WO 00/44887 PCTtFROO/00109

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PEPTIDES ET PROTEINES APTES A DESENSIBILISER LES SUJETS ALLERGIQUES AU VENIN D'ABEILLE ET COMPOSITIONS LES CONTENANT.

La présente invention est relative à des peptides et à des protéines aptes à désensibiliser, de manière spécifique, la grande majorité des sujets allergiques au venin d'abeille, ainsi qu'à des compositions contenant lesdits peptides ou protéines.

L'allergie immédiate aux hyménoptères (abeille, guêpe, frelon) touche 15 à 20 % de la population, si l'on tient compte des tests cutanés à lecture immédiate (prick tests), mais seulement 0,1 à 0,5 % de la population est exposé à un accident de type anaphylactique (1, 2). Cette allergie se caractérise par des manifestations variables allant du gonflement local aux réactions systémiques comme l'urticaire, l'angiodème ou le choc anaphylactique. Compte tenu de la soudaineté des piqûres, la désensibilisation (immunothérapie spécifique ou ITS) par les venins constitue le traitement de choix de cette allergie mais n'est pas sans danger. En effet, 13 % des patients désensibilisés par le venin d'abeille et 5 % dans le cas du venin de guêpe sont victimes d'effets secondaires (3). La recherche d'une ITS mieux tolérée et aussi efficace est donc nécessaire, en particulier pour le venin d'abeille.

La rapidité des réactions observées chez les patients allergiques au venin d'abeille est caractéristique d'une allergie de type immédiate, qui est médiée par des IgE spécifiques des constituants du venin. Le mécanisme complexe de ces réactions est résumé ci-après.

Les IgE apparaissent progressivement sous l'action répétée des piqûres et avant que le moindre symptôme ne soit apparent. Bien que le venin de l'abeille comporte de nombreux peptides et protéines, tous les composants ne semblent par allergéniques (4). La mélittine par exemple n'induit des IgE que chez 30 % des patients, alors que la proportion s'élève à plus de 90 % pour la phospholipase A2 (PLA2) qui est, de fait, considérée comme l'allergène majeur (API ml) (4, 5). La séquence protéique de la phospholipase A2 du venin d'abeille (API ml) est illustrée à la figure 1 ; cette séquence est déduite de celle de l'ADNc complémentaire (36). Les IgE possèdent la propriété de se fixer par leur fragment Fc à des récepteurs situés sur les mastocytes tissulaires et les basophiles du sang. Lorsque WO 00/44887 PCTtFROO/00109

2 l'allergène se complexe aux IgE spécifiques fixées à la membrane des basophiles ou des mastocytes, il provoque la dégranulation de ces cellules et la libération de molécules qui sont responsables des principales manifestations observées lors de l'accident allergique. Les IgE ne sont cependant pas seules responsables de l'allergie car bien que le taux d'IgE soit un indicateur de la maladie, il n'a aucune valeur diagnostique de l'état des patients. Il n'est pas rare que des patients aient des taux élevés d'IgE sans présenter de symptômes. L'apparition des IgE chez les patients allergiques résulte de la production de cytokines de type TH2 telles que l'IL-4, l'IL-5 et l'IL-13 et est inhibée par la synthèse d'IFN-γ (6).

+ Ce sont principalement les lymphocytes T CD4 qui produisent ces cytokines. On retrouve effectivement chez les patients allergiques des cellules T spécifiques qui sécrètent plus d'IL-4 que d'IFN-γ, alors que les cellules T isolées chez des sujets non allergiques produisent plus d'IFN-γ que d'IL-4.

+ Les lymphocytes T CD4 de type TH2 et spécifiques des composants du venin participent donc activement à l'apparition et au maintien de l'allergie.

Pour protéger les sujets allergiques au venin d'abeille, il a été proposé, depuis longtemps, de désensibiliser les sujets allergiques par immunothérapie spécifique (ou ITS). Les mécanismes immunologiques de l'ITS, responsables de l'amélioration de l'état du patient restent mal compris. L'induction d'IgG spécifiques et

+ de sous-classe IgG4 (7) ainsi que la génération de cellules T CD8 suppressives (8) ont initialement été proposées pour rendre compte de l'efficacité du traitement. Mais plus récemment, il a été observé qu'au cours de la désensibilisation au venin d'abeille, la

+ prolifération des lymphocytes T CD4 spécifiques de l'allergène décroît alors que la sécrétion de l'IL-4 et de l'IL-5 diminue (9, 10) ou est détournée vers la production d'IFN-γ (11). Des résultats très similaires ont été également obtenus avec des aller- gènes de pollens (12). Ces observations semblent indiquer que l'amélioration de l'état du patient résulte d'une tolérance périphérique ou d'une dérive vers un profil de type

+ TH1 des lymphocytes T CD4 spécifiques de l'allergène. Elles sont de plus en accord avec des expériences effectuées chez l'animal. Il a été en effet montré pour plusieurs WO 00/44887 PCTtFROO/00109

_> antigènes que dans des conditions d'injection proches de celles utilisées pour désensibiliser (telles que l'injection sous-cutanée) l'anergie des lymphocytes T est induite alors qu'une forte réponse est observée pour les mêmes antigènes lorsqu'ils sont injectés en présence d'adjuvant (13, 14). L'ensemble de ces expériences permet de considé-

+ rer les lymphocytes T CD4 spécifiques du venin d'abeille comme les cellules cibles de l'immunothérapie.

Les lymphocytes T CD4 possèdent un récepteur T réarrangé qui leur permet de reconnaître sélectivement les fragments peptidiques issus de la dégradation de l'antigène par les cellules présentatrices et présentés par les molécules du Complexe Majeur d'Histocompatibilité de classe II (CMH II) (15). Les déterminants que portent ces fragments peptidiques et que reconnaissent effectivement les lymphocytes T sont appelés épitopes T.

Lors de la désensibilisation, ce sont ces déterminants qui sont reconnus par les lymphocytes T et qui donc constituent les éléments de base pour l'élaboration de molécules alternatives d'immunothérapie spécifique.

Il a été en effet observé in vivo chez la souris pour les allergènes Fel dl (poil de chat), Der pi (acarien : Dermatophagoïdes pterissimus) et Bet vl (pollen de bouleau) que l'administration par voie nasale, orale ou sous-cutanée de peptides porteurs d'épitopes T de ces allergènes inhibe l'activation des lymphocytes T spéci- fiques ( 16- 18) et module la réaction allergique (16, 18).

Idéalement, les molécules de désensibilisation doivent posséder tous les épitopes de l'allergène et être dépourvues de réactivité vis-à-vis des IgE, de manière à éviter les risques d'accidents.

Plusieurs types de molécules sont d'ores et déjà à l'étude y compris dans le cadre de l'allergie au venin d'abeille et sont constitués soit de fragments peptidiques, soit de protéines modifiées.

. Fragments peptidiques

Par une démarche empirique, l'utilisation de fragments peptidiques

(19) pour désensibiliser les patients allergiques a été à plusieurs reprises proposée comme alternative à la désensibilisation spécifique conventionnelle y compris pour l'allergie au venin d'abeille (20, 21).

Ces fragments ne possèdent généralement plus de réactivité vis-à-vis des IgE, mais peuvent également avoir perdu leur capacité à être reconnus par les lymphocytes T. Plus récemment, des fragments peptidiques d'allergène ont été choisis sur la base de leur capacité à stimuler des lymphocytes T de patients allergiques (22).

Dans le cas de l'allergène majeur du venin d'abeille (API ml), les fragments 50-69 et 83-97 ont été décrits comme étant actifs lors d'une étude compre- nant un seul patient (23).

Dans une étude comprenant quarante patients (24), ce sont les fragments 45-62 et 81-92 et 113-124 qui se sont révélés être actifs. Ces trois fragments ne sont épitopes T que pour 25 à 45 % des patients et les auteurs n'excluent pas l'existence d'autres épitopes (24, 25). Ces trois peptides sont en cours d'essai clinique et semblent donner des résultats encourageants (22). Muller et al. (22) les ont utilisés pour désensibiliser cinq patients allergiques dont les lymphocytes T prolifèrent en présence de ces peptides. Aucun effet systémique grave n'a été observé et les patients sont devenus tolérants aux piqûres d'abeille. Ceci démontre l'intérêt de l'utilisation de peptides pour désensibiliser, mais ne permet pas d'étendre l'utilisation de ces peptides à d'autres patients.

