适用于HPV和乙型肝炎感染的疫苗组合物以及其制备方法
阅读：353发布：2021-06-07
专利汇可以提供适用于HPV和乙型肝炎感染的疫苗组合物以及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 描述一种适用于乙型 肝炎 病毒以及人 乳头 瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染的 疫苗 组合物，其包含HPV 抗原 与赋予较强免疫原性的病毒或细菌蛋白的嵌合融合物。，下面是适用于HPV和乙型肝炎感染的疫苗组合物以及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种疫苗组合物，其包含人乳头瘤病毒(HPV)抗原与赋予较强免疫原性的病毒或细菌蛋白的嵌合融合物，所述疫苗组合物适用于乙型肝炎病毒以及HPV感染。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述HPV抗原选自包含但不限于
HPV16、HPV18、HPV6、HPV11、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68的群组。
3.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中包含所述HPV抗原的完整/部分序列/突变体/变异体的所述抗原性组合物选自包含以下各项的清单：L1、L2、E2、E5、E6和E7抗原，或者所述抗原的特异性T细胞或B细胞表位，这些是单一序列，或者是与细菌/病毒蛋白的在投予宿主时能够诱导强抗体应答的嵌合融合物中的串联重复序列。
4.根据权利要求3所述的免疫原性组合物，其中所述病毒和细菌蛋白选自包括但不限于以下各项的清单中的一种或者组合或者来源于清单中蛋白质的表位：乙型肝炎抗原，例如乙型肝炎核心抗原、乙型肝炎小抗原；失活的破伤风类毒素；白喉类毒素；大肠杆菌不耐热毒素；霍乱毒素；绿脓杆菌外毒素A；志贺毒素；李斯特菌素。
5.根据权利要求4所述的免疫原性组合物，其中所述抗原性组合物由HPV抗原与乙型肝炎小抗原(HbsAg)的嵌合融合物组成。
6.根据权利要求3所述的免疫原性组合物，其中所述HPV抗原包含例如L1和L2等衣
壳蛋白的完整或部分序列/表位，或者来源于其L1和/或L2的多肽，且与所述HbsAg融合，例如SEQ ID NO.3到SEQ ID NO.13中所示。
7.根据权利要求3所述的免疫原性组合物，其中所述HPV抗原包含单独或组合形式的例如E2、E5、E6和E7等HPV早期蛋白的完整/部分序列/突变体/变异体/表位，例如SEQ ID No.1和2中所示。
8.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述HPV抗原与所述乙型肝炎小抗原的N末端或C末端或者开放阅读框内的任何区域融合，其中在所述两个序列之间添加有或不添加连接子序列。
9.一种表达上述根据权利要求1所述的HPV和HPV-HBsAg嵌合抗原的方法，其包含培养经根据权利要求1所述的抗原/融合抗原转化的宿主细胞，从所述宿主细胞中分离出所述重组蛋白并纯化。
10.根据权利要求9所述的方法，其中上述HPV抗原在所述宿主中重组表达为细胞内蛋白或分泌蛋白，所述宿主是原核或真核表达系统，优选酵母。
11.一种药物组合物，其包含有效量的适用作疫苗的根据权利要求1至10所述的抗原性组合物，以及药学上可接受的载剂。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述抗原的用量在每剂10μg到
1000μg所述蛋白质的范围内，优选介于10μg到200μg之间，最优选介于10μg到100μg之间。
13.根据权利要求11和12所述的药物组合物，其另外包含适合的佐剂，所述佐剂选自以下各项中的至少一种：氢氧化铝、磷酸铝、单磷酰脂A、其它有机亲脂性化合物、含有CpG和非CpG的低聚核苷酸、细胞因子。
14.一种引发对于根据前述权利要求中任一权利要求所述的抗原性组合物的保护性抗体应答和/或细胞毒性T细胞应答的方法，其包含借助例如经口、粘膜或肠胃外投药途径等途径中的至少一种途径，将所述组合物投予需要所述治疗的个体。
15.根据权利要求14所述的方法，其中上述抗原性组合物的递送是以药学上可接受的生物可降解聚合物实现。
16.一种上述抗原制剂的用途，其是用于预防性或治疗性治疗哺乳动物、尤其是人类的乳头瘤病毒感染和相关的癌症风险。
适用于HPV和乙型肝炎感染的疫苗组合物以及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及包含单独或组合使用的人乳头瘤病毒(HPV)抗原和来源于所述抗原的多肽并作为与细菌或病毒抗原的嵌合融合物形式的组合物，其可用于预防性和/或治疗性治疗哺乳动物、尤其是人类的HPV以及乙型肝炎感染。
[0002] 本发明涉及一种药物制剂，其能够引发针对人乳头瘤病毒感染(HPV)的保护性抗体应答和细胞毒性T细胞应答。免疫原性制剂包含纯化的重组HPV抗原于稳定制剂中。本发明还论述了使用单价、二价和多价嵌合疫苗引发保护性抗体应答和细胞毒性T细胞应答的方法。配制的免疫原性组合物适于在体内投予人类。
背景技术
[0003] 人乳头瘤病毒(HPV)是感染鳞状上皮细胞和粘膜上皮细胞的双链DNA病毒。由“高风险”或致癌的HPV类型引起的恶性上皮肿瘤可能进展成恶性子宫颈癌(博斯(Bosch)和德圣荷西(de Sanjose)，2003)。HPV的持续感染与进展到侵袭性癌显著相关。“高风险”基因型可在低级别鳞状上皮内病变(low grade squamous intraepitheliallesion，LSIL)到恶性肿瘤间有差别地进展(斯奇利特(Schlecht)等人，2003)。HPV是子宫颈癌的主要病因，据悉，约99.7％的子宫颈癌病例都具有持续的HPV感染(沃布梅斯(Walboomers)等人，1999)。HPV感染常发生于性活跃的年轻女性中间，并且超过95％的易发感染似乎都会在一段时间内自发消退。不到5％感染HPV16的女性发展成侵袭性子宫颈癌(斯奇利特(Schlecht)等人，2003)。
[0004] 截至目前，已经借助分子方法鉴别出近100类HPV，并且超过35类HPV是在生殖道中鉴别出来的，在大多数国家，50％到60％的子宫颈癌病例是由HPV16引起，其次为HPV18(10％到20％)以及HPV 31和45(各4％到5％)。因此，在所有地理区域，HPV16是最常见的类型，HPV18紧随其后，特别是在东南亚更为普遍。虽然在世界范围内，此种模式常见于鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)，但对于腺癌(adenocarcinoma，ADC)来说，HPV18是最主要的，其次为HPV16(卡利福德(Clifford)等人，2003)。流行病学研究显示，存在数种HPV基因型的混合感染。
[0005] 其它研究也证实，与其它高风险HPV基因型相比较，HPV 16的持续性更强(理查德森(Richardson)等人，2003；朗德斯博(Londesborough)等人，1996)，并且进展成CIN3的可能性更大。因此，在基于HPV的子宫颈筛查程序中，基因分型可在分开需要密切监督的HPV16(也可能是HPV18和其它基因型)阳性LSIL病例与感染其它高风险基因型的LSIL病例时起到诊断作用(卡利福德(Clifford)等人，2005)。
