一种用于奶牛粪便中酿酒酵母菌的分离鉴定和筛选方法
专利汇可以提供一种用于奶牛粪便中酿酒酵母菌的分离鉴定和筛选方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种用于奶 牛 粪便 中酿酒 酵母 菌的分离鉴定和筛选方法，属于 生物 技术领域。本发明的目的是从 奶牛 粪便中高效的分离并筛选出耐受性好、生长优势佳的 酿酒酵母 菌，以及其中的分离鉴定和筛选方法。本发明的有益效果是：利用生物学和分子生物学鉴定成功的从奶牛粪便中分离纯化出酿酒酵母菌，并通过耐酸筛选、耐胆 碱 筛选、耐组胺筛选、耐内毒素筛选、耐高温筛选、菌株活性比较筛选和生长曲线实验，成功的筛选出了一株耐受性高，生长优势佳的酿酒酵母菌。用于优质的酿酒酵母菌微生态制剂的制备，对研发 反刍动物 微生体制剂提供优质菌种，推动反刍动物生物制品的研发起着至关重要的作用。，下面是一种用于奶牛粪便中酿酒酵母菌的分离鉴定和筛选方法专利的具体信息内容。
1.一种用于奶牛粪便中酿酒酵母菌的分离方法，其特征在于，包括以下所需成分：酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖培养基、WL固体培养基、赖氨酸固体培养基；
分离方法为：
a.样本采集：选取健康奶牛的新鲜粪便20g，置于含有100mL无菌的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中，并充分混匀；
b.样本扩大培养：将含有粪便的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基放入摇床中，在温度为28℃且转速为180rmp/min，过夜培养；
c.样本分离：将过夜培养的样本用3层纱布过滤，转移至另一个空的无菌锥形瓶中，然后将样本稀释，稀释梯度分别为101、102、103、104，取103、104稀释后的样本100μL，均匀涂布接种于酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基上，在30℃恒温培养箱中培养48-72h；
d.样本纯化：将酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基上的酿酒酵母菌挑选出，并划线接种于另一个无菌的酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基中，在30℃恒温培养箱中培养48-72h，再重复以上操作，直到得到酿酒酵母菌的单克隆菌落。
2.根据权利要求1所述的一种用于奶牛粪便中酿酒酵母菌的鉴定方法，其特征在于：生物学鉴定和分子生物学鉴定；
生物学鉴定：将纯化得到的酿酒酵母菌接种培养于100mL YPD无菌液体培养基中，在温度为28℃且转速为180rmp/min的摇床中培养24h，在光学显微镜(×40)下观察酿酒酵母菌多端出芽繁殖状态；同时，将纯化得到的酿酒酵母菌划线接种于WL固体培养基中，在30℃恒温培养箱中培养5-8d，菌落状态为中央绿色凸起，边缘白色，光滑不透明；同时，利用赖氨酸固体培养基进行鉴定，该培养基可从分离得到的所有酵母菌中鉴定出酿酒酵母菌，将纯化得到的酿酒酵母菌先饥饿培养于5mL无菌的生理盐水中，将其在30℃恒温培养箱中培养7d，然后取100μL饥饿后的酿酒酵母菌涂布接种于赖氨酸固体培养基中，在30℃恒温培养箱中培养5-15d。
3.根据权利要求2所述的一种用于奶牛粪便中酿酒酵母菌的鉴定方法，其特征在于：
分子生物学鉴定：将分离纯化得到的酿酒酵母菌进行DNA提取，将提取的总DNA与酵母菌特异性上游引物：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'和下游引物：5'-
GGTCCGTGTTTCAACAAGACGG-3'进行PCR反应得到目的基因片段后，进行目的基因DNA纯化，将测序结果在NCBI的BLAST软件进行基因序列比对，把同源性高的序列与目的基因利用MAGE
7进行系统发育树的构建。