Un autre essai utilisant des peptides a été mis en place pour l'allergène du chat (Fel dl) (26). Plusieurs demandes relatives à des peptides du ragweed (WO 93/21321 ; WO 96/13589), du pollen du cèdre japonais (WO 93/01213 ; WO 94/01560) et du pollen de ray-grass (WO 94/21675 ; WO 94/16068) ont été déposées. Tous les peptides décrits dans ces demandes ont été choisis sur la base de la stimulation de lymphocytes T d'un échantillon de patients allergiques.

La démarche suivie par ces différents auteurs (23, 24 et 30) est basée sur des tests cellulaires et non sur des tests de liaison. Les résultats observés montrent que les peptides actifs varient selon les patients. Dans ces trois dernières études, les peptides contenant la zone 80-90 sont ceux qui sont le plus souvent épitope T. Ils montrent également que les lymphocytes de plusieurs patients sont stimulés par des peptides contenant la partie C-terminale de API ml .

Par exemple, Kâmmerer et al. (30) propose, selon le même principe du test de stimulation, d'utiliser de longs fragments d'API ml, en particulier le fragment 90-134. Toutefois, ces fragments sont spécifiques de certains patients et ne sont pas adaptés à un ensemble significatif de patients, du fait que leur sélection ne tient pas compte du type HLA des patients.

Les tests de stimulation permettent en effet de sélectionner des peptides adaptés à la désensibilisation d'un patient donné (22), mais ne permettent pas d'étendre l'utilisation de ces peptides à d'autres patients que ceux pour lesquels ils ont été élaborés.

. Protéines modifiées

Une autre alternative à l'utilisation d'allergènes natifs est celle d'allergènes modifiés de telle sorte qu'il n'y ait plus de réactivité vis-à-vis des IgE spécifiques de l'allergène, tout en conservant leur réactivité vis-à-vis des lymphocytes T. Les IgE étant principalement dirigées contre des épitopes conformationneis, la perte de réactivité peut être facilement obtenue en détruisant la structure tridimensionnelle de l'allergène ce qui ne modifie par les épitopes T. C'est ce qui a été fait pour des mutants de Der f2 (27) et Der p2 (28) dans lesquels des ponts disulfures ont été rompus. Une autre façon de procéder est d'introduire dans l'allergène des mutations ponctuelles qui affectent la reconnaissance des IgE sans modifier la structure tridimensionnelle (29). Le faible nombre de mutations introduites est censé ne pas modifier les épitopes T.

Les différences importantes observées entre études traduisent la variabilité interindividuelle des épitopes T et rendent évidemment difficile le choix des molécules de désensibilisation. De plus, ces études qui n'utilisent qu'un échantillon de patients allergiques ne permettent pas d'assurer que tous les épitopes T sont conservés dans la molécule de désensibilisation.

C'est pourquoi les Inventeurs se sont donnés pour but de pourvoir à un ensemble de peptides aptes à désensibiliser la grande majorité des sujets allergiques au venin d'abeille.

Un tel ensemble de peptides a pour propriété d'être efficace chez un grand nombre de sujets, alors que les peptides de l'Art antérieur sont actifs chez un sujet allergique mais peuvent être totalement inefficaces pour un autre sujet parce que ce dernier ne reconnaît pas l'allergène par les mêmes déterminants.

Pour ce faire, les Inventeurs ont défini une relation entre les séquences peptidiques de l'allergène majeur du venin d'abeille (API ml) et des molécules du CMH de classe II, aussi bien les allèles du gène HLA-DRB1 (1 ^er gène), que les allèles des gènes DRB3, DRB4 et DRB5 (2 ^ème gène), prépondérants dans les populations caucasiennes. Cette relation permet, de manière inattendue, de définir des molécules de désensibilisation et de traitement préventif de l'allergie au venin d'abeille qui tiennent compte du polymorphisme du CMH de classe II, notamment des molécules HLA-DR, et qui de par leur grande spécificité, induisent une meilleure désensibilisation qui se traduit par un risque significativement diminué des accidents (chocs) en cours de désensibilisation. Ceci représente un atout supplémentaire pour l'utilisation de tels peptides à titre préventif. Les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe II (HLA II chez l'homme) sont des hétérodimères exprimés sur les cellules présentatrices et présentent aux lymphocytes T CD4 les épitopes T des antigènes. Ces molécules sont capables de lier un répertoire important de peptides ayant des séquences très différentes, ce qui leur permet de présenter aux cellules T plusieurs peptides par antigène.

Il existe quatre types différents de molécules du CMH II par individu (2 HLA-DR, 1 HLA-DQ et 1 HLA-DP). La molécule HLA-DR dont la chaîne β est codée par le gène DRB1 (1 ^er gène) est la plus exprimée. On répertorie, actuellement plus de 200 allèles différents pour DRB 1 , qui définissent différents antigènes ou types, comme résumé dans le Tableau I ci-après. Tableau I : Molécules exprimées par différents allèles HLA-DRB1

Antigène Allèle Alias

DR1 DRB1*0101 DR1 DR2 DRB1*1501 DR2w2b DR3 DRB1 *0301 DR3wl7 DR4 DRB 1*0401 DR4w4

DRB 1*0405 DR4wl5

DR7 DRB 1*0701 DR7

DR8 DRB 1*0802 DR8w2

DR9 DRB 1 *0901 DR9

DRU DRB1*1101 DR5wl l

DR12 DRB1*1201 DR5wl2

DR13 DRB1*1301

DRB1*1302 DR6wl9

Chaque allèle possède ses propres propriétés de liaison. Il lie donc un répertoire de peptides qui lui est propre et qui diffère de celui d'un autre allèle, même sur un même antigène. La spécificité large des molécules HLA II et l'existence de plusieurs isoformes et d'un polymorphisme important font que de nombreux fragments différents de l'antigène peuvent être présentés aux lymphocytes T.

Les fréquences de chaque allèle (1 ^er gène) ne sont pas identiques et varient d'une population à l'autre (35) : - l'allèle DRB1*1304 représente à lui seul 25,4 % des allèles de la population sénégalaise contre 0 % en Allemagne et au Japon.

- l'allèle DRB 1*0301 est observé avec une fréquence de 10 % chez les sénégalais et les allemands mais seulement à 0,4 % chez les japonais.

- en France, seuls sept allèles dépassent les 5 %. Il s'agit des allèles DRB1 *0101, DRB1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701, DRB1 *1 101, DRB1 *1301 et

DRB1*1501, comme illustré au Tableau II, ci-après. Tableau II : Fréquence des allèles HLA-DR dans plusieurs populations caucasiennes

FRA DAN GER ΓΓA ROU SPA US CA

DRB 1 *0101 9,3 13,0 6,7 6,5 7,6 6,6 7,3 5,6

DRB 1 *0301 10,9 10,2 9,4 10,5 1 1.4 6,7 9,5 12,3

DRB 1 *0401 5,6 17,6 8, 1 2,3 4,2 5,6 6,7 9,5

DRB 1 *0701 14,0 14,8 12,3 12,5 8,3 18.9 14,4 9,4

DRB I* 1101 9,2 0,9 9,2 12,4 7,3 1 ,0 4,4 2,6

D,RB 1*1301 6,0 8,3 4,5 4,8 4,4 4,5 5, 1 4,7

DRB 1*1501 8,0 17,6 7,8 5,6 6,2 9,4 10,3 10,4

Total 63 82 58 55 49 53 58 55

Ils représentent à eux seuls 63 % de la population française. Ces mêmes allèles sont aussi les plus abondants dans les autres populations caucasiennes. Leurs fréquences varient de 53 % (en Espagne) à 82 % (au Danemark). Pour les États- Unis et le Canada, ils représentent respectivement 58 et 55 % de la population. Ils représentent donc à eux seuls 53 à 82 % des allèles des populations caucasiennes et font partie des différentes spécificités de séries HLA-DR.