[0006] 基于有关年龄和类型特异性HPV感染分布的可用流行病学数据的疫苗接种策略可形成开发有效疫苗以控制和根治人乳头瘤病毒感染的基础。赋予针对多种基因型的广泛保护性功效的候选疫苗应成为进行有效疫苗接种的策略。使用L1衣壳蛋白的可用疫苗对于HPV16、HPV18、HPV6和HPV11具有类型特异性，但不能充分保护由例如HPV31、HPV35、HPV52、HPV58等也与进展成子宫颈癌相关的其它基因型所引起的感染。目前，还没有能够提供针对多种HPV基因型的交叉保护的HPV疫苗。
[0007] 包含重组HPV L1病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)的两种预防性疫苗已经获得批准。这两种疫苗仅靶向约15种已知致癌性HPV类型中的两种。尽管约70％的子宫颈癌病例是由这两种类型引起，而且有证据显示，对其它密切相关的类型存在某种程度的交叉保护，但当前这些疫苗的成本阻碍了持续的全球传递，尤其是在HPV感染发生率很高的第三世界国家。
发明内容
[0008] 因此，本发明提供一种适用于乙型肝炎病毒以及人乳头瘤病毒(HPV)感染的疫苗组合物，其包含HPV抗原与赋予较强免疫原性的病毒或细菌蛋白的嵌合融合物。
[0009] HPV抗原可选自包含(但不限于)以下各项的群组：HPV16、HPV18、HPV6、HPV11、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68。
[0010] 包含HPV抗原的完整/部分序列/突变体/变异体的抗原性组合物可选自包含以下各项的清单：L1、L2、E2、E5、E6和E7抗原，或者所述抗原的特异性T细胞或B细胞表位，这些可以是单一序列，或者是与细菌/病毒蛋白的在投予宿主时能够诱发强抗体应答的嵌合融合物中的串联重复序列。
[0011] 所述病毒和细菌蛋白可选自包括(但不限于)以下各项的清单中的一种或者组合或者来源于清单中蛋白质的表位：乙型肝炎抗原(例如乙型肝炎核心抗原、乙型肝炎小抗原)、失活的破伤风类毒素(tetanus toxoid)、白喉类毒素(diphtheria toxoid)、大肠杆菌不耐热毒素、霍乱毒素(cholera toxin)、绿脓杆菌外毒素A(Pseudomonas exotoxinA)、志贺毒素(Shiga toxin)、李斯特菌素(listerolysin)。
[0012] 抗原性组合物是由HPV抗原与乙型肝炎小抗原(HbsAg)的嵌合融合物组成。
[0013] HPV抗原包含例如L1和L2等衣壳蛋白的完整或部分序列/表位，或者来源于其L1和/或L2的多肽，且与HbsAg融合，如SEQ ID NO.3到SEQ ID NO.13中所示。
[0014] HPV抗原包含单独或组合形式的HPV早期蛋白(例如E2、E5、E6和E7)的完整/部分序列/突变体/变异体/表位，如SEQ ID No.1和2所示。
[0015] HPV抗原与乙型肝炎小抗原的N末端或C末端或者开放阅读框内的任何区域融合，其中在这两个序列之间添加有或不添加连接子序列。
[0016] 根据本发明另一方面，提供一种表达上述技术方案1的HPV和HPV-HBsAg嵌合抗原的方法，其包含培养经技术方案1的抗原/融合抗原转化的宿主细胞，从所述宿主细胞中分离出重组蛋白并纯化。
[0017] 上述HPV抗原可在宿主中重组表达为细胞内蛋白或分泌蛋白，所述宿主可以是原核或真核表达系统，优选酵母。
[0018] 一种药物组合物，其包含有效量的可用作疫苗的如上文所揭示的抗原性组合物，以及药学上可接受的载剂。
[0019] 抗原的用量在每剂10μg到1000μg蛋白质的范围内，优选介于10μg到200μg之间，最优选介于10μg到100μg之间。
[0021] 一种引发对于根据前述技术方案中任一技术方案所述的抗原性组合物的保护性抗体应答和/或细胞毒性T细胞应答的方法，其包含借助例如经口、粘膜或肠胃外投药途径等途径中的至少一种途径，将所述组合物投予需要所述治疗的个体。
[0024] 图1：描述乙型肝炎小抗原(HepBsAg)基因的PCR扩增。泳道1：约700bp的HbsAg基因；泳道2：100bp的DNA梯状条带。
[0025] 图2：描述用于构建嵌合HbsAg-HPV嵌合体的E6和E7合成基因片段的多表位序列的PCR扩增。泳道1：约150bp的多表位基因片段，由129bp的多表位序列组成；泳道2：100bp的DNA梯状条带。
[0026] 图3：描述用于产生嵌合HbsAg-HPV序列的HPV16L2的PCR扩增；约530bp的基因片段，由510bp的HPV16L2基因组成；泳道2：100bp的DNA梯状条带。
[0027] 图4：描述对应于L2基因的氨基酸100-220的HPV16L2片段的PCR扩增，获得含有360bp特定序列的约380bp的PCR片段。
[0028] 图5：说明99bp HPV16L1基因片段的PCR扩增，通过PCR扩增得到约120bp的片段。对应于L2基因的氨基酸100-220，获得含有360bp特定序列的约380bp的PCR片段。
[0029] 图6：说明HPV18L1基因的PCR扩增，得到由117bp HPV18L1序列组成的约140bp的片段。
[0030] 图7：描述HPV18L1基因的PCR扩增，得到由480bp HPV18L1片段组成的约500bp的片段。
[0031] 图8：显示嵌合HbsAg-HPV蛋白的表达水平，是在毕赤酵母(Pichia pastoris)的诱导培养物中借助ELISA法针对HbsAg含量所检测，并视为嵌合蛋白的表达的量度。
[0032] 图9：涉及嵌合HbsAg-HPV蛋白的表达水平，是在毕赤酵母的诱导培养物中借助ELISA法针对HPV抗原含量所检测。
[0033] 图10：使用HPV特异性ELISA法，使用针对市售的四价疫苗而产生的初级抗体和对于HPV16L2，针对纯化蛋白质而产生的兔抗血清检测的嵌合蛋白的免疫原性。
具体实施方式
[0035] 本发明涵盖用于人类的人乳头瘤病毒感染的预防性和治疗性疫苗候选物的开发。现有技术已知，当在体外表达成重组蛋白时，HPV的主要衣壳蛋白L1蛋白可单独或与次要衣壳蛋白L2组合组装成病毒样颗粒(VLP)。这些病毒样颗粒具有免疫原性，并且已被用作预防人类HPV感染的疫苗。子宫颈癌是由数种“致癌性”HPV类型引起，这些HPV类型包括HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68等。包含L1衣壳蛋白的VLP是良好的疫苗候选物，但识别VLP上的特定结构表位的抗体具有基因型特异性，而且针对一种VLP类型的抗体对于其它HPV基因型具有极少或没有交叉反应性。然而，数种HPV基因型的混合感染是很常见的。
