一种治疗腰椎间盘退变性疾病的制剂及制备方法
阅读：541发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种治疗腰椎间盘退变性疾病的制剂及制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及腰 椎间盘 医疗技术领域，具体涉及一种 治疗 腰椎间盘退变性 疾病 的制剂及制备方法。本发明所提供的治疗腰椎间盘退变性疾病的制剂包含间充质干细胞，所述间充质干细胞是经过软骨细胞的条件性培养基诱导培养的，有利于间充质干细胞的分化；所述间充质干细胞包裹有 水 凝胶，其在 机体 内的存活率和活 力 增强。本发明还提供用于上述治疗腰椎间盘退变性疾病的制剂的保温 注射器 ，所述保温注射器的管壁内填充有保温材料，确保内容物的 温度 ，有利于保持细胞的活性，减少机体应激反应。，下面是一种治疗腰椎间盘退变性疾病的制剂及制备方法专利的具体信息内容。
1.一种治疗腰椎间盘退变性疾病的制剂，其特征在于：包括用水凝胶包裹的间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的治疗腰椎间盘退变性疾病的制剂，其特征在于：所述治疗腰椎间盘退变性疾病的制剂含有的间充质干细胞的浓度是1×106个/mL。
3.权利要求1所述的治疗腰椎间盘退变性疾病的制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
①提取间充质干细胞；
②免疫荧光染色鉴定其表面抗原CD29、CD34、CD45、CD71、CD90、CD106的表达；
③将间充质干细胞培养至第三代，消化后用软骨细胞的条件性培养基进行培养，培养密度为1×105个/mL，37℃、5％CO2条件下培养24小时；
④水凝胶包裹间充质干细胞，每1mL水凝胶中包含1×106个间充质细胞。
4.权利要求1所述的治疗腰椎间盘退变性疾病的制剂的保温注射器，其特征在于：
包括注射器和限位装置，注射器包括注射器管、锥形活塞、推柄、乳头和注射针；注射器管是密封双层结构，双层结构之间是保温夹层，注射器管的一端是乳头，乳头内焊接注射针，注射器管内有锥形活塞，锥形活塞向外连接有推柄；所述限位装置包括螺纹套管、限位器和内螺纹管，所述螺纹套管套接于注射器乳头，螺纹套管外壁上有螺纹，所述内螺纹管和限位器通过内壁螺纹与螺纹套管连接，旋动限位器可以调整限位器相对于针管针头的位置，内螺纹管用于固定限位器。
5.根据权利要求4所述的治疗腰椎间盘退变性疾病的制剂的保温注射器，其特征在于：
所述保温夹层填充有泡沫材料、保温棉或保温橡胶。
6.根据权利要求4所述的治疗腰椎间盘退变性疾病的制剂的保温注射器，其特征在于：
所述注射针外壁上标记有刻度，刻度的起始点是针尖。
7.根据权利要求4所述的治疗腰椎间盘退变性疾病的制剂的保温注射器，其特征在于：
所述内螺纹管和限位器的外壁是齿纹状。
一种治疗腰椎间盘退变性疾病的制剂及制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及腰椎间盘医疗技术领域，具体涉及一种治疗腰椎间盘退变性疾病的制剂及制备方法。
背景技术
[0002] 腰痛(Low back pain，LBP)被认为是世界范围内致残的主要原因，全世界约有6.32亿受到腰痛的影响。尽管引发LBP的直接原因未知，但它的症状是和腰间盘(intervertebral disc，IVD)退化变形相关。腰间盘是两个椎骨之间的纤维软骨组织结构。
腰椎间盘突出症是较为常见的疾患之一，主要是因为腰椎间盘各部分(髓核、纤维环及软骨板)，尤其是髓核，有不同程度的退行性改变后，在外力因素的作用下，椎间盘的纤维环破裂，髓核组织从破裂之处突出(或脱出) 于后方或椎管内，导致相邻脊神经根遭受刺激或压迫，从而产生腰部疼痛，一侧下肢或双下肢麻木、疼痛等一系列临床症状。腰椎间盘突出症以腰4～5、腰5～骶1发病率最高，约占95％。
