一种快速检测桃蚜对拟除虫菊酯类杀虫剂抗药性的方法
阅读：80发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种快速检测桃蚜对拟除虫菊酯类杀虫剂抗药性的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 杀虫剂 抗药性检测技术领域，具体涉及一种快速检测桃蚜对拟 除虫菊 酯 类杀虫剂抗药性的方法。本发明基于桃蚜 电压 门 控Na+通道突变设计了LAMP引物组，其包含序列如SEQ ID NO.1-2所示的外引物对和序列如SEQ ID NO.3-4的内引物对。利用本发明提供的LAMP引物组和检测方法在60min内即可完成桃蚜对拟 除虫菊酯 类杀虫剂抗药性的检测，且特异性高、灵敏度高、准确性高，可实现桃蚜对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的早期、快速、高效检测，适于推广应用。，下面是一种快速检测桃蚜对拟除虫菊酯类杀虫剂抗药性的方法专利的具体信息内容。
1.用于检测桃蚜电压门控Na+通道突变的LAMP引物组，其特征在于，包含外引物对和内引物对，其中，外引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，内引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
2.包含权利要求1所述的LAMP引物组的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包含选自反应缓冲液、链置换DNA聚合酶，dNTPs、MgSO4、丙三醇、二甲基亚砜中的一种或多种。
4.权利要求1所述的LAMP引物组或权利要求2或3所述的试剂盒在检测桃蚜电压门控Na++
通道突变中的应用；优选地，所述电压门控Na通道突变为L1014F突变。
5.权利要求1所述的LAMP引物组或权利要求2或3所述的试剂盒在检测桃蚜对拟除虫菊酯类杀虫剂抗药性中的应用。
6.一种检测桃蚜对拟除虫菊酯类杀虫剂抗药性的方法，其特征在于，包括：利用权利要求1所述的LAMP引物组或权利要求2或3所述的试剂盒进行LAMP扩增反应。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述LAMP扩增反应的反应程序包括：60-64℃反应40-50min，85℃反应3～6min。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述LAMP扩增反应的反应体系包括终浓度为1～3μM的外引物对和终浓度为12～20μM的内引物对；
优选地，所述反应体系还包括终浓度为1～3％的二甲基亚砜。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述LAMP扩增反应的25μL反应体系包括：
2.5μL 10×反应缓冲液、8U链置换DNA聚合酶，1μL待测桃蚜基因组DNA、终浓度1.4mM的dNTPs、终浓度4mM的MgSO4、终浓度2μM的外引物对、终浓度16μM的内引物对、1.5μL的丙三醇和0.25μL的二甲基亚砜。
10.根据权利要求6～9任一项所述的方法，其特征在于，根据LAMP扩增反应的颜色变化或根据扩增产物的电泳检测条带判断待测桃蚜是否存在电压门控Na+通道突变。
一种快速检测桃蚜对拟除虫菊酯类杀虫剂抗药性的方法
技术领域
背景技术
[0002] 农林有害生物会严重危害农业和林业的发展，目前已报道的农林有害生物种类繁多，其中，蝗虫、桃蚜、草地贪夜蛾、小麦赤霉病、稻瘟病等均会对植物造成严重危害。目前，化学防治仍在有害生物防治中发挥主要作用，但是，化学农药的不合理使用，如对单一药剂品种的长期依赖和过量、频繁使用，使有害生物抗性频发，药剂防治效果下降。目前，至少有30种农作物害虫对40种杀虫剂产生不同程度的抗性。病虫害抗药性的产生往往会导致病虫害防治难度加大，易造成病虫害的再猖獗。同时，病虫害的抗药性迫使投入更多的化学农药，不仅易对环境造成多种污染，而且会杀伤多种非靶标生物。农药残留已经成为农产品质量的主要威胁。
[0003] 桃蚜是重要的多食性经济害虫，具有生活周期短、世代重叠严重、繁殖快、后代存活率高等特点，导致桃蚜的危害性十分严重。桃蚜危害到50个科的400多种植物，主要有十字花科的油菜、甘蓝、辣椒、白菜、荠菜等，蔷薇科的桃树、杏树、李树等，茄科的马铃薯、烟草、番茄等，豆科的大巢菜、紫云英等。桃蚜以成虫和若虫的形态聚集在叶背面以及嫩茎、嫩梢上，刺吸大量的汁液，造成植物叶片卷缩变形、发黄、失水，使得植物营养缺失、发育不良、生长缓慢。除此以外，桃蚜分泌的蜜露还会引发煤污病，影响作物的质量。同时桃蚜作为植物病毒传播的媒介，可传播100多种植物病毒，如黄瓜花叶病毒、西瓜花叶病毒、烟草花叶病毒等，直接影响到了经济作物的正常生长，造成大量减产。