[0036] 本发明的范围是开发一种广谱疫苗，其可提供针对与子宫颈癌风险有关的主要HPV类型的保护性免疫。鉴于次要的HPV衣壳蛋白L2中存在较高的序列保守性，故L2蛋白可潜在地提供针对数种病毒基因型的广泛中和活性。然而，与L1的结构表位具有较高抗原性不同，L2蛋白的免疫原性相对较弱。L2蛋白在天然衣壳蛋白中的低丰度，即每360个L1拷贝约12到72个分子，限制了其免疫原性(皮埃拉(Pereira)等人，2009)。一种以较低成本扩大免疫性的可能方法是考虑针对L2进行疫苗接种。L2疫苗的制造相对便宜，并且也有望赋予比利用L1VLP免疫所观察到的免疫范围广得多的交叉型保护性免疫(坎达(Kanda)和肯度(Kondo)2009)。HPV的次要衣壳蛋白L2在病毒进入细胞、病毒组分定位于细胞核、DNA结合、衣壳形成和稳定性方面起到重要作用，它所引出的抗体在各类HPV之间的交叉反应性高于主要衣壳蛋白L1，这些使得其成为针对HPV感染的新一代更广泛保护性亚单位疫苗的引人注目的潜在目标。
[0037] 本发明一个目的在于，通过利用与病毒和细菌蛋白的嵌合融合而提供抗原表位的多个拷贝来增强免疫原性，由此增加候选疫苗的免疫原性。截至目前，市面上还没有针对HPV感染的多表位疫苗。由于在病毒的不同基因型间衣壳蛋白与早期蛋白的抗原表位存在高序列保守性，故使得多表位疫苗有利于提供广泛的保护活性。
[0038] 由乙型肝炎小抗原(HbsAg)形成的病毒样颗粒是一种多聚体(multimeric)结构，当作为针对乙型肝炎病毒感染的疫苗投予时，其具有高免疫原性。VLP的结构允许将来自其它蛋白质的异源序列插入其开放阅读框中的个别位置，从而可使用蛋白质与HbsAg的嵌合融合物用作潜在疫苗候选物。HPV抗原包括衣壳蛋白L1和L2，以及早期蛋白，例如E1、E2、E5、E6和E7。这些蛋白质可由单独或组合形式的HPV L1、L2、E1、E2、E5、E6和E7蛋白的完整/部分序列/突变体/变异体/表位组成。这些候选蛋白质的T细胞或B细胞表位可单独使用或以串联重复序列的形式使用，并且与HbsAg融合，用作供HPV疫苗接种的疫苗候选物。HPV抗原与乙型肝炎小抗原的N末端或C末端或者开放阅读框内的任何区域融合，其中在这两个抗原之间添加有或不添加连接子序列。
[0039] 迄今为止，尚无有关HPV衣壳蛋白与HbsAg的嵌合融合物的报导。次要HPV衣壳蛋白L2与HbsAg的嵌合体是一种引人注目的疫苗候选物，因为尽管L2蛋白可赋予针对多种病毒基因型的广泛中和活性，但它由于是线性多肽而本身为弱抗原。负责针对多种HPV病毒基因型的广泛中和活性的L2区是以多聚体拷贝的形式呈现于HbsAg的VLP上，鉴于在VLP上多个拷贝的呈现，故相比于以单一拷贝存在时，增加了免疫原性。所选用于与HbsAg形成嵌合构建体的HPV16和HPV18L1蛋白的区域也为对其它基因型具有广泛中和活性并且能潜在地提供交叉保护的区域。我们已经利用了HbsAg在自组装成病毒样颗粒后，仍允许利用其它蛋白质与异源序列进行嵌合融合的柔性。还制备出HbsAg与HPV E6和E7蛋白的B细胞和T细胞表位(以串联形式存在以增加免疫原潜力)以及与HPV16和HPV18的L1和L2蛋白的嵌合体。已经报导过HPV E7的个别区域与HbsAg蛋白的嵌合构建体。我们使用了来源于HPV的E6和E7蛋白的多个T细胞和B细胞表位，因为这些序列以串联形式存在时所引发的免疫原性高于以单一拷贝形式存在的情形。它们在HbsAg的多聚体VLP上的存在又会增加呈现于VLP上的拷贝数，这进一步增加其免疫原性，并代表一种优良的疫苗候选物。已知B细胞和T细胞表位可引发强细胞毒性T细胞应答，从而有望成为针对HPV感染的优良治疗性疫苗。
[0040] 所属领域的技术人员将确定，以下候选物也可用于与利用HPV抗原的嵌合序列类似的策略中，以便增加其疫苗潜力。候选物的清单包括(但不限于)：乙型肝炎核心抗原、失活的破伤风类毒素、白喉类毒素、大肠杆菌不耐热毒素、霍乱毒素、绿脓杆菌外毒素A、志贺毒素、李斯特菌素、热激蛋白、钙网蛋白，或来源于上述蛋白质的表位。
[0041] 上述蛋白质可在原核或真核表达系统中表达为细胞内或分泌蛋白。在工业规模上，毕赤酵母宜作为表达系统，因为其可节省成本，并且由毕赤酵母表达和纯化得到的几种蛋白质由于能够安全用于人类而已经成功商业化。此系统适用于任一种属的酵母。HPV抗原与HAS(人血清白蛋白)的分泌信号的嵌合融合使培养基中所述蛋白质的合成和分泌增加，这使得不仅能够进行高水平表达，而且还易于在工业发酵规模上纯化出所述蛋白质。HSA的TMN末端序列可与毕赤酵母中的高水平合成和高效率分泌相适应。使用专有的Himax 技术纯化病毒抗原，便于以节省成本的方法分离出HbsAg-HPV嵌合抗原，尤其是VLP，所述节省成本的方法能安全用于人类，而且在工业规模上，比在氯化铯上的常规密度梯度超速离心法更经济。这将能够制造出低成本疫苗，并且环保，避免了如氯化铯等重金属的使用。
[0042] 所述蛋白质被表达为VLP、壳粒(capsomere)、多肽或包含HPV和细菌/病毒抗原的嵌合多肽。以单一序列并入或以串联重复序列形式呈与细菌/病毒蛋白的嵌合融合物并入的所述抗原在投予宿主时，能诱导强的抗体应答或细胞毒性T细胞应答。含有串联的T细胞和B细胞表位拷贝的亚单位免疫原的免疫原性可能高于这些细胞表位以单一拷贝出现的情形。如借助ELISA法所测定，与E6和E7表位以及与L2和L1蛋白形成的嵌合构建体针对HbsAg和HPV表位都引发了强抗体应答。这提供了疫苗的双重用途，即针对乙型肝炎以及多种HPV病毒基因型。
[0043] 上述蛋白质的抗原性组合物以药学上可接受的载剂配制，以便用于人类免疫。所述抗原制剂可单独投予，或与选自包括(但不限于)以下各项的清单的佐剂一起投予：氢氧化铝、磷酸铝、单磷酰脂A、其它有机亲脂性化合物、含有CpG和非CpG的低聚核苷酸、细胞因子等。或者，抗原制剂可包含两种或两种以上纯化的抗原，这些抗原在体外混合于适合的制剂中，并用作疫苗。抗原制剂可借助数种方法中的一种，通过经口、粘膜或肠胃外途径递送给哺乳动物，优选人类个体，以便引发保护性抗体应答和/或细胞毒性T细胞应答。抗原也可以药学上可接受的生物可降解聚合物递送。上述制剂可用于预防性或治疗性治疗哺乳动物的乳头瘤病毒感染和相关的癌症风险。
[0044] HPV透过粘膜细胞进入体内，并且不会全身扩散。因此，HPV疫苗有可能在生殖器粘膜诱发强烈而且持续的免疫应答。在这点上，动物中的鼻和口腔免疫研究显示，VLP可诱导生殖器粘膜中的抗体。赋予针对HPV抗原的粘膜免疫性的疫苗有利于预防HPV感染。将对适于疫苗的粘膜递送的制剂进行测试。市面上还没此类供粘膜应用的HPV疫苗。本发明将利用以下实例进一步予以说明。然而，这些实例只出于说明的目的，并且不应解释保护范围。
[0045] 实例：
[0046] 1.实例1：克隆策略
[0047] a)策略1：来源于早期蛋白的多表位与HbsAg的嵌合融合：
[0048] 本序列是由乙型肝炎小抗原与来源于HPV16和HPV18E7蛋白的串联的多表位融合，随后所述多表位与HbsAg蛋白的C末端和N末端嵌合融合而组成。(HbsAg蛋白序列：
[0049] MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPISCCLWAYI).
[0050] 以下来源于E7和/或E6蛋白的表位串联排列，得到：5′EYMLDLQPETTEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIDEIDGVNHQHL 3′，即43个氨基酸(129个核苷酸)。这个主要表位是以下各项的组合，并选自T细胞和B细胞表位清单：HPV16E7T细胞表位：氨基酸20-29：TDLYCYEQLN；氨基酸45-54AEPDRAHYNI；B细胞表位：氨基酸10-20：EYMLDLQPETT；氨基酸
