[0093] 局部制剂，如乳膏、软膏、凝胶剂和水性或油性溶液或悬浮剂通常可通过采用本领域熟知的常规方法将活性成分与常规、局部可接受的载体或赋形剂配制在一起而获得。
[0094] 通过吹入给药的组合物可以是包含平均粒径为例如30μ或更小的颗粒的细粉，所述粉末本身包含单独的或被一种或多种生理学上可接受的载体如乳糖稀释的活性成分。然后不难将吹入用粉末保留在含有，例如1-50mg活性成分的胶囊中以便与涡轮吸入器，如用于吹入已知药剂色甘酸钠的联用。
[0095] 通过吸入给药的组合物可以是配置成将活性成分作为包含微细固体或液滴的气溶胶分配的常规加压气溶胶形式。可使用常规气溶胶推进剂，如挥发性氟化烃或烃，所述气溶胶装置通常配置成分散计量的活性成分。
[0096] 关 于 制 剂 的 其 它 信 息，读 者 参 见 综 合 医 学 化 学 (Comprehensive MedicinalChemistry)(Corwin Hansch；Chairman of Editorial Board)，Pergamon Press1990的第5卷，第25.2章。
[0097] 根据熟知的药学原则，治疗目的的本发明化合物的剂量大小自然会根据病症的性质和严重程度、动物或患者的年龄与性别和给药路径而变化。
[0098] 总的来说，本发明化合物的给予应能使得获得日剂量为例如0.1mg-1000mg活性成分/kg体重，假如需要分开的剂量的话。然而，日剂量必需根据治疗的宿主、具体的给药途径和治疗疾病的严重程度而变化。因此，最佳剂量可由治疗任何特定患者的医师确定。总之，当采用肠胃外途径时将给予较低剂量。因此，例如，就静脉给药而言，通常采用例如
0.1mg/kg-30mg活性成分/kg体重的剂量范围。同样，就吸入给药而言，采用例如0.1mg/kg-25mg活性成分/kg体重的剂量范围。然而，优选口服给药。例如，打算口服给予人的制剂通常包含例如0.1mg-2g活性成分。
0.1mg/kg-30mg活性成分/kg体重的剂量范围。同样，就吸入给药而言，采用例如0.1mg/kg-25mg活性成分/kg体重的剂量范围。然而，优选口服给药。例如，打算口服给予人的制剂通常包含例如0.1mg-2g活性成分。
[0099] 关于给药途径和剂量方案的其它信息，读者参见综合医学化学(CorwinHansch；Chairman of Editorial Board)，Pergamon Press 1990的第5卷，第25.3章。
[0100] 上文定义的抗癌治疗可作为单独疗法应用，或除了本发明化合物外，可包括传统的外科手术或放疗或化疗。这种化疗可包括以下抗肿瘤药剂目录中的一种或多种：
[0101] (i)肿瘤内科所用的其它抗增殖/抗瘤药物及其组合，如烷化剂(例如顺铂、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡铂(carboplatin)、环磷酰胺、氮芥、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥、白消安(Busulphan)、替莫唑胺和亚硝基脲)；抗代谢物(例如吉西他滨(gemcitabine)和抗叶酸剂，如5-氟尿嘧啶等氟嘧啶和替加氟(Tegafur)、雷替曲塞(raltitrexed)、氨甲喋呤、阿糖胞苷和羟基脲)；抗肿瘤抗生素(例如蒽环类如亚德里亚霉素(adriamycin)、博莱霉素(bleomycin)、多柔比星(doxorubicin)、道诺霉素(daunomycin)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idambicin)、丝裂霉素C(mitomycin-C)、放线菌素D(dactinomycin)和光辉霉素(mithramycin))；抗有丝分裂药物(例如长春花生物碱如长春新碱、长春花碱、长春地辛和长春瑞滨和紫杉烷类如紫杉醇和多西他赛(taxotere)和polo激酶抑制剂)；和拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素如依托泊甙(etoposide)和替尼泊甙(teniposide)、安吖啶(amsacrine)、拓扑替康(topotecan)和喜树碱(camptothecin))；
[0102] (ii)细胞生长抑制剂如抗雌激素(例如他莫昔芬(tamoxifen)、氟维斯群(fulvestrant)、托瑞 米 芬(toremifene)、雷洛 昔 芬(raloxifene)、屈 洛 昔 芬(droloxifene)和艾多昔芬(iodoxyfene))、抗雄激素(例如比卡鲁胺(bicalutamide)、氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和乙酸环丙氯地孕酮)、LHRH拮抗剂或LHRH激动剂(例如戈舍瑞林(goserelin)、亮丙瑞林(leuprorelin)和布舍瑞林(buserelin))、孕激素(例如乙酸甲地孕酮)、芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑(Anastrozole)、来曲唑(letrozole)、伏氯唑(vorazole)和依西美坦(exemestane))和5*-还原酶的抑制剂如非那雄胺(finasteride)；
[0103] (iii)抗侵袭药剂(anti-invasion agent)(例如c-Src激酶家族抑制剂，如4-(6-氯-2，3-亚甲基二氧基苯胺基)-7-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]-5-四氢吡喃-4-基羟喹唑啉(AZD0530；国际专利申请WO 01/94341)、N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-{6-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]-2-甲基嘧啶-4-基氨基}噻唑-5-羧酰胺(达沙替尼(dasatinib)，BMS-354825；J.Med.Chem.，2004，47，6658-6661)，和金属蛋白酶抑制剂如马立马司他(marimastat)、尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂受体功能的抑制剂或乙酰肝素酶抗体)；
[0104] (iv)生长因子功能抑制剂：例如此类抑制剂包括生长因子抗体和生长因子受体TM抗体(例如抗erbB2抗体曲妥珠单抗[Herceptin ]、抗EGFR抗体帕尼单抗、抗erbB1抗体西妥昔单抗[Erbitux，C225]和Stern等，Critical reviews inoncology/haematology，
2005，第54卷，第11-29页公开的所有生长因子或生长因子受体抗体)；此类抑制剂还包括酪氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族抑制剂(例如EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂，如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉基丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼，ZD1839)、N-(3-乙炔基苯基)-6，7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(埃罗替尼，OSI-774)和
6-丙烯酰氨基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉基丙氧基)-喹唑啉-4-胺(CI 1033)、erbB2酪氨酸激酶抑制剂如拉帕替尼，肝细胞生长因子家族的抑制剂；血小板衍生生长因子家族的抑制剂如伊马替尼；丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂(例如Ras/Raf信号传导抑制剂如法尼基转移酶抑制剂，例如索拉非尼(BAY 43-9006))，通过MEK和/或AKT激酶的细胞信号传导的抑制剂、肝细胞生长因子家族的抑制剂、c-kit抑制剂、abl激酶抑制剂、IGF受体(胰岛素样生长因子)激酶抑制剂；aurora激酶抑制剂(例如AZD1152、PH739358、VX-680、MLN8054、R763、MP235、MP529、VX-528和AX39459)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂如CDK2和/或CDK4抑制剂；
2005，第54卷，第11-29页公开的所有生长因子或生长因子受体抗体)；此类抑制剂还包括酪氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族抑制剂(例如EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂，如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉基丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼，ZD1839)、N-(3-乙炔基苯基)-6，7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(埃罗替尼，OSI-774)和