[0004] 拟除虫菊酯类杀虫剂包括高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氰菊酯和联苯菊酯等，对于桃蚜具有较好的杀灭作用，但是桃蚜会迅速产生抗药性。导致害虫抗药性的一个主要形式是击倒抗性。击倒抗性最早被用来描述家蝇没有被DDT击倒并存活下来的现象，并且还与拟除虫菊酯类杀虫剂存在交互抗性。到目前为止几乎所用的农业、卫生害虫中都存在击倒抗性。对击倒抗性的研究表明，这种抗性主要是由Na+通道特定位置的氨基酸突变所致。Williamson等最早通过遗传分子标记的方法将家蝇击倒抗性基因定位于Na+通道，通过测序发现位于家蝇Na+通道基因ⅡS6上的第1014位亮氨酸到苯丙氨酸的突变(L1014F)是击倒抗性产生的原因。杀虫剂靶标突变是害虫对杀虫剂产生抗性的主要原因之一，如与有机磷杀虫剂、氨基甲酸酯类杀虫剂相关的乙酰胆碱酯酶突变、与新烟碱类杀虫剂相关的乙酰胆碱受体突变。这些突变多为单碱基突变，因此可以利用单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)检测技术确定抗性相关突变位点是否存在。
[0005] 环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是利用具有很强的链置换能力的Bst DNA Polymerase，识别针对目标序列六个特定区域设计的两对引物在等温条件下实现扩增反应。两对引物包括：外引物F3和B3，内引物FIP(forward inner primer)和BIP(backward inner primer)。LAMP反应首先在一对外引物的作用下扩增出内引物结合的片段，紧接着在一对内引物的作用下合成目的序列，由于内引物扩增的DNA产物包含与该引物5’端反向互补的序列，所以扩增产物内部会形成茎环结构。Bst DNA Polymerase将该产物置换下来之后，在另外一条内引物的作用下在DNA片段的另外一端产生了新的茎环结构，形成哑铃结构，如此往复循环。由于内引物发生反应的起始时间不同，所以最终会形成大小不一的DNA片段，在琼脂糖凝胶电泳中可以观察到连续的条带。在扩增反应中大量的焦磷酸根离子被解离下来，与反应体系中的镁离子结合，形成焦磷酸镁白色沉淀，使反应体系变得浑浊，可用肉眼观察到沉淀的有无来判断LAMP反应是否发生。LAMP技术在恒温的条件下在60min内就可以实现目的片段的大量扩增，具有反应迅速、灵敏性高、特异性强、对设备要求低、结果易于观察等优点，非常适合昆虫基因突变情况在田间的快速检测。中国专利CN201510204854.6建立了一种多菌灵抗性基因型F200Y核盘菌的LAMP检测技术。目前对于桃蚜的抗药性的检测方法存在灵敏度低、周期长、材料要求高、人力要求高等问题，尚没有关于桃蚜对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的快速高效的检测方法。
发明内容
[0006] 为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种LAMP快速高效检测桃蚜对拟除虫菊酯类杀虫剂抗药性的方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明经过多年的田间采集和室内选育获得了桃蚜对高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氰菊酯和联苯菊酯的敏感品系和抗性品系，并发现桃蚜的抗性品系的电压门控Na+通道(Sodium Channel)存在抗性相关突变L1014F。电压门控Na+通道的L1014F突变主要导致对DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性。本发明通过针对桃蚜对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的靶标变异——电压门控Na+通道L1014F突变设计2对LAMP特异性扩增引物，利用该LAMP引物组进行LAMP扩增反应，检测桃蚜对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性。
[0008] 具体地，本发明的技术方案如下：