35-49EEDEIDGPAGQAEPDR；与HPV18E7B细胞表位DEIDGVNHQHL融合，所述HPV18E7B细胞表位是HPV18E7的免疫优势(immunodominant)表位，由此获得下述指定为SEQ ID No.1的嵌合融合物。类似地，所述多表位与HbsAg的N末端融合得到的嵌合融合物为SEQ ID No.2中提供的序列。在所述多表位的5′端引入翻译起始子甲硫氨酸来用于起始翻译。
35-49EEDEIDGPAGQAEPDR；与HPV18E7B细胞表位DEIDGVNHQHL融合，所述HPV18E7B细胞表位是HPV18E7的免疫优势(immunodominant)表位，由此获得下述指定为SEQ ID No.1的嵌合融合物。类似地，所述多表位与HbsAg的N末端融合得到的嵌合融合物为SEQ ID No.2中提供的序列。在所述多表位的5′端引入翻译起始子甲硫氨酸来用于起始翻译。
[0051] SEQ ID No.1
[0052] MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPISCCLWAYIGSEYMLDLQPETTEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIDEIDGVNHQHL-
[0053] SEQ ID NO.2：
[0054] MEYMLDLQPETTEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIDEIDGVNHQHLGSENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPISCCLWAYI-
[0055] b)策略2：次要衣壳蛋白L2与HbsAg的嵌合融合。
[0056] 将次要衣壳蛋白L2的N末端区域与HbsAg的C末端融合。扩增的L2区域为下述在HbsAg的C末端融合的具有171个氨基酸的序列(引入起始子甲硫氨酸以促进翻译)：
[0057] MSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPVRPPLTVDPVGPSDPSIVSLVEETSFIDAGAPTPVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYEEIPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSR
[0058] SEQ ID No.3：
[0059] MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPISCCLWAYIGSSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPVRPPLTVDPVGPSDPSIVSLVEETSFIDAGAPTPVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYEEIPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSR-
[0060] SEQ ID No.4：
[0061] 将包含下述具有171个氨基酸的序列的次要衣壳蛋白序列L2在其C末端与HbsAg的N末端融合，得到SEQ ID No.4。添加起始子甲硫氨酸以便翻译。
[0062] 5′
[0063] MSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPVRPPLTVDPVGPSDPSIVSLVEETSFIDAGAPTPVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYEEIPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSRGSENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPISCCLWAYI 3′
[0064] c)策略3：L2片段的嵌套缺失体与HbsAg的嵌合融合。
[0065] 将次要衣壳蛋白L2的N末端区域与HbsAg的C末端融合。扩增的L2区域是下述具有约120个氨基酸(360bp)的序列：
[0066] SDPSIVSLVEETSFIDAGAPTPVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYEEIPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSR
[0067] 将其连接至HbsAg的C末端，得到SEQ ID No.5。
[0068] SEQ ID No.5：
[0069] 5′
[0070] MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPISCCLWAYIGSSDPSIVSLVEETSFIDAGAPTPVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYEEIPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSR 3′
[0071] SEQ ID No.6：
[0072] 将包含下述具有120个氨基酸的序列的次要衣壳蛋白序列L2：
[0073] SDPSIVSLVEETSFIDAGAPTPVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYEEIPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSR
[0074] 在其C末端与HbsAg的N末端嵌合融合，得到SEQ ID NO.6。添加起始子甲硫氨酸以便翻译。
[0075] MSDPSIVSLVEETSFIDAGAPTPVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYEEIPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSRGSENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPISCCLWAYI 3′
[0076] d)策略4：HPV16的L1区与HbsAg的嵌合融合：
[0077] 由以下来源于HPV16蛋白L1区的33个氨基酸(99bp)的序列组成的HPV16蛋白的L1区在HbsAg的C末端发生嵌合融合：NTVIQDGDMVDTGFGAMDFITLQANKSEVPLDI[0078] SEQ ID No.7
[0079] 5′
[0080] MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPISCCLWAYIGS NTVIQDGDMVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDI 3′
