基于与硼酸及其衍生物络合的季铵化合物的抗病毒和抗菌制剂
阅读：232发布：2020-05-15
专利汇可以提供基于与硼酸及其衍生物络合的季铵化合物的抗病毒和抗菌制剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 描述了季铵化合物与 硼 酸和/或其衍 生物 络合形成的化合物及其制备方法，以及使用该化合物 治疗 致病性感染的方法。，下面是基于与硼酸及其衍生物络合的季铵化合物的抗病毒和抗菌制剂专利的具体信息内容。
1.一种式I化合物或其药学上可接受的盐及其立体异构体：
其中，
R1、R2、R3、和R4独立地选自烷基、环烷基、或芳基，所述基团任选地被一个或多个-OH取代，且
所述的各个R1、R2、R3、和R4可以任选地与另一个所述R1、R2、R3、和R4连接；
R5选–BO2、–BO3、–BO4、–B2O3、–B2O4、–B3O5、–B3O7、–B4O7、–B4O9–B5O8、–O–BR6R7；
R6选自-H、-OH、烷基、烯基、芳基、-O-R8；
R7不存在或选自-H、-OH、烷基、烯基、芳基、和-O-R8；
R8选自-H、烷基、烯基、芳基。
2.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐及其立体异构体，其中，R1是CH2-CH2。
3.权利要求1-2中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐及其立体异构体，其中，R2、R3、和R4中任一独立地是CH3、CH2-CH3、或CH2-CH2-CH3。
4.权利要求1所述的化合物，其中，R1是CH2-CH2，R2、R3、和R4独立地是CH3。
5.如权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中，R5是–B5O8。
6.如权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中，R5为-O-BR6R7。
7.如权利要求5所述的化合物，其中，R5是-O-B(OH)2。
8.如权利要求1所述的化合物，其中，所述化合物选自下列化合物：
或其组合。
9.如权利要求1所述的化合物，其中，所述化合物是以下化合物的组合：
10.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
11.一种组合物，所述组合物包含权利要求1至8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及可接受的载体。
12.权利要求1至8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐的用途，用于制备一药物，所述的药物用于治疗受试者的致病性感染。
13.权利要求1至8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，或者权利要求10-11中任一项所述的组合物的用途，用于治疗受试者的致病性感染。
14.如权利要求12至13中任一项所述的用途，其中，所述受试者选自下组：哺乳动物、鱼类、鸟类和甲壳动物。
15.如权利要求14所述的用途，其中，所述的哺乳动物选自下组：人、牛、马和有蹄类动物。
16.如权利要求14所述的用途，其中，所述的鱼类选自下组：盲鳗、七鳃鳗、软骨鱼和硬骨鱼。
17.如权利要求14所述的用途，其中，所述的鸟类选自下组：鸡、火鸡和家禽。
18.如权利要求14所述的用途，其中，所述的甲壳动物选自下组：虾、蟹、大螯虾、龙虾。
19.一种治疗或预防有需要的受试者的致病性感染的方法，包括：
向所述的受试者施用治疗有效量的权利要求1至8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，或者权利要求10至11中任一项所述的组合物。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述受试者选自下组：哺乳动物、鱼类、鸟类和甲壳动物。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述的哺乳动物选自下组：人、牛、马和有蹄类动物。
22.如权利要求20所述的方法，其中，所述的鱼类选自下组：盲鳗、七鳃鳗、软骨鱼和硬骨鱼。
23.如权利要求20所述的方法，其中，所述的鸟类选自下组：鸡、火鸡和家禽。
24.如权利要求20所述的方法，其中，所述的甲壳动物选自下组：虾、蟹、大螯虾、和龙虾。
25.一种治疗或预防有需要的甲壳动物的致病性感染的方法，包括：
向所述的甲壳动物施用治疗有效量的权利要求1至8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，或者权利要求10至12中任一项所述的组合物。
26.如权利要求25所述的方法，其中，所述的甲壳动物选自下组：虾、蟹、大螯虾、和龙虾。
27.如权利要求25-26中任一项所述的方法，其中，所述的致病性感染由病毒、微生物或其组合引起。
28.如权利要求27所述的方法，其中，所述病毒是白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)、黄头病毒(YHV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、球形杆状病毒、产卵虾死亡病毒病、鲤春病毒血症(由弹状病毒引起的SVC)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、大口黑鲈病毒(LMBV)、和对虾杆状病毒(BP)中的一种或多种。
29.如权利要求27所述的方法，其中，所述微生物是副溶血性弧菌、哈维氏弧菌、灿烂弧菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌、坎氏弧菌、费氏弧菌、美人鱼弧菌、远洋弧菌、东方弧菌、病海鱼弧菌、地中海弧菌、火神弧菌、肠杆菌科、肉毒杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌中的一种或多种。
30.如权利要求29所述的方法，其中，所述的肠杆菌科是大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌中的一种或多种。
31.如权利要求25-30中任一项所述的方法，其中，所述施用是通过将所述化合物或其药学上可接受的盐，或者所述组合物喂食给所述甲壳动物。
32.如权利要求11所述的组合物，其中，所述组合物是食品组合物。
33.如权利要求11所述的组合物，其中，所述组合物可以用于治疗或预防有需要的甲壳动物的致病性感染。
基于与硼酸及其衍生物络合的季铵化合物的抗病毒和抗菌
制剂
[0001] 相关申请的交叉引用
[0003] 背景
[0004] (a)领域
[0005] 本发明公开的主题总体上涉及由季铵化合物与硼酸和/或其衍生物络合形成的化合物及其制备方法。
[0006] (b)相关的现有技术
[0007] 近年来，虾养殖产业迅速扩大，据联合国粮农组织(FAO)估计，每年产量约为350万公吨(相当于150亿美元的估值)。尽管具有经济重要性，全球养虾产业仍然受到各种疾病的
困扰，其成为产业发展中突出的严重障碍。据估计，虾养殖中大约60％的损失是由病毒性病
原体造成的，20％是由细菌性病原体造成的(Flegel,T.W.,Lightner,D.V.,Lo,C.F.,
Owens,L.2008.在：《亚洲水产养殖疾病VI》.M.G.,Mohan,C.V.,Crumlish,M.和Subasinghe,
R.P.编辑《. 鱼类健康部分》，亚洲渔业协会，菲律宾马尼拉.第355-378页)。
困扰，其成为产业发展中突出的严重障碍。据估计，虾养殖中大约60％的损失是由病毒性病
原体造成的，20％是由细菌性病原体造成的(Flegel,T.W.,Lightner,D.V.,Lo,C.F.,
Owens,L.2008.在：《亚洲水产养殖疾病VI》.M.G.,Mohan,C.V.,Crumlish,M.和Subasinghe,
R.P.编辑《. 鱼类健康部分》，亚洲渔业协会，菲律宾马尼拉.第355-378页)。
[0008] 根据所涉及的虾的种类，每种疾病的临床表现是不同的，例如，桃拉综合症病毒(Taura Syndrome Virus，TSA)等病原体引起角质层黑化斑点(cuticular melanized
spots)，黄头病毒(Yellow head Virus，YHV)导致头胸部黄化和身体脱色，特别是白斑综合
征病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)，如其名称所述，在甲壳、附件和角质层的内表
面上引起白斑。有趣的是，WSSV是世界范围内养殖虾类最严重和最具破坏性的病原体，因为
它具有高度的致命性和传染性，能够快速杀死虾。WSSV病的爆发在几天内就杀灭了全世界
许多养虾场的全部种群。从台湾传播到亚洲，再传播到美洲的中部，南部和北部(Zuidema,
D.,Van Hulten,M.C.W.,Marks,H.,Witteveldt,J.,Vlak,J.M.2004.在：细菌性和病毒性鱼
虾病研究的当前趋势.Leung,K.Y.编辑)，世界科学，新加坡，第237-255页)，目前，虾WSSV是
白斑病毒属(Whispovirus)以及线头病毒科(Nimaviridae)中唯一可感染超过90种的水生
甲壳类动物的成员。
spots)，黄头病毒(Yellow head Virus，YHV)导致头胸部黄化和身体脱色，特别是白斑综合
征病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)，如其名称所述，在甲壳、附件和角质层的内表
面上引起白斑。有趣的是，WSSV是世界范围内养殖虾类最严重和最具破坏性的病原体，因为
它具有高度的致命性和传染性，能够快速杀死虾。WSSV病的爆发在几天内就杀灭了全世界
许多养虾场的全部种群。从台湾传播到亚洲，再传播到美洲的中部，南部和北部(Zuidema,
D.,Van Hulten,M.C.W.,Marks,H.,Witteveldt,J.,Vlak,J.M.2004.在：细菌性和病毒性鱼
虾病研究的当前趋势.Leung,K.Y.编辑)，世界科学，新加坡，第237-255页)，目前，虾WSSV是
白斑病毒属(Whispovirus)以及线头病毒科(Nimaviridae)中唯一可感染超过90种的水生
甲壳类动物的成员。
[0009] 除病毒感染外，许多致病菌也会给养殖业带来严重的问题。最重要的是由弧菌(Vibrio)引起的弧菌病。一般来说，当虾受到压力时，这些细菌被认为是导致疾病的机会致
病菌。尽管外骨骼提供了对某些病原体的有效物理屏障，但弧菌属(Vibrio spp.)是与外壳
疾病相关的可分解甲壳的细菌之一，并可通过甲壳动物的外骨骼或孔隙中的伤口进入。弧
菌病是世界范围内普遍存在的问题，不仅引起甲壳动物的慢性死亡，而且对贝类，比目鱼和
有鳍鱼类的养殖也是严重的问题。值得一提的是，由弧菌病引起的问题很常见，但与病毒性
流行病相比，被认为是次要的。
病菌。尽管外骨骼提供了对某些病原体的有效物理屏障，但弧菌属(Vibrio spp.)是与外壳
疾病相关的可分解甲壳的细菌之一，并可通过甲壳动物的外骨骼或孔隙中的伤口进入。弧
菌病是世界范围内普遍存在的问题，不仅引起甲壳动物的慢性死亡，而且对贝类，比目鱼和
有鳍鱼类的养殖也是严重的问题。值得一提的是，由弧菌病引起的问题很常见，但与病毒性
流行病相比，被认为是次要的。
[0010] 白斑综合征病毒(WSSV)
[0011] 1993年，WSSV首次被描述为白斑疾病，其在日本养殖的日本对虾(Penaeus japonicus)中暴发。大约在同一时间，在从它被怀疑起源的地方，台湾和中国的其他种类的
对虾中观察到类似的疾病和死亡。已知该病毒有各种名称，主要涉及杆状病毒，如“中国杆
状病毒”，“系统性外胚层和中胚层杆状病毒”，“白斑杆状病毒”等。目前，基于其独特的形态和遗传特征相似性，该病毒被共同归类为白斑病毒复合体，采用WSSV作为通用病毒名称。
WSSV现在被国际病毒分类委员会认为代表一个新的病毒属，称为“白斑病毒属
(Whispovirus)”，属于线头病毒科(Nimaviridae)。
对虾中观察到类似的疾病和死亡。已知该病毒有各种名称，主要涉及杆状病毒，如“中国杆
状病毒”，“系统性外胚层和中胚层杆状病毒”，“白斑杆状病毒”等。目前，基于其独特的形态和遗传特征相似性，该病毒被共同归类为白斑病毒复合体，采用WSSV作为通用病毒名称。
WSSV现在被国际病毒分类委员会认为代表一个新的病毒属，称为“白斑病毒属
(Whispovirus)”，属于线头病毒科(Nimaviridae)。
[0012] WSSV的形态学和超微结构
[0013] 迄今为止，尚未完全了解WSSV的形态学和超微结构。然而，已经观察到WSSV病毒体显示卵形粒子形态，具有长度约300nm和直径约120nm的平均尺寸。病毒包膜具有明显的脂
质双分子层膜，包裹着核衣壳，紧密包装在病毒体内。
质双分子层膜，包裹着核衣壳，紧密包装在病毒体内。
[0014] WSSV病毒包膜由至少35种不同的蛋白质组成，其中VP28和VP26是最丰富的，约占包膜的60％。VP28，由开放阅读框(ORF)421(wsv421)编码，是主要的包膜蛋白，一些研究表
明，VP28在虾的系统性WSSV感染的初始步骤中起到至关重要的作用，尤其是作为附件蛋白，
将病毒结合至虾细胞，并帮助其进入细胞质。
明，VP28在虾的系统性WSSV感染的初始步骤中起到至关重要的作用，尤其是作为附件蛋白，
将病毒结合至虾细胞，并帮助其进入细胞质。
[0015] 关于VP26，由wsv311基因编码的产物，首先被鉴定为与核衣壳相关。VP26可能能够与肌动蛋白或肌动蛋白相关蛋白结合。在内化入宿主细胞后，病毒必须被运送到转录和复
制的位点附近，病毒基因组在这里递送。因此，有人提出，作为病毒核衣壳的主要成分，VP26
可能通过与肌动蛋白或细胞肌动蛋白结合蛋白相互作用，帮助WSSV向细胞核移动。
制的位点附近，病毒基因组在这里递送。因此，有人提出，作为病毒核衣壳的主要成分，VP26
可能通过与肌动蛋白或细胞肌动蛋白结合蛋白相互作用，帮助WSSV向细胞核移动。