[0009] 第一方面，本发明提供用于检测桃蚜电压门控Na+通道突变的LAMP引物组，包含外引物对和内引物对，其中，外引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，内引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0010] 外引物F3：CAAAGACCACGAGCTTCC；
[0011] 外引物B3：CCGAGTAGTACATATTTATCATTCA；
[0012] 内引物FIP：GTCCCACATTGATTCTATCCATTCGAACTTCACCGATTTTTTGCA；
[0013] 内引物BIP：CTGTTTACACGTCGGAGAACCAAAGTACTTATACATACCACGAA。
[0014] 本发明所述的电压门控Na+通道突变具体为第1014位亮氨酸突变为苯丙氨酸(L1014F)。
[0015] 上述引物组所针对的电压门控Na+通道L1014F突变片段序列如SEQ ID NO.5所示，其中，Y代表C/T(该位点突变前为C，突变后为T)，对应L1014F突变。
[0016] 本发明中，拟除虫菊酯类杀虫剂包括但不限于高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氰菊酯和联苯菊酯。
[0018] 第三方面，本发明提供包含所述LAMP引物组的试剂盒。
[0019] 所述试剂盒还可包含选自反应缓冲液、链置换DNA聚合酶，dNTPs、MgSO4、丙三醇、二甲基亚砜中的一种或多种。上述试剂可以共同组成LAMP反应液，所述LAMP反应液可与所述LAMP引物组组成LAMP扩增反应的反应体系。
[0020] 第四方面，本发明提供所述LAMP引物组或包含所述LAMP引物组的试剂盒在检测桃蚜电压门控Na+通道突变中的应用。
[0021] 所述电压门控Na+通道突变具体为L1014F突变。
[0022] 第五方面，本发明提供所述LAMP引物组或包含所述LAMP引物组的试剂盒在检测桃蚜对拟除虫菊酯类杀虫剂抗药性中的应用。
[0023] 第六方面，本发明提供一种检测桃蚜对拟除虫菊酯类杀虫剂抗药性的方法，包括：利用所述LAMP引物组或包含所述LAMP引物组的试剂盒进行LAMP扩增反应。
[0024] 优选地，所述LAMP扩增反应的反应程序包括：60-64℃反应40-50min，85℃反应3～6min。
[0025] 优选地，所述LAMP扩增反应的反应体系包括终浓度为1～3μM的外引物对和终浓度为12～20μM的内引物对。
[0026] 更优选地，所述反应体系还包括1～3％二甲基亚砜
[0027] 作为本发明的一种优选方案，所述LAMP扩增反应的25μL反应体系包括：2.5μL 10×反应缓冲液、8U链置换DNA聚合酶，1μL单头待测桃蚜基因组DNA、终浓度1.4mM的dNTPs、终浓度4mM的MgSO4、终浓度2μM的外引物对、终浓度16μM的内引物对、1.5μL的丙三醇、0.25μL的二甲基亚砜。
[0028] 上述反应体系可加水补足至25μL。
[0029] 优选地，所述检测桃蚜对拟除虫菊酯类杀虫剂抗药性的方法中，根据LAMP扩增反应的颜色变化或根据扩增产物的电泳检测条带判断待测桃蚜是否存在电压门控Na+通道突变。
[0030] 作为本发明的一种实施方式，在LAMP扩增反应结束后加入核酸染料SYBR Green I进行反应，若反应颜色为荧光绿色，则待测桃蚜为抗性突变个体；若反应颜色为浅褐色，则待测桃蚜为敏感未突变个体。
[0031] 本发明的有益效果在于：本发明发现拟除虫菊酯类杀虫剂抗性桃蚜存在电压门控Na+通道的L1014F突变，针对该突变设计了高效特异的LAMP引物组，针对该引物组开发了LAMP检测方法，实现了桃蚜对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的快速高效检测，对于抗性害虫的准确检测、抗性群体发展动态的信息获得以及指导科学用药、降低成本和减少环境污染具有重要意义。与传统的桃蚜抗药性检测方法相比，本发明提供的检测方法具有以下优势：
[0032] 1、特异性高、可重复性高：本发明提供的LAMP引物组具有高度的特异性，可特异检+测电压门控Na 通道L1014F突变，对于未突变的野生型则无法扩增，同时具有高度的可重复性。
[0033] 2、准确性高：本发明的LAMP检测方法具有较高的准确性，判断为阳性检测结果的样品与电压门控Na+通道L1014F突变的符合率高。
[0034] 3、灵敏度高：本发明提供的LAMP检测方法的灵敏度高，扩增模板所需量少，最少只需要10个拷贝数的模板就可以在短时间内扩增109-1010倍，比传统的PCR扩增技术高100-1000倍。