6-丙烯酰氨基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉基丙氧基)-喹唑啉-4-胺(CI 1033)、erbB2酪氨酸激酶抑制剂如拉帕替尼，肝细胞生长因子家族的抑制剂；血小板衍生生长因子家族的抑制剂如伊马替尼；丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂(例如Ras/Raf信号传导抑制剂如法尼基转移酶抑制剂，例如索拉非尼(BAY 43-9006))，通过MEK和/或AKT激酶的细胞信号传导的抑制剂、肝细胞生长因子家族的抑制剂、c-kit抑制剂、abl激酶抑制剂、IGF受体(胰岛素样生长因子)激酶抑制剂；aurora激酶抑制剂(例如AZD1152、PH739358、VX-680、MLN8054、R763、MP235、MP529、VX-528和AX39459)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂如CDK2和/或CDK4抑制剂；
[0105] (v)抗血管生成药剂，如抑制血管内皮生长因子的效果的那些，[例如抗血管内皮TM细胞生长因子抗体贝伐单抗(Avastin )和VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂，如4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474；WO 01/32651中的实施例2)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171；WO 00/47212中的实施例240)、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787；
WO 98/35985)和SU11248(苏尼替尼(sunitinib)；WO 01/60814)、如国际专利申请WO97/22596、WO 97/30035、WO 97/32856和WO 98/13354中公开的那些化合物和通过其它机理起作用的化合物(例如利诺胺(linomide)、整合素αvβ3功能抑制剂和血管生成抑制素)]；
WO 98/35985)和SU11248(苏尼替尼(sunitinib)；WO 01/60814)、如国际专利申请WO97/22596、WO 97/30035、WO 97/32856和WO 98/13354中公开的那些化合物和通过其它机理起作用的化合物(例如利诺胺(linomide)、整合素αvβ3功能抑制剂和血管生成抑制素)]；
[0106] (vi)血管破坏剂如考布他汀(Combretastatin)A4和国际专利申请WO99/02166、WO 00/40529、WO 00/41669、WO 01/92224、WO 02/04434和WO 02/08213中公开的化合物；
[0107] (vii)反义治疗，例如针对以上列出的靶标的那些，如ISIS 2503，一种抗-ras反义；
[0108] (viii)基因治疗法，包括例如替代异常基因，如异常p53或异常BRCA1或BRCA2的方法，GDEPT(基因介导的酶前药治疗)法，如采用胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的那些和提高患者对化疗或放疗耐受性的方法如多药耐药性基因疗法；和
[0109] (ix)免疫疗法，包括例如提高患者肿瘤细胞的免疫原性的离体和体内方法，如用细胞因子，如白介素2、白介素4或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子转染，降低T-细胞无反应性(anergy)的方法，采用转染免疫细胞如细胞因子转染树突细胞的方法，采用细胞因子转染肿瘤细胞系的方法和采用抗独特型抗体的方法。实施例
[0110] 现在将参考以下示例性实施例对本发明进行进一步描述，除非另有表述，其中：
[0111] (i)温度以摄氏度(℃)给出；操作在室温或环境温度下(即18-25℃范围内的温度下)进行；
[0113] (iii)层析是指在硅胶上的快速层析；薄层层析(TLC)在硅胶板上进行；
[0114] (iv)反应过程后通常进行TLC，反应时间仅用于说明；
[0115] (v)最终产物具有令人满意的质子核磁共振(NMR)谱和/或质谱数据；
[0116] (vi)产量仅用于说明且不必是努力工艺开发可获得的产量；如果需要更多的材料，则重复制备；
[0117] (vii)除非另外指出，给出时，NMR数据为主要特征性质子(majordiagnostic proton)的δ值，以相对于作为内标的四甲基硅烷(TMS)的百万分之份数(ppm)给出，在300MHz下，在DMSO-d6中测定的；
[0118] (viii)化学符号具有其通常意义；采用SI单位和符号；
[0119] (ix)溶剂比以体积∶体积(v/v)给出；和
[0120] (x)质谱(MS)数据在LC/MS系统上产生，其中HPLC组件通常包括Agilent 1100或Waters Alliance HT(2790&2795) 设 备 并 在 PhemonenexGemini C185μm，50×2mm column(or similar)上运行，用酸性洗脱剂(例如，采用0-95％梯度的水/乙腈，含有5％在50∶50水∶乙腈(v/v)混合物中的1％甲酸；或采用甲醇代替乙腈的等同溶剂体系)，或碱性洗脱剂(例如采用0-95％梯度的水/乙腈，含有5％在乙腈混合物中的0.1％880氨水)洗脱；和MS组分通常包括Waters ZQ分光光度计。产生电喷雾(ESI)正和负基础峰强度的色谱和220-300nm的UV总吸收色谱，给出m/z值；通常，仅报道代表母体的离子且除非-另外明确说明，引用的值为正离子模式的(M+H)+和负离子模式的(M-H) ；
[0121] (xi)制备型HPLC在C18反相硅胶，例如在Waters‘Xterra’制备型反相柱(5微米硅胶，19mm直径，100mm长度)上进行，采用极性下降的混合物作为洗脱剂，例如极性下降的水(包含1％乙酸或1％氢氧化铵水溶液(d＝0.88))和乙腈的混合物；
[0122] (xii)使用以下缩写：
[0123] THF 四氢呋喃；
[0124] DMF N，N-二甲基甲酰胺；
[0125] EtOAc 乙酸乙酯；
[0126] DCM 二氯甲烷；和
[0127] DMSO 二甲亚砜
[0128] DIPEA N，N-二异丙基乙胺(还称为N-乙基-N-丙-2-基-丙-2-胺)
[0129] PBS 磷酸缓冲盐水
[0130] HEPES N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[2-乙磺酸]
[0131] DTT 二硫苏糖醇
[0132] ATP 三磷酸腺苷
[0133] BSA 牛血清蛋白
[0134] DMEM Duibecco改进的Eagle培养基
[0135] MOPS 3-(N-吗啉)丙磺酸
[0137] (xiv)除非另外明确描述，原料是可商品化购得。
[0138] 实施例1(a) (S)-N-(3-(3，5-二甲氧基苯乙基)-1H-吡唑-5-基)-4-(3，4-二甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺的制备
[0139]
[0140] 25℃下将三甲基铝(在甲苯中的2M溶液，1.93ml，3.87mmol)滴加入3-(3，5-二甲氧基苯乙基)-1H-吡唑-5-胺(382mg，1.55mmol)和(S)-4-(3，4-二甲基哌嗪-1-基)苯甲酸甲酯(384mg，1.55mmol)在甲苯(10ml)中的悬浮液中。将所得溶液在60℃搅拌18小时。将反应混合物倒入甲醇(50ml)中并用2M盐酸酸化。通过离子交换层析法采用SCX柱纯化粗产物。采用7M甲醇铵将所需产物从该柱洗脱并蒸发至干得到不纯的产物。通过制备型HPLC(Waters XTerra C18柱，5μ硅胶，30mm直径，100mm长度)采用1％氨水和乙腈的极性下降混合物作为洗脱剂纯化粗产物。将包含所需化合物的部分蒸发至干，得到白色固体状的(S)-N-(3-(3，5-二甲氧基苯乙基)-1H-吡唑-5-基)-4-(3，4-二甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺(387mg，54％)。
[0141] 1H NMR(399.9MHz，DMSO-d6)δ1.07(3H，d)，2.09-2.14(1H，m)，2.18-2.25(1H，m)，2.22(3H，s)，2.44-2.53(1H，m)，2.77-2.87(2H，m)，2.88(4H，s)，3.65-3.75(2H，m)，3.73(6H，s)，6.34(1H，t)，6.43(2H，d)，6.46(1H，s)，6.96(2H，d)，7.91(2H，d)，10.31(1H，s)，12.09(1H，s).MS：m/z 464(MH+).