[0016] 病毒基因组是双链环状DNA分子，全长序列已提交给GenBank(登录号：AF440570)。通常，估计WSSV的基因组大约为300kbp，含292967个核苷酸，包含184个主要ORF。然而，只可
以证明6％的WSSV ORF在参与核苷酸代谢，DNA复制和蛋白质修饰中的推定功能(Van
Hulten,M.C.,Witteveldt,J.,Peters,S.,Kloosterboer,N.,Tarchini,R.,Fiers,M.,
Sandbrink,H.,Lankhorst,R.K.,Vlak,J.M.2001.286,7-22)。
以证明6％的WSSV ORF在参与核苷酸代谢，DNA复制和蛋白质修饰中的推定功能(Van
Hulten,M.C.,Witteveldt,J.,Peters,S.,Kloosterboer,N.,Tarchini,R.,Fiers,M.,
Sandbrink,H.,Lankhorst,R.K.,Vlak,J.M.2001.286,7-22)。
[0017] WSSV的控制策略
[0018] 由于WSSV对世界各地虾类养殖业的影响，已经采用了几种方法来控制这种疾病。但是值得注意的是，目前还没有治疗手段能够干预疾病的自然发生和蔓延。
[0019] 虾抗WSSV免疫应答
[0021] 相反，无脊椎动物，如甲壳动物缺乏真正的适应性免疫系统，没有使用抗体来识别和破坏非自我物质的特定免疫功能。由于这个原因，还设想了被动免疫，其产生过程是通过
将病原体施用于家畜(如鸟类)以获得相应的抗体，然后用于控制虾类感染症状。然而，无脊
椎动物的体内防御机制与脊椎动物的免疫机制明显不同，关于被动免疫对控制无脊椎动物
(如虾类)感染症状的有效性还没有具体的公开。
将病原体施用于家畜(如鸟类)以获得相应的抗体，然后用于控制虾类感染症状。然而，无脊
椎动物的体内防御机制与脊椎动物的免疫机制明显不同，关于被动免疫对控制无脊椎动物
(如虾类)感染症状的有效性还没有具体的公开。
[0022] 这提示血细胞在甲壳动物抵抗病原体的防御系统中起着重要作用，因为它们启动凝血，延缓WSSV感染，并且抑制病毒复制。但是，血蓝蛋白的确切作用机制尚不清楚。
[0023] 无论主动免疫还是被动免疫，这些过程都只针对一种类型的病原体。在这种情况下，优选使用具有广谱作用的产品以同时有效控制不同的病原体(细菌和病毒)。
[0024] 感染动物的治疗
[0025] 尽管最近开发了几种方法和产品试图控制这些病原体，但都没有成功，对新的有效产品的研究似乎是迫切和必要的。迄今为止，不存在任何商业试剂证明能够完全清除
WSSV感染，或者在WSD爆发的情况下进行预防。对于其他病毒如桃拉综合症病毒或黄头病毒
也可以做出类似的观察报告。
WSSV感染，或者在WSD爆发的情况下进行预防。对于其他病毒如桃拉综合症病毒或黄头病毒
也可以做出类似的观察报告。
[0026] 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)
[0027] 许多致病菌也会给养殖业造成严重的问题。最重要的是由弧菌(弧菌科(Vibrionaceae)中的革兰氏阴性菌)引起的弧菌病。在对虾养殖中已经报道了这种疾病，包
括至少14个种类：哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、灿烂弧菌(V.splendidus)、副溶血性弧菌
(V.parahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、鳗弧菌(V.anguillarum)、创伤弧菌
(V.Vulnificus)、坎氏弧菌(V.campbelli)、费氏弧菌(V.fischeri)、美人鱼弧菌
(V.Damsella)、远洋弧菌(V.pelagicus)、东方弧菌(V.orientalis)、病海鱼弧菌
(V.ordalii)、地中海弧菌(V.mediterrani)、火神弧菌(V.logei)等。
括至少14个种类：哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、灿烂弧菌(V.splendidus)、副溶血性弧菌
(V.parahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、鳗弧菌(V.anguillarum)、创伤弧菌
(V.Vulnificus)、坎氏弧菌(V.campbelli)、费氏弧菌(V.fischeri)、美人鱼弧菌
(V.Damsella)、远洋弧菌(V.pelagicus)、东方弧菌(V.orientalis)、病海鱼弧菌
(V.ordalii)、地中海弧菌(V.mediterrani)、火神弧菌(V.logei)等。
[0028] 作为对照措施，抗生素通常用于抵抗包括弧菌病在内的细菌感染症状。近来，由于抗生素的广泛传播，抗性细菌的出现已经成为问题，此外，抗生素的施用不能保证充分的防
治效果。另外，还没有开发出针对病毒感染症状有效药物，因此，可以说不存在有效的控制
措施。
治效果。另外，还没有开发出针对病毒感染症状有效药物，因此，可以说不存在有效的控制
措施。
[0029] 其他病原体
[0031] 1 .桃拉综合症病毒(TSV)是一种新兴的疾病，由双顺反子病毒科(Dicistroviridae)科、蟋蟀麻痹病毒属(Cripavirus)的病毒引起，影响南美白对虾生活阶
段的幼虫后期，幼体期和亚成体期。这些生命阶段的死亡率可以达到90％；
段的幼虫后期，幼体期和亚成体期。这些生命阶段的死亡率可以达到90％；
[0032] 2.黄头病毒(YHV)是另一种影响巨虎虾(斑节对虾，Penaeus monodon)的新兴疾病，特别是在幼体的早期和晚期生活阶段，这种病毒具有高致命性和传染性，能够快速杀死
虾类。YHV属于杆套病毒科(Roniviridae)；
虾类。YHV属于杆套病毒科(Roniviridae)；
[0033] 3.其他病毒，如传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、球形杆状病毒(Spherical Baculovirus)、产卵虾死亡病毒病(Spawner-isolated Mortality Virus
Disease)、鲤春病毒血症(由弹状病毒(Rhabdoviruses)引起的SVC)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、
大口黑鲈病毒(Large Mouth Bass Virus,LMBV)、对虾杆状病毒(Baculovirus penaei，BP)
等，也存在问题。
Disease)、鲤春病毒血症(由弹状病毒(Rhabdoviruses)引起的SVC)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、
大口黑鲈病毒(Large Mouth Bass Virus,LMBV)、对虾杆状病毒(Baculovirus penaei，BP)
等，也存在问题。
[0034] 人病原体
[0035] 有许多细菌(如i)肠杆菌科，即大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌等；ii)肉毒杆菌；iii)单核细胞增多性李斯特菌等)和病毒(如疱疹病毒科，逆转录病毒科，丝状病毒科(埃博
拉病毒)等)会导致严重甚至致命的人类疾病。
拉病毒)等)会导致严重甚至致命的人类疾病。
[0036] 尽管已经开发了多种用于预防和治疗病原体的产品，如基因疫苗，但是这些产品已经在商业操作中证明是无效的，由于缺乏有效递送机制，或者价格昂贵而不能实际应用。
[0037] 因此，需要新的抗病原体制剂和包含其的组合物。
[0038] 而且，还需要用于治疗或预防致病性感染的新型组合物。
[0039] 概要
[0040] 在本发明中，使用硼酸及其衍生物，与季铵化合物，优选氯化胆碱(由于其天然来源，例如来自磷脂酰胆碱)络合，形成四元络合物，其能够控制由许多细菌和病毒引起的人
和动物的感染，特别是用于水产动物养殖业。
和动物的感染，特别是用于水产动物养殖业。
[0041] 根据一种实施方式，提供了式I的化合物，或其药学上可接受的盐及其立体异构体：
[0042]
[0043] 其中，
[0044] R1、R2、R3、和R4独立地选自烷基、环烷基、或芳基，所述基团任选地被一个或多个-OH取代，且
[0045] 所述的各个R1、R2、R3、和R4可以任选地与另一个所述R1、R2、R3、和R4连接；
[0046] R5选–BO2、–BO3、–BO4、–B2O3、–B2O4、–B3O5、–B3O7、–B4O7、–B4O9–B5O8、–O–BR6R7；
[0047] R6选自-H、-OH、烷基、烯基、芳基、-O-R8；
[0048] R7不存在或选自-H、-OH、烷基、烯基、芳基、和-O-R8；
[0049] R8选自-H、烷基、烯基、芳基。
[0050] R1可以是CH2-CH2。
[0051] R2、R3、和R4可以独立地是CH3、CH2-CH3、或CH2-CH2-CH3。
[0052] R1可以是CH2-CH2，R2、R3、和R4可以独立地是CH3。
[0053] R5可以是-B5O8。
[0054] R5可以是-O-BR6R7。
[0055] R5可以是-O-B(OH)2。
[0056] 该化合物可以选自以下化合物：
[0057] 或其组合。
[0058] 该化合物可以是以下化合物的组合：
[0059]
[0060] 根据另一种实施方式，提供了包含本发明化合物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体的药物组合物。
[0061] 根据另一种实施方式，提供了包含本发明化合物或其药学上可接受的盐，和可接受的载体的组合物。
[0062] 根据另一种实施方式，提供了本发明化合物或其药学上可接受的盐的用途，用于制备一药物，所述的药物用于治疗受试者的致病性感染。
[0063] 根据另一种实施方式，提供了本发明化合物或其药学上可接受的盐，或本发明的组合物的用途，用于治疗受试者的致病性感染。
[0064] 受试者可以选自下组：哺乳动物、鱼类、鸟类和甲壳动物。
[0066] 鱼类可以选自下组：盲鳗、七鳃鳗、软骨鱼和硬骨鱼。
[0067] 鸟类可以选自下组：鸡、火鸡和家禽。
[0068] 甲壳动物可以选自下组：虾、蟹、大螯虾(lobster)、龙虾(langouste)。
[0069] 根据另一种实施方式，提供了一种治疗或预防有需要的受试者的致病性感染的方法，其包括：
[0070] ●向所述的受试者施用治疗有效量的本发明化合物，或其药学上可接受的盐，或本发明的组合物。
[0071] 受试者可以选自下组：哺乳动物、鱼类、鸟类和甲壳动物。
[0072] 哺乳动物可以选自下组：人、牛、马和有蹄类动物。
[0073] 鱼类可以选自下组：盲鳗、七鳃鳗、软骨鱼和硬骨鱼。
[0074] 鸟类可以选自下组：鸡、火鸡和家禽。
[0075] 甲壳动物可以选自下组：虾、蟹、大螯虾(lobster)、龙虾(langouste)。
[0076] 根据另一种实施方式，提供了治疗或预防有需要的甲壳动物的致病性感染的方法，其包括：
[0077] ●向所述的甲壳动物施用治疗有效量的本发明化合物，或其药学上可接受的盐，或本发明的组合物。
[0078] 甲壳动物可以选自下组：虾，螃蟹，大螯虾(lobster)、龙虾(langouste)。
[0079] 致病性感染可能由病毒、微生物、或其组合引起。
[0080] 病毒可以是白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)、黄头病毒(YHV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、球形杆状病毒、产卵虾死亡病毒病、鲤春病毒血症(由
弹状病毒引起的SVC)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、大口黑鲈病毒(LMBV)、和对虾杆状病毒
(Baculovirus penaei，BP)。
弹状病毒引起的SVC)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、大口黑鲈病毒(LMBV)、和对虾杆状病毒
(Baculovirus penaei，BP)。
[0081] 所述微生物可以是副溶血性弧菌、哈维氏弧菌、灿烂弧菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌、坎氏弧菌、费氏弧菌、美人鱼弧菌、远洋弧菌、东方弧菌、病海鱼弧菌、地中海弧菌、火神弧菌、肠杆菌科、肉毒杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌中的一种或多种。
[0082] 肠杆菌科可以是大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌中的一种或多种。
[0083] 可以通过将所述化合物或其药学上可接受的盐或所述组合物喂食给所述甲壳动物来施用。
[0084] 该组合物可以是食品组合物。
[0085] 该组合物可以用于治疗或预防有需的甲壳动物的致病性感染。
[0086] 如附图所示，根据所选实施方式的以下详细描述，本发明主题的特征和优点将变得更加明显。可以认识到，所公开和要求保护的主题能够在各个方面进行修改，而不脱离权
利要求的范围。因此，附图和说明书在本质上被认为是说明性的，而不是限制性的，并且主
题的全部范围在权利要求中进行了阐述。
利要求的范围。因此，附图和说明书在本质上被认为是说明性的，而不是限制性的，并且主
题的全部范围在权利要求中进行了阐述。
[0087] 附图的简要说明
[0088] 结合附图，根据以下的详细描述，本发明的进一步的特征和优点是显而易见的，其中：
[0089] 图1：显示了胆碱/硼酸络合物的合成。
[0090] 图2：显示了通过不同合成方法获得的胆碱/五硼酸盐络合物的制备。
[0091] 图3：显示了通过不同合成方法获得的与硼酸盐和五硼酸盐络合的氯化胆碱、硼酸、五硼酸盐和胆碱的FTIR光谱。
[0092] 图4：感染副溶血性弧菌后用含有胆碱/五硼酸盐络合物(5mg/g)的饲料治疗的南美白对虾的存活率(％)的百分比。