Le 2 ^ème gène code pour les molécules HLA-DRB3, -DRB4 et DRB5 qui sont des molécules HLA-DR dont la chaîne β n'est pas codée par le gène DRB1. Bien que moins connues que les molécules issues du 1 ^er gène, ces molécules HLA sont fonctionnelles et sont capables de présenter des peptides aux lymphocytes T (56-59). Leur principal intérêt pour l'immunothérapie est que des allèles comme DRB3*0101 (9,2 %), DRB4*0101 (28,4 %) et DRB5*0101 (7,9 %) sont très fréquents dans la population caucasienne. Ils couvrent à eux seuls 45 % de la fréquence génique. Ils sont systématiquement associés à une autre molécule HLA-DR et peuvent donc compléter sa spécificité. Il existe un fort déséquilibre de liaison entre le 1 ^er et le 2 ^eme gène, c'est-à- dire qu'un 2 ^eme gène est très souvent associé à des allèles particuliers du 1 ^er gène. L'ensemble des gènes et pseudo gène DR présents sur un même chromosome consti- tue un haplotype DR (figure 5). Chaque haplotype est défini par la deuxième molécule DR qui le caractérise.

Le rôle des molécules de CMH II dans l'allergie a historiquement été initié par la découverte d'association entre le taux d'IgE contre un allergène donné et certains allèles. Ces associations concernent de nombreux allergènes de faible masse moléculaire comme Amb a5, Loi p3 et Amb a6 (31) qui sont les allergènes pour lesquels les risques relatifs sont les plus importants. Ces associations ne sont pas systématiques ou correspondent à des risques relatifs très faibles.

Dans le cas du venin d'abeille, il a été montré que l'allèle HLA-DR7 est plus fréquent chez les patients allergiques que dans la population témoin (32) alors que l'allèle HLA-DR4 est au contraire sous-représenté chez les allergiques au venin d'abeille (33).

Le contrôle de la réponse en IgE (et en IgG) par les molécules de dk classe II est encore plus clair chez la souris (34). Les souris H-2 et H-2 sont en effet b bonnes répondeuses alors que les souris H-2 répondent peu ou pas à cet allergène.

La présente invention a pour objet des peptides aptes à désensibiliser un sujet allergique au venin d'abeille, caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par :

- le fragment (1) correspondant aux positions P85-97 de l'allergène majeur du venin d'abeille,

- le fragment (2) correspondant aux positions P 81-93 de l'allergène majeur du venin d'abeille,

- le fragment (3) correspondant aux positions P 94-106 de l'allergène majeur du venin d'abeille, - le fragment (4) correspondant aux positions P76-88 de l'allergène majeur du venin d'abeille,

- le fragment (5) correspondant aux positions P77-94 de l'allergène majeur du venin d'abeille,

- le fragment (6) correspondant aux positions PI 22- 134 de l'allergène majeur du venin d'abeille, et - les fragments mutés desdits fragments (1) à (6) qui présentent une activité de liaison aux molécules du CMH de classe II identiques ou supérieures à celles desdits fragments (1) à (6).

Les fragments (1) et (2) forment le groupe I ; le fragment (3) forme le groupe II ; les fragments (4) et (5) forment le groupe III et le fragment (6) forme le groupe IN.

De tels peptides comprennent des déterminants ou épitopes T qui interagissent avec une ou plusieurs molécules HLA-DR issus des gènes DRB 1 ou autres DRB (DRB3, DRB4 et DRB5). La présente invention englobe également les peptides tels que définis ci-dessus, polymérisés.

Le site de liaison des peptides aux molécules de classe II est situé entre les hélices α des domaines αl et 2 et forme un sillon ouvert aux deux extrémités. Cette ouverture permet la liaison de peptides ayant des tailles variables, en général de 13 à 25 acides aminés. L'ancrage des peptides aux molécules du CMH II se fait grâce à des liaisons hydrogène entre le squelette du peptide et des acides aminés du sillon et grâce à des résidus qu'accommodent des poches de spécificité. Cinq poches, dénommées PI, P4, P6, P7 et P9, correspondent à l'acide aminé du peptide qu'elle accommode, la première position étant celle qui est dans la première poche, accueillent des acides aminés du peptide et sont composées de résidus conservés ou polymorphes. Les résidus polymorphes sont responsables des différences de spécificité entre molécules de CMH II. Comme le site de liaison est ouvert, deux peptides liant une molécule de CMH II peuvent le faire selon différents modes, c'est-à-dire en utilisant des résidus d'ancrage différents dans leur séquence. Des peptides P81-93 et P85-97 mutés au niveau d'au moins un résidu correspondent à l'une des poches PI, P4, P6, P7 et P9 sont en particulier incluent dans l'invention.

De manière à pouvoir introduire des résidus qui préservent ou augmentent l'activité de liaison, les modes d'interaction des peptides P81-93 et P85- 97 vis-à-vis des molécules HLA-DR capables de les lier ont été étudiés. L'approche choisie a été d'introduire à chaque position une alanine de manière à évaluer le rôle de la chaîne latérale dans l'interaction ou une lysine qui est un acide aminé basique et encombrant. S'il y a lieu, une combinaison de mutations a été introduite. A titre d'exemple, on observe sur la figure 6 une baisse d'activité provoquée par les substitutions de la phénylalanine 88 par une lysine ou une alanine. D'autres baisses d'activité sont observées à des positions situées à 3, 5 et 8 acides aminés de la phénylalanine 88. Ce profil d'activité correspond à un mode de liaison où les positions F88, 191, T93 et Y96 sont accommodées par respectivement les poches PI, P4, P6 et P9 des molécules HLA-DRB3*0101, HLA-DRB5*0101, HLA-DRB1*1301 et HLA-DRB 1*0701. Ce mode d'association a été confirmé par modélisation moléculaire pour les complexes : P85-97/DRB3*0101, P85-97/DRB5*0101 et P81-93/DRB4*0101. L'ensemble des résultats est donné figure 7. On constate que sur la séquence 81-97, il existe au moins six modes de liaison aux molécules HLA-DR. On remarque également que le mode I est commun à huit molécules alors que les modes V et VI sont propres à une seule molécule. Le fait que l'on puisse très exactement savoir comment le peptide se positionne sur chaque molécule HLA-DR permet de proposer des modifications de séquence :

* sur les positions PI, P4, P6, P7 et P9, il est possible d'introduire des modifications qui sont compatibles avec les spécificités connues des molécules HLA (61). Il est par exemple probable que la tyrosine 87 puisse être changée par une phénylalanine sans aucune perte d'activité. En revanche, la substitution de la phénylalanine 88 par une tyrosine ne devrait pas causer de perte d'activité pour, par exemple, les molécules DRB1*0101 et DRB1*0401 mais devrait diminuer l'activité du peptide pour des molécules comme DRB1 *0301 ou DRB3*0101. * il est également possible d'augmenter l'affinité du peptide en modifiant de manière optimale les résidus PI, P4, P6, P7 et P9. C'est ce qui a été fait pour les résidus 89 et 84. Le résidu 89 peut être avantageusement modifié en leucine ou en thréonine (Tableau IX). En particulier, la substitution par la leucine augmente l'affinité du peptide 85-97 d'un facteur 10 et 12 pour respectivement les molécules DRB3*0101 et DRB1*0301. Dans le cas de DRB 1 *0301, cette augmentation s'explique par le fait que l'asparagine N89 en position PI n'est pas optimale pour cette molécule contrairement à la leucine (61). De même, la substitution de la glycine 84 par une alanine augmente l'affinité d'un facteur 5 pour DRB1 * 1501. Cette augmentation est en accord avec le positionnement de la glycine 84 en P 1 et devrait être encore plus élevée si on introduit un résidu hydrophobe tel que la leucine ou l'isoleucine. En revanche, la substitution de l'acide aspartique D92 systématiquement diminue l'affinité pour DRB1*0301. Cette baisse d'activité est conforme au rôle d'ancrage de l'acide aspartique en P4 pour cette molécule.

* sur les positions, P-2, Pl, P2, P3, P5, P8, P10 et PI 1 des modifications peuvent être introduites sans crainte de provoquer des pertes majeures d'affinité.

Tableau IX : Activités relatives des peptides modifiés par rapport au peptide P85-97A.