[0142] (S)-4-(3，4-二甲基哌嗪-1-基)苯甲酸甲酯
[0143]
[0144] 25℃下将三乙酰氧基硼氢化钠(2.25g，10.6mmol)加入在甲醇(21ml)中的(S)-4-(3-甲基哌嗪-1-基)苯甲酸甲酯(0.99g，4.24mmol)、甲醛(6.32ml 37％水溶液，84.9mmol)和乙酸(0.49ml，8.49mmol)中。氮气气氛下将所得溶液在环境温度下搅拌18小时。用饱和NaHCO3水溶液将反应混合物碱化并减压浓缩。残余物用EtOAc(200ml)稀释并用饱和NaHCO3水溶液(200ml)连续洗涤。水相用EtOAc(2×75ml)进一步萃取，合并的有机相用水(200ml)和饱和盐水(200ml)洗涤。有机层经MgSO4干燥、过滤并蒸发，得到粗产物。通过快速硅胶层析法(用EtOAc/异己烷(极性从0∶100提高到100∶0)洗脱)纯化粗产物。将纯的组分蒸发至干得到白色固体状的(S)-4-(3，4-二甲基哌嗪-1-基)苯甲酸甲酯(0.538g，51％)。
[0145] 1H NMR(399.9MHz，CDCl3)δ1.14-1.15(3H，m)，2.18-2.26(1H，m)，2.34(3H，s)，2.35-2.41(1H，m)，2.61-2.67(1H，m)，2.87-2.91(1H，m)，2.99-3.06(1H，m)，3.58-3.62(1H，m)，3.66-3.70(1H，m)，3.86(3H，s)，6.84-6.87(2H，m)，7.89-7.93(2H，m).MS：m/z
249(MH+).
249(MH+).
[0146] (S)-4-(3-甲基哌嗪-1-基)苯甲酸甲酯
[0147]
[0148] 25℃下将4-氟苯甲酸甲酯(1.00ml，7.73mmol)加入在DMA(31ml)中 的(S)-(+)-2-甲基哌嗪(1.55g，15.5mmol)中。将所得溶液在氮气气氛、120℃搅拌3天。将反应混合物浓缩并用EtOAc(100ml)稀释，用饱和NaHCO3水溶液(200ml)连续洗涤。水相用EtOAc(2×100ml)进一步萃取，合并的有机物用水(200ml)和饱和盐水(200ml)洗涤。有机层经MgSO4干燥、过滤并蒸发，得到褐色油状的所需(S)-4-(3-甲基哌嗪-1-基)苯甲酸甲酯(0.995g，55％)，其静置后结晶。其不经过进一步纯化而直接使用。
[0149] 1H NMR(399.9MHz，CDCl3)δ1.14-1.15(3H，d)，2.44-2.50(1H，m)，2.80-2.86(1H，m)，2.91-3.03(2H，m)，3.10-3.15(1H，m)，3.67-3.70(2H，m)，3.86(3H，s)，6.85-6.87(2H，m)，7.89-7.93(2H，m)，没有观察到NH。MS：m/z 235(MH+).
[0150] 3-(3，5-二甲氧基苯乙基)-1H-吡唑-5-胺
[0151]
[0152] 用作原料，按照如下制备：
[0153] 将乙腈(2.29ml，43.61mmol，1.2eq)加入氢化钠(1.75g在矿物油中的分散液，43.61mmol，1.2eq)在无水甲苯(70ml)中的浆液中并将所得混合物在室温搅拌30分钟。加入在甲苯(60ml)中的3-(3，5-二甲氧基苯基)丙酸乙酯(8.66g，36.34mmol，1eq)并将反应物回流18小时。冷却后，反应混合物用水骤冷并将溶剂减压蒸发。将残余物溶解于2M HCl(50ml)中。酸性溶液用乙酸乙酯萃取。将有机萃取物合并，用水、盐水洗涤并经硫酸镁干燥。过滤后，将溶剂减压蒸发，得到黄色油状的粗产物。通过硅胶柱层析(用DCM洗脱)纯化该油，合并所需组分，蒸发得到膏状固体(3.76g，44％产率)。
[0154] 向在乙醇(55ml)中的该膏状固体(3.72g，15.96mmol，1eq)中加入水合肼(852μl，17.56mmol，1.1eq)。将反应物回流24小时，之后让其冷却。减压蒸发后，将残余物萃取到DCM中。所得有机层用水、盐水洗涤，经硫酸镁干燥、过滤并减压蒸发，得到浅黄色固体状的3-(3，5-二甲氧基苯乙基)-1H-吡唑-5-胺(3.76g，两步产率42％)。1
[0155] H NMR(300.132MHz，DMSO)δ2.64-2.82(4H，m)，3.71(6H，s)，4.07-4.72(2H，m)，5.20(1H，s)，6.31(1H，t)，6.38(2H，d).MS：m/z 248(MH+)
[0156] 实施例1(b)(i) (R)-N-(3-(3，5-二甲氧基苯乙基)-1H-吡唑-5-基)-4-(3，4-二甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺的制备
[0157]
[0158] 25℃下将三甲基铝(在甲苯中的2M溶液，2.44ml，4.88mmol)滴加入3-(3，5-二甲氧基苯乙基)-1H-吡唑-5-胺(483mg，1.95mmol)和(R)-4-(3，4-二甲基哌嗪-1-基)苯甲酸甲酯(485mg，1.95mmol)在甲苯(10ml)中的悬浮液中。将所得溶液在60℃搅拌18小时。将反应混合物倒入甲醇(50ml)中并用2M盐酸酸化。通过离子交换层析采用SCX柱纯化粗产物。采用7M甲醇铵将所需产物从该柱洗脱并蒸发至干，得到不纯产物。通过制备型HPLC(Waters XTerraC18柱，5μ硅胶，30mm直径，100mm长度)采用1％氨水和乙腈的极性下降混合物作为洗脱剂纯化粗产物。将包含所需化合物的组分蒸发至干，得到白色固体状的(R)-N-(3-(3，5-二甲氧基苯乙基)-1H-吡唑-5-基)-4-(3，4-二甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺(561mg，62％)。
[0159] 1H NMR(399.9MHz，DMSO-d6)δ1.07(3H，d)，2.09-2.14(1H，m)，2.18-2.25(1H，m)，2.22(3H，s)，2.44-2.53(1H，m)，2.77-2.87(2H，m)，2.88(4H，s)，3.65-3.75(2H，m)，3.73(6H，s)，6.34(1H，t)，6.43(2H，d)，6.46(1H，s)，6.96(2H，d)，7.91(2H，d)，10.31(1H，s)，12.09(1H，s).MS：m/z 464(MH+).
[0160] (R)-4-(3，4-二甲基哌嗪-1-基)苯甲酸甲酯
[0161]
[0162] 25℃下将三乙酰氧基硼氢化钠(1.62g，7.63mmol)加入在甲醇(15ml)中的(R)-4-(3-甲基哌嗪-1-基)苯甲酸甲酯(0.715g，3.05mmol)、甲醛(4.54ml 37％水溶液，61mmol)和乙酸(0.35ml，6.10mmol)中。将所得溶液在氮气气氛、环境温度下搅拌18小时。
用饱和NaHCO3水溶液将反应混合物碱化并减压浓缩。反应混合物用EtOAc(200ml)稀释并用饱和NaHCO3水溶液(200ml)连续洗涤。水相用EtOAc(2×75ml)进一步萃取，合并的有机相用水(200ml)和饱和盐水(200ml)洗涤。有机层经MgSO4干燥、过滤并蒸发，得到粗产物。通过快速硅胶层析法(用EtOAc/异己烷(极性从30∶70提高到100∶0)洗脱)纯化粗产物。将纯的组分蒸发至干，得到膏状固体状的(R)-4-(3，4-二甲基哌嗪-1-基)苯甲酸甲酯(0.600g，79％)。
用饱和NaHCO3水溶液将反应混合物碱化并减压浓缩。反应混合物用EtOAc(200ml)稀释并用饱和NaHCO3水溶液(200ml)连续洗涤。水相用EtOAc(2×75ml)进一步萃取，合并的有机相用水(200ml)和饱和盐水(200ml)洗涤。有机层经MgSO4干燥、过滤并蒸发，得到粗产物。通过快速硅胶层析法(用EtOAc/异己烷(极性从30∶70提高到100∶0)洗脱)纯化粗产物。将纯的组分蒸发至干，得到膏状固体状的(R)-4-(3，4-二甲基哌嗪-1-基)苯甲酸甲酯(0.600g，79％)。
[0163] 1H NMR(399.9MHz，CDCl3)δ1.14-1.15(3H，d)，2.19-2.24(1H，m)，2.34(3H，s)，2.35-2.41(1H，m)，2.61-2.67(1H，m)，2.87-2.91(1H，m)，2.99-3.06(1H，m)，3.58-3.62(1H，m)，3.66-3.71(1H，m)，3.86(3H，s)，6.84-6.87(2H，m)，7.89-7.93(2H，m).MS：m/z
249(MH+).