[0093] 图5：感染白斑综合征病毒(WSSV)匀浆后用含胆碱/五硼酸盐络合物(5mg/g)的饲料治疗的南美白对虾的存活率(％)的百分比。
[0094] 图6：饲喂商业饲料和添加了胆碱/五硼酸盐络合物的商业饲料的虾的平均体重随时间的增加。(●)饲喂商业饲料的虾组(对照组)；(△)饲喂添加了胆碱/五硼酸盐络合物
(5mg/g)的商业饲料的虾组。两个虾组每天自由采食(ad libitum)，饲喂至28天。
(5mg/g)的商业饲料的虾组。两个虾组每天自由采食(ad libitum)，饲喂至28天。
[0095] 图7：生物过程微阵列中2个上调基因的微阵列功能注释。计算图中的每个节点和GO原始项(GO original terms)的距离之和的分数。
[0096] 图8：分子功能微阵列中2个上调基因的功能注释。计算图中的每个节点和GO原始项(GO original terms)的距离之和的分数。
[0097] 图9：使用α＝0.01，费舍尔准确测试(Fischer Exact Test)2个上调的GO项(GO terms)与来自微阵列的所有基因的GO项。
[0098] 图10：生物过程微阵列中2个下调基因的功能注释。计算图中的每个节点和GO原始项(GO original terms)的距离之和的分数。
[0099] 图11：分子功能微阵列中2个下调基因的功能注释。计算图中的每个节点和GO原始项(GO original terms)的距离之和的分数。
[0100] 图12：使用α＝0.01，费舍尔准确测试(Fischer Exact Test)2个下调GO项(GOterms)与来自微阵列的所有基因的GO项。
[0102] 图14：显示了其他季铵化合物与硼酸的络合物的合成。
[0103] 图15：显示了胆碱/苯基硼酸盐络合物的合成。
[0104] 图16：显示了胆碱/十四烷基硼酸盐络合物的合成。
[0105] 定义
[0106] “烷基”以及具有前缀“烷”的其它基团，如烷氧基和烷酰基(alkanoyl)，是指可以是直链或支链及其组合的碳链，除非碳链另有定义。烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙
基、丁基、仲丁基和叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基等。当碳原子的规定数目允许为，例如C3-10时，术语烷基还包括环烷基，以及与环烷基结构结合的直链或支链烷基链的组合。
当没有指定碳原子数时，指C1-6。
基、丁基、仲丁基和叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基等。当碳原子的规定数目允许为，例如C3-10时，术语烷基还包括环烷基，以及与环烷基结构结合的直链或支链烷基链的组合。
当没有指定碳原子数时，指C1-6。
[0107] 芳基是指包含碳环原子的单环或多环芳环系。优选的芳基是6-10元的单环或双环芳环系。苯基和萘基是优选的芳基。最优选的芳基是苯基。
[0108] 术语“环烷基”是烷基的子集，是指具有特定碳原子数目的饱和碳环。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基等。除非另有说明，环烷基通常是单环。除非另有定义，环烷基是饱和的。环烷烃仅由碳原子(C)和氢(H)原子组成，且是饱和的，
因为没有多个C-C键来氢化(加入更多的氢)。环烷的一般化学式为CnH2(n+1-g)，其中n＝C原子
数，g＝分子中环的数目。对于分子中具有一个环的环烷，环烷可以作为其烯烃对应物的异
构体处理，例如环丙烷和丙烯都具有化学式C3H6。具有单环的环烷的命名类似于其相同碳数
的正构烷烃对应物：环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷等。具有大于20个碳原子的较大环烷通
常称为环烷烃。
因为没有多个C-C键来氢化(加入更多的氢)。环烷的一般化学式为CnH2(n+1-g)，其中n＝C原子
数，g＝分子中环的数目。对于分子中具有一个环的环烷，环烷可以作为其烯烃对应物的异
构体处理，例如环丙烷和丙烯都具有化学式C3H6。具有单环的环烷的命名类似于其相同碳数
的正构烷烃对应物：环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷等。具有大于20个碳原子的较大环烷通
常称为环烷烃。
[0109] 如本文所用，术语“组合物”旨在涵盖包含特定量的特定成分的产品，以及由特定量的特定成分的组合而直接或间接得到的任何产品。与药物组合物相关的该术语旨在涵盖
包含构成载体的活性成分和惰性成分的产品，以及由任何两种或更多种成分的组合、络合
或聚集，或由一种或多种成分的解离，或由一种或多种成分的其他类型的反应或相互作用
而直接或间接得到的任何产品。因此，本发明的药物组合物包括通过混合本发明的化合物
和药学上可接受的载体而制成的任何组合物。“药学上可接受的”或“可接受的”是指载体、
稀释剂或赋形剂必须与制剂的其它成分相容并且对其接受者无害。
包含构成载体的活性成分和惰性成分的产品，以及由任何两种或更多种成分的组合、络合
或聚集，或由一种或多种成分的解离，或由一种或多种成分的其他类型的反应或相互作用
而直接或间接得到的任何产品。因此，本发明的药物组合物包括通过混合本发明的化合物
和药学上可接受的载体而制成的任何组合物。“药学上可接受的”或“可接受的”是指载体、
稀释剂或赋形剂必须与制剂的其它成分相容并且对其接受者无害。
[0110] 应理解，术语“施用”、“给药”和/或“给予”化合物是指通过任何合适的手段，如口服、非经肠、直肠、透皮给药等，向需要治疗的个体或受试者的提供，分配，给予，分发本发明的化合物。根据甲壳动物给药的一种实施方式，本发明的化合物和组合物可以通过给予受试者食物的方式来提供。
[0111] 式I化合物可以含有一个或多个不对称中心，因此可以以外消旋体和外消旋混合物，单一对映体，非对映的混合物和单一非对映体的形式存在。本发明意在包含式I化合物
的所有这些异构形式。
的所有这些异构形式。
[0112] 式I化合物可以通过例如从合适的溶剂(例如甲醇或乙酸乙酯或其混合物)中分级结晶，或者通过利用光学活性固定相的手性色谱，分离成它们各自的非对映异构体。绝对立
体化学可以通过结晶产物或衍生的结晶中间体的X-射线晶体学来确定，如果需要，则使用
含有已知绝对构型的不对称中心的试剂。
体化学可以通过结晶产物或衍生的结晶中间体的X-射线晶体学来确定，如果需要，则使用
含有已知绝对构型的不对称中心的试剂。
[0113] 或者，结构通式I的化合物的任何立体异构体可以使用光学纯的原材料或已知绝对构型的试剂，通过立体定向合成来获得。
[0114] 如果需要，可以分离化合物的外消旋混合物，从而分离单一对映体。可通过本领域熟知的方法进行分离，例如化合物的外消旋混合物与对映体纯的化合物偶联以形成非对映
的混合物，接着通过标准方法如分级结晶或层析，分离单一非对映体。偶联反应通常是使用
对映体纯的酸或碱形成盐。然后，可以通过添加的手性残基的裂解将非对映异构体衍生物
转化为纯的对映体。化合物的外消旋混合物也可以通过利用手性固定相的色谱方法直接分
离，该方法是本领域公知的。
的混合物，接着通过标准方法如分级结晶或层析，分离单一非对映体。偶联反应通常是使用
对映体纯的酸或碱形成盐。然后，可以通过添加的手性残基的裂解将非对映异构体衍生物
转化为纯的对映体。化合物的外消旋混合物也可以通过利用手性固定相的色谱方法直接分
离，该方法是本领域公知的。
[0115] 详细说明
[0116] 在实施方案中，公开了硼酸及其衍生物与季铵化合物通过络合作用形成的化合物。
[0117] 硼酸及其衍生物
[0118] 硼酸及其盐于1983年注册，用于控制蟑螂，蚂蚁，谷物象鼻虫和几种甲虫。它们也用作除草剂，杀真菌剂和木材防腐剂，甚至作为绝缘中的驱虫剂。作为一种杀虫剂，硼酸对
蚂蚁，蟑螂，蠹虫和白蚁起到胃毒作用，并对昆虫的外骨骼产生磨蚀作用。作为一种除草剂，
硼酸引起干燥或中断植物的光合作用。
蚂蚁，蟑螂，蠹虫和白蚁起到胃毒作用，并对昆虫的外骨骼产生磨蚀作用。作为一种除草剂，
硼酸引起干燥或中断植物的光合作用。
[0119] 硼是地球地壳和背景值中天然存在的元素，甚至在人类血液中循环。根据美国环境保护署(US EPA.1993.预防，杀虫剂和有毒物质.EPA-738-F-93-006)，硼酸及其盐不会对
人体或环境造成不合理的风险或不利影响。现有研究表明，工业硼酸对鸟类，鱼类和水生无
脊椎动物几乎无毒，对有益昆虫相对无毒。此外，用作农药的硼酸及其盐类的量相对较少，
且明显低于土壤和水中自然存在的硼量。
人体或环境造成不合理的风险或不利影响。现有研究表明，工业硼酸对鸟类，鱼类和水生无
脊椎动物几乎无毒，对有益昆虫相对无毒。此外，用作农药的硼酸及其盐类的量相对较少，
且明显低于土壤和水中自然存在的硼量。
[0120] 可用于本发明的硼酸盐包括但不限于原硼酸盐、偏硼酸盐、三硼酸盐、四硼酸盐、五硼酸盐、或其组合等。还包括硼酸衍生物如硼酸(烷基(例如十四烷基，棕榈基，硬脂基)、
烯基或芳基取代的硼酸，如苯基硼酸，4-吡啶硼酸等)或有机硼酸盐(烷基、烯基或芳基硼酸
盐，如苯酯硼酸)，或其组合。
烯基或芳基取代的硼酸，如苯基硼酸，4-吡啶硼酸等)或有机硼酸盐(烷基、烯基或芳基硼酸
盐，如苯酯硼酸)，或其组合。
[0121] 季铵化合物和胆碱
[0122] 季铵化合物(阳离子)，也称为季铵盐(quats)，是带正电荷的多原子离子，具有NH4++
结构，R是烷基或芳基。与铵离子(NH4)以及伯铵，仲铵或叔铵阳离子不同，季铵阳离子永久
带电，与其溶液的pH值无关。季铵盐或季铵化合物(在油田说法(oilfield parlance)中称
为季胺(quaternary amines))是具有阴离子的季铵阳离子的盐。
结构，R是烷基或芳基。与铵离子(NH4)以及伯铵，仲铵或叔铵阳离子不同，季铵阳离子永久
带电，与其溶液的pH值无关。季铵盐或季铵化合物(在油田说法(oilfield parlance)中称
为季胺(quaternary amines))是具有阴离子的季铵阳离子的盐。
[0123] 根据一种实施方式，季铵化合物是胆碱及其衍生物，其是一种水溶性营养素，通常分组在B族复合维生素中，在许多生物过程中起关键作用。胆碱通常是指含有N，N，N-三甲基
乙醇铵阳离子的各种季铵盐。阳离子出现在磷脂酰胆碱和鞘磷脂的端基中，这两种磷脂在
细胞膜中是丰富的。胆碱是神经递质乙酰胆碱的前体分子，其参与许多功能，包括记忆和肌
肉控制。必须通过饮食消耗胆碱才能保持身体健康。它被用于合成体细胞膜中的结构成分。
尽管胆碱具有感知收益，饮食建议劝阻人们吃某些高胆碱食物，如鸡蛋和脂肪肉。2005年全
国健康和营养调查表明，只有2％的绝经后妇女消耗推荐摄入量的胆碱。
乙醇铵阳离子的各种季铵盐。阳离子出现在磷脂酰胆碱和鞘磷脂的端基中，这两种磷脂在
细胞膜中是丰富的。胆碱是神经递质乙酰胆碱的前体分子，其参与许多功能，包括记忆和肌
肉控制。必须通过饮食消耗胆碱才能保持身体健康。它被用于合成体细胞膜中的结构成分。
尽管胆碱具有感知收益，饮食建议劝阻人们吃某些高胆碱食物，如鸡蛋和脂肪肉。2005年全
国健康和营养调查表明，只有2％的绝经后妇女消耗推荐摄入量的胆碱。
[0124] 根据另一种实施方式，季铵化合物优选但不限于在烷基链上至少具有一个游离羟基的氯化胆碱(2-羟乙基三甲基氯化铵)或其衍生物，即(2-羟乙基)三乙基氯化铵、(2-羟丙
基)三甲基氯化铵、(2,3-二羟基丙基)三甲基氯化铵等。
基)三甲基氯化铵、(2,3-二羟基丙基)三甲基氯化铵等。
[0125] 因此，在实施方案中，公开了基于与季铵络合的硼酸盐或硼酸盐衍生物的抗菌和抗病毒化合物。
[0126] 实施方案中，公开了式I的化合物或其药学上可接受的盐及其立体异构体：
[0127]
[0128] 其中，
[0129] R1、R2、R3、和R4独立地选自烷基、环烷基、或芳基，所述基团任选地被一个或多个-OH取代，且
[0130] 各个R1、R2、R3、和R4可以任选地与另一个R1、R2、R3、和R4连接；
[0131] R5选自–BO2、–BO3、–BO4、–B2O3、–B2O4、–B3O5、–B3O7、–B4O7、–B4O9–B5O8、–O–BR6R7、–R9–BR6R7；
[0132] R6选自-H、-OH、烷基、烯基、芳基、-O-R8；
[0133] R7不存在或选自-H、-OH、烷基、烯基、芳基、和-O-R8；
[0134] R8选自-H、烷基、烯基、芳基；
[0135] R9选自烷基、烯基、芳基。
[0136] 根据一种实施方式，R1可以是直链或支链的C1-6烷基。根据一种实施方式，R1可以是CH2-CH2。
[0137] 根据另一种实施方式，R2、R3、和R4可以是C1-3烷基。根据另一种实施方式，R2、R3、和R4可以独立地是CH3、CH2-CH3、或CH2-CH2-CH3。
[0138] 根据另一种实施方式，R5是-B5O8。
[0139] 事实上，根据一种实施方式，由于天然存在；低毒；廉价而且容易制造的几个优点，本发明优先选用与胆碱络合的硼酸或其衍生物。
[0140] 根据另一种实施方式，式I化合物，或其药学上可接受的盐及其立体异构体，可选自以下化合物：
[0141] 及其组合。
[0142] 本发明包括所示化合物，并且还包括(如果可能)化合物的各一非对映体，对映体和差向异构体，及其非对映体和/或对映体的混合物，包括外消旋混合物。虽然本文公开了
优选的具体立体化学，但其它立体异构体，包括非对映体、对映体、差向异构体、及其混合物
也可用于治疗致病性感染。无活性或活性较低的非对映体和对映体可用于涉及本发明化合
物的靶病原体和作用机制的科学研究。
优选的具体立体化学，但其它立体异构体，包括非对映体、对映体、差向异构体、及其混合物
也可用于治疗致病性感染。无活性或活性较低的非对映体和对映体可用于涉及本发明化合
物的靶病原体和作用机制的科学研究。
[0143] 本文公开的化合物可以用于包含(a)所述化合物或其药学上可接受的盐和(b)药学上可接受的载体的药物组合物中。所述化合物可以用于包含一种或多种其他活性药物成
分的药物组合物中。所述化合物也可用于式I化合物或其药学上可接受的盐是唯一活性成
分的药物组合物中。
分的药物组合物中。所述化合物也可用于式I化合物或其药学上可接受的盐是唯一活性成