腰椎间盘突出症是较为常见的疾患之一，主要是因为腰椎间盘各部分(髓核、纤维环及软骨板)，尤其是髓核，有不同程度的退行性改变后，在外力因素的作用下，椎间盘的纤维环破裂，髓核组织从破裂之处突出(或脱出) 于后方或椎管内，导致相邻脊神经根遭受刺激或压迫，从而产生腰部疼痛，一侧下肢或双下肢麻木、疼痛等一系列临床症状。腰椎间盘突出症以腰4～5、腰5～骶1发病率最高，约占95％。
[0003] 腰椎间盘突出症是一种常见疾病，且由于其久治不愈，反复发作的特点，已严重影响到人们的生活质量。很多人一旦患了腰突，容易盲目的治疗，这其实是一种错误的做法，稍有不慎就会造成终生性的遗憾，因此，正确的认识腰突，采取最适合的治疗方法是治愈的关键。腰椎间盘突出的治疗方法很多，一般有牵引治疗、物理治疗(理疗和推拿、按摩)、封闭治疗，针刀疗法，手术疗法(常规开放手术、椎间盘镜微创手术、经皮穿刺的切吸术、胶原酶化学溶解疗法)，臭氧注射疗法，中药包热敷渗透疗法等，现有的治疗腰间盘突出的方法有许多，但是大多只能减轻症状，并不能根治腰间盘突出。然而，现有的治疗方法分别存在各自的缺陷，如下：
[0004] 1、牵引疗法只适用于椎间盘膨出患者，如果椎间盘已造成突出和脱出，进行牵引治疗是完全无效的，而且有可能加重病人的症状；
[0005] 2、物理治疗包括电疗、红外线照射、热疗等方法，和推拿、针灸等治疗目的基本相同，是以缓解病人的临床症状为主，而非根治手段；
[0006] 3、封闭治疗分两种应用方法，一种为椎管内封闭，一种为神经根封闭，椎管内封闭是直接用药物注射到椎管内，神经根封闭是把药物注射在神经根周围，封闭的效果就是止痛，突出物压迫无法解决，当封闭药效过后腰腿痛症状马上又恢复；
[0007] 4、针刀疗法是在针灸和封闭疗法的基础上发展来的一种新的治疗方法，其目的就是为封闭范围扩大创造条件，因此，小针刀治疗其实就是一种封闭疗法的改良，其治疗效果等同封闭；
[0008] 5、常规开放手术包括：全椎板切除、半椎板切除、经腹椎间盘手术、椎体融合术等。手术的目的是直接切除病变腰椎间盘髓核，解除神经根压迫而达到治疗目的。由于腰椎的特殊生理位置的限制，因此手术破坏了正常的腰椎骨生理结构，造成手术损伤大，易造成腰椎术后失稳，术后瘢痕组织粘连，术中误伤神经根等一系列不良反应；
[0009] 6、椎间盘镜微创手术避免了常规开放性手术的大损伤问题，减少手术的风险和并发症的发生，在显微外科和关节内窥镜辅助腰椎间盘手术，虽然是减少了手术过程中对正常骨关节的破坏，但手术视野变小之后，难以干净彻底摘除病变腰椎间盘髓核，增高了手术不成功的风险；
[0010] 7、经皮穿刺的切吸术经皮穿刺切吸可以显著降低椎间盘内压，减少突出的椎间盘内容物，从而减轻或消除突出物对神经的压迫症状。该方法的优点在于手术过程中损伤较小，但缺点是该手术以减压为主，对于椎间盘膨出有效，禁用于腰突症脱出、游离、合并钙化等类型，这样造成手术面太窄；
[0011] 8、近几年有极个别医院采用臭氧治疗腰突症。在理论上注射臭氧可以气化浓缩腰椎间盘髓核，但臭氧进入椎管内会有哪些化学反应和并发症有待进一步的观察与研究，从目前病人反馈来看，该治疗方法的成功率并不是太高。
[0012] 干细胞移植治疗是一门先进的医学技术，为一些疑难杂症的治疗带来了希望。干细胞移植治疗是把健康的干细胞移植到患者体内，以达到修复或替换受损细胞或组织，从而达到治愈的目的。干细胞移植治疗范围很广，一般能治疗神经系统疾病、免疫系统疾病、还有其他的一些内外科疾病。干细胞在医学界被称为“万用细胞”，它可以分化成多种功能细胞或组织器官。干细胞移植治疗是把健康的干细胞移植到患者体内，以达到修复或替换受损细胞或组织，从而达到治愈的目的。根据干细胞的分化潜能，其在制备治疗腰椎间盘退变性疾病的药物中具有应用价值。