Peptides

N89L N89T D92N D92L D92T

DRB1*0101 2 1 2 1 2

DBR1*0301 12 7 -57 -29 -12

DRB1*0401 4 2 3 -2 4

DRB 1*0701 4 3 *> j 12 9

DRB1 *1101 8 2 8 7 13

DRB1*1301 1 1 1 2 1

DRB3*0101 10 2 1 2 2

DRB5*0101 1 -1 2 2 2

Les peptides N89L, N89T, D92N, D92L, D92T sont des analogues du peptide P85-97A. La première lettre correspond à l'acide aminé d'origine, le numéro à sa position dans la séquence d'Api ml et la deuxième lettre à la modification introduite. Les données correspondent aux ratios entre les IC ₅₀ des analogues et celle du peptide de référence P85-97A. Un signe - signifie une perte d'activité et l'absence de signe signifie une augmentation d'activité.

Le peptide P85-97A possède une alanine en position 95 en remplacement de la cystéine. Cette substitution ne provoque pas de modification de l'activité quelle que soit la molécule HLA-DR. Conformément à l'invention, au moins l'une des positions PI, P4, P6 et P9 des fragments (1), en référence à la figure 7 est mutée.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, lesdits fragments (1) comportent l'un des acides aminés mutés suivants : N89L, N89T, C95A, G84L, G84I. Egalement conformément à l'invention, au moins l'une des positions

P-2, Pl, P2, P3, P5, P8, P10 et PI 1 des fragments (1), en référence à la figure 7, est mutée.

La présente invention a également pour objet des compositions désensibilisantes pour les allergies au venin d'abeille, caractérisées en ce qu'elles comprennent :

- au moins un peptide sélectionné dans le groupe A constitué par :

* les peptides de groupe I, tel que défini ci-dessus et

* les peptides constitués par des fragments d'au moins 13 acides aminés qui sont inclus dans ou comprennent le fragment correspondant aux positions P81-97 de l'allergène majeur du venin d'abeille (API ml), qui se lient au moins aux molécules HLA-DR codées par les allèles HLA DRB1 *0101, DRB 1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701, DRB1*1101, DRB1 *1301 et DRB1*1501 (molécules DR1, DR3, DR4, DR7, DRU, DR13 et DR2), avec une activité de liaison < 1000 nM et - au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

De telles compositions particulièrement bien adaptées au patient peuvent avantageusement être utilisées à titre préventif ou à titre curatif.

Selon un mode de réalisation avantageux desdites compositions, elles sont constituées de préférence par un mélange de peptides comprenant : - au moins un peptide de groupe A tel que défini ci-dessus et au moins un autre peptide sélectionné dans les groupes suivants :

- les peptides sélectionnés dans le groupe B constitué par :

* les peptides de groupe II, tel que défini ci-dessus et

* les peptides constitués par des fragments d'au moins 13 acides aminés qui sont inclus dans ou comprennent le fragment correspondant aux positions

94-106 de l'allergène majeur du venin d'abeille (API ml) et qui se lient au moins aux molécules HLA-DR exprimées par les allèles DRB1 *0101, DRB 1 *0401 et DRB1 *1101 (molécules DR1, DR4 et DR1 1), avec une activité de liaison < 1000 nM, - les peptides sélectionnés dans le groupe C constitué par :

* les peptides de groupe III, tel que défini ci-dessus et * les peptides constitués par des fragments d'au moins 13 acides aminés qui sont inclus dans ou comprennent le fragment correspondant aux positions P76-94 de l'allergène majeur du venin d'abeille et qui se lient au moins aux molécules HLA-DR exprimées par les allèles DRB 1*0701, DRB1 *1101 et DRB 1* 1501 (molécules DR7, DR11 et DR2), avec une activité de liaison < 1000 nM et - les peptides sélectionnés dans le groupe D constitué par :

* les peptides de groupe IV tel que défini ci-dessus et

* les peptides constitués par des fragments d'au moins 13 acides aminés qui sont inclus dans ou comprennent le fragment correspondant aux positions P122-134 de l'allergène majeur du venin d'abeille et qui se lient au moins aux molé- cules HLA-DR exprimées par les allèles DRB1*1101, DRB1*1301 et DRB1*1501 (molécules DR1 1, DR13 et DR2), avec une activité de liaison < 1000 nM.

Selon un autre mode de réalisation desdites compositions, elles comprennent en outre, éventuellement, le peptide correspondant aux positions PI 8-30 et/ou le peptide correspondant aux positions P45-62 et/ou le peptide correspondant aux positions P 57-74 et/ou le peptide correspondant aux positions P65-82 et/ou le peptide correspondant aux positions PI 11-123, de l'allergène majeur du venin d'abeille, conformément aux Tableaux Illa et Illb ci-après et/ou les peptides incluant les peptides précités.

Tableau Ma : Peptides représentatifs des différentes zones d'interaction entre l'allergène majeur du venin d'abeille et les molécules HLA-DR (1 ^er gène) codées par le gène DRB1

101 401 1101 701 301 1301 1501

PI 8-30 P45-62

P57-74

P65-82 P76-88

P77-94 P77-94

P81-93

P85-97 P85-97 P85-97 P85-97 P85-97 P85-97

P94-106 P94-106 P94-106 Pl l l-123 P122-134 P122-134 P122-134

Tableau IHb : Peptides représentatifs des différentes zones d'interaction entre l'allergène majeur du venin d'abeille et les molécules HLA-DR (2 ^eme gène) dont la chaîne β n'est pas codée par le gène DRB1.

Allèles HLA-DR (2 ^eme gène) Fréquence cumulée ³

B5*0101 B4*0101 B3*0101

21-38 7,9

45-62 7,9

53-70 9,2

77-94 77-94 17,1

81-93 28,4

85-97 85-97 ^a 17,1

89-101 28,4

94-106 7,9

11 1-123 111-123 111-123 45,5

122-134 122-134 122-134 45,5

Ces peptides sont représentatifs des zones d'interaction avec les 2 ^e molécules HLA-DR. Ils font partie des peptides les plus actifs pour une zone donnée et sont le plus court possible. ^a : les fréquences cumulées entre les allèles de gènes différents n'ont un sens que parce que les 2 ^emes molécules se comportent dans la population cauca- sienne comme une même série allélique.

De manière avantageuse, dans lesdites compositions :

- les peptides de groupe I peuvent avantageusement être concaténés pour former un seul peptide (P81-97) et/ou

- les peptides de groupe III peuvent avantageusement être concaténés pour former un seul peptide (P76-94) correspondant aux positions P81-97 de l'allergène majeur du venin d'abeille et/ou

- les peptides de groupe II et de groupe III peuvent avantageusement être concaténés, pour former un seul peptide (P76-106) correspondant aux positions P81-97 de l'allergène majeur du venin d'abeille. De manière générale, les compositions selon l'invention comprennent au moins un peptide englobant au moins un de ceux décrits au Tableau III et qui sont adaptés au patient à désensibiliser.

Ces compositions désensibilisantes sont définies à partir des activités de liaison aux molécules HLA-DR des peptides qu'elles comprennent, de la fréquence d'allèles vis-à-vis desquels elles sont actives et de la complémentarité des zones d'interaction ou épitopes que portent lesdits peptides.

Pour un patient, pour lequel on ne connaît pas les molécules HLA- DR qu'il porte, on utilisera de préférence une composition selon l'invention qui comprend au moins un peptide de groupe A. On peut y adjoindre, de manière avantageuse et de manière à augmenter le nombre d' épitopes : un peptide de groupe B ; un peptide de groupe C ; un peptide correspondant à la concaténation d'un peptide de groupe B et d'un peptide de groupe C et/ou un peptide de groupe D.

Pour les patients pour lesquels on connaît les molécules HLA, on utilisera soit les peptides précédemment définis, soit une combinaison de peptides englobant au moins ceux décrits aux Tableaux Illa et Illb, qui correspondent aux allèles que possèdent le patient.