分的药物组合物中。
[0144] 本文公开的化合物可以用于包含(a)所述化合物或其可接受的盐和(b)可接受的载体的组合物中。所述化合物可以用于包含一种或多种其他活性成分的组合物中。所述化
合物也可用于式I化合物或其可接受的盐是唯一活性成分的组合物中。
合物也可用于式I化合物或其可接受的盐是唯一活性成分的组合物中。
[0145] 根据另一种实施方式，公开了本发明化合物或其药学上可接受的盐的用途，用于制备一药物，所述的药物用于治疗受试者的致病性感染。
[0146] 还公开了本发明化合物或其药学上可接受的盐，或本发明的组合物的用途，用于治疗受试者的致病性感染。
[0147] 根据另一种实施方式，公开了治疗或预防有需要的受试者的致病性感染的方法，其包括：向所述的受试者施用治疗有效量的本发明化合物，或其药学上可接受的盐，或本发
明的组合物。
明的组合物。
[0148] 根据一种实施方式，致病性感染可以是细菌感染、病毒感染、真菌感染、寄生虫感染、或其组合。细菌感染的实例包括但不限于弧菌科感染、肠杆菌感染、肉毒杆菌感染、单核
细胞增生性李斯特氏菌感染。病毒感染的实例包括但不限于桃拉综合征病毒(TSV)感染、黄
头病毒(YHV)感染、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)感染、球形杆状病毒感染、产卵
虾死亡病毒病感染、弹状病毒感染、锦鲤疱疹病毒(KHV)感染、大口黑鲈病毒(LMBV)感染、对
虾杆状病毒(BP)感染、疱疹病毒科感染、逆转录病毒科感染、丝状真菌病毒感染、和HIV感
染。
细胞增生性李斯特氏菌感染。病毒感染的实例包括但不限于桃拉综合征病毒(TSV)感染、黄
头病毒(YHV)感染、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)感染、球形杆状病毒感染、产卵
虾死亡病毒病感染、弹状病毒感染、锦鲤疱疹病毒(KHV)感染、大口黑鲈病毒(LMBV)感染、对
虾杆状病毒(BP)感染、疱疹病毒科感染、逆转录病毒科感染、丝状真菌病毒感染、和HIV感
染。
[0149] 根据一种实施方式，受试者可以是哺乳动物、鱼类、鸟类和甲壳动物。哺乳动物可以是人、牛、马和有蹄类动物等。鱼类可以是盲鳗、七鳃鳗、软骨鱼和硬骨鱼。所述鸟类可以
选自下组：鸡、火鸡和家禽。甲壳动物可以是虾、蟹、大螯虾、龙虾等。
选自下组：鸡、火鸡和家禽。甲壳动物可以是虾、蟹、大螯虾、龙虾等。
[0150] 根据另一种实施方式，公开了治疗或预防有需要的甲壳动物的致病性感染的方法，其包括：向所述的甲壳动物施用治疗有效量的本发明任一化合物，或其药学上可接受的
盐，或本发明的组合物。
盐，或本发明的组合物。
[0151] 通过参考下面的实施例可以更容易地理解本发明，这些实施例是为了说明本发明而不是限制其范围。
[0152] 这些实施例进一步说明了生产硼酸盐衍生物的方法和与季铵化合物，优选胆碱(2-羟乙基)三甲基氯化铵(图1)络合的方法。
[0153] 实施例1
[0154] 胆碱/硼酸盐络合物的制备
[0155] 胆碱/硼酸盐络合物(图1)基本上是在饱和水溶液中制备的，以便于在低温下通过结晶获得最终产物。优选使用的胆碱和硼酸的浓度为等摩尔比(1:1)。
[0156] 1-1-氯化胆碱与硼酸的络合作用
[0157] 在90℃下，将总量为123.66g的硼酸分散在400mL蒸馏水中。剧烈搅拌该溶液。硼酸分散后，将总量为279.24g的氯化胆碱缓慢加入硼酸溶液中，且温度保持在60℃。在持续的
剧烈搅拌下(～600rpm)，当加入氯化胆碱时，溶液是浑浊的，但是在加热1小时后变得澄清。
反应至少持续2小时。
剧烈搅拌下(～600rpm)，当加入氯化胆碱时，溶液是浑浊的，但是在加热1小时后变得澄清。
反应至少持续2小时。
[0158] 1-2-胆碱/硼酸盐络合物的结晶
[0159] 在反应结束时，逐渐降低温度，以便缓慢冷却溶液，同时缓慢搅拌(～200rpm)。当温度达到35-40℃时，将溶液转移到塑料容器中，搅拌速度降至150rpm，以促进结晶的形成。
此时，可以在水槽中加入一些冰块来加速冷却过程。一旦温度约为15℃，将溶液在4-6℃冷
藏24小时。然后通过倾析，或者通过使用24cm沃特曼(Whatman)滤纸N°1，在约40kPa的负压
(真空)下过滤，来收集晶体。收集的晶体在温度约35-40℃的烘箱中干燥至少24小时。
此时，可以在水槽中加入一些冰块来加速冷却过程。一旦温度约为15℃，将溶液在4-6℃冷
藏24小时。然后通过倾析，或者通过使用24cm沃特曼(Whatman)滤纸N°1，在约40kPa的负压
(真空)下过滤，来收集晶体。收集的晶体在温度约35-40℃的烘箱中干燥至少24小时。
[0160] 实施例2
[0161] 胆碱/四硼酸盐络合物的制备
[0162] 胆碱和四硼酸的络合在与实施例1所述的相同条件下进行制备，除了使用十水合四硼酸钠代替硼酸之外。
[0163] 实施例3
[0164] 胆碱/五硼酸盐络合物的制备
[0165] 可以采用两种方法进行胆碱/五硼酸盐络合物的合成。首先，一种方法是首先制备第一种胆碱/硼酸盐络合物，其与十水合四硼酸钠反应形成胆碱/五硼酸盐络合物。或者，另
一方法是首先合成五硼酸钠，然后与胆碱络合。
一方法是首先合成五硼酸钠，然后与胆碱络合。
[0166] 3-1-方法I：
[0167] 3-1-1-胆碱/硼酸盐络合物的制备
[0168] 胆碱和硼酸的络合在与实施例1中所述的相同条件下制备(图1)。
[0169] 3-1-2-胆碱/硼酸盐与十水合四硼酸钠的络合
[0170] 当进行胆碱/硼酸络合反应时，溶液的温度降至约60℃。然后，在剧烈搅拌下，在溶液中加入总量为127.39g的十水合四硼酸钠，以便与先前获得的胆碱/硼酸(图2，方法1)反
应。完全分散后，反应持续至少2小时，溶液的温度逐渐降至室温，缓慢搅拌(150-200转/分)
以促进结晶。当温度达到室温时，将溶液冷藏24小时，过滤收集胆碱/五硼酸盐晶体，并在40
℃下干燥24小时。
应。完全分散后，反应持续至少2小时，溶液的温度逐渐降至室温，缓慢搅拌(150-200转/分)
以促进结晶。当温度达到室温时，将溶液冷藏24小时，过滤收集胆碱/五硼酸盐晶体，并在40
℃下干燥24小时。
[0171] 3-2-方法II
[0172] 3-2-1-五硼酸钠的制备
[0173] 向玻璃钢化烧杯中加入体积为800mL的蒸馏水，并在约60℃的温度下加热。当达到设定温度时，在温和搅拌下，将总量为350g的十水合四硼酸钠和总量为340g硼酸交替地，逐
份地(每份约20克)加入烧杯中。在添加下一份之前，确保所有化学品溶解，且不停止搅拌。
份地(每份约20克)加入烧杯中。在添加下一份之前，确保所有化学品溶解，且不停止搅拌。
[0174] 一旦所有化学品都完全加入，溶液的温度保持在60℃，并保持搅拌至少30分钟。为了获得五硼酸钠粉末，在适度搅拌(约200rpm)下，缓慢冷却溶液。当温度达到25℃时，将溶
液在4℃下冷藏24小时。在塑料容器中通过过滤收集沉淀，并且在使用前至少在40℃储存24
小时。
液在4℃下冷藏24小时。在塑料容器中通过过滤收集沉淀，并且在使用前至少在40℃储存24
小时。
[0175] 3-2-2-五硼酸盐与胆碱的络合
[0176] 在温度55±2℃的温和搅拌下，将总量为300g的五硼酸钠晶体(先前获得的)加入含有350mL蒸馏水的玻璃钢化烧杯中。完全溶解后，将总量为140g的氯化胆碱缓慢加入五硼
酸盐溶液中，始终在搅拌下且反应开始至少1小时(图2，方法2)。
酸盐溶液中，始终在搅拌下且反应开始至少1小时(图2，方法2)。
[0177] 通过在与前述制备五硼酸钠的相同条件下冷藏，获得胆碱/五硼酸盐络合物晶体。实际上，胆碱/五硼酸盐溶液在适度搅拌(约200rpm)下缓慢冷却。当温度达到25℃时，将溶
液在4℃下冷藏24小时。在塑料容器中通过过滤收集沉淀，并且在使用前至少在40℃储存24
小时。图2显示了胆碱/五硼酸盐络合物的预测结构。
液在4℃下冷藏24小时。在塑料容器中通过过滤收集沉淀，并且在使用前至少在40℃储存24
小时。图2显示了胆碱/五硼酸盐络合物的预测结构。
[0178] 实施例4
[0179] 胆碱/硼酸盐及其衍生物络合物的表征
[0180] 4-1-络合物中季铵化合物的测定
[0181] 4-1-1-基于碘化铋钾试剂的分光光度测定法
[0182] 为了评估作为胆碱衍生物的季铵化合物(QAC)，使用基于碘化铋钾试剂的分光光度测定法，如Stumpf(Stumpf，D.K.1984.Plant.Physiol.,75,273-274)所述，稍作修改。其
原理是利用硝酸铋和碘化钠形成络合物，并使得反应介质中的QAC沉淀呈现出砖红色。实际
上，碘化铋钾试剂通过混合等体积的0.35M的硝酸铋(在20％(v/v)的乙酸中)和2.45M的碘
化钠(在蒸馏水中)来制备。然后，在10μL样品中加入100μL混合物。通过将1.0-8.0μL胆碱原液(0.500g/ml)加入塑料的1.5mL微量离心管中，绘制标准曲线。样品和标准溶液以10,000g
离心3分钟，完全去除上清液。然后，将获得的沉淀物溶解在1mL的2.45M NaI溶液中，剧烈搅
拌至少15分钟，并通过加入99mL的0.49M NaI进行稀释。最后，使用0.49M NaI溶液作为空
白，通过分光光度法在420nm(最大吸收)下记录样品。
原理是利用硝酸铋和碘化钠形成络合物，并使得反应介质中的QAC沉淀呈现出砖红色。实际
上，碘化铋钾试剂通过混合等体积的0.35M的硝酸铋(在20％(v/v)的乙酸中)和2.45M的碘
化钠(在蒸馏水中)来制备。然后，在10μL样品中加入100μL混合物。通过将1.0-8.0μL胆碱原液(0.500g/ml)加入塑料的1.5mL微量离心管中，绘制标准曲线。样品和标准溶液以10,000g
离心3分钟，完全去除上清液。然后，将获得的沉淀物溶解在1mL的2.45M NaI溶液中，剧烈搅
拌至少15分钟，并通过加入99mL的0.49M NaI进行稀释。最后，使用0.49M NaI溶液作为空
白，通过分光光度法在420nm(最大吸收)下记录样品。
[0183] 通常，在所有样品中检测到季铵化合物，其中胆碱/硼酸盐(四硼酸盐或五硼酸盐)络合物的比例为1:1(等摩尔络合物)。如实施例3所述，从方法1和2获得的胆碱/五硼酸盐络
合物没有观察到显著差异。
合物没有观察到显著差异。
[0184] 4-1-2-元素分析
[0185] 胆碱/硼酸盐或其衍生物络合物的元素组成的分析，能够确认胆碱与不同硼酸盐或其衍生物之间形成的络合物的结构。如实施例3中所述，通过方法1和2获得的胆碱/五硼
酸盐的比例没有观察到显著差异。
酸盐的比例没有观察到显著差异。
[0186] 4-1-3-FTIR分析
[0187] 在装备有通用衰减全反射(UATR)装置的红外光谱仪(Spectrum One)(珀金埃尔默，加拿大)仪器上记录FTIR光谱。所有样品(包括硼酸盐或其衍生物以及硼酸盐或其衍生
物络合物)在粉末(20mg)形式下，在光谱区(4000-650cm-1)以4cm-1的分辨率，以24次扫描/
分钟进行记录。
物络合物)在粉末(20mg)形式下，在光谱区(4000-650cm-1)以4cm-1的分辨率，以24次扫描/
分钟进行记录。
[0188] 图3显示了通过不同合成方法获得的与硼酸盐和五硼酸盐络合的氯化胆碱、硼酸、五硼酸盐和胆碱的FTIR光谱。
[0189] 对于平面的硼酸FTIR光谱，在3220cm-1处观察到B-O-H谱带的伸缩振动。将位于1430和1195cm-1的吸收带分别指定为不对称的B-O伸缩振动和平面内B-O-H弯曲。关于五硼
酸盐，注意到在3220cm-1处观察到相似的B-O-H带的伸缩振动。然而，在约3380cm-1处出现了
新的吸收带，并且可能是由于H-O-H(来自水的游离O-H)。另外，B-O吸收带引起了不对称的
B-O伸缩振动，并且平面内B-O-H弯曲移至1375和1140cm-1。在1300cm-1也观察到一个新的
带，可能是由于B-O-B伸缩振动。
酸盐，注意到在3220cm-1处观察到相似的B-O-H带的伸缩振动。然而，在约3380cm-1处出现了
新的吸收带，并且可能是由于H-O-H(来自水的游离O-H)。另外，B-O吸收带引起了不对称的
B-O伸缩振动，并且平面内B-O-H弯曲移至1375和1140cm-1。在1300cm-1也观察到一个新的
带，可能是由于B-O-B伸缩振动。
[0190] 当硼酸或五硼酸盐与胆碱络合时，观察到类似的FTIR光谱图。在3500-3000cm-1的光谱区域内，在3380和3220cm-1处观察到O-H带的伸缩振动，分别指定为H-O-H吸收带和B-O-
H吸收带。在1500-1000cm-1的光谱范围内，B-O的伸缩振动位于1375和1300cm-1处，并且在
-1 -1
1140cm 处注意到平面内B-O-H弯曲。在1410cm 处观察到的轻微的肩峰(shoulder)，似乎
有助于季铵CH3-N+(来自胆碱)。而且，1080和1010cm-1处的吸收带分别归因于C-N和C-O伸缩
振动。
H吸收带。在1500-1000cm-1的光谱范围内，B-O的伸缩振动位于1375和1300cm-1处，并且在
-1 -1
1140cm 处注意到平面内B-O-H弯曲。在1410cm 处观察到的轻微的肩峰(shoulder)，似乎
有助于季铵CH3-N+(来自胆碱)。而且，1080和1010cm-1处的吸收带分别归因于C-N和C-O伸缩
振动。
[0191] 实施例5
[0192] 胆碱/硼酸盐和胆碱/硼酸盐衍生物络合物对南美白对虾的毒性评价
[0193] 5-1-实验动物的采集和维护
[0194] 虾，南美白对虾(Litopenaeus vannamei)(约12-16日龄的后期幼虫)从LaPaz(BCS，墨西哥)的商业孵化场获得，并保持在具有气升式生物过滤器的1000L玻璃纤维池中，
在室温下的水中，盐度为35‰(ppt)。
在室温下的水中，盐度为35‰(ppt)。
[0195] 所有的实验都使用天然海水。从恩塞纳达-拉巴斯(Ensenada de La Paz)获得去除沙子和其他悬浮颗粒后的海水。最后，在用于实验之前，海水用紫外线灯杀菌。水池通过
连接到大容量鼓风机的气石单独充气。每周进行一次局部换水，以保持水质。虾首先被喂食
卤虫(Artemia sp)，当虾达到20日龄(20日龄幼虫后)时，戒断并喂食商业饲料(含35％粗蛋