发明内容
[0013] 针对上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种治疗腰椎间盘退变性疾病的制剂及制备方法，所述制剂包括用水凝胶包裹的间充质干细胞，间充质干细胞具有自我更新和多向分化能力，其分化的细胞和分泌的促生长因子可以有效地缓解退行性病变的发生和发展。
[0014] 一种治疗腰椎间盘退变性疾病的制剂，包括用水凝胶包裹的间充质干细胞。
[0015] 进一步，上述治疗腰椎间盘退变性疾病的制剂含有的间充质干细胞的浓度是1×106个/mL。
[0016] 本发明还提供上述治疗腰椎间盘退变性疾病的制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0017] ①提取间充质干细胞；
[0019] ③将间充质干细胞培养至第三代，消化后用软骨细胞的条件性培养基进行培养，培养密度为1×105个/mL，37℃、5％CO2条件下培养24小时；
[0020] ④水凝胶包裹间充质干细胞，每1mL水凝胶中包含1×106个间充质细胞。
[0021] 本发明还提供上述治疗腰椎间盘退变性疾病的制剂的保温注射器。根据所述制剂中含有活细胞需要保温的特性，所述保温注射器具有保温的作用。本发明提供的保温注射器技术方案如下：
[0022] 一种保温的腰间盘注射器，包括注射器和限位装置，注射器包括注射器管、锥形活塞、推柄、乳头和注射针；注射器管是密封双层结构，双层结构之间是保温夹层，注射器管的一端是乳头，乳头内焊接注射针，注射器管内有锥形活塞，锥形活塞向外连接有推柄；所述限位装置包括螺纹套管、限位器和内螺纹管，所述螺纹套管套接于注射器乳头，螺纹套管外壁上有螺纹，所述内螺纹管和限位器通过内壁螺纹与螺纹套管连接，旋动限位器可以调整限位器相对于注射针的位置，内螺纹管用于固定限位器。
[0024] 进一步，所述注射针外壁上标记有刻度，刻度的起始点是针尖。
[0025] 进一步，所述内螺纹管和限位器的外壁是齿纹状。
[0026] 本发明的有益效果：
[0027] 本发明所提供的治疗腰椎间盘退变性疾病的制剂含有间充质干细胞，现已有研究表明间充质干细胞移植疗法可以用于治疗腰椎间盘退变性疾病，本发明用水凝胶包裹间充质干细胞制成注射制剂，水凝胶包裹有利于提高间充质干细胞的存活率，为细胞的生长繁殖提供支持。
[0028] 本发明所提供的保温注射器是根据治疗腰椎间盘退变性疾病的制剂含有间充质干细胞的特性设计的，注射器的管壁是双层结构，其中填充保温材料，具有保温效果，防止注射液温度变化引发患者不适。注射器上设置了定位装置，控制注射时刺入的深浅，避免刺入过深损伤神经，刺入过浅达不到作用靶点。附图说明
[0029] 图1是制备治疗腰椎间盘退变性疾病的制剂的流程图；
[0030] 图2是保温注射器示意图；
[0031] 图中，1-注射器管；2-注射针；3-螺纹套管；4-限位器；5-内螺纹管；6-保温夹层；7-锥形活塞；8-推柄；9-乳头。
具体实施方式
[0032] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0033] 实施例1
[0034] 本实施例为治疗腰椎间盘退变性疾病的制剂的制备，包括以下内容：
[0035] 1获取间充质干细胞
[0036] 无菌条件下，从患者髂脊骨处穿刺抽取骨髓，用PBS缓冲液将得到的骨髓稀释，利用Ficoll-Paque密度梯度介质(1.077g/mL，GE Healthcare)收集有核细胞，室温下400×g离心35分钟，收集细胞沉淀，用无菌PBS缓冲液洗涤两遍，最后重悬于培养基中。所用培养基是添加了15％胎牛血清(FBS)的DMEM完全培养基，每隔一天更换一次培养基，并去除未贴壁的细胞。
[0037] 1.1 BMSCs表面抗原鉴定