[0081] 由以下来源于HPV16L1区的33个氨基酸的序列组成的HPV16蛋白L1区：NlVIQDGDMVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDI与HbsAg的N末端嵌合融合，得到嵌合序列SEQ ID No.8。添加起始子甲硫氨酸以便翻译。
[0082] SEQ ID No.8：
[0083] 5′ MNTVIQDGDMVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDIGSENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPISCCLWAYI3′
[0084] e)策略5：HPV18的L1区与HbsAg的嵌合融合：
[0085] 具有以下序列的HPV18L1蛋白的区域(39个氨基酸；117bp)
[0086] 5′PPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDI 3′
[0087] 与HbsAg序列的C末端嵌合融合，由此得到以下嵌合序列：
[0088] SEQ ID NO.9：
[0089] 5′
[0090] MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPISCCLWAYIGSPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDI 3′
[0091] 将其与HbsAg蛋白的N末端融合，得到SEQ ID NO.10，其中添加起始子甲硫氨酸以便翻译。
[0092] SEQ ID NO.10：
[0093] 5′
[0094] MPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDIGSENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPISCCLWAYI
[0095] f)策略6：HPV18L1区的较大多肽与HbsAg的嵌合融合：
[0096] 由以下序列组成的较大HPV18片段
[0097] ATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPQSLYIKGTGMRAS PGSCVYSPS
[0098] 在其N末端与HbsAg的C末端嵌合融合，由此得到嵌合序列：
[0099] SEQ ID NO.11：
[0100] 5′
[0101] MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPISCCLWAYIGSATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPQSLYIKGTGMRASPGSCVYSPS 3′
[0102] 由以下序列组成的较大HPV18片段
[0103] 5′
[0104] ATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPQSLYIKGTGMRASPGSCVYSPS 3′
[0105] 在其C末端与HbsAg的N末端嵌合融合，由此得到嵌合序列SEQ ID 12：
[0106] SEQ ID No.12：
[0107] MATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPQSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSGSENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPISCCLWAYI
[0108] 策略7：
[0109] 全长HPV16L1蛋白序列在其N末端与用于在毕赤酵母中进行分泌表达的人血清白蛋白的具有24个氨基酸的信号序列嵌合融合，得到SEQ ID NO.13。
[0110] SEQ ID NO.13：
[0111] MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRGSSLWLPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVARTNIYYHAGTSRLIAVGHPYFPIKKPNNNKILVPKVSGLQYRVFRIHLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGHPLLNKLDDTENASAYAANAGVDNRECISMDYKQTQLCLIGCKPPIGEHWGKGSPCTNVAVNPGDCPPLELINTVIQDGDMVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDICTSICKYPDYIKMVSEPYGDSLFFYLRREQMFVRHLFNRAGAVGENVPDDLYIKGSGSTANIASSNYFPTPSGSMVTSDAQIFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMSLCAAISTSETTYKNTNFKEYLRHGEEYDLQFIFQLCKITLTADVMTYIHSMNSTILEDWNFGLQPPPGGTLEDTYRFVTSQAIACQKHTPPAPKEDPLKKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAKPKFTLGKRKATPTTSSTSTTAKRKKRKL[0112] SEQ ID NO.14：
[0113] 全长HPV16L2蛋白序列在其N末端与用于在毕赤酵母中进行分泌表达的人血清白蛋白的具有24个氨基酸的信号序列嵌合融合，得到SEQ ID NO.14。
[0114] MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRGSRHKRSAKRTKRASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPVRPPLTVDPVGPSDPSIVSLVEETSFIDAGAPTPVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYEEIPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSRPVARLGLYSRTTQQVKVVDPAFVTTPTKLITYDNPAYEGIDVDNTLYFSSNDNSINIAPDPDFLDIVALHRPALTSRRTGIRYSRIGNKQTLRTRSGKSIGAKVHYYYDFSTIDPAEEIELQTITPSTYTTTSHAASPTSINNGLYDIYADDFITDTSTTPVPSVPSTSLSGYIPANTTIPFGGAYNIPLVSGPDIPINITDQAPSLIPIVPGSPQYTIIADAGDFYLHPSYYMLRKRRKRLPYFFSDVSLAA
[0115] SEQ ID NO.15：
[0116] 全长HPV18L1蛋白序列在其N末端与用于在毕赤酵母中进行分泌表达的人血清白蛋白的具有24个氨基酸的信号序列嵌合融合，得到SEQ ID NO.15：