白，普瑞纳品牌)。每日记录温度和pH值；用盐度计(Aquafauna，日本)测量盐度，用温克勒法
估算溶解氧(Strickland和Parsons，1972)。
连接到大容量鼓风机的气石单独充气。每周进行一次局部换水，以保持水质。虾首先被喂食
卤虫(Artemia sp)，当虾达到20日龄(20日龄幼虫后)时，戒断并喂食商业饲料(含35％粗蛋
白，普瑞纳品牌)。每日记录温度和pH值；用盐度计(Aquafauna，日本)测量盐度，用温克勒法
估算溶解氧(Strickland和Parsons，1972)。
[0196] 5-2-胆碱/硼酸盐和胆碱/硼酸盐衍生物络合物的毒性评价
[0197] 在开始试验之前的一周，选择密集养殖池塘中的白对虾(南美白对虾)，并使其适应实验条件。将虾放入有1000L过滤海水的圆形水池中，盐度为38‰(ppt)，并持续充气，自
由采食方式饲喂含35％粗蛋白的商业颗粒饲料。
由采食方式饲喂含35％粗蛋白的商业颗粒饲料。
[0198] 在适应期之后，将不同浓度(1、5和10mg/g)的胆碱/硼酸盐或其衍生物与商业颗粒饲料物理混合，并在15天内在相同的条件下(自由采食)饲喂。全球范围内，本研究共调查了
6组：
6组：
[0199] 1.硼酸；
[0200] 2.四硼酸盐；
[0201] 3.五硼酸盐；
[0202] 4.胆碱/硼酸盐络合物；
[0203] 5.胆碱/四硼酸盐络合物；
[0204] 6.胆碱/五硼酸盐络合物。
[0205] 结果显示，对照组和用与胆碱络合的硼酸或其衍生物处理的组之间没有显著差异。这些结果表明，对于剂量低于10mg/g虾饲料的硼酸或其衍生物络合物，对南美白对虾没
有显著毒性。
有显著毒性。
[0206] 实施例6
[0207] 激发研究的准备
[0208] 6-1-细菌分析的准备
[0209] 6-1-1-细菌菌株和培养条件
[0210] 在本研究中使用剧毒细菌菌株副溶血性弧菌CAIM 170(重要水生微生物保藏中心，CIAD，墨西哥)(Roque等，1998)。菌株保存在含有2.5％(w/v)NaCl和15％(v/v)甘油的胰
蛋白胨大豆肉汤(TSB)中，-80℃下。在使用之前，将冷冻管解冻并接种到具有2.5％(w/v)
NaCl的5mL TSB中，在37℃下，在旋转振荡器(200rpm)中温育过夜，以活化菌株。之后，将2mL
体积的过夜培养物转移至100mL的TSB中，并在相似的活化条件(37℃，200rpm)下再温育。
蛋白胨大豆肉汤(TSB)中，-80℃下。在使用之前，将冷冻管解冻并接种到具有2.5％(w/v)
NaCl的5mL TSB中，在37℃下，在旋转振荡器(200rpm)中温育过夜，以活化菌株。之后，将2mL
体积的过夜培养物转移至100mL的TSB中，并在相似的活化条件(37℃，200rpm)下再温育。
[0211] 每隔30分钟，通过分光光度法在600nm处测量细菌的密度。同时，取出小份样品，通过在含有1％NaCl的胰蛋白胨大豆琼脂上接种连续稀释液，进行活菌数测定。平板在37℃孵
育24小时。通过对活菌计数(x轴)与600nm处的光密度(y轴)作图，绘制生长曲线。此图用于
确定进一步的峰值研究期间的活细胞计数。对于激发，所有试验中包含对照组：
育24小时。通过对活菌计数(x轴)与600nm处的光密度(y轴)作图，绘制生长曲线。此图用于
确定进一步的峰值研究期间的活细胞计数。对于激发，所有试验中包含对照组：
[0212] -虾的阳性对照组用副溶血性弧菌病原体进行处理；
[0213] -虾的阴性对照组用无菌生理盐水(无病原体)处理，而不接受病原体。
[0214] 初步试验显示，1x106菌落形成单位(cfu)/mL的副溶血性弧菌(VP)悬浮液可在24小时内杀死60％的对虾种群，在96小时内杀死约70％，而用非毒性副溶血弧菌处理的组显
示，96小时累计对虾死亡率小于10％。
示，96小时累计对虾死亡率小于10％。
[0215] 6-1-2-用于定量测定副溶血性弧菌的实时聚合酶链式反应测定的优化
[0216] 用于该测定的引物是Vp-ToxR q-PCR(副溶血性弧菌ToxR基因定量聚合酶链式反应)176F(正向引物，SEQ ID NO：1：GGA AGT TTT AAC CCG TAA CGA GC)和176R(反向引物，
SEQ ID NO：2：GGT ACA AAT GAG TTG ATA GCC TCG)，并按照Untergasser等人(2007)的描
述，使用软件“Primer3Plus”进行设计，参数如下：
SEQ ID NO：2：GGT ACA AAT GAG TTG ATA GCC TCG)，并按照Untergasser等人(2007)的描
述，使用软件“Primer3Plus”进行设计，参数如下：
[0217] -引物长度：18-24bp；
[0218] -GC含量：35-65％；
[0219] -熔解温度(Tm)：℃-60℃；
[0220] -产物大小：80-250bp(Wang，X.和Seed，B.2007.在：“实时PCR”.Dorak M.Tevfik.编辑泰勒&弗朗西斯.纽约.美国.第93-105页)。
[0221] 使用软件“Oligoevaluator”(Sigma-AldrichTM)和“Primer digital”(Kalendar，R.，Lee，D.，Schulman，A.H.2011.基因组学，98,137-144)，评估每个引物的热力学参数以检查引物二聚体和二级结构。这些引物产生了一个176bp的扩增子，并将其悬浮在无核酸酶的
水中，制成10pmol/μL的工作溶液。
水中，制成10pmol/μL的工作溶液。
[0222] 为了建立标准曲线，使用以下混合物从副溶血性弧菌CAIM 170的培养物中提取和纯化DNA进行连续稀释：
[0223] -5μL的SSO-Fast supermix evagreen(BIORAD，美国)；
[0224] -1μL的Vp-ToxR q-PCR 176F(10pmol/μL)；
[0225] -1μL的Vp-ToxR q-PCR 176R(10pmol/μL)；
[0226] -2μL不含DNAse的水和1μL作为模板的DNA。
[0227] 定量PCR在Rotor基因6000实时PCR系统(QiagenTM)上进行。实施的扩增条件如下：
[0228] -50℃初始活化2分钟；
[0229] -95℃预变性10分钟，随后进行45个循环的95℃变性15s
[0230] -60℃引物退火20s和72℃延伸30s，最后在72℃下延伸5min。
[0231] -在扩增结束时使用以下条件进行熔解曲线分析：65℃-80℃(1℃/s)。
[0232] 使用Rotor Gene-Q Pure Detection(1.7Build 94)软件分析数据。
[0233] 6-1-3-用于检测副溶血性弧菌的富集培养基和样品
[0234] 在这项研究中，使用富集培养基来评估它们对副溶血性弧菌检测的影响。所用的富集培养基是碱性蛋白胨水(APW；1％蛋白胨，1％NaCl，pH8.5；Tyagi等，2009)。实际上，收集5克虾，放在冰上。在无菌条件下，在pH 7.5的磷酸盐缓冲液中，立即将这些虾用Polytron
匀浆器匀浆。将体积为1mL的匀浆物质接种到APW培养基中，并在200rpm的旋转振荡器中，在
37℃下，过夜培养24小时。
匀浆器匀浆。将体积为1mL的匀浆物质接种到APW培养基中，并在200rpm的旋转振荡器中，在
37℃下，过夜培养24小时。
[0235] 6-1-4-从APW培养基中提取副溶血性弧菌DNA
[0236] 将1mL体积的APW培养基收集在微量离心管中。将含有培养基的管以10,000g离心10分钟，收集沉淀并用miliQ无菌水洗涤，并悬浮于400μL miliQ无菌水中。以10,000g进一
步离心5分钟，并将管在98℃温育20分钟，然后以5,000g离心5分钟。将上清液收集在新的微
量离心管中并储存在-20℃。
步离心5分钟，并将管在98℃温育20分钟，然后以5,000g离心5分钟。将上清液收集在新的微
量离心管中并储存在-20℃。
[0237] 6-2-白斑综合症病毒(WSSV)分析的制备
[0238] 6-2-1-WSSV原液和体内滴定
[0239] 该病毒是从2013年在墨西哥锡那罗亚州的商业化农场获得的感染WSSV的成年南美白对虾中分离出来的。通过改进的差速离心法从感染的虾匀浆中纯化病毒原液，如前述
的Du等人(Du，H.H.，Fu，L.L.，Xu，Y.X.，Kil，Z.S.，Xu，Z.R.2007.水产养殖，262：532-534)，然后储存在-80℃。对于测定，将WSSV原液连续稀释以制备含有通过竞争性PCR确定的各种
靶拷贝数的溶液。
的Du等人(Du，H.H.，Fu，L.L.，Xu，Y.X.，Kil，Z.S.，Xu，Z.R.2007.水产养殖，262：532-534)，然后储存在-80℃。对于测定，将WSSV原液连续稀释以制备含有通过竞争性PCR确定的各种
靶拷贝数的溶液。
[0240] 使用胰岛素针头将20μL体积的不同稀释度的组织匀浆(含有WSSV的330mMNaCl)肌肉注射到南美白对虾的第四或第五腹节中。死亡率每天记录两次，用PCR检测死虾，以突出
WSSV的存在。
WSSV的存在。
[0241] 含有1×106个拷贝的WSSV稀释物适用于随后的实验(Du等人2006).在本研究中，含有1×106个拷贝的稀释度大约相当于3％的WSSV悬浮液，其可以在48小时内杀死50％的
虾，在96小时内杀死100％的虾；另一方面，1％的WSSV悬浮液的病毒稀释度可以在120小时
内杀死80％的虾。
虾，在96小时内杀死100％的虾；另一方面，1％的WSSV悬浮液的病毒稀释度可以在120小时
内杀死80％的虾。
[0242] 6-2-2-使用q-PCR技术检测WSSV
[0243] 在感染48、72和96小时后，使用含有500μL抗凝血剂溶液(pH7.3，在4℃)的无菌注射器从腹血窦收集血淋巴，如Vargas-Albores等人所述(Vargas-Albores，F.，Guzmán，
M.A.，Ochoa，J.L.1993.Compa.Biochem.Physiol.,A部分，106,299-303)：
M.A.，Ochoa，J.L.1993.Compa.Biochem.Physiol.,A部分，106,299-303)：
[0244] -450mM NaCl；
[0245] -10mM KCl；
[0246] -10mM HEPES；
[0247] -10mM EDTA
[0248] 在4℃下，将收集的血淋巴以12,000g离心20分钟，并将沉淀重悬于TRIzol试剂TM中。根据生产商的说明，提取总RNA，并将总RNA沉淀重悬于15μL无RNA酶的水中。使用DNAse
I(InvitrogenTM)处理过的1μg量的总RNA，使用NanodropTM1000(Thermoscientific)，对总
RNA进行定量。使用“GoScript逆转录系统”(Promega)进行cDNA的合成。使用的引物WSV230F
的序列是SEQ ID NO：3：GCT GGT GGG GGA TGA TAC TA，引物WSV230R的序列为SEQ ID NO：
4：GTC TCC CGT CAC CGT CTT TA，如Gomez-Anduro等人所述。(Gomez-Anduro,G.A.,
Barillas-Mury,C.V.,Peregrino-Uriarte,A.B.,Gupta,L,Gollas-Galvam,T.,Hernandez-
Lopez,J.,Yepiz-Plascencia,G.2006.Develop.Comp.Immunol.,30:893–900).q-PCR如下
进行：
I(InvitrogenTM)处理过的1μg量的总RNA，使用NanodropTM1000(Thermoscientific)，对总
RNA进行定量。使用“GoScript逆转录系统”(Promega)进行cDNA的合成。使用的引物WSV230F
的序列是SEQ ID NO：3：GCT GGT GGG GGA TGA TAC TA，引物WSV230R的序列为SEQ ID NO：
4：GTC TCC CGT CAC CGT CTT TA，如Gomez-Anduro等人所述。(Gomez-Anduro,G.A.,
Barillas-Mury,C.V.,Peregrino-Uriarte,A.B.,Gupta,L,Gollas-Galvam,T.,Hernandez-
Lopez,J.,Yepiz-Plascencia,G.2006.Develop.Comp.Immunol.,30:893–900).q-PCR如下
进行：
[0249] -5μL SSO快速qPCR超混物evaGreen(BIORAD，USA)；
[0250] -1μL WSV230F(10pmol/μL)和1μL WSV230R(10pmol/μL)；
[0251] -2μL不含DNAse的水；
[0252] -1μL模板，作为来自血细胞的cDNA。
[0253] 首先95℃预变性10分钟，随后进行40个循环的95℃变性15s，58℃引物退火20s和72℃延伸30s，最后在72℃下延伸5min。在扩增结束时使用以下条件进行熔解曲线分析：70
℃-95℃(1℃/s).使用转子-基因-Q纯检测(softwareRotor-Gene-Q Pure Detection，
1.7Build 94)软件分析数据。
℃-95℃(1℃/s).使用转子-基因-Q纯检测(softwareRotor-Gene-Q Pure Detection，
1.7Build 94)软件分析数据。
[0254] 6-3-激发(Challenge)研究
[0255] 6-3-1-实验系统
[0256] 采用静态实验系统，由24个20-I玻璃纤维池组成。每个含有过滤和紫外线消毒的海水(35ppt，pH8.0)的池子在27℃下通过气石单独充气。
[0257] 6-3-2-实验步骤
[0258] 6-3-2-1-欢呼(Acclamation)
[0259] 向每个装有30升紫外线灭菌海水的池子中引入20只虾。在2天时间里，将虾留下来适应系统(欢呼)。在28天时间里，用混合有不同量的胆碱/五硼酸盐络合物的颗粒状商业饲
料来喂虾，用于WSSV和致病性副溶血性弧菌菌株的进一步激发。
料来喂虾，用于WSSV和致病性副溶血性弧菌菌株的进一步激发。
[0260] 6-3-2-2-激发测试