[0038] (1)取消化后的细胞液滴加到盖玻片上，酸缸浸泡过夜，自来水冲洗10次，双蒸水冲洗3次，浸泡于75％酒精中备用；
[0039] (2)包被时取出75％酒精中的盖玻片，在酒精灯上烘干，放入 35mm2培养皿中，吸取0.5mL浓度为50μg/mL的多聚赖氨酸滴加在盖玻片上，37℃放置1h，回收多余的多聚赖氨酸。经紫外线照射30min 后在超净工作台内晾干；
[0040] (3)将预先经过灭菌处理并包被多聚赖氨酸的盖玻片置于 35mm2培养皿中，将第5代BMSCs用0.25％胰蛋白酶消化，按1×105个/mL密度接种，37℃、5％CO2条件下培养；
[0041] (4)待细胞生长至70％汇合时，去除培养基，进行免疫荧光染色鉴定其表面抗原CD29、CD34、CD45、CD71、CD90、CD106的表达。用PBS清洗，加入4％多聚甲醛固定，4℃过夜。PBS洗涤3 次后，分别滴加用PBS+NaN3(0.02％)+BSA(3％)+TritonX-100(0.2％) 稀释的单克隆抗体孵育，室温90min。PBS洗涤3次，细胞核用Hoechst 33258染色，室温放置5min并冲洗。用50％甘油缓冲液封片，荧光显微镜观察拍照。
[0042] 正常间充质干细胞都有CD29、CD34、CD45、CD71、CD90、 CD106的抗原表达，可以观察到阳性结果，Hoechst 33258染色后可以观察到细胞核呈蓝色。
[0043] 已有研究表明软骨细胞的培养基可以刺激间充质干细胞向软骨细胞分化。
[0044] 2获取软骨细胞培养基
[0045] 用含有15％FBS的DMEM完全培养基培养软骨细胞至细胞生长到对数生长期，收集培养过软骨细胞的条件性培养基，0.22μm滤器过滤，向其中添加10％FBS。
[0046] 3培养间充质干细胞
[0047] 将步骤1获得的间充质干细胞培养至第三代，消化后用步骤2所得的软骨细胞条件性培养基进行培养，培养密度为1×105个/mL， 37℃、5％CO2条件下培养24小时。
[0048] 4获得细胞液
[0049] 收获间充质干细胞，无菌生理盐水洗涤3次，无菌生理盐水重悬所得细胞，细胞密度为1-9.6×107个/mL。
[0050] 5包裹水凝胶
[0051] 按照透明质酸水凝胶试剂盒HyStem Hydrgel(BIOTIME)说明书制作0.8％的透明质酸水凝胶。用1mL注射器向HyStem管型瓶中添加0.5mL去离子水，将Extralink和HyStem按照1∶4比例混合，20min 内完成凝胶化。包封细胞时，先反应10min，然后用移液枪吹吸溶液，使细胞在凝胶中均匀分布，每1mL水凝胶中包含1×106个间充质细胞。
[0052] 实施例2
[0053] 实施例1所制备的治疗腰椎间盘退变性疾病的制剂中含有干细胞且为凝胶状，本发明还提供了用于注射所得制剂的注射器。
[0054] 一种保温的腰间盘注射器，包括注射器和限位装置，注射器包括注射器管1、锥形活塞7、推柄8、乳头9和注射针2；注射器管1是密封双层结构，双层结构之间是保温夹层6，注射器管1的一端是乳头9，乳头9内焊接注射针2，注射器管1内有锥形活塞7，锥形活塞7向外连接有推柄8；所述限位装置包括螺纹套管3、限位器4和内螺纹管5，所述螺纹套管3套接于注射器乳头9，螺纹套管3外壁上有螺纹，所述内螺纹管5和限位器4通过内壁螺纹与螺纹套管3连接，旋动限位器4可以调整限位器4相对于注射针2的位置，内螺纹管5用于固定限位器4。
[0055] 进一步，所述保温夹层6填充有泡沫材料、保温棉或保温橡胶。
[0056] 进一步，所述注射针2外壁上标记有刻度，刻度的起始点是针尖。
[0057] 进一步，所述内螺纹管5和限位器4的外壁是齿纹状。
[0058] 使用本发明的具体方法如下：
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