Les peptides inclus dans lesdites compositions ont été avantageusement sélectionnés à l'aide d'un test de liaison HLA-DR/peptides comprenant (i) l'incubation des molécules HLA-DR purifiées, sélectionnées parmi celles concernant plus de 5 % d'une population donnée et notamment les molécules HLA DR1, DR3, DR4, DR7, DRU, DR13 et DR2, simultanément avec différentes concentrations de fragments de 13 à 18 acides aminés chevauchants et couvrant entièrement la séquence de l'API ml et avec un réactif RI constitué d'un fragment peptidique associé à un marqueur non radioactif, tel que la biotine et dont la séquence est différente desdits peptides et est choisie de manière à ce qu'il présente une affinité vis-à-vis de la molécule HLA-DR choisie, telle qu'il puisse être utilisé à une concentration < 200 nM, (ii) le transfert des complexes obtenus sur une plaque de type ELISA, préalablement sensibilisée avec un anticorps spécifique de tous les HLA-DR, (iii) révélation des complexes molécules HLA-DR/réactif RI, fixés au fond de la plaque au moyen de conjugués convenables, tels que streptavidine-phosphatase et d'un substrat fluorescent, (iv) sélection des peptides comprenant des épitopes différents, c'est-à-dire les plus représentatifs des différentes zones d'interaction entre l'allergène majeur du venin d'abeille et les molécules HLA-DR et (v) choix des peptides les plus adaptés, en fonction de la fréquence des allèles vis-à-vis desquels ils présentent une activité de liaison < 1000 nM, correspondant à la concentration de ce peptide qui inhibe 50 % de la liaison du réactif RI (IC ₅₀ ).

Ces tests permettent, de manière non ambiguë, d'associer à chaque allèle du 1 ^er gène ou du 2 ^eme gène, les séquences des fragments capables de s'y lier ou au contraire qui ne s'y lient pas. Cette démarche permet de définir des compositions désensibilisantes incluant des peptides qui se lient au plus grand nombre de molécules HLA-DR différentes et qui peuvent être ainsi avantageusement désensibilisantes pour la majorité des patients, même si l'on ne connaît pas leurs molécules HLA.

Cette démarche a en outre l'avantage de permettre la sélection de peptides signifîcativement plus spécifiques vis-à-vis de la plupart des sujets allergiques que les démarches cherchant à sélectionner des peptides sur la base de leur capacité à stimuler des lymphocytes T de sujets allergiques.

Ainsi, les Inventeurs ont trouvé que seulement certains peptides ont une activité de liaison vis-à-vis de plusieurs des allèles les plus fréquents dans la population caucasienne conformément aux Tableaux Illa et Illb. a présente invention a également pour objet des compositions désensibilisantes pour les allergies au venin d'abeille, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une phospholipase A2 de venin d'abeille modifiée, dans laquelle les zones comprenant les peptides tels que définis ci-dessus sont conservées et les zones en dehors des zones précitées sont modifiées, de telle sorte qu'elles ne présentent plus de réactivité aux IgE et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Lesdites zones sont notamment modifiées par mutation ponctuelle ou délétion. La PLA2 de venin d'abeille est en effet capable d'accueillir de nombreuses mutations et délétions (53, 54). Il est donc possible d'obtenir des mutants n'ayant plus de réactivité aux IgE, comme ceux obtenus pour Bet VI (55). Par exemple, le mutant de PLA2 d'abeille dans lequel la lysine en position 25 a été substituée est beaucoup moins antigénique pour des sérums d'apiculteurs que la molécule native (55).

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une phospholipase A2 de venin d'abeille modifiée, dans laquelle les zones comprenant les peptides tels que définis ci-dessus sont conservées et les zones en dehors des zones précitées sont modifiées, de telle sorte qu'elles ne présentent plus de réactivité aux IgE, pour la préparation d'une une composition désensibilisantes pour les allergies au venin d'abeille. Les peptides aptes à être inclus dans une composition désensibilisante pour les allergies au venin d'abeille peuvent avantageusement être sélectionnés par un procédé qui comprend :

(i) l'incubation des molécules HLA-DR purifiées sélectionnées parmi celles concernant soit moins de 5 % d'une population donnée, c'est-à-dire celles constituées par d'autres HLA-DR que les molécules HLA DR1, DR3, DR4, DR7,

DRU, DR13 et DR2, soit des molécules HLA-DR d'un patient donné, simultanément avec différentes concentrations de fragments de 13 à 18 acides aminés chevauchants et couvrant entièrement la séquence de l'API ml et avec un réactif RI constitué d'un fragment peptidique associé à un marqueur non radioactif tel que la biotine et dont la séquence est différente des peptides, tels que définis ci-dessus (groupes A à D) et est choisie de manière à ce qu'il présente une affinité vis-à-vis de la molécule HLA-DR choisie, telle qu'il puisse être utilisé à une concentration < 200 nM, (ii) le transfert des complexes obtenus sur une plaque de microtitration, préalablement sensibilisée avec un anticorps spécifique de toutes les molécules HLA-DR, (iii) la révélation des complexes molécules HLA-DR/réactif RI, fixés au fond de la plaque au moyen de conjugués convenables, tels que streptavidine-phosphatase et d'un substrat fluorescent, (iv) la sélection des peptides comprenant des épitopes différents, c'est-à-dire les plus représentatifs des différentes zones d'interaction entre l'allergène majeur du venin d'abeille et les molécules HLA-DR étudiées et (v) le choix des peptides les plus adaptés, en fonction de la fréquence des allèles vis-à-vis desquels ils présentent une activité de liaison < 1000 nM, correspondant à la concentration de ce peptide qui inhibe 50 % de la liaison du réactif RI (IC ₅₀ ).

Les conditions d'incubation sont propres à chaque molécule HLA- DR (temps d'incubation, pH, réactif RI, concentration en HLA-DR ou en peptide).

Le réactif RI est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences suivantes :

PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: l), spécifique des allèles DRB1 *0101,

DRB1*0401, DRB1*1101,

EAEQLRAYLDGTGVE (SEQ ID NO:2), spécifique de l'allèle DRB1 *1501,

AKTIAYDEEARGLE (SEQ ID NO:3), spécifique de l'allèle DRB1*0301, AAYAAAKAAALAA (SEQ ID NO:4), spécifique de l'allèle DRB 1 *0701 , TERVRLVTRHIYNREE (SEQ ID NO:5), spécifique de l'allèle DRB1 *1301, ESWGAVWRIDTPDKLTGPFT (SEQ ID NO:6), spécifique des allèles DRB 1 * 1301, DRB3*0101, et AGDLLAIETDKATI (SEQ ID NO:7), spécifique des allèles DRB 1 *0701 et DRB4*0101.

D'autres réactifs RI peuvent être utilisés, notamment ceux décrits dans Southwood et al. (52).

Pour étudier les molécules HLA-DR (2 ^eme gène), cela nécessite des paires appropriées de peptides biotinylés qui doivent lier la préparation à faible concentration et être sélectifs d'une des deux molécules. Plus précisément, la liaison des peptides biotinylés doit être inhibée efficacement par leur homologue non bioti- nylé, mais peu perturbée par la forme non biotinylée de l'autre peptide (Tableau X). De tels peptides ont pu être trouvés pour chacune des molécules DRB3*0101, DRB4*0101 ou DRB5*0101.

Au moyen de ces tests, les peptides d'Api ml qui lient ces molécules ont été définis. Le même ensemble de peptides que précédemment a été utilisé : des peptides de 18 acides aminés qui couvrent la séquence de l'allergène et des peptides de 13 résidus qui couvrent de manière exhaustive des zones particulières. Les résultats obtenus sont illustrés au Tableau X ci-après.

L'allèle DRB5*0101 interagit avec sept régions différentes de Api ml. Seulement quatre et cinq régions de Api ml peuvent lier respectivement les allèles DRB4*0101 et DRB3*0101. Elles sont principalement situées dans la partie centrale et C-terminale de l'allergène. Les peptides PI 11-123 et 122-134 lie en effet les trois deuxièmes molécules. Il est également intéressant de noter qu'il existe des peptides communs aux 1 ^ères et 2 ^emes molécules DR, notamment les peptides P81-93 et P85-97.

Tableau X : Sensibilité et sélectivité des traceurs peptidiques biotinylés.

Peptides l ^eres DR e es DR allèle IC ₅₀ (nM) allèle IC ₅₀ (nM)

Bl 21-36 Bl *1301 275 B3*0101 35000 LOL 191-210 B1 301 > 100000 B3*0101 5

YKL B 1 *0701 35 B4*0101 950 E2/E168 B 1 *0701 5000 B4*0101 2

A3 152-166 Bl *1501 33 B5*0101 85000 HA 306-318 Bl *1501 2500 B5*0101 6,5

La sélectivité de chaque peptide est évaluée par 1TC ₃₀ du peptide non biotinylé testé sur chacune des molécules. Pour chaque paire, le premier peptide est celui qui est sélectif de la l ^ere molécule DR et le deuxième de la 2 ^ee molécule DR.