[0261] 通过向虾注射已知浓度的白斑综合征病毒(1-3％病毒悬浮液)或致病性副溶血性弧菌(1×106cfu/mL)菌株进行激发，实验重复三次。有两个对照组：
[0262] 1.阳性对照组-虾先前未接触过任何硼酸盐或其衍生物，且注射已知浓度的WSSV或致病性VP；
[0263] 2.阴性对照组-不用硼酸盐或其衍生物饲喂虾，且不用任何病原体处理；然而，虾注射生理盐水，而不是病原体。
[0264] 在病原体激发后，处理虾组和对照虾组继续接受相应的饲料。每天记录虾的死亡率。每次激发后观察虾96至120小时，记录水温和死亡率。在第一天，激发期间和激发后72小
时采集虾样品。将所有的虾样品以RNA储存液的形式(RNA latter)储存于-80℃，以便对病
原体装载和免疫相关基因的表达进行进一步的q-PCR分析。
时采集虾样品。将所有的虾样品以RNA储存液的形式(RNA latter)储存于-80℃，以便对病
原体装载和免疫相关基因的表达进行进一步的q-PCR分析。
[0265] 6-3-2-3-虾死亡率的测定
[0266] 在120小时内，每天记录死虾。将所有死虾样品以RNA储存液的形式(RNA latter)储存于-80℃，以便对病原体装载和免疫相关基因的表达进行进一步的q-PCR分析。
[0267] 6-4-单独使用硼酸或其衍生物或与胆碱复合的激发研究结果
[0268] 用毒性副溶血性弧菌激发虾(图4)，显示96小时后阴性(未感染病原体，且未用任何硼酸盐络合物处理)对照组的虾存活率为100％。对于阳性(感染病原体，但未用任何硼酸
盐络合物处理)的对照组，存活率约为30％。不同剂量(1、5和10mg/g商业颗粒饲料)的硼酸
盐、四硼酸盐或五硼酸盐(不与胆碱复合)观察到相似的存活率。
盐络合物处理)的对照组，存活率约为30％。不同剂量(1、5和10mg/g商业颗粒饲料)的硼酸
盐、四硼酸盐或五硼酸盐(不与胆碱复合)观察到相似的存活率。
[0269] 相反，胆碱/硼酸盐、胆碱/四硼酸盐和胆碱/五硼酸盐络合物观察到高存活率(>60％，p<0.05)。
[0270] 用WSSV(感染1％WSSV悬浮匀浆)激发的虾类似的观察，在96小时后阴性(未感染病原体且未用任何硼酸盐络合物处理)对照组的虾存活率为100％。对于阳性(感染病原体，但
未用任何硼酸盐络合物处理)的对照组，存活率约为30％。不同剂量(1、5和10mg/g商业颗粒
饲料)的硼酸盐、四硼酸盐或五硼酸盐(不与胆碱复合)观察到相似的存活率。相反，胆碱/硼
酸盐、胆碱/四硼酸盐和胆碱/五硼酸盐络合物观察到高存活率(>60％)。
未用任何硼酸盐络合物处理)的对照组，存活率约为30％。不同剂量(1、5和10mg/g商业颗粒
饲料)的硼酸盐、四硼酸盐或五硼酸盐(不与胆碱复合)观察到相似的存活率。相反，胆碱/硼
酸盐、胆碱/四硼酸盐和胆碱/五硼酸盐络合物观察到高存活率(>60％)。
[0271] 值得一提的是，对于用副溶血性弧菌测试的所有络合物，最佳存活(>80％)结果都是以5mg/g商业颗粒饲料的剂量，添加胆碱/五硼酸盐络合物获得的。因此，选择胆碱/五硼
酸盐络合物用于随后的研究。
酸盐络合物用于随后的研究。
[0272] 6-4-1-用副溶血性弧菌激发胆碱/五硼酸盐络合物的结果
[0273] 对于感染副溶血性弧菌(1×106cfu/mL)并以剂量为5mg/g饲料的胆碱/五硼酸盐络合物处理的虾，96小时后的存活率(图4)为84％(p<0.01)，感染副溶血性弧菌而不用胆
碱/五硼酸盐处理的虾的存活率约为30％。
碱/五硼酸盐处理的虾的存活率约为30％。
[0274] 6-4-1-用WSSV激发的胆碱/五硼酸盐络合物的结果
[0275] 由于样品之间的标准偏差低于3％，相同处理的重复实验之间没有统计学差异(p>0.05)。
[0276] 结果显示，用3％WSSV悬浮液激发的虾有统计学差异。对于来自阳性对照(感染)的虾，48小时后的存活率约为80％，对于以5mg/g的剂量的胆碱/五硼酸盐络合物饲喂的虾，存
活率为95％(统计学差异p<0.05)。后激发(post-challenge)96小时后，只有10％的阳性对
照虾存活。对于以1mg/g和5mg/g的剂量的胆碱/五硼酸盐络合物饲喂的虾，存活率约为
40％，有一点改善。
活率为95％(统计学差异p<0.05)。后激发(post-challenge)96小时后，只有10％的阳性对
照虾存活。对于以1mg/g和5mg/g的剂量的胆碱/五硼酸盐络合物饲喂的虾，存活率约为
40％，有一点改善。
[0277] 相反，当虾用1％WSSV悬浮液激发时(图5)，存活率有统计学差异(p<0.05)。72小时后，阳性对照(感染)的虾具有约65％的存活率，而饲喂5mg(胆碱/五硼酸盐络合物)/g饲料
的虾具有95％的存活率。后激发96小时后，阳性对照的虾的存活率约35％，而以饲喂5mg(胆
碱/五硼酸盐络合物)/g饲料的虾的存活率为85％(p<0.05)。
的虾具有95％的存活率。后激发96小时后，阳性对照的虾的存活率约35％，而以饲喂5mg(胆
碱/五硼酸盐络合物)/g饲料的虾的存活率为85％(p<0.05)。
[0278] 使用含有抗病原体化合物的功能性饲料被认为是预防虾的早期感染性疾病如早期死亡综合征(EMS)和白斑综合征病毒(WSSV)的基本策略。此外，一些抗微生物化合物，例
如在本试验中测试的化合物，似乎能够破坏细菌通讯，激活某些与释放毒素有关的基因。这
种细菌群体感应抑制(quorum quenching)代表了抗生素使用的一个重要的选择。
如在本试验中测试的化合物，似乎能够破坏细菌通讯，激活某些与释放毒素有关的基因。这
种细菌群体感应抑制(quorum quenching)代表了抗生素使用的一个重要的选择。
[0279] 数据分析显示，在遵循标准化注射方案时，在饲料日粮中添加5mg/g的胆碱/五硼酸盐络合物制剂可有效降低WSSV感染的影响。这对于控制影响相当数量商业性对虾生产作
业(从孵化场到养成设备)的疾病来说是一个重大的突破。尽管已经开发了多种用于预防和
治疗WSSV的产品，如基因疫苗，但是这些产品已经在商业操作中证明是无效的，由于缺乏有
效递送机制，或者是昂贵的而不能实际应用。胆碱/五硼酸盐络合物无毒，制造简单，稳定，
易于施用且相对便宜。
业(从孵化场到养成设备)的疾病来说是一个重大的突破。尽管已经开发了多种用于预防和
治疗WSSV的产品，如基因疫苗，但是这些产品已经在商业操作中证明是无效的，由于缺乏有
效递送机制，或者是昂贵的而不能实际应用。胆碱/五硼酸盐络合物无毒，制造简单，稳定，
易于施用且相对便宜。
[0280] 在商业化日粮中使用胆碱/五硼酸盐络合物作为添加剂提供了一种有效的控制虾肠道微生物活性的机制，这可能有助于解决商业养虾场中与副溶血性弧菌和WSSV有关的大
规模死亡问题。
规模死亡问题。
[0281] 实施例7
[0282] 胆碱/五硼酸盐络合物对南美白对虾免疫相关基因表达的研究
[0283] 7-1-RNA提取
[0284] 使用 和Qiagen Mini试剂盒(Qiagen，日耳曼敦，MD，USA)提取RNA。将浸泡在 中的虾样品置于 (MP生物医药有限责任公司，Solon，
OH，USA)中，并在4℃以6m/s的速度匀浆40秒。将200μL体积的氯仿加入到含有匀浆物质的
1.5mL无RNase的试管中并颠倒15次。将样品在室温下孵育3分钟，然后使用Eppendorf离心
机在4℃以8000g离心15分钟。小心地将上清液转移到新的1.5mL无RNA酶的试管中，按照制
造商的方案继续提取。
OH，USA)中，并在4℃以6m/s的速度匀浆40秒。将200μL体积的氯仿加入到含有匀浆物质的
1.5mL无RNase的试管中并颠倒15次。将样品在室温下孵育3分钟，然后使用Eppendorf离心
机在4℃以8000g离心15分钟。小心地将上清液转移到新的1.5mL无RNA酶的试管中，按照制
造商的方案继续提取。
[0285] 7-2-评估RNA质量和数量
[0286] RNA的质量和数量通过NanoDropTM 1000分光光度计(赛默飞世尔科技，沃尔瑟姆，MA，USA)和Bio-RadTM(Bio-Rad，赫拉克勒斯，CA，USA)通过变性凝胶电泳(用甲醛和MOPS 1X
的缓冲液的)进行(Sambrook，J.1989.在：“分子克隆-实验手册，第二版”.J.Sambrook，
E.F.Fritsch，T.Maniatis编辑.纽约冷泉港：冷泉港实验室出版社)。
的缓冲液的)进行(Sambrook，J.1989.在：“分子克隆-实验手册，第二版”.J.Sambrook，
E.F.Fritsch，T.Maniatis编辑.纽约冷泉港：冷泉港实验室出版社)。
[0287] 7-3-微阵列和扫描
[0288] 基于公开可得的基因序列，以及从代表各种生理条件和/或雄性和雌性南美白对虾的多个组织的cDNA文库确定的EST，设计微阵列。
[0289] 本研究共包括长度约61440-mer的寡核苷酸：将39592个虾ESTs；1216个质量控制点；112个Alexa-555染料阳性对照；80个Alexa-647染料阳性对照；20320Unigenes；16个
alexa-555收敛阳性对照；16个Alexa-647染料收敛性阳性对照和88阴性空白对照交给
MYCroarray(密歇根大学化学工程系)在氨基酸玻璃载玻片上印刷。用分子生物学级别的水
溶寡d(T)(2μg/μL)和随机引物(1μg/μL)，调节暴露样品和参比样品RNA至终体积19μL。将样品在70℃温育10分钟，然后在冰中冷冻。最后，将样品与5X反应缓冲液Superscript II试剂
盒(英杰公司，生命技术公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德，USA)混合：25mM MgCl2；氨基烯丙
基-dNTP和dUTP(3:1)；0.1M DTT和200U/μL Superscript II逆转录酶。混合物在25℃下温
浴10分钟，然后在42℃下温浴2小时。用5μL 1N NaOH和1μL EDTA 0.5M进行RNA水解。将混合
物在65℃孵育10分钟，然后加入25μL pH7.5的HEPES 1M。用Alexa-647染料分子探针TM(生命
技术公司，尤金俄勒冈，USA)荧光染料标记暴露于胆碱/五硼酸盐络合物的样品(n＝6)，并
用Alexa-555染料探针TM(生命技术公司，尤金俄勒冈，USA)标记参比样品(n＝6)。使用
QIAquickTM(Qiagen，杜塞尔多夫，德国)纯化氨基烯丙基-DNA(aa-DNA)。加入7μL体积的乙酸
钠3M和400μL试剂盒提供的结合缓冲液。根据制造商的说明，将混合物放置5分钟以进行纯
化。将洗脱的aa-DNA在VacufugeTM中浓缩至干，并重悬于4.5μL 100mM碳酸氢钠(pH9.0)中。
反应在室温下黑暗中过夜进行。使用QIAquickTM(Qiagen，杜塞尔多夫，德国)纯化标记的aa-
DNA，并用50uL水洗脱。在NanodropTM 1000分光光度计(赛默飞世尔科技，沃尔瑟姆，MA，USA)中定量标记的aa-DNA。
alexa-555收敛阳性对照；16个Alexa-647染料收敛性阳性对照和88阴性空白对照交给
MYCroarray(密歇根大学化学工程系)在氨基酸玻璃载玻片上印刷。用分子生物学级别的水
溶寡d(T)(2μg/μL)和随机引物(1μg/μL)，调节暴露样品和参比样品RNA至终体积19μL。将样品在70℃温育10分钟，然后在冰中冷冻。最后，将样品与5X反应缓冲液Superscript II试剂
盒(英杰公司，生命技术公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德，USA)混合：25mM MgCl2；氨基烯丙
基-dNTP和dUTP(3:1)；0.1M DTT和200U/μL Superscript II逆转录酶。混合物在25℃下温
浴10分钟，然后在42℃下温浴2小时。用5μL 1N NaOH和1μL EDTA 0.5M进行RNA水解。将混合
物在65℃孵育10分钟，然后加入25μL pH7.5的HEPES 1M。用Alexa-647染料分子探针TM(生命
技术公司，尤金俄勒冈，USA)荧光染料标记暴露于胆碱/五硼酸盐络合物的样品(n＝6)，并
用Alexa-555染料探针TM(生命技术公司，尤金俄勒冈，USA)标记参比样品(n＝6)。使用
QIAquickTM(Qiagen，杜塞尔多夫，德国)纯化氨基烯丙基-DNA(aa-DNA)。加入7μL体积的乙酸
钠3M和400μL试剂盒提供的结合缓冲液。根据制造商的说明，将混合物放置5分钟以进行纯
化。将洗脱的aa-DNA在VacufugeTM中浓缩至干，并重悬于4.5μL 100mM碳酸氢钠(pH9.0)中。
反应在室温下黑暗中过夜进行。使用QIAquickTM(Qiagen，杜塞尔多夫，德国)纯化标记的aa-
DNA，并用50uL水洗脱。在NanodropTM 1000分光光度计(赛默飞世尔科技，沃尔瑟姆，MA，USA)中定量标记的aa-DNA。
[0290] 在Vacufuge浓缩器中完全干燥后，将标记的aa-DNA重悬于杂交混合物中，其含有：来自各样品的～0.1光密度单位的aa-DNA标记；SSC(5X)缓冲液；0.1％SDS；1X缓冲区TE。杂
交混合物在94℃变性5分钟，最后在65℃变性30秒。将混合物置于事先放置在微阵列杂交室
中的微阵列载玻片上，并用无RNA酶的塑料盖玻片(Hybrislip，Schleicher&Schuell，HS40-
40x22mm；Hs22-22x22mm，经由托马斯科学)覆盖。杂交室在42℃温育过夜。
交混合物在94℃变性5分钟，最后在65℃变性30秒。将混合物置于事先放置在微阵列杂交室
中的微阵列载玻片上，并用无RNA酶的塑料盖玻片(Hybrislip，Schleicher&Schuell，HS40-
40x22mm；Hs22-22x22mm，经由托马斯科学)覆盖。杂交室在42℃温育过夜。
[0291] 将载玻片置于50mL锥形管中，并加入50mL体积的SSC(1X)缓冲液和0.05％SDS，进行1分钟的第一次洗涤。使用50mL体积的SSC(0.06X)进行2分钟的洗涤，重复2次。载玻片在
1500rpm下离心5分钟。
1500rpm下离心5分钟。
[0292] 在 4100A微阵列扫描仪(Molecular Devices，Silicon Valley，CA，USA)中，以5μm分辨率，在通道PMT 647和PMT 555上，进行微阵列载玻片扫描。在GenArise