249(MH+).
[0164] (R)-4-(3-甲基哌嗪-1-基)苯甲酸甲酯
[0165]
[0166] 25℃下将4-氟苯甲酸甲酯(0.62ml，4.79mmol)加入在DMA(19ml)中 的(R)-(-)-2-甲基哌嗪(0.96g，9.58mmol)中。将所得溶液在氮气气氛、120℃搅拌50小时。
将反应混合物浓缩并用EtOAc(100ml)稀释，用饱和NaHCO3水溶液(200ml)连续洗涤。水相用EtOAc(2×100ml)进一步萃取，合并的有机物用水(200ml)和饱和盐水(200ml)洗涤。
有机层经MgSO4干燥、过滤并蒸发，得到褐色油状的(R)-4-(3-甲基哌嗪-1-基)苯甲酸甲酯(0.721g，64％)。其不经过进一步纯化而直接使用。
将反应混合物浓缩并用EtOAc(100ml)稀释，用饱和NaHCO3水溶液(200ml)连续洗涤。水相用EtOAc(2×100ml)进一步萃取，合并的有机物用水(200ml)和饱和盐水(200ml)洗涤。
有机层经MgSO4干燥、过滤并蒸发，得到褐色油状的(R)-4-(3-甲基哌嗪-1-基)苯甲酸甲酯(0.721g，64％)。其不经过进一步纯化而直接使用。
[0167] 1H NMR(399.9MHz，CDCl3)δ1.14-1.16(3H，m)，2.45-2.51(1H，m)，2.80-2.87(1H，m)，2.93-3.04(2H，m)，3.11-3.15(1H，m)，3.66-3.71(2H，m)，3.86(3H，s)，6.84-6.88(2H，m)，7.89-7.93(2H，m)，没有观察到NH。MS：m/z235(MH+).
[0168] 实施例1(b)(ii) (R)-N-(3-(3，5-二甲氧基苯乙基)-1H-吡唑-5-基)-4-(3，4-二甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺的其它制备方法
[0169]
[0170] 采用迪安-斯达克仪将5-(3，5-二甲氧基苯乙基)-1H-吡唑-3-胺(159g，0.643mol，1eq)和(R)-4-(3，4-二甲基哌嗪-1-基)苯甲酸甲酯(191g，0.772mol，1.2eq)在
2-甲基四氢呋喃(3500ml)中的溶液加热回流。除去约300ml溶剂并让溶液冷却至70℃。
在30分钟内加入叔戊醇钾的甲苯溶液(25％，1.7M，908ml，1.544mol，2.4eq)。将所得悬浮液加热回流并在Dean-Stark条件下在75分钟内除去总共1.5L溶剂。将悬浮液冷却至
40℃，LC显示完全转化。
2-甲基四氢呋喃(3500ml)中的溶液加热回流。除去约300ml溶剂并让溶液冷却至70℃。
在30分钟内加入叔戊醇钾的甲苯溶液(25％，1.7M，908ml，1.544mol，2.4eq)。将所得悬浮液加热回流并在Dean-Stark条件下在75分钟内除去总共1.5L溶剂。将悬浮液冷却至
40℃，LC显示完全转化。
[0171] 小心加入水(20ml)和2M盐酸(380ml，0.76mol)(从40℃放热到50℃)。形成深色溶液并用乙酸异丙酯(1500ml)将其稀释。分离水层，有机层用水(500ml)和盐水(500ml)洗涤。有机层经硫酸镁干燥并在45℃真空蒸发，留下深色胶状物。加入乙酸异丙酯(960ml)并将所得混合物在55℃旋转60分钟。该胶状物缓慢溶解，有白色固体沉淀。将所得浆液冷却至0℃并搅拌120分钟。过滤收集产物，用冷的乙酸异丙酯(2×400ml)洗涤并在50℃干1
燥120分钟。获得白色固体状的产物(231g，78％)。H NMR(CDCl3)与实施例1(b)(i)的数据一致。LC：99.5％纯度。
燥120分钟。获得白色固体状的产物(231g，78％)。H NMR(CDCl3)与实施例1(b)(i)的数据一致。LC：99.5％纯度。
[0172] (R)-4-(3，4-二甲基哌嗪-1-基)苯甲酸甲酯
[0173] 将(R)-4-(3-甲基哌嗪-1-基)苯甲酸甲酯(218g，0.93mol，1eq)溶解于甲醇(2200ml，10体积)和乙酸(111.7g，1.86mol，2eq)中。加入37％甲醛水溶液(880ml，11.74mol，12.6eq)，有固体沉淀。搅拌混合物同时在1小时内逐份加入三乙酰氧基硼氢化钠(493g，2.33mol，2.5eq)。将温度保持在30℃下。将所得溶液在氮气气氛下搅拌过夜。
[0174] 在45℃下真空除去甲醇并将残余物小心地倒入碳酸氢钠饱和溶液(5000ml)中。将混合物在氮气流下搅拌15分钟，有固体沉淀。所得产物用乙酸异丙酯(2000ml和1500ml)萃取。合并的有机层用饱和碳酸氢钠溶液(1000ml)洗涤并经硫酸镁干燥。将乙酸异丙酯溶液真空浓缩，产物在低体积下开始结晶。过滤收集产物并获得第二批产物(196g，85％)。
1
H NMR(CDCl3)与实施例1(b)(i)的数据一致。LC：99.5％纯度。
1
H NMR(CDCl3)与实施例1(b)(i)的数据一致。LC：99.5％纯度。
[0175] (R)-4-(3-甲基哌嗪-1-基)苯甲酸甲酯
[0176] 37℃下搅拌(R)-2-甲基哌嗪(203g，2.03mol，1.59eq)的DMSO(1200ml，6vol)悬浮液。加入碳酸钾(383g，2.77mol，2.16eq)，搅拌悬浮液同时在20分钟内加入4-氟苯甲酸甲酯(198g，1.28mol，1eq)的DMSO(200ml，1vol)悬浮液。将反应混合物在95℃搅拌24小时。IPC显示剩余不到1％4-氟苯甲酸甲酯。
[0177] 将反应混合物冷却至40℃，用乙酸乙酯(1600ml)稀释并缓慢倒入水(5000ml)中。将混合物搅拌5分钟并让各层分离。水层用乙酸乙酯萃取(1600ml)。合并的有机层用水
1
(1200ml)和盐水(1200ml)洗涤。真空除去溶剂，得到233g白色固体(78％)。H NMR(CDCl3)与实施例1(b)(i)的数据一致。LC：98.4％纯度
1
(1200ml)和盐水(1200ml)洗涤。真空除去溶剂，得到233g白色固体(78％)。H NMR(CDCl3)与实施例1(b)(i)的数据一致。LC：98.4％纯度
[0178] XRD-晶型A
[0179] 采用Bruker D4X-射线衍射仪(X-射线波长 Cu源，电压40kV，丝发射40mA)记录粉末X-射线衍射图谱。采用0.00570°步长(step)和0.03秒/步的时间计数从2-40°2θ对样品进行扫描。
[0180] 在以下位置观察到峰：
[0181]
[0182]
[0183] 晶型A的XRD图谱显示于图1中。
[0184] 酶试验
[0185] FGFR1激酶试验-Caliper Echo给药
[0186] 为了确定对FGFR1活性的抑制，采用Caliper技术进行激酶试验。
[0187] 在Greiner 384孔低容积板(总反应容积为每孔12ul)中进行激酶活性试验。各反应孔中FGFR1活性激酶的最终浓度为7.2nM。各试验用的底物为具有荧光标记的定制肽(13个氨基酸长，KKSRGDYMTMQIG，荧光标记在第一个K)。
[0188] 采用Labcyte Echo 550声波液滴喷射装置将化合物直接分布到试验板中。各孔获得120nl包含化合物的DMSO，使得在加入终止溶液之前试验中的化合物终浓度为30uM-30pM。除了化合物外，各板具有最大和最小对照孔，最大孔包含120nl DMSO，最小孔包含120nl 10mM星形孢菌素(LCLaboratories，MA 01801，USA目录号S-9300)。将所述酶(7.2nM[最终])和底物(3.6uM[最终])分别反应缓冲剂[包含：50mM MOPS(Sigma，目录号M1254)-pH 6.5，0.004％Triton(Sigma，目录号X-100)，2.4mM DTT，12mM MgCl2，408uM ATP]中加入化合物板，导致反应混合物中DMSO终浓度为1％。