Les séquences des peptides sont les suivantes : Bl 21-36 (TERVRLVTRHIYNREE) (SEQ ID NO:5) (62), LOL 191-210 (ESWGAVWRIDTPDKLTGPFT) (SEQ ID NO:6) (63), YKL (AAYAAAKAAALAA) (SEQ ID NO:4) (64), HA 306-318 (PKYVKQNTLKLAT) (SEQ ID NO:l) (65), A3 152-166 (EAEQLRAYLDGTGVE) (SEQ ID NO :2) (65), E2/E168 (AGDLLAIETDKATI) (SEQ ID NO:7).

De manière surprenante, le procédé de sélection selon l'invention est adapté à n'importe quelle molécule d'HLA-DR.

La présente invention a également pour objet un kit de sélection de peptides aptes à désensibiliser un sujet allergique au venin d'abeille, caractérisé en ce qu'il comprend différentes concentrations de fragments de 13 à 18 acides aminés chevauchants et couvrant entièrement la séquence de l'API ml, un ensemble de réac- tifs RI constitués chacun d'un fragment peptidique associé à un marqueur non radioactif, tel que la biotine et dont la séquence est différente des peptides tels que définis ci-dessus (groupes A à D) et est choisie de manière à ce qu'il présente une affinité vis-à-vis de la molécule HLA-DR choisie, telle qu'il puisse être utilisé à une concentration < 200 nM et un anticorps spécifique de toutes les molécules HLA-DR. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre du procédé objet de la présente invention, ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels :

- la figure 1 représente la séquence protéique de la phospholipase A2 (API ml) du venin d'abeille, déduite de celle de l'ADN complémentaire,

- la figure 2 illustre l'activité de liaison aux molécules HLA-DR des peptides de treize acides aminés qui couvrent la séquence 15-37 de l'allergène majeur du venin d'abeille. Les résultats sont exprimés sous la forme de 1/IC ₅₀ . L'unité est la M ^"1 ; - la figure 3 illustre l'activité de liaison des peptides de treize acides aminés qui couvrent la séquence 107-134 de l'allergène majeur du venin d'abeille aux molécules HLA-DR. Les résultats sont exprimés sous la forme 1/IC ₅₀ . L'unité est la

M ^"1 ; - la figure 4 illustre les fréquences des déterminants de API ml dans la population caucasienne. Cette représentation est basée sur les fréquences des allèles étudiés dans la population française. Dans d'autres populations caucasiennes, on retrouve sensiblement le même profil ;

- la figure 5 illustre la structure des gènes du CMH de classe HLA- DR par haplotype ; dans cette figure, les gènes sont schématisés par des blocs noirs et les pseudo-gènes par des blocs hachurés. Le nom des gènes est donné au dessus du bloc et celui des principaux allèles présents dans l 'haplotype est reporté sous le bloc ;

- la figure 6 illustre la localisation des résidus d'ancrage du peptide P85-97 sur les molécules HLA-DR. Chaque position a été substituée par une alanine ou une lysine. Les résultats sont donnés en activité relatives par rapport au peptide P85-97A (0,01 signifie une perte relative d'un facteur 100) ;

- la figure 7 illustre les modes de liaison de la séquence 81-97 aux molécules HLA-DR. Les blocs schématisent le site de liaison des molécules HLA-DR que caractérisent les poches PI, P4, P6, P7 et P9. Une couleur et un numéro en chiffre romain ont été attribués à chaque mode afin de faciliter leur visualisation ; et

- la figure 8 illustre la réponse des lymphocytes T de patients allergiques au venin d'abeille, aux peptides qui couvrent la séquence d'Api ml ; les PBMC des patients allergiques ont été cultivées pendant 7 jours en présence d'Api ml. AJ=7 et J=10 de 1TL2 (50 U/ml) a été rajoutée. AJ=14, les cellules ont été récoltées puis incubées en présence des différents peptides. La prolifération des cellules a été estimée par incorporation de thymidine tritiée. Composition des pools : pool 1 : Pl-18, P5-22, P9-26, pool 2 : P13-30, P17-34, P21-38, pool 3 : P25-42, P29-46, P33-50, P37-54, pool 4 : P41-58, P45-62, P49-66, pool 5 : P53-70, P57-74, pool 6 : P61-78, P65-82, P69-86, P73-90, pool 7 : P77-94, P81-98, P85-102, P89-106, P93-110, pool 8 : P97- 114, P101-118, pool 9 : P105-122, P109-126, PI 13-130, PI 17-134. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLE 1 : Principe des tests de liaison. - Synthèse des peptides

Les peptides qui couvrent la séquence de l'allergène majeur du venin d'abeille (figure 1) ont été choisis à partir de la séquence déduite de celle de l'ADN complémentaire correspondant (36). Tous les peptides ont été synthétisés selon la stratégie Fmoc en synthèse parallèle sur phase solide, purifiés par HPLC et contrôlés par spectrométrie de masse (ES-MS).

. Purification des molécules HLA-DR

Les molécules HLA-DR sont purifiées à partir de différentes lignées EBV homozygotes (52) par immunoaffinité. On peut notamment utiliser la méthode décrite dans Southwood et al. (52). Leur origine et les différents allèles qui les caracté- lisent sont décrits dans le Tableau IV.

Tableau IV

Lignées Spécificités Allèles DRB 1 Autres allèles DRB

LG2 (52) HLA-DR1 DRB1*0101 HOM2 SCHU HLA-DR2 DRB1 *1501 DRB5*0101 MAT (52) HLA-DR3 DRB1*0301 DRB3*0101 STEILIN BOLETH HLA-DR4 DRB 1 *0401 DRB4*0101 PREISS (52) PITOUT (52) HLA-DR7 DRB 1*0701 DRB4*0101 SWEIG (52) HLA-DR11 DRB1 *1101 DRB3*0202 HHKB (46) HLA-DR13 DRB1 *1301 DRB3*0101

Les hybridomes sécréteurs d'un anticorps monomorphique spécifique des molécules HLA-DR est notamment celui décrit dans Southwood et al. (52) ou celui décrit dans Posch et al. (42). Les anticorps sont purifiés à partir de surna- géants de culture sur des colonnes de Protéine A-Sépharose. Ces anticorps sont couplés sur des colonnes Sépharose 4B ou Protéine A-Sépharose pour la purification des molécules HLA-DR.

. Tests de liaison HLA-DR/peptides Les tests de liaison des peptides aux molécules HLA-DR sont des tests en compétition avec une révélation immuno-enzymatique, initialement mis au point par Hill sur la molécule HLA-DR (37). Ils sont effectués en plaques 96 puits, ce qui permet d'étudier dans la même expérience de nombreux échantillons. Brièvement, les molécules HLA-DR purifiées sont incubées avec un peptide biotinylé qui sert de traceur et différentes concentrations du peptide à tester.

Après 24 à 72 heures d'incubation, les échantillons sont neutralisés, puis 100 μl de chaque échantillon sont transférés sur une plaque ELIS A préalablement sensibilisée par l'anticorps monomorphique spécifique des molécules HLA-DR. Les complexes molécules HLA-DR/peptides biotinylés, fixés au fond de la plaque par l'intermédiaire de l'anticorps monomorphique spécifique des molécules HLA-DR sont révélés au moyen de conjugué streptavidine-phosphatase et d'un substrat fluorescent. L'activité de chaque peptide est caractérisée par la concentration de ce peptide qui inhibe 50% de la liaison du peptide biotinylé (IC ).

. Choix et optimisation des tests de liaison Choix des allèles (1 ^er gène)

Les allèles étudiés sont tous les allèles de la population française dont la fréquence dépasse les 5% de la population.

Il s'agit des allèles DRB1*0101, DRB 1*0301, DRB 1*0401, DRB1*0701, DRB1* 1101, DRB1*1301 et DRBl*1501 (Tableau I). Ils représentent à eux seuls 53 à 82% des allèles des populations caucasiennes et font partie de différentes spécificités des séries HLA-DR.

Choix des allèles (2 ^eme gène)

Les allèles étudiés sont les allèles rencontrés les plus fréquemment. Il s'agit des allèles HLA-DRB3*0101, HLA-DRB4*0101 et HLA-DRB5*0101 (voir Tableau Illb). Spécificité des tests

Le choix des peptides biotinylés est l'élément déterminant de la spécificité du test. La plupart des cellules utilisées possèdent deux molécules HLA-DR différentes qui sont toutes les deux purifiées par un anticorps monomorphique spéci- fique des molécules HLA-DR et toutes les deux reconnues par le même anticorps. De manière à étudier sans ambiguïté la liaison d'un peptide à l'allèle DRB1, il est nécessaire de s'assurer que le peptide biotinylé lie cet allèle et ne lie pas le produit de l'autre gène.