[0117] MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRGSLWRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVPAGGGNKQDIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDNSIYNPETQRLVWACAGVEIGRGQPLGVGLSGHPFYNKLDDTESSHAATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPQSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPVPGQYDATKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSILEDWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAITCQKDAAPAENKDPYDKLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAPSATTSSKPAKRVRVRARK[0118] 2.实例2：基因克隆和HbsAg-HPV抗原嵌合体的构建：
[0119] a)利用分别含有EcoR1和BamH1限制性位点的N末端和C末端引物，借助PCR扩增编码全长HbsAg蛋白的乙型肝炎基因，得到约700bp的PCR片段(参看图1)。HbsAg基因的PCR扩增使用的引物为：
[0120] HB N末端(HBNTERM)：
[0121] 5’CACGAATTCACCATGGAGAACACAACATCAGG 3’
[0122] HB C末端(HBCTERM)：
[0123] 5’TCAGGATCCAATGTATGCCCAAAGACAACAGG 3’
[0124] PCR扩增的条件为在94℃下变性45秒，在65℃下退火40秒并在72℃下延伸1.5分钟，持续30个循环，随后在72℃下进行最后一次延伸，持续10分钟。10ng将HbsAg基因克隆到pBluescript SKII+中得到的质粒DNA用作PCR反应的模板。反应物由1x TaqDNA聚合酶缓冲液、0.25mM dNTP、20皮摩尔各引物和1.5U Taq DNA聚合酶组成。所有试剂都来自班加罗尔-吉奈公司(Bangalore Genei)。对PCR片段进行凝胶纯化，并用BamH1消化。使用经BamH1消化的HbsAg PCR片段来与各种HPV抗原连接，得到嵌合构建体。为了构建在C末端带有HbsAg基因且在N末端带有HPV抗原的嵌合构建体，利用含有Not1位点的C末端引物和含有BamH1位点的N末端引物，借助PCR扩增HbsAg。在用于PCR扩增的构建体(其中HPV抗原在N末端且HbsAg在C末端)中，针对HPV抗原的PCR引物在其N末端含有EcoR1位点，且在其C末端含有BamH1位点。在两种情况下，通过连接两个序列的BamH1端，来使HbsAg基因片段与HPV基因片段发生嵌合融合。BamH1位点在HbsAg-HPV序列的接点处引入两个氨基酸“GS”(甘氨酸-丝氨酸)。本发明中描述的所有嵌合融合物(SEQ IDNo.1到SEQ IDNo.15)都是在核苷酸水平上使用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)以及连接PCR扩增基因得到。
[0125] 借助PCR法扩增以下HPV基因片段以便连接：
[0126] 多表位序列的克降：
[0127] EYMLDLQPETTEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIDEIDGVNHQHL，即43个氨基酸(129个核苷酸)。在金斯瑞公司(GenScript Corporation)合成编码上述序列的合成基因片段。利用以下引物扩增所述基因片段，这些引物在N末端引入BamH1位点且在C末端引入Not1位点。使PCR反应物在94℃下变性45秒，在62℃下退火45秒，并在72℃下延伸30秒，持续33个循环，由此得到含有129bp表位序列的约140bp的PCR片段。
[0128] ME N末端(MENTERM)引物：
[0129] 5′ATAGGATCCGAGTACATGTTGGATTTG 3′
[0130] ME C末端(MECTERM)引物：
[0131] 5′ATCGCGGCCGCTTATCACAAATGTTGGTGGTTG 3′
[0132] 对使用上述引物得到的129bp PCR片段(参看图2)进行凝胶纯化，并用BamH1消化。使用T4DNA连接酶将经BamH1消化的PCR片段连接至经BamH1消化的HbsAg基因过夜，由此得到约840bp的嵌合片段，其翻译序列指定为SEQ ID NO.1。对恰当尺寸(约840bp)的连接片段进行凝胶纯化，用EcoR1和Not1消化，以便克隆到酵母载体pPIC3.5K中。为了产生SEQ ID NO.2(其中多表位序列连接于HbsA基因的5′端)，制备出具有类似序列的引物，但C末端引物带有BamH1位点而非Not1位点，并且在N末端引物中，利用EcoR1代替BamH1位点。用BamH1消化约140bp的PCR产物，并用T4DNA连接酶将其与经BamH1消化的HbsAg连接过夜。对连接得到的约840bp的片段(指定为SEQ ID NO.2)进行凝胶纯化，用EcoR1和Not1消化，以便克隆到酵母表达载体pPIC3.5K中。
[0133] HPV16L2片段在HbsAg的C末端的嵌合融合。
[0134] 将次要衣壳蛋白L2的N末端区域与HbsAg的C末端融合。在金斯瑞公司合成HPV16L2基因。扩增的L2区域对应于氨基酸50-220(510bp)，并将其连接于HbsAg的C末端，产生SEQ ID NO.3。为了将L2基因片段连接至HbsAg基因的C末端，利用含有BamH1位点的类似N末端引物和含有Not1位点的C末端引物，借助PCR扩增编码L2蛋白的基因。用BamH1消化PCR扩增得到的约530bp的片段，并与经BamH1消化的在C末端带有BamH1位点的HbsAg连接。对连接得到的约1230bp片段进行凝胶纯化，并用EcoR1和Not1消化，以便克隆到酵母载体pPIC3.5K中。
[0135] 为了产生HPV-HbsAg嵌合构建体，利用具有类似序列的引物扩增L2基因(氨基酸位置50-220bp)，但N末端引物带有EcoR1位点而非BamH1，且C末端引物含有BamH1位点而非Not1。如上文所述进行PCR扩增、消化，得到SEQ ID NO.4。
[0136] HPV16L2片段的嵌套缺失体在HbsAg的C末端的嵌合融合。
[0137] 将次要衣壳蛋白L2的N末端区域与HbsAg的C末端融合。扩增的L2区域为100到220位的氨基酸(120个氨基酸；360bp)。L2基因片段的PCR扩增使用的引物为：
[0138] 6P2CF N末端(6P2CFNTERM)：
[0139] 5′ACCGGATCCGATCCATCTATCGTTTC 3′
[0140] 6P2CF C末端(6P2CFCTERM)：
[0141] 5′ATCGCGGCCGCTTATCATCTTGAACCTGGAATTG 3′