[0189] 将试 验板在 室温 下培 养1.5小时，之后通 过加 入缓 冲剂[包 含：100mMHEPES-pH7.5，0.033％Brij-35(Sigma目录号B4184)，0.22％Caliper 3号包被试剂(Caliper Life Sciences目录号760050)，88mM EDTA，5％DMSO]终止反应。接着采用Caliper LC3000(其采用微流测定荧光标记肽和该肽的FGFR1激酶磷酸化形式
之间迁移的滞后)对终止的试验板读数。
之间迁移的滞后)对终止的试验板读数。
[0190] 在该试验中，在一定的浓度范围内对化合物进行测试。采用各浓度的平均数据值连同未处理对照孔和100％抑制对照孔得到抑制率对浓度的图。从该数据，可确定固定浓度下的IC50值或百分抑制率。
[0191] 文中所表达的1uM的百分抑制率是根据试验产生的曲线拟合的计算值。从拟合曲线图将1uM浓度的化合物的效果计算为百分抑制率。IC50为在本试验中抑制50％FGFR1激酶活性的化合物浓度。采用标准曲线拟合软件包OriginTM计算该值。当对化合物测试超过一次时，该IC50值可为几何平均值。
[0192] 实施例1a-IC50 0.00074μM
[0193] 实施例1b-IC50 0.0011μM、0.00064μM、0.00076μM。
[0194] FGFR4激酶分析-Caliper
[0195] 为了确定对FGFR4活性的抑制，采用Caliper技术进行激酶试验。采用FGFR4酶(8μM，目录号PR4380B，Invitrogen)。在Greiner 384孔低容积板(总反应容积为每孔12μl)中进行激酶活性试验。各反应孔中FGFR4活性激酶的最终浓度为25nM。各试验用的底物为具有荧光标记的定制肽(13个氨基酸长，5FAM-EEPLYWSFPAKKK-CONH2)，其序列是FGFR4激酶特异性的。
[0196] 用5％(v/v)DMSO将化合物连续稀释，之后加入试验板中。将所述酶(25nM(最终))和底物(1.5μM(最终))分别在反应缓冲剂(包含：100mM HEPES-pH 7.5，0.004％Triton，1mM DTT(最终)，10mM MnCl2(最终)，30μM ATP(最终))中加入化合物板，导致反应混合物中DMSO终浓度为0.8％。
[0197] 将试验板在室温下温育2小时，之后通过加入缓冲剂(包含：100mMHEPES-pH7.5，0.033％Brij-35，0.22％Caliper 3号包被试剂，40mM EDTA，5％DMSO)终止反应。接着采用Caliper LabChipTM LC3000(其采用微流测定荧光标记肽和该肽的FGFR4激酶磷酸化形式之间迁移的滞后)对终止的试验板读数。
[0198] 在该试验中，在一定的浓度范围内对化合物进行测试。采用各浓度的平均数据值连同未处理对照孔和100％抑制对照孔得到抑制率对浓度的图。从该数据，可确定固定浓度下的IC50值或百分抑制率。
[0199] 实施例1b-IC50 0.022μM、0.016μM、0.016μM。
[0200] 细胞试验
[0201] 细胞FGFR1(ECHO)-采用ECHO技术的瞬时表达的FGFR1IIIc磷酸化的细胞抑制(采用磷酸化特异性一抗和荧光二抗检测)。
[0202] 设计此试验通过采用ArrayScan技术检测固定细胞的抗体染色来检测瞬时表达的FGFR1磷酸化的抑制剂。
[0203] 使Cos-1细胞在包含3％胎牛血清(FCS)、1％L-谷酰胺(Gibco BRL，25030)的DMEM(Gibco BRL，41966)中常规传代至80％汇合。为了进行该试验，在90-95％汇合时采集Cos-1细胞以进行细胞转染。就各96孔板而言，将24μlLipofectamine 2000加入809ul OptiMEM中并在室温培育5分钟。就各96孔板而言，用OptiMEM将20ug 3’FLAG标记的FGFR1/pcDNA3.1(内部克隆15，MSD 4793)稀释至总体积为833μl。将等体积的DNA和Lipofectamine 2000合并(DNA∶脂质＝1∶1.2)并在室温培育20分钟。
[0204] 采用库尔特计数仪对采集的Cos-1细胞计数并用1％FCS/DMEM进一步稀释到5
2.5×10 细胞/ml。就各96孔而言，需要8.33ml细胞。将形成复合物的转染溶液加入细
5
胞溶液中，将细胞以2.5×10 细胞/孔接种到96孔板(Costar，3904)中的含有1％胎牛血清、1％L-谷酰胺的DMEM中并在加湿培养器中在37℃(+5％CO2)培育过夜(24小时)。
2.5×10 细胞/ml。就各96孔而言，需要8.33ml细胞。将形成复合物的转染溶液加入细
5
胞溶液中，将细胞以2.5×10 细胞/孔接种到96孔板(Costar，3904)中的含有1％胎牛血清、1％L-谷酰胺的DMEM中并在加湿培养器中在37℃(+5％CO2)培育过夜(24小时)。
[0205] 第二天，将来自干重样品的化合物溶解于100％DMSO中，得到10mM浓度。将40μl该化合物分散到384Labcyte板(Labcyte目录号P-05525)(包括阳性对照(100％DMSO)、阴性对照(10μM)和参比化合物(250nM))各象限的各孔中。接着将384Labcyte板转移到Hydra以将化合物1∶100稀释到该象限的剩余孔中。采用Quadra从试验板吸取70μl培养液，之后将该板转移到ECHO 550上。将384Labcyte化合物板也转移到ECHO 550上。转移到ECHO 550上的试验板的化合物在以下浓度范围：1)10μM、2)3μM、3)1μM、4)0.3μM、5)0.1μM、6)0.01。
[0206] 轻轻敲击板以将化合物和细胞培养液混合并在37℃、5％CO2培育1小时。
[0207] 采用真空吸引将培养基从各孔中除去；通过向各孔中加入50μl 100％甲醇将细胞固定并在室温培育20分钟。接着除去固定剂溶液并用200μl磷酸缓冲盐水(PBS/A)洗涤各孔一次，再通过加入50μl/孔0.1％triton/PBS/A在室温下将细胞透化处理20分钟。接着除去透化处理溶液并用200μl/孔PBS/A再洗涤细胞一次，之后向各孔中加入40μl
1/1000一抗溶液(Cell SignallingTechnologies#CS3476；在含有10％FCS+0.1％Tween20的PBS/A中稀释的小鼠抗磷酸FGFRl)。
1/1000一抗溶液(Cell SignallingTechnologies#CS3476；在含有10％FCS+0.1％Tween20的PBS/A中稀释的小鼠抗磷酸FGFRl)。
[0208] 在室温培育1小时后，除去抗体溶液并用200μl/孔PBS/A将各孔洗涤一次。接着加入40μl 1/500二抗(A11005；山羊抗小鼠594)溶液和1/10000Hoechst(在含有10％FCS+0.1％Tween 20的PBS/A中一起稀释)并将该板在室温下、黑暗中培育1小时。最后，用200μl/孔PBS/A将各板洗涤一次，将最后的洗涤剂留在各孔中，之后将各板密封。用Arrayscan(Cellomics)对各板读数。采用从板内的未给剂量(最大)和对照化合物(最小)孔获得的Channel 2(594nm)值设定0％和100％化合物抑制的边界。将化合物数据对这些值归一化以确定测试化合物对磷酸化的FGFR1产生50％抑制的稀释范围。
[0209] 实施例1b-IC50＜0.01μM、0.0011μM、0.0022μM、0.0048μM。
[0210] 细胞FGFR2(ECHO)试验