[0035] 4、假阳性率低：本发明通过LAMP引物组的特异设计并配合在LAMP反应体系中加入二甲基亚砜有效降低了假阳性的产生。
[0036] 5、检测周期短：本发明的LAMP检测方法在60分钟内即可完成检测，极大地缩短了桃蚜抗药性检测的周期，提高了检测的工作效率。
[0037] 6、简单易行：本发明的LAMP检测方法只需在恒温下进行，水浴、金属浴加热即可完成检测，不需要昂贵的仪器设备，且操作步骤简单。
[0038] 7、结果易于鉴定：本发明的LAMP检测方法可通过观察是否有白色沉淀或者通过添加核酸染料SYBR Green I，观察反应后的颜色变化，判断反应是否进行，进而判断桃蚜对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性。附图说明
[0039] 图1为本发明实施例1中不同浓度二甲基亚砜对LAMP反应假阳性产生的影响分析结果；其中，M：DNA marker，1-3为未添加二甲基亚砜，1：模板为水，2：模板为未突变质粒，3：模板为突变质粒；4-6为添加1％二甲基亚砜，4：模板为水，5：模板为未突变质粒，6：模板为突变质粒；7-9为添加2％二甲基亚砜，7：模板为水，8：模板为未突变质粒，9：模板为突变质粒；10-12为添加3％二甲基亚砜，10：模板为水，11：模板为未突变质粒，12：模板为突变质粒；13-15为添加4％二甲基亚砜，13：模板为水，14：模板为未突变质粒，15：模板为突变质粒。
[0040] 图2为本发明实施例1中不同反应时间、温度的LAMP反应电泳图；其中，A为不同反应时间的LAMP反应电泳图，M：DNA marker1-6依次是63℃反应25min、30min、35min、40min、45min和50min；B为不同反应温度的LAMP反应电泳图，M：DNA marke，1-7依次是56℃、58℃、
60℃、62℃、64℃、66℃和68℃反应40min。
60℃、62℃、64℃、66℃和68℃反应40min。
[0041] 图3为本发明实施例2中LAMP检测方法的特异性及重复性分析；其中，A为LAMP检测L1014F突变的核酸染料SYBR Green I显色变化图；B为LAMP检测L1014F突变的琼脂糖凝胶电泳图；M：DNAmarker；1-3：模板为ddH2O；4-6：模板为野生型桃蚜DNA；7-9：模板为含L1014F突变的质粒。
[0042] 图4为本发明实施例3中LAMP产物酶切验证电泳图；其中，M：DNA marker，1：含L1014F突变的质粒，2：LAMP产物经HinfI酶切的产物。
具体实施方式
[0043] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
[0044] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0045] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0046] 实施例1 利用LAMP检测桃蚜对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的方法的建立
[0047] 1、LAMP引物组设计
[0048] 针对桃蚜电压门控Na+通道L1014F突变，本发明经过大量实验筛选和优化获得了具有高度特异性、结合力和扩增效率的LAMP引物组，其由一对外引物和一对内引物组成，其中，一对外引物的序列如SEQ ID NO.1-2所示，一对内引物的序列如SEQ ID NO.3-4所示，L1014F突变位点位于反向内引物BIP的3’端。
[0049] 外引物F3：CAAAGACCACGAGCTTCC；
[0050] 外引物B3：CCGAGTAGTACATATTTATCATTCA；
[0051] 内引物FIP：GTCCCACATTGATTCTATCCATTCG-AACTTCACCGATTTTTTGCA；
[0052] 内引物BIP：CTGTTTACACGTCGGAGAACCAA-AGTACTTATACATACCACGAA。
[0053] 2、LAMP反应体系的确定
[0054] 本发明通过在LAMP反应体系中加入二甲基亚砜并优化其浓度，有效降低了假阳性率，并确定了最佳的反应体系。
[0055] LAMP反应的25μL体系如下：2.5μL 10×Bst Buffer、8U Bst 2.0DNA Polymerase，1μL扩增模板、终浓度1.4mM的dNTPs、终浓度4mM的MgSO4、终浓度2μM的外引物对、终浓度16μM的内引物对、1.5μL的丙三醇和二甲基亚砜，二甲基亚砜的加入量分别为0、0.25、0.5、0.75或1μL，加双蒸水至反应总体积为25μL。