v2.7软件中分析扫描的数据，以获得对照和处理样品中表达有显著差异的选定基因的数
据。对基因进行分类，并基于归一化数据指定一个数值“zScore”。利用“Batch-Entrez”在
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/batchentrez下载来自微阵列的EST、核苷酸和通用
基因(Unigenes)序列，并作为FASTA文件载入Blast2GO中(Conesa,A., S.,García-Gó
mez,J.M.,Terol,J.,Talón,M.,&Robles,M.2005.生物信息学,21,3674-3676)，使用来自基
因本体数据库的功能注释和针对非冗余数据库的1×103的e值执行BlastX。
v2.7软件中分析扫描的数据，以获得对照和处理样品中表达有显著差异的选定基因的数
据。对基因进行分类，并基于归一化数据指定一个数值“zScore”。利用“Batch-Entrez”在
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/batchentrez下载来自微阵列的EST、核苷酸和通用
基因(Unigenes)序列，并作为FASTA文件载入Blast2GO中(Conesa,A., S.,García-Gó
mez,J.M.,Terol,J.,Talón,M.,&Robles,M.2005.生物信息学,21,3674-3676)，使用来自基
因本体数据库的功能注释和针对非冗余数据库的1×103的e值执行BlastX。
[0293] 7-4-通过RT-qPCR分析基因
[0294] 对用于微阵列分析(n＝16)的用胆碱/五硼酸盐络合物处理的8个虾样品和未经处理的相似数量的虾样品进行RT q-PCR，以验证7个感兴趣的基因(GOI)和3个内参基因。锰超
氧化物歧化酶(MnSOD)引物[Lv MnSOD q-PCR 149F(正向引物，SEQ ID NO：5：GGG CTT CAT
TAA CAA CCT AAT TGC)，和Lv MnSOD q-PCR149R(反向引物，SEQ ID NO：6：GGG CTT CAT
TAA CAA CCT AAT TGC)]；和内参基因核糖体蛋白L8[Lv L8pro q-PCR 166F(正向引物，SEQ
ID NO：7：TAG GCA ATG TCA TCC CCA TT)，和Lv L8pro q-PCR 166R(反向引物，SEQ ID NO：
8：TCC TGA AGG AAG CTT TAC ACG)]取自Gomez-Anduro等。(2006)。在在线应用程序
“primer3plus”中进行引物设计(Untergasser，A.，Nijveen，H.，Rao，W.，Bisseling，T.，Geurts，R.，Leunissen，J.A.M.2007.核酸研究，35：71-74)，基于以下特点：长度18-24nt；GC含量35-65％；产物大小80-250bp；和≤2个GC配对(Wang，X.和Seed，B.，2007)。使用在线应
用“Oligo评估”(西格玛奥德里奇TMSt’Louis，MO)评估引物，以检测基于自对准引物(self-
aligned primer)和引物二聚体结构的热力学特征。选定的引物≤-2Kcal/mol，并使用in
sillico PCR软件“数字引物(Primer Digital)”进行评估(Kalendar等人，2011)。使用普洛
麦格公司的GoScriptTM反转录系统(普洛麦格公司，麦迪逊，WI，USA)和SsoFastTM
超混液(Bio-Rad，赫拉克勒斯，CA，USA)，将用于微阵列杂交的RNA提取物转化
为cDNA，以便进行RT-qPCR。使用Rotor基因6000实时PCR检测系统(Corbette)检测荧光。根
据引物特异性退火温度，进行三步循环方案。RT q-PCR循环为95℃10分钟；随后进行40个循
环的95℃15秒和引物特异性退火温度下20秒(参见表1)；72℃25秒，随后读板。引物的退火
温度范围是56-62℃。在65-95℃的温度范围内以1℃递增并且每5秒读取一次，进行熔解曲
线分析，以确定产物特异性。除了重复三次的阴性RT对照和阴性模板对照(NTC)之外，对用
于微阵列的处理和未处理虾的相同的六个样品(n＝12)进行RT q-PCR分析，重复实验三
次，。geNorm软件(Vandensompele等人，2002)鉴定3个基因：β-肌动蛋白，延伸因子1-α和核糖体蛋白L8最稳定，并满足M值<1.25的选择标准，代表了平均表达稳定性且V值≤1.5，表征
了成对变异。
氧化物歧化酶(MnSOD)引物[Lv MnSOD q-PCR 149F(正向引物，SEQ ID NO：5：GGG CTT CAT
TAA CAA CCT AAT TGC)，和Lv MnSOD q-PCR149R(反向引物，SEQ ID NO：6：GGG CTT CAT
TAA CAA CCT AAT TGC)]；和内参基因核糖体蛋白L8[Lv L8pro q-PCR 166F(正向引物，SEQ
ID NO：7：TAG GCA ATG TCA TCC CCA TT)，和Lv L8pro q-PCR 166R(反向引物，SEQ ID NO：
8：TCC TGA AGG AAG CTT TAC ACG)]取自Gomez-Anduro等。(2006)。在在线应用程序
“primer3plus”中进行引物设计(Untergasser，A.，Nijveen，H.，Rao，W.，Bisseling，T.，Geurts，R.，Leunissen，J.A.M.2007.核酸研究，35：71-74)，基于以下特点：长度18-24nt；GC含量35-65％；产物大小80-250bp；和≤2个GC配对(Wang，X.和Seed，B.，2007)。使用在线应
用“Oligo评估”(西格玛奥德里奇TMSt’Louis，MO)评估引物，以检测基于自对准引物(self-
aligned primer)和引物二聚体结构的热力学特征。选定的引物≤-2Kcal/mol，并使用in
sillico PCR软件“数字引物(Primer Digital)”进行评估(Kalendar等人，2011)。使用普洛
麦格公司的GoScriptTM反转录系统(普洛麦格公司，麦迪逊，WI，USA)和SsoFastTM
超混液(Bio-Rad，赫拉克勒斯，CA，USA)，将用于微阵列杂交的RNA提取物转化
为cDNA，以便进行RT-qPCR。使用Rotor基因6000实时PCR检测系统(Corbette)检测荧光。根
据引物特异性退火温度，进行三步循环方案。RT q-PCR循环为95℃10分钟；随后进行40个循
环的95℃15秒和引物特异性退火温度下20秒(参见表1)；72℃25秒，随后读板。引物的退火
温度范围是56-62℃。在65-95℃的温度范围内以1℃递增并且每5秒读取一次，进行熔解曲
线分析，以确定产物特异性。除了重复三次的阴性RT对照和阴性模板对照(NTC)之外，对用
于微阵列的处理和未处理虾的相同的六个样品(n＝12)进行RT q-PCR分析，重复实验三
次，。geNorm软件(Vandensompele等人，2002)鉴定3个基因：β-肌动蛋白，延伸因子1-α和核糖体蛋白L8最稳定，并满足M值<1.25的选择标准，代表了平均表达稳定性且V值≤1.5，表征
了成对变异。
[0295] 其他的引物是：
[0297] Toll样受体：LvToll正向，SEQ ID NO：11：GCCCTAAATGATGGATGAC，和LvToll反向，SEQ ID NO：12：GCCAAGGGAAAAAGAAAT。
[0298] 延伸因子1-α：LvEF1A正向，SEQ ID NO：13：CCACACTGCTCACATTGC，和LvEF1A反向，SEQ ID NO：14：GAAGGTCTCCACGCACAT。
[0299] B-肌动蛋白：LvACTB正向，SEQ ID NO：15：TGGGACGACATGGAGAAG，和LvACTB反向，SEQ ID NO：16：GGGGGTGTTGAAGGTCTC。
[0300] 前淀粉酶1：LvPAMY正向，SEQ ID NO：17：CCGTCTCCTATAAACTCGTCACTC，和LvPAMY反向，SEQ ID NO：18：TCGCCGTAGTTTTCAATGTTC。
[0301] 胰蛋白酶原1：LvTry正向，SEQ ID NO：19：TCGTCGGAGGAACTGACG，和LvTry反向，SEQ ID NO：20：TGCCCTCATCCACATCCT。
[0302] 脂肪消化酶1：LvLIP正向，SEQ ID NO：21：TCCTGGCTCACACACCTG，和LvLIP反向，SEQ ID NO：22：GTCCTTCAGCGAGCCTTG。
[0303] 组织蛋白酶L：LvCPL正向，SEQ ID NO：23：CGTCCTTCCAGTTCTACCAT，和LvCPL反向，SEQ ID NO：24：ATCTGGATGTAGCCCTTGTT。
[0304] 7-5-统计分析
[0305] 在暴露实验结束时，使用TOXSTAT概率单位(probit)(改编自Stephan，1977)分析软件分析存活率和死亡率数据，以计算置信区间95％的LC50。使用单因素方差分析微阵列基
因表达值，100个排列检测为显著的，p值为0.05。还使用了Tukey事后检验来鉴定受胆碱/五
硼酸盐络合物处理影响而显著分化的基因。使用GeneSpring(安捷伦公司，米西索加，ON，加
拿大)，以Pearson居中距离矩阵(centered distance matrix)和100次迭代，运行用户定义
的k均值聚类分析(n＝4)。使用具有多重检验校正并且显著性p值<0.05的单因素方差分析,
比较来自经处理的和未经处理的虾的GOI的RT q-PCR分析的平均CNRQ值，以测定相对丰度
的显著差异。CNRQ值进行log2转换，并与微阵列log2转换的表达率进行比较。
因表达值，100个排列检测为显著的，p值为0.05。还使用了Tukey事后检验来鉴定受胆碱/五
硼酸盐络合物处理影响而显著分化的基因。使用GeneSpring(安捷伦公司，米西索加，ON，加
拿大)，以Pearson居中距离矩阵(centered distance matrix)和100次迭代，运行用户定义
的k均值聚类分析(n＝4)。使用具有多重检验校正并且显著性p值<0.05的单因素方差分析,
比较来自经处理的和未经处理的虾的GOI的RT q-PCR分析的平均CNRQ值，以测定相对丰度
的显著差异。CNRQ值进行log2转换，并与微阵列log2转换的表达率进行比较。
[0306] 7-6-利用RT q-PCR进行基因分析的结果
[0307] 7-6-1-用胆碱/五硼酸盐络合物处理南美白对虾
[0308] 用商业饲料的饲喂一组(对照组)和用添加了胆碱/五硼酸盐络合物(以5mg/g饲料的剂量)的相同商业饲料饲喂另一组，将两个虾组维持在生物测试实验室中多至28天。
[0309] 有趣的是，与对照虾组(图6)相比，用添加了5mg胆碱/五硼酸盐络合物的商业饲料饲喂的虾的平均重量增加了20％。处理14天后，对虾进行取样用于DNA微阵列分析，同时也
确认这些虾对WSSV和副溶血性弧菌感染如前述一样更有抵抗力。
确认这些虾对WSSV和副溶血性弧菌感染如前述一样更有抵抗力。
[0310] 7-6-2-对胆碱/五硼酸盐络合物处理的虾进行DNA微阵列分析
[0311] 虾的DNA微阵列含有60000个点。基于两种通道的吸收源模式，表2总结了差异基因表达的分类：Alexa-555和Alexa-647染料，以及微阵列分析中上调和下调的基因的数量。
[0312] Tab表1：RT-qPCR中使用的引物序列
[0313]
[0314] 表2：虾DNA微阵列分析中上调和下调的基因数量的统计分析
[0315]
[0316] 7-6-3-基因本体分析
[0317] 基因本体(GO)通常用于对基因产物进行分类，并将其在物种间的表达标准化。为了消除数据冗余，只将2倍上调和下调的差异表达基因提交给Blast26O组件，用于配制基于
GO术语的多个功能组。用添加了5mg/g的胆碱/五硼酸盐络合物的饲料饲喂14天的虾的样品
中有583个上调基因，表达基因落入以下生物过程：
GO术语的多个功能组。用添加了5mg/g的胆碱/五硼酸盐络合物的饲料饲喂14天的虾的样品
中有583个上调基因，表达基因落入以下生物过程：
[0318] 1.细胞过程(20％)；
[0319] 2.代谢过程(18％)；
[0320] 3.单一生物过程(17％)；
[0321] 4.生物调节(9％)；
[0322] 5.细胞组分的组织或生物发生(7％)；
[0323] 6.定位(7％)；
[0324] 7.刺激反应(6％)；
[0325] 8.多细胞生物过程(6％)；
[0327] 583种2倍上调的表达基因的分子功能分为四类：
[0328] 10.结合活性(44％)；
[0329] 11.催化活性(43％)；
[0330] 12.转运活性(7％)；
[0331] 13.结构分子活性(6％)(图8)。
[0332] 相对来自DNA微阵列的所有基因(虾对照组)，GO项2倍上调的基因(用胆碱/五硼酸盐络合物处理的虾)的Fisher的准确性实验显示，胆碱/五硼酸盐络合物处理的虾中表达增
加的基因具有如下分类：
加的基因具有如下分类：
[0333] 14.离子转运(8.15％)；
[0334] 15.单价无机阳离子转运(5.92％)；
[0335] 16.细胞骨架蛋白结合(5.55％)；
[0336] 17.氢转运(4.81％)；
[0337] 18.质子转运(4.81％)；
[0338] 19.肌动蛋白细胞骨架(4.62％)；
[0339] 20.钙离子结合(4.25％)；
[0340] 21.单糖代谢过程(4.10％)；
[0341] 22.生物合成过程的正调控(3.70％)；
[0342] 23.细胞生物合成过程的正调控(3.70％)(图9)。
[0343] 对来自生物过程的DNA微阵列的表达2倍下调的基因进行功能注释，发现用添加了5mg/g的胆碱/五硼酸盐络合物的饲料饲喂14天的虾中有262个基因的表达2倍下调，表达基
因落入以下生物过程：
因落入以下生物过程：