4.根据权利要求1所述的一种用于奶牛粪便中酿酒酵母菌的筛选方法，其特征在于，包括以下筛选方式：耐酸筛选、耐胆碱筛选、耐组胺筛选、耐内毒素筛选、耐高温筛选、菌株活性比较筛选和生长曲线筛选；
耐酸筛选：将含有乳酸的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基调节成pH为2.5、3.5、4.5、5.5，将不同pH培养基用滤器过滤至无菌，将鉴定出的酿酒酵母菌分别等量的培养在不同pH的培养基中，在30℃恒温培养箱静置培养2h，然后利用酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基进行平板菌落计数，在30℃恒温培养箱培养48h。
5.根据权利要求4所述的一种用于奶牛粪便中酿酒酵母菌的筛选方法，其特征在于：
耐胆碱筛选：将含有牛胆盐的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基调节成牛胆盐浓度为0.1％、
0.2％、0.3％、0.4％，将不同牛胆盐浓度培养基用滤器过滤至无菌，将鉴定出的酿酒酵母菌分别等量的培养在不同牛胆盐浓度的培养基中，培养条件和计数方法与耐酸筛选中相同。
6.根据权利要求4所述的一种用于奶牛粪便中酿酒酵母菌的筛选方法，其特征在于：
耐组胺筛选：每毫升酵母浸出粉胨葡萄糖培养基对应放入不同量的组胺(50umol/L)
0.4μL、0.8μL、1.2μL，将不同组胺浓度培养基用滤器过滤至无菌，将鉴定出的酿酒酵母菌分别等量的培养在不同组胺浓度的培养基中，培养条件和计数方法与耐酸筛选中相同。
7.根据权利要求4所述的一种用于奶牛粪便中酿酒酵母菌的筛选方法，其特征在于：
耐内毒素筛选：每毫升酵母浸出粉胨葡萄糖培养基对应放入不同量的内毒素(1mg/mL)
1μL、5μL、10μL，将不同内毒素浓度培养基用滤器过滤至无菌，将鉴定出的酿酒酵母菌分别等量的培养在不同内毒素浓度的培养基中，培养条件和计数方法与耐酸筛选中相同。
8.根据权利要求4所述的一种用于奶牛粪便中酿酒酵母菌的筛选方法，其特征在于：
耐高温筛选：将鉴定出的酿酒酵母菌分别等量的接种在30℃、39.5℃、41.5℃的YPD无菌液体培养基中，培养条件(除温度外)和计数方法与耐酸筛选中相同。
9.根据权利要求4所述的一种用于奶牛粪便中酿酒酵母菌的筛选方法，其特征在于：
菌株活性比较筛选：将鉴定出的酿酒酵母菌数量统一为1×108CFU/mL，在28℃，180rmp/min的摇床中培养24h，利用酶标仪测量OD值(570nm)进行活性比较。
10.根据权利要求4所述的一种用于奶牛粪便中酿酒酵母菌的筛选方法，其特征在于：
生长曲线筛选：将鉴定出的酿酒酵母菌等量的接种于无菌的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中，生长曲线设置的时间点为0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h、
52h、56h、60h、72h、96h、120h，在温度为28℃且转速为180rmp/min的环境中进行培养，用平板菌落计数法进行计数。
一种用于奶牛粪便中酿酒酵母菌的分离鉴定和筛选方法
技术领域
背景技术
发明内容
7进行系统发育树的构建。
具体实施方式
4
和10 的菌液100μL涂布到酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基上，在30℃恒温培养箱中培养48-
72h，选取与酿酒酵母菌相似形态的菌落，划线接种到酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基上，在30℃的恒温培养箱中培养48-72h，直到分离纯化出单克隆菌落，结果见图1，分离纯化得到的酵母菌在酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基上的菌落形态为乳白色且中央呈球形凸起，表明光滑不透明。
16株酿酒酵母菌，结果见图6，可见共构建出16株酿酒酵母菌的系统发育树。
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