[0056] 每3个样品为一组，其中1-3、4-6、7-9、10-12和13-15样品的反应体系中二甲基亚砜的加入量分别为0、0.25、0.5、0.75和1μL，每组的3个样品的扩增模板依次为水、未突变质粒和突变质粒。
[0057] 未突变质粒和突变质粒的构建方法如下：
[0058] (1)PCR扩增目的片段：采用基因组DNA提取试剂盒提取单头无翅成蚜的基因组DNA，以L1014F杂合突变桃蚜的基因组DNA为模板，使用上游引物(kdr-S:5’-TATGCAGTTATTTGGAAA-3’)下游引物(kdr-A:5’-GTAGGTTCTGGATAGCAA-3’)对包含LAMP目的序列的DNA片段进行PCR扩增。PCR扩增反应体系(共25μL)如下：12.5μL 2×Phanta Max Master Mix，1μL上游引物，1μL下游引物，1μL基因组DNA。PCR扩增反应程序如下：94℃预变性3min；35个循环(94℃变性30s，46℃退火40s，72℃延伸40s)；72℃彻底延伸7min。
[0059] (2)质粒构建：将PCR产物进行胶回收后,将目的产物连接到质粒pClone007Blunt Simple Vector。反应体系：1μL纯化产物，1μLpClone007Blunt Simple Vector，10×Topo Mix 1μL，ddH2O 7μL。在室温(22-30℃)条件下反应1-5min。
[0060] (3)细菌转化和提取质粒：取100μL冰浴上融化的感受态细胞,加入连接产物轻轻混匀，冰上静置25min；42℃水浴热激30-45s，迅速转移至冰浴中，静置2min；向离心管中加入不含抗生素的无菌培养基，混匀后37℃、200rpm复苏1h；吸取复苏液均匀涂布到含抗生素的LB培养基上，将平板倒置，37℃培养箱过夜培养，提取质粒送公司进行测序。将测序正确的、包含L1014F突变的质粒(突变质粒)和不包含L1014F突变的质粒(未突变质粒)于-20℃保存，待用。
[0061] LAMP反应程序为：63℃反应40min，85℃反应5min。
[0062] 反应体系中加入不同浓度的二甲基亚砜的扩增结果分析：取5μLPCR扩增产物，在2.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外光下检测，结果如图1所示，1、4、7、10、13样品无特异性条带，以水为模板的对照组未发生假阳性扩增。2样品有特异性条带但不明显，5、8、11、14样品无特异性条带，未加入二甲基亚砜的样品发生假阳性扩增，而加入二甲基亚砜后，假阳性扩增被有效抑制。3、6、9、12样品有特异性条带，随着二甲基亚砜浓度的升高条带的亮度逐渐降低。15样品无特异性条带，当二甲基亚砜的浓度达到4％时，LAMP反应被彻底抑制，不发生反应。以上结果表明，不添加二甲基亚砜时，LAMP体系会发生非特异性扩增，1-3％的二甲基亚砜添加可以有效抑制假阳性的产生，4％及以上的二甲基亚砜添加会彻底抑制LAMP反应的发生。因此，确定在反应体系中加入1-3％的二甲基亚砜抑制假阳性的产生。
[0063] 3、LAMP反应条件的确定
[0064] 采用上述2中确定的LAMP反应体系，进行LAMP反应条件的优化，具体如下：
[0065] LAMP反应体系(25μL)：2.5μL10×Bst Buffer、8U Bst 2.0DNAPolymerase，1μL突变质粒、终浓度1.4mM的dNTPs、终浓度4mM的MgSO4、终浓度2μM的外引物、终浓度16μM的内引物、1.5μL的丙三醇、0.25μL的二甲基亚砜，加双蒸水至反应总体积为25μL。
[0066] LAMP反应程序：
[0067] 反应时间的确定：分别在63℃反应25min、30min、35min、40min、45min和50min(上述反应时间对应的样品依次命名为样品1-6)，85℃反应5min。
[0068] 反应温度的确定：分别在56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃和68℃(上述反应温度对应的样品依次命名为样品1-7)反应40min，85℃反应5min。