Dans ce but, un certain nombre de peptides, décrits dans le Tableau V, ont été utilisés.

Tableau V

Réactif RI Séquences 1 ^er gène 2 ^eme gène Références (Allèles DRB 1) (Allèles DRB3, DRB4, DRB5)

HA 306-318 SEQ ID NO:l DRB1 *0101 DRB5*0101 37-39

(≈HA 307-319) DRB 1 *0401 37, 40, 41, 42 DRB1*1 101 38, 39, 42 DRB1 * 1501

A3 152-166 SEQ ID NO:2 DRB1*1501 DRB5*0101 43

MT 2-16 SEQ ID NO: 3 DRB 1 *0301 44

YKL SEQ ID NO:4 DRB 1 *0701 DRB4*0101 41

Bl 21-36 SEQ ID NO:5 DRB1 *1301 DRB3*0101 46

LOL 191-210 SEQ ID NO:6 DRB1 *1301 DRB3*0101 63

E2/E168 SEQ ID NO:7 DRB 1 *0701 DRB4*0101

Pour HLA-DRB1*0101, DRB1*0401 et DRB1* 1101, le peptide ha 306-318 que d'autres auteurs avaient précédemment utilisé dans des tests de liaison sur ces allèles (37, 41), a été utilisé.

De même, pour DRB1 *0301 et DRB1* 1501, les traceurs utilisés (réactif RI) dérivent de traceurs précédemment décrits (44), (45).

Pour DRB 1 *0701, le peptide YKL a été décrit comme étant un très bon ligand (41) alors que le peptide Bl 21-36 est un ligand naturel de DRB1 * 1301 (46). Ni l'un ni l'autre n'ont été déjà utilisés comme traceurs. Conditions et sensibilité des tests

Pour chaque molécule HLA-DRB 1, la concentration en molécules du CMH II, la concentration du peptide biotinylé, le pH d'incubation et le temps d'incubation ont été optimisés. Pour les molécules HLA-DRB 1 * 101, DRB 1*0401 et DRB 1*0701, les conditions de tests en ELISA sont proches de celles déjà décrites par d'autres auteurs (37, 41). Pour les autres molécules HLA-DRB 1 qui ont été étudiées, il n'y a pas de tests en ELISA décrits dans la littérature. Le détail des conditions utilisées est décrit dans le Tableau VI.

Tableau NI

Allèles Concentration Traceurs Concentration pH Temps protéine traceur optimal d'incubation

(μg/ml) (nM) (h)

DRB1*0101 0,6 HA 306-318 10 6 24

DRB1*0301 2,3 MT 2-16 50 4,5 72

DRB 1*0401 1,6 HA 306-318 30 6 24

DRB 1*0701 0,4 YKL 10 5 24

DRB1*1101 1,3 HA 306-318 20 5 24

DRB1*1301 0,7 Bl 21-36 200 4,5 72

DRB1*1501 0,5 A3 152-166 10 4,5 24

La sensibilité de chaque test est reflétée par les IC observées avec

50 les peptides non-biotinylés qui correspondent aux traceurs (Tableau VII et Tableau X).

WO 00/44887 PCTtFROO/00109

27 Tableau VII

DRB 1 Allèles

Peptides 101 401 1101 701 301 1301 1501

Pl-18 2300 7500 83000 11000 P5-22 1900 10000 58000 22000 P9-26 82000

P13-30 toooo 5000 8000 880 20000 PI7-34 3500 2000 1300 560 67000 4300 5500 P21-38 1600 3000 1500 160 23000 85000

P25-42 50000 P29-46 40000 85000 1500 P33-50 80000 78000 13000 90000 P37-54 80000 88000 P41-58 75000

P45-62 68000 640 4300 1100 19000

P49-66 1800 17000 15000 95000

P53-70 85000 120 P57-74 35000 70000 75000 40 63000

P61-78 55000 29000 67000 23000 25000 55000

P65-82 4000 2500 4000 2100 13000 730 P69-86 15000 75000 490 P73-90 75000 23

P77-94 10000 13000 570 280 50000 220

P81-98 300 300 530 130 400 650 750

P85-102 70 300 850 100 320 300 1900

P89-106 180 140 600 7600 50000 38000 P93-110 350 220 750 72000 70000

P97-114 - 77000 75000 " P101-118 30000

P105-122 950 30000 16000 80000

P109-126 1500 7000 12000 13000 10000 35000

PI 13-130 4500 11000 6100 3500 79

PI 17-134 55000 67 3700 350 56 références 31 44 38 34 100 320 14

Activité de liaison aux molécules HLA-DR des peptides de dix-huit acides aminés qui couvrent la séquence de l'allergène majeur du venin d'abeille. - : activité > 100000 nM

Les résultats sont exprimés sous la forme d'ïC ₅₀ . L'unité est le nM. Les IC _S0 des meilleurs peptides (IC _S0 inférieures à 1000 nM) ont été entourées

Elles varient de 14 à 44 nM pour les allèles 101, 401, 1 101, 701 et 1501 qui sont des valeurs très satisfaisantes. Elles ne sont que de 100 à 320 nM pour respectivement les allèles 301 et 1301 et traduisent une sensibilité de qualité moyenne. Cartographie des déterminants de API ml restreints aux molécules HLA-DR étudiées

Localisation des déterminants de API ml : au moyen de peptides de 18 résidus Les peptides qui sont naturellement présents sur les molécules HLA-

DR ont des tailles qui varient entre 13 et 25 acides aminés environ, la taille la plus fréquemment rencontrée étant de 15 acides aminés. De manière à optimiser la recherche des peptides de API ml capables de se lier aux molécules HLA-DR, nous avons synthétisé trente peptides de 18 acides aminés qui se chevauchent de 14 acides aminés et qui donc contiennent tous les peptides de 15 résidus possibles de la séquence de API ml. Les capacités de liaison de chacun de ces peptides ont été testées sur les 7 allèles que nous avons retenus et sont exprimées sous la forme IC (Tableau

VII).

Les allèles 101, 401 et 1101 ont un profil d'activité très similaire et en particulier acceptent les 4 peptides (P81-98, P85-102, P89-106 et P93-110) comme ligands. Ils présentent toutefois des différences. Le peptide PI 05- 122 lie en effet l'allèle 401, alors que les peptides P77-94 et PI 17-134 lient l'allèle 1 101. L'allèle 701 possède 7 peptides actifs (P13-30, P17-34, P21-38, P45-62, P77-94, P81-98 et P85- 102) alors que 4 peptides (P81-98, P85-102, P53-70 et P57-74) sont actifs vis-à-vis de l'allèle 301. Les peptides P81-98 et P85-102 lient l'allèle 1301 avec une efficacité comparable à celle du peptide PI 17-134. Finalement, deux régions activent existent pour l'allèle 1501 et comprennent d'une part les peptides P65-82, P69-86, P73-90, P77-94, P81-98 et P85-102 et d'autre part les peptides PI 13-130 et PI 17-134.

Clairement chaque allèle possède un profil de liaison des peptides d'API ml qui lui est propre. Certains peptides ne se lient qu'à un seul allèle (par exemple P105-122 à l'allèle 401, P69-86 et P73-90 à l'allèle 1301). D'autres, au contraire, se lient à plusieurs allèles. C'est le cas en particulier du peptide P81-98, qui lie de manière significative les sept allèles étudiés et du peptide P85-102 qui lie six allèles de manière significative. Dans de nombreux cas, un peptide est commun à deux ou plusieurs allèles. Ces peptides communs définissent principalement trois zones distinctes de la séquence d'API ml :i) une partie N-terminale que forment les peptides P13-30, P17-34, P21-38, ii) une partie centrale constituée par les peptides P77-94 à P93-110 et iii) une partie C-terminale qu'englobent les peptides PI 13-122 à PI 17-134. On observe également que treize peptides sur les trente testés ont des activités de liaison > à 1000 nM, quelle que soit la molécule de CMH II étudiée. Ils sont donc peu ou pas actifs.