[0211] 采用ECHO技术的组成型表达的FGFR2磷酸化的细胞抑制(采用磷酸-特异性一抗和荧光二抗检测)。
[0212] 该试验通过采用ArrayScan技术检测固定细胞的抗体染色而可用于检测组成型表达的FGFR2磷酸化的抑制剂。使SUM52-PE细胞在包含10％胎牛血清(FCS)、1％L-谷酰胺(Gibco BRL，25030)的RPMI 1640(Gibco BRL，31870)中常规传代至70％汇合。采用库5
尔特计数仪对采集的SUM52-PE细胞计数并用1％FCS/RPMI 1640进一步稀释到1.5×10 细胞/mL。就各96孔板而言，需要10mL细胞。将100μL细胞悬浮液加到96孔板(Costar，
3904)的各孔中并在加湿培养器中在37℃(+5％CO2)培育过夜(24小时)。第二天，将来自干重样品的化合物溶解于100％DMSO中，得到100μM浓度。将40μL该化合物溶液分散到384Labcyte板(Labcyte目录号P-05525)的各象限的各孔中(包括阳性对照(100％DMSO)、阴性对照(10μM)和参比化合物(250nM)-1-叔丁基-3-[2-{[3-(二乙基氨基)丙基]氨基}-6-(3，5-二甲氧基苯基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]脲-PD173074-可商品化购得的FGFR抑制剂)。接着将384Labcyte板转移到Hydra以将化合物1∶100稀释到该象限的剩余孔中。采用Quadra从该试验板吸取70μl培养液，之后将该板转移到ECHO 550上。将384Labcyte化合物板也转移到ECHO 550上。转移到ECHO 550上的试验板的化合物在以下浓度范围：(1)100nM、(2)33.3nM、(3)11.1nM、(4)3.70nM、(5)1.23nM、(6)0.41nM。
轻轻敲击板以将化合物和细胞培养液混合并在37℃、5％CO2培育1小时。采用真空吸引将培养基从各孔中除去；通过向各孔中加入50μl100％甲醇将细胞固定并在RT培育20分钟。接着除去固定剂溶液并用200μl磷酸缓冲盐水(PBS/A)洗涤各孔一次，再通过加入
50μl/孔0.1％triton/PBS/A在RT下将细胞透化处理20分钟。接着除去透化处理溶液并用200μl/孔PBS/A再洗涤细胞一次，之后向各孔中加入40μl1/1000一抗溶液(Cell Signalling Technologies#CS3476；在含有10％FCS+0.1％Tween20的PBS/A中稀释的小鼠抗磷酸FGFR)。在RT培育1小时后，除去抗体溶液并用200μl/孔PBS/A将各孔洗涤一次。接着加入40μl1/500二抗(A11005；山羊抗小鼠594)溶液和1/10000Hoechst(在含有10％FCS+0.1％Tween 20的PBS/A中一起稀释)并将该板在RT、黑暗中培育1小时。最后，用200μl/孔PBS/A将各板洗涤一次，将最后的洗涤剂留在各孔中，之后将各板密封。用Arrayscan(Cellomics)对各板读数。采用从板内的未给剂量(最大)和对照化合物(最小)孔获得的Channel 2(594nm)值设定0％和100％化合物抑制的边界。
尔特计数仪对采集的SUM52-PE细胞计数并用1％FCS/RPMI 1640进一步稀释到1.5×10 细胞/mL。就各96孔板而言，需要10mL细胞。将100μL细胞悬浮液加到96孔板(Costar，
3904)的各孔中并在加湿培养器中在37℃(+5％CO2)培育过夜(24小时)。第二天，将来自干重样品的化合物溶解于100％DMSO中，得到100μM浓度。将40μL该化合物溶液分散到384Labcyte板(Labcyte目录号P-05525)的各象限的各孔中(包括阳性对照(100％DMSO)、阴性对照(10μM)和参比化合物(250nM)-1-叔丁基-3-[2-{[3-(二乙基氨基)丙基]氨基}-6-(3，5-二甲氧基苯基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]脲-PD173074-可商品化购得的FGFR抑制剂)。接着将384Labcyte板转移到Hydra以将化合物1∶100稀释到该象限的剩余孔中。采用Quadra从该试验板吸取70μl培养液，之后将该板转移到ECHO 550上。将384Labcyte化合物板也转移到ECHO 550上。转移到ECHO 550上的试验板的化合物在以下浓度范围：(1)100nM、(2)33.3nM、(3)11.1nM、(4)3.70nM、(5)1.23nM、(6)0.41nM。
轻轻敲击板以将化合物和细胞培养液混合并在37℃、5％CO2培育1小时。采用真空吸引将培养基从各孔中除去；通过向各孔中加入50μl100％甲醇将细胞固定并在RT培育20分钟。接着除去固定剂溶液并用200μl磷酸缓冲盐水(PBS/A)洗涤各孔一次，再通过加入
50μl/孔0.1％triton/PBS/A在RT下将细胞透化处理20分钟。接着除去透化处理溶液并用200μl/孔PBS/A再洗涤细胞一次，之后向各孔中加入40μl1/1000一抗溶液(Cell Signalling Technologies#CS3476；在含有10％FCS+0.1％Tween20的PBS/A中稀释的小鼠抗磷酸FGFR)。在RT培育1小时后，除去抗体溶液并用200μl/孔PBS/A将各孔洗涤一次。接着加入40μl1/500二抗(A11005；山羊抗小鼠594)溶液和1/10000Hoechst(在含有10％FCS+0.1％Tween 20的PBS/A中一起稀释)并将该板在RT、黑暗中培育1小时。最后，用200μl/孔PBS/A将各板洗涤一次，将最后的洗涤剂留在各孔中，之后将各板密封。用Arrayscan(Cellomics)对各板读数。采用从板内的未给剂量(最大)和对照化合物(最小)孔获得的Channel 2(594nm)值设定0％和100％化合物抑制的边界。
[0213] 细胞FGFR3(ECHO)分析
[0214] 采用ECHO技术的瞬时表达的FGFR3IIIc磷酸化的细胞抑制(采用磷酸-特异性一抗和荧光二抗)。
[0215] 该试验通过采用ArrayScan技术检测固定细胞的抗体染色而可用于检测瞬时表达的FGFR3磷酸化的抑制剂。使Cos-1细胞在包含3％胎牛血清(FCS)、1％L-谷酰胺(Gibco BRL，25030)的DMEM(Gibco BRL，41966)中常规传代至80％汇合。为了进行该试验，在90-95％汇合时采集Cos-1细胞以进行细胞转染。就各96孔板而言，将24μl Lipofectamine 2000加入809μlOptiMEM中并在RT培育5分钟。就各96孔板而言，用OptiMEM将20μg 3’FLAG标记的FGFR3/pcDNA3.2全长FGFR3稀释至总体积为833μl。将等体积的DNA和Lipofectamine 2000合并(DNA∶脂质＝1∶1.2)并在RT培育20分钟。5
采用库尔特计数仪对采集的Cos-1细胞计数并用1％FCS/DMEM进一步稀释到2.5×10 细胞/ml。就各96孔而言，需要8.33ml细胞。将形成复合物的转染溶液加入细胞溶液中，将
4
细胞以2.1×10 细胞/孔接种到在96孔板(Costar，3904)中含有1％胎牛血清、1％L-谷酰胺的DMEM中并在加湿培养器中在37℃(+5％CO2)培育过夜(24小时)。第二天，将来自干重样品的化合物溶解于100％DMSO中，得到10mM浓度。将40μl该化合物溶液分散到