[0344] 24.细胞过程(20％)；
[0345] 25.代谢过程(20％)；
[0346] 26.刺激反应(5％)；
[0347] 27.单一生物过程(17％)；
[0348] 28.多细胞过程(6％)；
[0349] 29.信号(3％)；
[0350] 30.定位(8％)；
[0351] 31.生物调节(9％)；
[0352] 32.发育过程(5％)；
[0353] 33.细胞组分的组织或生物发生(7％)(图10)。
[0354] 2倍下调表达基因中的262个基因的分子功能分为四类：
[0355] 34.结合(44％)；
[0356] 35.催化活性(40％)；
[0357] 36.转运活性(9％)；
[0358] 37.结构分子活性(4％)；
[0359] 38.酶调节活性(3％)(图11)。
[0360] 相对来自DNA微阵列的所有基因(虾对照组)，GO项2倍下调的基因(用胆碱/五硼酸盐络合物处理的虾)的Fisher的准确性实验显示，用胆碱/五硼酸盐络合物处理的虾中过表
达(over-represented)的基因具有如下分类：
达(over-represented)的基因具有如下分类：
[0361] 1.蛋白质代谢过程的调控(10.56％)；
[0362] 2.转运活性(10.56％)，胞外区(9.75％)；
[0363] 3.胞外区部分(5.69％)，胞外空间(4.87％)；
[0364] 4.翻译因子活性，核酸结合(4.47％)；
[0365] 5.感光细胞分化(2.43％)；
[0366] 6.气体转运(2.03％)；
[0367] 7.氧转运活性(2.03％)；
[0368] 8.淀粉代谢过程(2.03％)；
[0369] 9.蔗糖代谢过程(2.03％)；
[0370] 10.Toll样受体信号通路(1.62％)(图12)。
[0371] 7-6-4-代谢途径的比较分析
[0372] 将来自虾DNA微阵列的南美白对虾的转录组学序列，与来自NCBI数据库中的果蝇EST和核苷酸序列进行比较，以检测蛋白在不同代谢途径中的过表达的情况。表3总结了各
组中与基因和酶表达相关的2倍上调基因的结果。类似地，表4总结了各组中与基因和酶表
达相关的2倍下调基因的结果。
组中与基因和酶表达相关的2倍上调基因的结果。类似地，表4总结了各组中与基因和酶表
达相关的2倍下调基因的结果。
[0373] 表3：虾DNA微阵列分析中用添加了胆碱/五硼酸盐络合物(5mg/g)的商业饲料处理的南美白对虾中的2倍上调基因的代谢途径
[0374]
[0375] 表4：虾DNA微阵列分析中用添加了胆碱/五硼酸盐络合物(5mg/g)的商业饲料处理的南美白对虾中的2倍下调基因的代谢途径
[0376]
[0377] 7-6-5-免疫相关基因的数据挖掘
[0378] 用GO项搜索DNA微阵列分析：0006955(免疫应答)，显示用添加了5mg/g的胆碱/五硼酸盐络合物的饲料饲喂虾14天后，过表达的免疫应答相关分子的数量增加。表5显示南美
白对虾中与免疫应答相关的主要组分2倍上调。
白对虾中与免疫应答相关的主要组分2倍上调。
[0379] 7-6-6-通过RT-qPCR验证特定基因
[0380] 通过RT q-PCR进一步验证存在于虾DNA微阵列(表1)中的与免疫和消化蛋白相关的选定基因，结果如图13所示。
[0381] 表5：虾DNA微阵列中2倍上调的免疫相关基因的数据挖掘
[0382]# NCBIID 蛋白描述
1 40958211 白介素增强子结合因子
2 52863030 可能的brick1样蛋白(Probable Protein Brick1-like)
3 171595417 肌动蛋白相关蛋白3亚型x2
4 171649044 Toll蛋白
5 171484743 SRSF蛋白激酶2
6 171604948 抑制蛋白
7 171640969 组蛋白乙酰转移酶P300-部分
8 171533428 红色蛋白
9 171638050 丝氨酸/苏氨酸蛋白质磷酸酶2a 65Kda α亚型样调节亚基A
10 171601498 泛素-40s核糖体蛋白S27a
11 171578425 泛素家族蛋白
12 171527123 蛋白Lsm14同源A亚型X2(Protein Lsm14 Homolog A Isoform X2)
13 171576197 β-葡聚糖结合蛋白
14 171497789 含Sam结构域和Hd结构域的蛋白1
15 171616000 组织蛋白酶C
16 171660130 葡萄糖苷酶β亚基
17 171644991 钙调蛋白
18 171655889 细胞质部分
19 171506897 二肽基肽酶1
20 171534712 抑制蛋白
21 171606038 DNA导向RNA聚合酶III亚基Rpabc5
22 171615285 DNA导向RNA聚合酶III亚基Rpc6
23 171649584 Exocyst复合体组件2样
24 171524287 泛素-40s核糖体蛋白S27a
25 171488738 泛素缀合酶E2
26 171580457 泛素C
27 171533219 含Lrr和Pyd结构域的蛋白10
28 171626089 口服活性链2-Hsp90 chaperone的氨基噻吩并嘧啶抑制剂
29 156637463 脂多糖和β-葡聚糖结合蛋白
30 89258160 蜕皮素调节蛋白
31 68271149 Dead box解旋酶部分
32 1907112 骨形成蛋白6
33 29838465 β-葡聚糖结合蛋白
1 40958211 白介素增强子结合因子
2 52863030 可能的brick1样蛋白(Probable Protein Brick1-like)
3 171595417 肌动蛋白相关蛋白3亚型x2
4 171649044 Toll蛋白
5 171484743 SRSF蛋白激酶2
6 171604948 抑制蛋白
7 171640969 组蛋白乙酰转移酶P300-部分
8 171533428 红色蛋白
9 171638050 丝氨酸/苏氨酸蛋白质磷酸酶2a 65Kda α亚型样调节亚基A
10 171601498 泛素-40s核糖体蛋白S27a
11 171578425 泛素家族蛋白
12 171527123 蛋白Lsm14同源A亚型X2(Protein Lsm14 Homolog A Isoform X2)
13 171576197 β-葡聚糖结合蛋白
14 171497789 含Sam结构域和Hd结构域的蛋白1
15 171616000 组织蛋白酶C
16 171660130 葡萄糖苷酶β亚基
17 171644991 钙调蛋白
18 171655889 细胞质部分
19 171506897 二肽基肽酶1
20 171534712 抑制蛋白
21 171606038 DNA导向RNA聚合酶III亚基Rpabc5
22 171615285 DNA导向RNA聚合酶III亚基Rpc6
23 171649584 Exocyst复合体组件2样
24 171524287 泛素-40s核糖体蛋白S27a
25 171488738 泛素缀合酶E2
26 171580457 泛素C
27 171533219 含Lrr和Pyd结构域的蛋白10
28 171626089 口服活性链2-Hsp90 chaperone的氨基噻吩并嘧啶抑制剂
29 156637463 脂多糖和β-葡聚糖结合蛋白
30 89258160 蜕皮素调节蛋白
31 68271149 Dead box解旋酶部分
32 1907112 骨形成蛋白6
33 29838465 β-葡聚糖结合蛋白
[0383] 总体上，每克饲料添加5毫克胆碱/五硼酸盐络合物的商品虾饲料可以有效刺激虾的非特异性免疫系统，并改善南美白对虾对WSSV和副溶血性弧菌感染的天然抵抗力。
[0384] 虾DNA微阵列分析中表达的免疫相关基因的数目显示，添加胆碱/五硼酸盐络合物可以增加虾的免疫反应性。至少有33种免疫相关基因过表达(表5)。通过RT q-PCR对这些基
因中的部分进行了进一步验证，结果显示，这些基因中的部分(例如Toll样受体和SOD)的表
达增加了超过200倍(图13)，清楚地显示了商业虾饲料中添加的胆碱/五硼酸盐络合物的免
疫刺激活性。
因中的部分进行了进一步验证，结果显示，这些基因中的部分(例如Toll样受体和SOD)的表
达增加了超过200倍(图13)，清楚地显示了商业虾饲料中添加的胆碱/五硼酸盐络合物的免
疫刺激活性。
[0385] 作为节肢动物，虾主要依赖固有免疫系统，由对病毒感染的体液和细胞反应组成。通过生殖细胞系编码的蛋白，又称为模式识别受体(PRR)，其与Toll样受体紧密相关，直接
或间接识别病原体或病原体相关的分子模式，导致快速的体液和细胞免疫应答(Li，F.，
Xiang，J.2013.Dev.Comp.Immunol.39,11-26)。
或间接识别病原体或病原体相关的分子模式，导致快速的体液和细胞免疫应答(Li，F.，
Xiang，J.2013.Dev.Comp.Immunol.39,11-26)。
[0386] 有趣的是，无脊椎动物不具备基于高特异性抗体和抗原受体的适应性免疫系统。他们必须依靠有效的免疫防御来保护自己免受侵害。血细胞已经证明是无脊椎动物先天防
御反应的关键细胞。甲壳动物血细胞的一种重要免疫防御反应是微生物或病毒激发生物体
时的吞噬作用。在吞噬过程中，宿主氧化酶(例如，NADPH氧化酶，特别是涉及虾凝血系统和
固有免疫的酚氧化酶)被激活，进而增强糖酵解反应(解释了淀粉酶基因的过表达)，这将增
加氧气的消耗并诱导超氧阴离子(O2·ˉ)、过氧化氢(H2O2)、羟自·由基(OH·)等活性氧(ROS)
的大量产生。尽管ROS可以杀死外来入侵者，但是这些反应分子在动物体内的大量积累可能
会导致严重的细胞损伤。WSSV感染可引起对虾体内ROS的释放，增加对虾的氧化应激反应，
导致高水平的脂质过氧化反应。因此，快速消除这些过量的ROS对于细胞的正常功能和生物
体的存活是必不可少的。这是由抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶(SOD)进行的，清除超氧阴
离子。SOD通过将超氧自由基转化成过氧化氢和氧来解毒。然后，通过过氧化氢酶或其他抗
氧化化合物，将过氧化氢转化为水和氧气，为细胞提供无害的化合物。
御反应的关键细胞。甲壳动物血细胞的一种重要免疫防御反应是微生物或病毒激发生物体
时的吞噬作用。在吞噬过程中，宿主氧化酶(例如，NADPH氧化酶，特别是涉及虾凝血系统和
固有免疫的酚氧化酶)被激活，进而增强糖酵解反应(解释了淀粉酶基因的过表达)，这将增
加氧气的消耗并诱导超氧阴离子(O2·ˉ)、过氧化氢(H2O2)、羟自·由基(OH·)等活性氧(ROS)
的大量产生。尽管ROS可以杀死外来入侵者，但是这些反应分子在动物体内的大量积累可能
会导致严重的细胞损伤。WSSV感染可引起对虾体内ROS的释放，增加对虾的氧化应激反应，
导致高水平的脂质过氧化反应。因此，快速消除这些过量的ROS对于细胞的正常功能和生物
体的存活是必不可少的。这是由抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶(SOD)进行的，清除超氧阴
离子。SOD通过将超氧自由基转化成过氧化氢和氧来解毒。然后，通过过氧化氢酶或其他抗
氧化化合物，将过氧化氢转化为水和氧气，为细胞提供无害的化合物。
[0387] 对于饮食中添加胆碱/五硼酸盐络合物处理的虾，除了免疫相关基因过量表达外，南美白对虾的其他生物过程也被调节，包括与以下相关基因的表达：应激反应(43)、代谢过
程(166)、细胞过程(159)、生物发生(59)、发育过程(40)、生物调节(73)、定位(66)和信号
(26)(图10，表3)。
程(166)、细胞过程(159)、生物发生(59)、发育过程(40)、生物调节(73)、定位(66)和信号
(26)(图10，表3)。
[0388] 在遵循标准化的给药方案时，虾饲料中添加浓度为5mg/g的胆碱/五硼酸盐络合物，可有效减少WSSV感染的影响。这是代表了控制影响大量商业虾生产的疾病的重大突破。
在商品饲料中添加用作添加剂的胆碱/五硼酸盐络合物,提供了刺激虾免疫系统的有效机
制，这有助于提高南美白对虾对WSSV和副溶血性弧菌感染的天然抵抗力。
在商品饲料中添加用作添加剂的胆碱/五硼酸盐络合物,提供了刺激虾免疫系统的有效机
制，这有助于提高南美白对虾对WSSV和副溶血性弧菌感染的天然抵抗力。
[0389] 实施例8
[0390] 用于与硼酸或其衍生物络合的其它季铵化合物
[0391] 8-1-(2-羟乙基)三乙基铵与硼酸(或其衍生物)的络合
[0392] 除了使用(2-羟乙基)三乙基铵代替(2-羟乙基)三甲基铵外，在与实施例1所述相同的条件下进行(2-羟乙基)三乙基铵和硼酸(或其衍生物)的络合(图14-A)
[0393] 8-2-(2,3-二羟乙基)三乙基铵与硼酸(或其衍生物)的络合
[0394] 由于胆碱([2-羟乙基]三甲基铵)具有羟基，络合作用可能不太稳定，因为与硼酸(或其衍生物)形成络合物时涉及一个羟基。因此，使用具有两个羟基的胆碱，如(2,3-二羟
基丙基)三甲基氯化铵似乎更稳定，这可能是由于其与硼酸(或其衍生物)络合时贡献了两
个羟基。
基丙基)三甲基氯化铵似乎更稳定，这可能是由于其与硼酸(或其衍生物)络合时贡献了两
个羟基。
[0395] 除了使用(2,3-二羟基丙基)三甲基氯化铵代替(2,3-羟乙基)三甲基铵外，在与实施例1所述相同的条件下进行胆碱和硼酸(或其衍生物)的络合(图14-B)
[0396] 8-3-胆碱与苯基硼酸的络合
[0397] 除了使用苯基硼酸代替硼酸，且蒸馏水体积为800mL而非400mL之外，在与实施例1所述相同的条件下进行胆碱和苯基硼酸的络合(图15)。
[0398] 8-4-胆碱与十四烷基硼酸的络合
[0399] 除了使用十四烷基硼酸代替苯基硼酸之外，在与前述“胆碱与苯基硼酸的络合”的相同条件下进行胆碱和苯基硼酸的络合(图16)。
[0400] 虽然以上描述了优选实施例并且在附图中进行了图示，但是对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的情况下进行的修改是显而易见的。这样的修改是包含在本公开范
围内的可能变体。
围内的可能变体。
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