[0142] PCR反应在含有1x Taq DNA聚合酶缓冲液、0.25mM dNTP以及20皮摩尔各引物和1.5U Taq DNA聚合酶的50μL体积中进行。PCR条件是在94℃下变性45秒，在64℃下40秒和在72℃下延伸1分钟，持续30个循环。
[0143] 对含有360bp L2序列的约380bp的PCR片段进行凝胶纯化，用BamH1消化，并连接到经BamH1消化的HbsAg基因，产生约1060bp的HbsAg-HPV嵌合体，指定为SEQ ID No.5。为了产生L2基因片段连接到HbsAg基因的N末端的HPV-HbsAg嵌合序列，用于L2的N末端和C末端引物含有EcoR1和BamH1限制性位点。使经BamH1消化的L2基因片段与经BamH1消化的HbsAg连接，产生1060bp的嵌合序列，指定为SEQ ID NO.6。
[0144] 具有HPV16的L1区和HbsAg的嵌合序列的产生：
[0145] 产生的嵌合序列由来源于HPV16蛋白L1区的33个氨基酸的序列(99bp)NTVIQDGDMVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDI与HbsAg基因组成。使用以下PCR引物，借助PCR扩增HPV16L1基因(在金斯瑞公司合成的基因)的指定区域，得到含有99bp上述序列的约120bp的PCR片段：
[0146] 6P1CF N末端(6P1CFNTERM)：
[0147] 5′ATCGGATCCAACACCGTTATCCAAGACGG 3′
[0148] 6P1CF C末端(6P1CFCTERM)：
[0149] 5′ACTGCGGCCGCTTATCAAATATCCAATGGAACTTC 3′
[0150] PCR反应在含有1x Taq DNA聚合酶缓冲液、0.25mM dNTP、20皮摩尔各引物和1.5U Taq DNA聚合酶的50μL反应体积中进行(所有试剂都从班加罗尔-吉奈公司获得)。PCR循环由在94℃下变性45秒、在65℃下退火40秒和在72℃下延伸45秒持续30个循环组成。对约120bp的PCR片段进行凝胶纯化，用BamH1消化，并利用T4DNA连接酶连接到经BamH1消化的HbsAg过夜，产生约810bp的嵌合序列(指定为SEQ ID No.7)，其中HPV16L1片段为HbsAg基因的C末端。为了产生上述片段连接于HbsAg基因的N末端的HPV-HbsAg，利用具有类似序列的引物，借助PCR扩增HPV16L1片段，其中N末端引物中含有EcoR1位点，且C末端引物中含有BamH1序列而非Not1。用BamH1消化类似尺寸的PCR片段，并如上文所述连接到经BamH1消化的HbsAg，产生指定为SEQ ID No.8的序列。
[0151] 具有HPV18的L1区和HbsAg的嵌合序列的产生：
[0152] 借助PCR，将具有序列PPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDI的HPV18L1蛋白(39个氨基酸；117bp)连接到HbsAg序列的C末端，产生嵌合序列。针对在毕赤酵母中表达来对合成性HPV18L1基因进行密码子优化，并在金斯瑞公司进行合成。利用以下PCR引物，借助PCR扩增上文指定的HPV18L1序列：
[0153] 8PICF N末端(8PICFNTERM)：
[0154] 5′GATGGATCCCCTCCTTTGGAATTGAAG 3′
[0155] 8P1CF C末端(8P1CFCTERM)：
[0156] 5′AGTGCGGCCGCTTATCAGTAATCTGGATATTTGC 3′
[0157] PCR反应以50μL体积进行，并含有1x Taq DNA聚合酶缓冲液、0.25mM dNTP、20皮摩尔各引物和1.5U Taq DNA聚合酶。PCR反应由在94℃下变性45秒、在65℃下退火30秒和在72℃下延伸40秒持续30个循环组成。对约135bp的PCR片段进行凝胶纯化，用BamH1消化，并连接到经BamH1消化的HbsAg，得到HPV18L1序列连接到HbsAg的C末端的HbsAg-HPV嵌合序列，得到SEQ ID No.9。为了产生HPV-HbsAg嵌合序列，对于PCR引物，在N末端引物中含有EcoR1位点，且在C末端引物中含有BamH1位点。在用BamH1消化后，将片段连接到在N末端含有BamH1的HbsAg，产生SEQ ID No.10。用EcoR1和Not1消化所述两个连接得到的PCR片段，以便克隆到酵母表达载体pPIC3.5K中。
[0158] 较大HPV18L1片段与HbsAg的嵌合序列的产生：
[0159] 借助PCR，将由以下序列组成的较大HPV18L1片段
[0160] 5′ ATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPQSLYIKGTGMRASPGSCVYSPS 3′
[0161] 连接到HbsAg的C末端，得到嵌合序列。利用以下PCR引物，借助PCR扩增L1片段：
[0162] 8P1CFLF N末端(8P1CFLFNTERM)：
[0163] 5′TCTGGATCCGCTACATCTAATGTCTC 3′
[0164] 8P1CFLF C末端(8P1CFLFCTERM)：
[0165] 5′ATTGCGGCCGCTTATCAGGATGGACTGTAAACG 3′
[0166] 50μL的PCR反应物由1x Taq DNA聚合酶缓冲液、0.25mM dNTP、N末端和C末端引物各20皮摩尔和1.5U Taq DNA聚合酶组成。PCR反应物由1x Taq DNA聚合酶缓冲液、0.25mM dNTP、20皮摩尔各引物和1.5U Taq DNA聚合酶组成。PCR循环由在94℃下变性30秒、在64℃下退火40秒和在72℃下延伸1分钟持续30个循环组成。对PCR片段进行凝胶纯化，用BamH1消化，并连接到经BamH1消化的HbsAg的C末端，得到具有SEQ ID No.11的嵌合片段。为了将上述HPV18L1片段连接到HbsAg序列的N末端，对于引物来说，N末端引物带有EcoR1位点，且C末端引物带有BamH1位点。将经BamH1消化的片段连接到经BamH1消化的HbsAg，得到HPV18L1片段处在HbsAg基因的N末端的嵌合序列，得到SEQ ID No.12。
用EcoR1和Not1消化上述两个嵌合序列，并连接到经EcoR1和Not1消化的酵母表达载体pPIC3.5K，以便克隆到毕赤酵母中。
用EcoR1和Not1消化上述两个嵌合序列，并连接到经EcoR1和Not1消化的酵母表达载体pPIC3.5K，以便克隆到毕赤酵母中。
[0167] HPV抗原与用于在毕赤酵母中分泌性表达HPV抗原的人血清白蛋白基因的信号序列的嵌合序列的产生：
[0168] 利用以下引物，借助PCR扩增人血清白蛋白基因的具有24个氨基酸的信号序列：
[0169] HASS N末端(HASSNTERM)：
[0170] 5′CCTGAATTCACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTC 3′
[0171] HASS C末端(HASSCTERM)：
[0172] 5′ATTGGATCCTCGACGAAACACACCCCTG 3′
[0173] 由此得到72bp的片段，对其进行凝胶纯化，用BamH1消化并连接到在5′端带有BamH1位点的HPV16L1、HPV16L2和HPV18L1全长基因的5′端，分别得到序列SEQID No.13、SEQ ID NO.14和SEQ ID No.15。