384Labcyte板(Labcyte目录号P-05525)的各象限的各孔中(包括阳性对照(100％DMSO)、阴性对照(10μM)和参比化合物(250nM)-1-叔丁基-3-[2-{[3-(二乙基氨基)丙基]氨基}-6-(3，5-二甲氧基苯基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]脲-PD173074-可商品化购得的FGFR抑制剂)。接着将384Labcyte板转移到Hydra以将化合物1∶100稀释到该象限的剩余孔中。采用Quadra从该试验板吸取70μl培养液，之后将该板转移到ECHO 550上。
将384Labcyte化合物板也转移到ECHO 550上。转移到ECHO 550上的试验板的化合物在以下浓度范围：(1)10μM、(2)3μM、(3)1μM、(4)0.3μM、(5)0.1μM和(6)0.01μM。轻轻敲击板以将化合物和细胞培养液混合并在37℃、5％CO2培育1小时。
采用库尔特计数仪对采集的Cos-1细胞计数并用1％FCS/DMEM进一步稀释到2.5×10 细胞/ml。就各96孔而言，需要8.33ml细胞。将形成复合物的转染溶液加入细胞溶液中，将
4
细胞以2.1×10 细胞/孔接种到在96孔板(Costar，3904)中含有1％胎牛血清、1％L-谷酰胺的DMEM中并在加湿培养器中在37℃(+5％CO2)培育过夜(24小时)。第二天，将来自干重样品的化合物溶解于100％DMSO中，得到10mM浓度。将40μl该化合物溶液分散到
384Labcyte板(Labcyte目录号P-05525)的各象限的各孔中(包括阳性对照(100％DMSO)、阴性对照(10μM)和参比化合物(250nM)-1-叔丁基-3-[2-{[3-(二乙基氨基)丙基]氨基}-6-(3，5-二甲氧基苯基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]脲-PD173074-可商品化购得的FGFR抑制剂)。接着将384Labcyte板转移到Hydra以将化合物1∶100稀释到该象限的剩余孔中。采用Quadra从该试验板吸取70μl培养液，之后将该板转移到ECHO 550上。
将384Labcyte化合物板也转移到ECHO 550上。转移到ECHO 550上的试验板的化合物在以下浓度范围：(1)10μM、(2)3μM、(3)1μM、(4)0.3μM、(5)0.1μM和(6)0.01μM。轻轻敲击板以将化合物和细胞培养液混合并在37℃、5％CO2培育1小时。
[0216] 采用真空吸引将培养基从各孔中除去；通过向各孔中加入50μl 100％甲醇将细胞固定并在RT培育20分钟。接着除去固定剂溶液并用200μl磷酸缓冲盐水(PBS/A)洗涤各孔一次，再通过加入50μl/孔0.1％triton/PBS/A在RT下将细胞透化处理20分钟。接着除去透化处理溶液并用200μl/孔PBS/A再洗涤细胞一次，之后向各孔中加入40μl 1/1000一抗溶液(Cell Signalling Technologies#CS3476；在含有10％FCS+0.1％Tween20的PBS/A中稀释的小鼠抗磷酸FGFR1)。在RT培育1小时后，除去抗体溶液并用
200μl/孔PBS/A将各孔洗涤一次。接着加入40μl1/500二抗(A11005；山羊抗小鼠594)溶液和1/10000Hoechst(在含有10％FCS+0.1％Tween 20的PBS/A中一起稀释)并将该板在RT、黑暗中培育1小时。最后，用200μl/PBS/A将各板洗涤一次，将最后的洗涤剂留在各孔中，之后将各板密封。用Arrayscan(Cellomics)对各板读数。采用从板内的未给剂量(最大)和对照化合物(最小)孔获得的Channel 2(594nm)值设定0％和100％化合物抑制的边界。将化合物数据对这些值归一化以确定测试化合物对磷酸化的FGFR 3产生50％抑制的稀释范围。
200μl/孔PBS/A将各孔洗涤一次。接着加入40μl1/500二抗(A11005；山羊抗小鼠594)溶液和1/10000Hoechst(在含有10％FCS+0.1％Tween 20的PBS/A中一起稀释)并将该板在RT、黑暗中培育1小时。最后，用200μl/PBS/A将各板洗涤一次，将最后的洗涤剂留在各孔中，之后将各板密封。用Arrayscan(Cellomics)对各板读数。采用从板内的未给剂量(最大)和对照化合物(最小)孔获得的Channel 2(594nm)值设定0％和100％化合物抑制的边界。将化合物数据对这些值归一化以确定测试化合物对磷酸化的FGFR 3产生50％抑制的稀释范围。
[0217] 细胞FGFR4(ECHO)分析
[0218] 采用ECHO技术的瞬时表达的FGFR4磷酸化的细胞抑制(采用磷酸-特异性一抗和荧光二抗)。
[0219] 该试验通过采用ArrayScan技术检测固定细胞的抗体染色而可用于检测瞬时表达的FGFR4磷酸化的抑制剂。使Cos-1细胞在包含3％胎牛血清(FCS)、1％L-谷酰胺(Gibco BRL，25030)的DMEM(Gibco BRL，41966)中常规传代至80％汇合。为了进行该试验，在90-95％汇合时采集Cos-1细胞以进行细胞转染。就各96孔板而言，将24μl Lipofectamine 2000加入809μlOptiMEM中并在室温培育5分钟。就各96孔板而言，用OptiMEM将20μg3’FLAG标记的FGFR4/pcDNA3.1(MSD 6273)稀释至总体积为833μl。将等体积的DNA和Lipofectamine 2000合并(DNA∶脂质＝1∶1.2)并在室温培育20分钟。
[0220] 采用库尔特计数仪对采集的Cos-1细胞计数并用1％FCS/DMEM进一步稀释到5
1.2×10 细胞/ml。就各96孔而言，需要8.33ml细胞。将形成复合物的转染溶液加入细
4
胞溶液中，将细胞以1.0×10 细胞/孔接种到96孔板(Biocoat#6640)中含有1％胎牛血清、1％L-谷酰胺的DMEM中并在加湿培养器中在37℃(+5％CO2)培育过夜(24小时)。
1.2×10 细胞/ml。就各96孔而言，需要8.33ml细胞。将形成复合物的转染溶液加入细
4
胞溶液中，将细胞以1.0×10 细胞/孔接种到96孔板(Biocoat#6640)中含有1％胎牛血清、1％L-谷酰胺的DMEM中并在加湿培养器中在37℃(+5％CO2)培育过夜(24小时)。
[0221] 第二天，将来自干重样品的化合物溶解于100％DMSO中，得到10mM浓度。将40μl该化合物溶液分散到384Labcyte板(Labcyte目录号P-05525)的各象限的各孔中(包括阳性对照(100％DMSO)、阴性对照(10μM)和参比化合物(250nM))。接着将384Labcyte板转移到Hydra以将化合物1∶100稀释到该象限的剩余孔中。采用Quadra从该试验板吸取70μl培养液，之后将该板转移到ECHO 550上。将384Labcyte化合物板也转移到ECHO 550上。转移到ECHO 550上的试验板的化合物在以下浓度范围：(1)10μM、(2)3μM、(3)1μM、(4)0.5μM、(5)0.1μM、(6)0.03μM、(7)0.01μM、(8)0.001μM。
[0222] 轻轻敲击板以将化合物和细胞培养液混合并在37℃、5％CO2培育1小时。
[0223] 采用真空吸引将培养基从各孔中除去；通过向各孔中加入50μl100％甲醇将细胞固定并在室温培育20分钟。接着除去固定剂溶液并用200μl磷酸缓冲盐水(PBS/A)洗涤一次，再通过加入50μl/孔0.1％triton/PBS/A在室温下将细胞透化处理20分钟。接着除去透化处理溶液并用100μL/孔PBS/A洗涤细胞4次，之后向各孔中加入40μl