Le Tableau VIII ci-après illustre l'activité de liaison des peptides de 13 acides aminés qui couvrent la zone 73-108 de API ml aux molécules HLA-DR.

Tableau VIII

Peptides DRB 1Allèles

101 401 1101 701 301 1301 1501

P73-85 28000 210 P74-86 65000 330 P75-87 15000 230 P76-88 2200 160 P77-89 2200 1400 780 P78-90 10000 3000 1100 190

P79-91 5000 3000 1300 1600 P80-92 6000 2800 1600

P81-93 2500 3200 1700 400

P82-94 8000 530 4300 33000

P83-95 4000 280 560 4500 2000 -

P84-96 1900 2200 1700 1700 3700 - -

P85-97 120 210 570 63 600 58 33000

P86-98 2000 1800 470 1100 150 68000

P87-99 2500 22000 45000 280 1200 - 6500

P88-100 5300 14000 1200 12000 15000 P89-101 13000 13000 6000 45000 35000 P90-102 3500 1200 18000 65000 60000 40000

23000

50000

Activité de liaison des peptides de 13 acides aminés qui couvrent la zone 73-108 de l'allergène majeur du venin d'abeille aux molécules HLA-DR.

- : activité s 100000 nM

Les résultats sont exprimés sous la forme d'IC ₅₀ . L'unité est le nM Les IC _S0 des meilleurs peptides (LC _S0 inférieures à 1000 nM) ont été entourées. Localisation précise des déterminants de API ml De manière à mieux définir les zones de contact entre les peptides actifs et les molécules de CMH II, tous les peptides de treize résidus qui couvrent les zones actives ont été synthétisés. La taille de treize acides aminés a été choisie comme compromis. Elle correspond à la taille minimale des peptides présents naturellement sur les molécules de CMH II et devrait être suffisamment petite pour discriminer deux surfaces de contact contenues dans un seul peptide de dix-huit acides aminés.

11 peptides qui couvrent exhaustivement la partie N-terminale 15 à

37 ont été testés sur les allèles 101, 401, 701, 1101 et 1301 (figure 2). Pour l'allèle 701, les peptides P18-30 à P22-34 présentent une activité significative de liaison qui dans le cas du peptide PI 8-30 est équivalente à celle du peptide de dix-huit acides aminés P21-38.

Les allèles 401, 101 et 1101 lient sensiblement les mêmes peptides que l'allèle 701. Cependant, les activités de liaison observées sont plus faibles, ce qui est en accord avec celles obtenues pour les peptides de dix-huit acides aminés.

La partie centrale a été étudiée sur les sept allèles au moyen de vingt-quatre peptides de treize résidus. Pour l'allèle 101, les peptides P85-97 d'une part et P91-103 à P95-107 d'autre part définissent deux zones distinctes d'interaction. Ces deux zones se retrouvent également pour les allèles 401 et 1101 mais avec de petites variations. La première comporte en plus du peptide P85-97, les peptides P82-94 et P83-95 pour l'allèle 401 et le peptide P83-95 pour l'allèle 1101. La deuxième zone de contact est strictement identique entre l'allèle 401 et 101 alors qu'elle est réduite à un seul peptide (P94-106) pour l'allèle 1101. L'allèle 701 se caractérise par trois peptides ayant une bonne activité de liaison (P85-97, P86-98 et P87-99) qui correspond à celle des peptides de dix-huit acides aminés P81-98 et P85-102. La bonne activité de liaison du peptide P77-94 sur l'allèle 701 précédemment décrite n'est observée pour aucun des peptides treize résidus qui couvrent cette zone, les peptides P76-88 à P81-93 ayant une activité sensiblement moindre.

Le peptide P85-97 possède pour les allèles 301 et 1301, une activité de liaison, similaire à celle des peptides de 18 acides aminés P81-98 et P85-102, qui le contiennent. L'allèle 1301 accepte également le peptide P86-105 comme ligand. Pour l'allèle 1501, sept peptides dont six consécutifs (P73-85 à P78-90) et un isolé (P81-93) reflètent l'activité des trois peptides de dix-huit acides aminés (P73-90. P77-94 et P81- 98).

Finalement, la partie C-terminale de API ml a été étudiée pour les allèles 401, 1501, 1101 et 1301 au moyen de seize peptides de treize résidus. L'allèle

401 se caractérise par six peptides actifs (PI 09-121 à PI 14-126) alors que sept autres peptides (PI 16-128 à P122-14) se lient avec une forte affinité à 1501. Les peptides

P121-133 et 122-134 sont également très actifs pour les allèles 1101 et 1301.

Ces résultats décrivent la localisation précise des déterminants de liaison de l'allergène majeur du venin d'abeille pour les sept allèles retenus et montrent clairement les différences et les similitudes entre les allèles pour les différents peptides d'API ml. De manière à rendre compte au mieux de l'activité et de la localisation de ces déterminants, il a été retenu, pour chacun d'entre eux, un peptide représentatif, le plus court possible et dont l'activité de liaison reflète celle du déterminant (Tableau III). On notera tout particulièrement que le peptide P85-97 est représentatif d'un déterminant pour les allèles 101, 401, 1101, 701, 301 et 1301 et que d'autres déterminants sont avantageusement situés près de ce peptide (P76-88, P77-94, P81-93, P94- 106).

Fréquences des déterminants de API ml dans la population cauca- sienne

De manière à évaluer l'impact des peptides les plus actifs (activité inférieure à 1000 nM) au sein de la population caucasienne, il a été calculé, pour chacun, la fréquence cumulée des allèles qu'ils sont capables de lier (figure 4). Appliquée à l'ensemble des peptides de 18 acides aminés qui couvrent entièrement la séquence de l'allergène majeur, cette représentation permet de pondérer l'activité des peptides testés. On observe nettement que la zone centrale allant du peptide P77-94 au peptide P93-110 est celle qui a le plus d'impact dans la population. Le peptide P81-98 se liant avec une bonne affinité à tous les HLA DR étudiés, couvre à lui seul 63 % de la population et cumule l'impact des déterminants portés par les peptides P85-97 et P81-93. L'adjonction de séquences en N et C-terminal permet d'ajouter à cette combinaison de déterminants d'autres zones d'interaction telles que P76-88, P77-94 et P93- 106 qui concernent des pourcentages non négligeables de la population. Enfin, on remarque en C-terminal, l'impact des peptides PI 17-134 ou 122-134 supérieur à 20 %. EXEMPLE 2 : Corrélation peptides sélectionnés/prolifération cellulaire.

Les peptides qui se lient aux molécules HLA ne sont pas forcément stimulants pour les lymphocytes T. Ils peuvent en effet ressembler à des peptides du soi, si bien qu'aucun lymphocyte T ne sera capable de les reconnaître. En revanche, il a été préalablement montré que tous les peptides qui stimulent des lymphocytes T font partie des meilleurs peptides qui se lient aux molécules du CMH II (60). La liaison aux molécules du CMH II est donc une condition nécessaire mais pas suffisante pour permettre à un peptide d'être reconnu par les lymphocytes T. De manière à vérifier que les peptides qui ont été identifiés sont effectivement capables de stimuler des lymphocytes T de patients allergiques, leur capacité de stimulation a été testée (figure 8). Les cellules utilisées sont les cellules sanguines du sang périphérique de personnes allergiques au venin d'abeille. Ces personnes sont venues à l'Hôpital Rothschild pour être désensibilisées et ont accepté de participer à cette étude (DGS n° 980457). Compte tenu du faible nombre de cellules, les peptides ont été regroupés en différents pools. Les cellules d'un patient n'a donné lieu à aucune prolifération (non montré). Sur les six patients pour lesquels une réactivité est observée, on observe une forte variabilité dans l'intensité de la réponse aux peptides, dans la nature et le nombre de peptides actifs. Toutefois, on remarque que sur les 6 patients, 5 répondent au pool 7 qui comprend des peptides qui couvrent la zone 77-111 et 3 répondent au pool 9 qui couvre la zone 105-134.

Les autres peptides peuvent répondre fortement mais de manière propre à un patient donné (exemple : pool 3 avec le patient HD). En conséquence, ces résultats confirment l'intérêt de l'utilisation de la séquence 76-106 pour la désensibilisation et dans une moindre mesure de la région C terminale : 105-134.

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Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d ^' application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.