[0069] 结果分析：取5μL PCR扩增产物，在2.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外光下检测，结果如图2所示。图2的A显示，1-3样品无特异性条带或者特异性条带不明显，4-6样品特异性条带明显，并且特异性条带的亮度随着反应时间的增加而增加。随着反应时间的增加，LAMP反应产物逐渐增多。结果表明，在LAMP反应发生40-50min后，可以产生大量的反应产物。图2的B显示，1、2、6和7样品无特性条带或者特异性条带不明显，3-5样品特异性条带明显。随着温度的升高LAMP反应开始进行，温度进一步升高又会抑制LAMP反应。结果表明，当温度在60℃-64℃时，LAMP反应可以有效的进行。
[0070] 综合以上结果，确定利用LAMP检测桃蚜对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的方法具体如下：采用序列如SEQ ID NO.1-4的引物组进行LAMP反应；LAMP反应体系(25μL)为：2.5μL10×Bst Buffer、8U Bst2.0DNA Polymerase，1μL突变质粒、终浓度1.4mM的dNTPs、终浓度4mM的MgSO4、终浓度2μM的外引物、终浓度16μM的内引物、1.5μL的丙三醇、0.25μL的二甲基亚砜，加双蒸水至反应总体积为25μL。LAMP反应程序为：60-64℃反应40-50min，85℃反应3～6min。
[0071] 实施例2 LAMP检测方法的特异性及重复性分析
[0072] 为验证实施例1提供LAMP检测桃蚜对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性方法的特异性，分别以含L1014F突变质粒(阳性对照)、野生型桃蚜基因组DNA、双蒸水(阴性对照)为模板，进行LAMP反应，每个模板设置三个重复。
[0073] LAMP反应体(25μL)系：2.5μL 10×Bst Buffer、8U Bst 2.0DNAPolymerase，1μL扩增模板、终浓度1.4mM的dNTPs、终浓度4mM的MgSO4、终浓度2μM的外引物、终浓度16μM的内引物、1.5μL的丙三醇、0.25μL的二甲基亚砜，加双蒸水至反应总体积为25μL。
[0074] LAMP反应程序：63℃反应40min，85℃反应5min。
[0075] LAMP反应结束后在反应体系中加入SYBR Green I进行显色反应。
[0076] 结果分析：根据反应体系颜色作为结果判断标准，结果如图3的A所示，以双蒸水(阴性对照)为模板的样品1-3呈现黄褐色；以野生型桃蚜个体(敏感个体)基因组DNA为模板的样品4-6呈现黄褐色；以含L1014F突变质粒为模板的样品7-9呈现荧光绿。
[0077] 为了进一步验证上述颜色变化判断结果的准确性，取5μL PCR扩增产物，在2.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外光下检测，结果如图3的B所示，以双蒸水(阴性对照)和野生型桃蚜个体(敏感个体)基因组DNA为模板的样品1-6样品均无条带，以含L1014F突变质粒为模板的样品7-9呈现一系列不同大小的DNA片段，电泳结果与颜色检测结果一致。以上结果说明，实施例1提供LAMP检测桃蚜对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性方法具有较高的特异性。
[0078] 实施例3 LAMP检测方法的准确性分析
[0079] 对实施例1提供LAMP检测桃蚜对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性方法的准确性进行分析，具体如下：
[0080] 在实施例1提供的LAMP的内引物(SEQ ID NO.3-4)扩增区域上鉴定有HinfI限制性核酸内切酶酶切位点，因此，通过在LAMP反应结束后，用HinfI酶酶切LAMP产物，分析LAMP检测的准确性。
[0081] HinfI酶酶切反应体系：2.5μL 10×NEBuffer，10U HinfI，10μLLAMP反应产物，加双蒸水至反应总体积为25μL。
[0082] 反应程序：37℃反应40min，80℃反应10min。
[0083] 结果分析：将酶切产物进行电泳检测，结果如图4所示。由于LAMP反应产物是由一系列重复的目标序列连接而成，使用HinfI限制性核酸内切酶降解后可得到160bp左右大小的DNA片段，表明实施例1提供LAMP检测桃蚜对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性方法具有较高的准确性。
[0084] 虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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