1/1000一抗溶液(Cell SignallingTechnologies#CS3476；在含有10％FCS+0.1％Tween20的PBS/A中稀释的小鼠抗磷酸FGFR1)。在室温培育1小时后，除去抗体溶液并用100μL/孔PBS/A将各孔洗涤4次。接着加入40μl 1/500二抗(A11005；山羊抗小鼠594)溶液和1/10000Hoechst(在含有10％FCS+0.1％Tween 20的PBS/A中一起稀释)并将该板在室温下、黑暗中培育1小时。最后，用100μl/孔PBS/A将各板洗涤4次，接着加入PBS/A
200μL/孔，之后将各板密封。用在Arrayscan(Cellomics)对各板读数。采用从板内的未给剂量(最大)和对照化合物(最小)孔获得的Channel 2(594nm)值设定0％和100％化合物抑制的边界。将化合物数据对这些值归一化以确定测试化合物对磷酸化的FGFR4产生
50％抑制的稀释范围。
1/1000一抗溶液(Cell SignallingTechnologies#CS3476；在含有10％FCS+0.1％Tween20的PBS/A中稀释的小鼠抗磷酸FGFR1)。在室温培育1小时后，除去抗体溶液并用100μL/孔PBS/A将各孔洗涤4次。接着加入40μl 1/500二抗(A11005；山羊抗小鼠594)溶液和1/10000Hoechst(在含有10％FCS+0.1％Tween 20的PBS/A中一起稀释)并将该板在室温下、黑暗中培育1小时。最后，用100μl/孔PBS/A将各板洗涤4次，接着加入PBS/A
200μL/孔，之后将各板密封。用在Arrayscan(Cellomics)对各板读数。采用从板内的未给剂量(最大)和对照化合物(最小)孔获得的Channel 2(594nm)值设定0％和100％化合物抑制的边界。将化合物数据对这些值归一化以确定测试化合物对磷酸化的FGFR4产生
50％抑制的稀释范围。
[0224] 实施例1b-IC50 0.029μM、0.033μM、0.045μM、0.028μM。
[0225] 细胞色素P450抑制试验
[0226] 采用从Crespi改进的自动荧光终点体外试验评估测试化合物对5种人细胞色素P450(CYP)同种型(1A2、2C9、2C 19、3A4和2D6)的抑制潜能(Crespi和Stresser，J Pharmacol Toxicol Methods 2000，44：325-331)。此试验中采用表达人CYP各同种型的酵母细胞系制备的微粒体亚细胞组分作为酶源。通过在NADPH存在下大量香豆素底物生物转化成荧光代谢物来确定这5种主要人CYP的活性。对这些CYP的抑制导致形成的荧光代谢物数量下降。比较各种浓度的测试化合物存在下和其不存在下观察到的荧光以计算IC50值。进行初步试验以优化该试验的动力学参数，这些已列于表1。在磷酸盐缓冲液pH7.4中制备各CYP及其各自底物的储备溶液(参见表1)并将178μl加入黑色实心平底300μl96孔微量滴定板(Corning Costar)的各孔。利用DMSO/乙腈连续稀释测试化合物并加入(2μl)反应中，使得最终浓度为0.1、0.3、1、3和10μM。在37℃预培育5分钟后，通过加入NADPH(20μl，浓度示于表1)使反应开始。各培育的最终溶剂浓度＜＝2％(1％来自测试化合物而最多1％来自底物)。各实验中包括合适溶剂对照和底物空白以评估对照物活性并鉴定测试化合物的任何固有荧光。此外，包括各CYP的已知抑制剂作为阳性对照(抑制剂浓度和预计的IC50范围参见表3)。在确定的时间点(参见表1)通过用100μl溶剂(乙腈∶0.5M Tris缓冲液80∶20v/v)骤冷使反应终止。用荧光计(Spectrafluor Plus)在合适的激发和发射波长(列于表2中)下对各板读数并将百分活性(已根据对照作了校正)对测试化合物的浓度作图。接着从这些图的斜率确定各CYP的IC50(抑制50％代谢活性所需的测试化合物浓度)。
[0227]
[0228] 表1：试验试剂的浓度和试验条件
[0229]
[0230] 表2：Spectrafluor Plus荧光计检测荧光代谢物所用的激发和发射波长。CEC和HFC购自Ultrafine Chemicals；CHC购自Molecular Probes；MFC，MAMC，HAMC和BFC购自Gentest Corporation。
[0231]
[0232] 表3：5种人CYP同种型各自的已知抑制剂和优化的试验条件。氟伏沙明购自Tocris Cookson Ltd；磺胺苯吡唑和奎尼丁购自Sigma；奥美拉唑购自AstraZeneca；酮康唑购自Ultrafine Chemicals。
[0233] 结果
[0234]
[0235] 结论：本发明的对映体(enatiomer)化合物在显示良好FGFR抑制的同时，还在其细胞色素P450抑制上显示出差异。细胞色素P450的低抑制是改善潜在药物：药物相互作用所需的。
[0236] 物理特性测试和方法
[0237] 蛋白结合
[0238] 通过平衡透析确定蛋白结合。20μM浓度化合物用10％血浆在37℃透析18小时。采用与质谱峰鉴定联用的普通HPLC-UV法对所得样品进行分析。报道的K1值是第一表观缔合常数[蛋白配体]/([蛋白][配体])，所有浓度以摩尔/升测定(J.Med.Chem.，2006，
49(23)，6672-6682)。
49(23)，6672-6682)。
[0239] 蛋白结合可在高通量筛中通过与液相色谱和质谱结合的平衡透析测定(Wan，H.和Rehngren，M.，J.Chromatogr.A 2006，1102，125-134).
[0240] 实施例1a：0.91％游离(大鼠)
[0241] 实施例1b：0.62％游离(大鼠)
[0242] 实施例1a：3.72％游离(人)
[0243] 实施例1b：2.79％游离(人)
[0244] 结论：蛋白结合减少表明有更多的游离药物(未结合的)。这可能是有利的，因为可能会有更多的药物在靶位置起作用。
[0245] 清除率：
[0246] 对于0.927mg/kg(2umol/kg)的大鼠剂量，在20％DMA∶80％索伦森氏缓冲液(sorensens buffer)pH5中配制浓度为1umol/ml的化合物。将各制剂给予(2mL/kg)自由进食的四只雄鼠(250-300g)。在给药后5和20分钟、1和4小时时从两只大鼠的尾静脉采集血液样品，在10和40分钟、2和6小时从另两只大鼠的尾静脉采集血液样品。在12小时从第一对大鼠和24小时从第二对采集末次样品。在分析之前用水以1∶1稀释血液样品。
[0247] 对于0.927mg/kg(2umol/kg)的狗剂量，在10％DMSO∶90％羟基-丙基-β-环糊精(25％w/v)索伦森氏缓冲液pH5中配制浓度为2umol/ml的化合物。将各制剂给予(1mL/kg)禁食过夜的雄狗和雌狗(8-15kg)。在给药后5、10、20和40分钟、1、2、4、6、12和24小时时从颈静脉采集血液样品。在分析之前用水以1∶1稀释血液样品。
[0248] 通过掺加空白样品(1∶1血液∶水)制备覆盖浓度范围(0.001umol/L-10umol/L)的一组10个校正标准。利用固相萃取板萃取样品和标准物，在氮气气氛下吹扫，接着在甲醇∶水(20∶80)中重建。采用LC-MSMS对样品进行分析，利用获得的结果确定各化合物从0时间到无限[AUC0-inf(微克.小时/毫升)]的曲线下面积、清除率[C1(毫升/分钟/千克)]和稳态体积分布[Vss(升/千克)]。
[0249] 雄鼠数据
[0250]
[0251] 雄狗数据
[0252]
[0253] 雌狗数据
[0254]
[0255] 结论：清除率降低表明药物保留更长时间。这可能是有利的，因为可能从更低的药物剂量达到并保持药效所需的药物接触程度。
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