[0174] 实例3：在毕赤酵母中的克隆和表达：
[0175] 通过对所有嵌合序列的两条DNA链进行测序来验证嵌合序列和阅读框的正确性，随后进行酵母转化。用EcoR1和Not1消化前几章节中提到的所有嵌合序列，随后进行凝胶纯化，并将其与经EcoR1和Not1消化的pPIC3.5K载体(英杰公司(InvitrogenCorporation)，美国卡尔斯巴德(Carlsbad，USA))连接，并用T4DNA连接酶连接过夜。用连接混合物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，并涂于含有100μg/mL氨必西林(ampicillin)的LB琼脂板中。从转化的克隆中大规模分离出每一所述构建体的质粒DNA，纯化并用Bgl II消化，使质粒线性化以用于酵母转化。
[0176] 遵照制造商(英杰公司)的方案以及其手册中略述的，将编码嵌合序列SEQ ID No.1到SEQ ID No.15的基本上线性化的质粒DNA转化到毕赤酵母GS115中。将所有嵌合序列都克隆到AOX1基因座中，并借助甲醇的诱导，在AOX1启动子下进行表达。重组毕赤酵母属菌株的克隆、筛选、分离以及甲醇对克隆基因的诱导均遵照毕赤酵母属表达试剂盒(Pichia Expression Kit，目录号K1710-01；英杰公司，美国卡尔斯巴德)中的用户手册“在毕赤酵母中表达重组蛋白的方法手册(A Manual of Methods for Expressionof Recombinant Proteins in Pichia pastoris)”(第M版，2002年1月)进行。
[0177] 实例4：嵌合HbsAg-HPV抗原的纯化：
[0178] 用甲醇诱导后，采集细胞，并借助超声波和/或利用玻璃珠进行溶解。用PEG6000处理溶解产物，达到7.5％的浓度，并用NaCl处理，使浓度达到3％。以8000 x g离心细胞悬浮液10分钟。借助盐处理(专用混合物)来使上清液沉淀，并进行沉淀。利用Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)，从盐沉淀中洗脱出蛋白质。浓缩洗脱液，并用50mM Tris-HCl(pH 8.5)透滤(diafiltered)，并装载到经同一缓冲液平衡的阳离子柱上。对于不同抗原蛋白，用不同浓度的NaCl洗脱蛋白质。在12％SDS-PAGE上借助银染色检查制剂的纯度。随后借助蛋白质免疫印迹(Western blot)确定各种嵌合蛋白的正确分子尺寸。
[0179] 实例5：HPV-HbsAg嵌合蛋白的ELISA：
[0180] 借助ELISA法，利用MONOLISA Anti-Hbs3.0试剂盒(产品编号72400；伯乐公司(Bio-Rad))，严格遵照试剂盒手册中略述的方案，针对乙型肝炎小抗原的含量来检测嵌合蛋白的表达，并以ng/mL表示。使用诱导后的100μL细胞溶解产物来估算HbsAg的含量。还借助ELISA法估计诱导后细胞溶解产物中嵌合蛋白中的HPV抗原。在涂布缓冲液(碳酸盐缓冲液，pH 9.6)存在下，将含1μg纯化蛋白质的200μL涂布于96孔微量滴定板上，并在4℃下培育过夜。在纸巾上轻敲所述板以去除孔中残留的缓冲液，随后排出孔中的内含物。用每孔225μL阻断溶液(含有0.5％BSA的1x PBST)阻断各孔，并在37℃下培育1小时。
[0181] 用洗涤缓冲液洗涤各孔3次(每孔200μL，每次洗涤30秒)。在每次洗涤后，在纸巾上轻敲所述板至干，以去除各孔中残留的缓冲液。以1x PBST(含有0.5％吐温20(tween20)的磷酸盐缓冲液)洗涤各孔5次，以去除未结合的蛋白质。在兔中产生的针对全长HPV6L1、HPV16L2和HPV18L1的抗体用作初级抗体。添加以1∶1000稀释的初级抗体后，在室温下，振荡培育所述板1小时。排出孔中内含物，并用含有1x PBST的洗涤缓冲液洗涤
5次。添加在10mM磷酸盐缓冲生理盐水中以1∶2000稀释的二级抗体抗兔IgG-HRP结合物，并在室温下振荡培育1小时。排出孔中的内含物，并在干纸巾上轻敲所述板，以去除孔中残留的缓冲液。每孔添加20μL新制的底物溶液OPD(邻苯二胺二盐酸盐)和过氧化氢，并在室温下培育30分钟。通过添加75μL终止溶液(stopping solution)来终止反应，并在ELISA读取器中读取在490nm下的吸光度。
5次。添加在10mM磷酸盐缓冲生理盐水中以1∶2000稀释的二级抗体抗兔IgG-HRP结合物，并在室温下振荡培育1小时。排出孔中的内含物，并在干纸巾上轻敲所述板，以去除孔中残留的缓冲液。每孔添加20μL新制的底物溶液OPD(邻苯二胺二盐酸盐)和过氧化氢，并在室温下培育30分钟。通过添加75μL终止溶液(stopping solution)来终止反应，并在ELISA读取器中读取在490nm下的吸光度。
[0182] 实例6：蛋白质免疫印迹
[0183] 在12％SDS-PAGE凝胶上分离前几章节所述的嵌合蛋白，在PVDF膜(Hybond-P转印膜，GE医疗集团(GE Healthcare))上进行电印迹，并在含有10mM磷酸盐缓冲液(pH7.4，含有3％脱脂奶粉)的溶液中阻断。用阻断溶液阻断过夜后，排出阻断溶液，并以PBST冲洗3次，每次5分钟。在37℃下，将印迹与利用市售四价疫苗而产生的初级兔抗血清的1∶500稀释液一起培育。与初级抗体培育1小时后，洗涤印迹5次，并与二级抗体(即，抗兔IgGHRPO结合物)的1∶2000的PBST稀释液一起培育，在室温下振荡培育1小时。添加底物二氨基联苯胺(diaminobenzidene，DAB)和过氧化氢，并显色，直到得到所需的颜色强度。通过排出底物溶液并用WFI冲洗，来终止反应。利用针对市售四价HPV疫苗而产生的抗血清，借助蛋白质免疫印迹检测嵌合序列中的HPV16L1和HPV18L1。
[0184] 实例7：嵌合蛋白的免疫原性：
[0185] 利用50μg吸收于氢氧化铝凝胶中并经肌肉内投予的每一嵌合抗原的纯化蛋白质使每一测试组中的10只BALB/C小鼠(15-20g)免疫。第1剂后21天，给予加强剂量，并在第1剂后45天后投予第2剂。借助间接ELISA测量对于前一章节略述的含有SEQID No.3-12的所有克隆的抗体滴度。估算经嵌合抗原免疫的小鼠中针对HbsAg和HPV抗原的抗体滴度。用于估算HPV16L1和HPV18L1的初级抗体为针对市售四价疫苗产生的兔抗血清，但对于表达HPV16L2蛋白的克隆，利用针对纯化的HPV16L2蛋白而产生的HPV16L2兔抗血清来测量。借助间接ELISA，测量从每一组小鼠汇集的血清中针对HPV抗原的抗体滴度。二级抗体为兔抗IgG HRPO结合物。重复本实验，其中将含等量抗原的氢氧化铝凝胶(algel)与每剂50μgCpG低聚核苷酸一起投予。在投予抗原的初始剂量后60到65天，估算所有小鼠的抗体滴度。为了估算免疫小鼠中针对HbsAg的抗体滴度，利用来自伯乐公司实验室的Monolisa Anti HBs 3.0试剂盒，严格遵照制造商的说明进行估算。在490nm下记录值，并作图。
[0186] 参考文献：
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