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减少功能蛋白的平基因转移

阅读:391发布:2020-05-25

专利汇可以提供减少功能蛋白的平基因转移专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且公开的是用于减少功能蛋白的 水 平基因转移的方法与组合物。在一些实施方案中,通过在至少两种空间上不同的核酸序列上单独编码 蛋白质 的结构域来降低功能蛋白的水平基因转移的 风 险,其中各个体结构域单独为非功能性的,但是编码的结构域的共表达导致它们缔合以形成功能蛋白。,下面是减少功能蛋白的平基因转移专利的具体信息内容。

1.一种生成表达功能性选择性标记的细胞的方法,包括以下步骤:
向细胞中引入至少两种编码显性选择性标记的不同结构域的不同的多核苷酸,其中所述显性选择性标记的所述不同结构域缔合以形成功能性显性选择性标记;并且没有个体多核苷酸编码所述功能性显性选择性标记。
2.权利要求1所述的方法,其中所述显性选择性标记是抗药性标记。
3.权利要求2所述的方法,其中所述抗药性标记赋予对选自以下的药物的抗性:两性霉素B、克念菌素、菲律宾菌素、哈霉素、那他霉素、制霉菌素、龟裂杀菌素、联苯苄唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、异康唑、康唑、卢立康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、阿巴康唑、氟康唑、沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、雷夫康唑、特康唑、伏立康唑、阿巴芬净、阿莫罗芬、布替芬、萘替芬、特比萘芬、阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净、苯甲酸、环吡酮、氟胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、灰黄霉素、卤普罗近、蓼二、托萘酯、结晶紫、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、妥布霉素、巴龙霉素、壮观霉素、格尔德霉素、除莠霉素、利福昔明、链霉素、氯头孢、厄他培南、多利培南、亚胺培南、美罗培南、头孢羟苄、头孢唑林、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢吡肟、头孢洛林酯、头孢比罗、替考拉宁、万古霉素、替拉凡星、氯洁霉素、林可霉素、达托霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素、螺旋霉素、氨曲南、呋喃唑酮、呋喃妥因、利奈唑胺、泊西唑利德、雷得唑来、特地唑胺、阿莫西林、氨苄青霉素、阿洛西林、羧苄青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素、氟氯西林、美洛西林、甲西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、青霉素G、替莫西林、替卡西林、克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦、克拉维酸、杆菌肽、粘菌素、多粘霉素B、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酮酸、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星、司帕沙星、替沙星、磺胺米隆、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺地索辛、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺、柳氮磺吡啶、磺胺异噁唑、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、复方新诺明、Sulfonamidochrysoidine、地美环素、强霉素、米诺环素、土霉素、四环素、氯法齐明、氨苯砜、卷曲霉素、环丝氨酸、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、利福布汀、利福喷汀、链霉素、胂凡纳明、氯霉素、磷霉素、夫西地酸、甲硝唑、莫匹罗星、平板霉素、奎奴普丁、达福普汀、甲砜霉素、替加环素、替硝唑、甲氧苄啶、遗传霉素、诺尔丝菌素、潮霉素、博来霉素和嘌呤霉素。
4.权利要求1所述的方法,其中所述显性选择性标记是营养标记。
5.权利要求4所述的方法,其中所述营养标记选自磷酸特异性氧化还原酶、α-酮戊二酸依赖性次磷酸双加氧酶、性磷酸酶、氨腈水合酶、三聚氰胺脱氨酶、氰尿酸酰胺水解酶、缩二脲水裂合酶、尿素酰胺裂合酶、氰尿酰胺氨基水解酶、嘌呤脱氨酶、磷酸二酯酶、磷酸三酯酶、亚磷酸氢化酶、甘油磷酸二酯酶、对硫磷水裂合酶、亚磷酸脱氢酶、二苯并噻吩脱硫酶、芳族脱亚磺酸酶、NADH依赖性FMN还原酶、氨基嘌呤转运蛋白、羟胺氧化还原酶、转化酶、β-葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、淀粉酶、纤维素酶和支链淀粉酶。
6.权利要求1所述的方法,其中所述细胞是原核细胞。
7.权利要求6所述的方法,其中所述细胞是细菌细胞。
8.权利要求1所述的方法,其中所述细胞是真核细胞。
9.权利要求8所述的方法,其中所述细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、丝状真菌细胞、原生生物细胞、藻类细胞、禽细胞、植物细胞或昆虫细胞。
10.权利要求1所述的方法,其中所述显性选择性标记的所述不同结构域经由蛋白结合基序缔合。
11.权利要求10所述的方法,其中所述蛋白结合基序是亮氨酸拉链基序、Src同源2结构域、Src同源3结构域、磷酸酪氨酸结合结构域、LIM结构域、不育α基序结构域、PDZ结构域、FERM结构域、调理蛋白同源结构域、普列克底物蛋白同源结构域、WW结构域或WSxWS基序。
12.权利要求1所述的方法,其中所述多核苷酸在载体中被引入所述细胞。
13.权利要求1所述的方法,其中所述多核苷酸是质粒、质粒的片段、或线性化的质粒。
14.权利要求1所述的方法,其中引入两种不同的多核苷酸。
15.权利要求1所述的方法,其中所述不同的多核苷酸整合到所述细胞的基因组中的不同位置
16.一种生成表达功能性显性选择性标记的细胞的方法,包括向表达显性选择性标记的第一结构域的细胞中引入编码所述显性选择性标记的第二结构域的多核苷酸的步骤,其中所述第一结构域与所述第二结构域缔合以形成功能性显性选择性标记;所述多核苷酸不编码所述功能性显性选择性标记;并且所述细胞在转染前不表达所述功能性显性选择性标记。
17.权利要求16所述的方法,其中所述显性选择性标记是抗药性标记。
18.权利要求17所述的方法,其中所述抗药性标记赋予对选自以下的药物的抗性:两性霉素B、克念菌素、菲律宾菌素、哈霉素、那他霉素、制霉菌素、龟裂杀菌素、联苯苄唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、异康唑、酮康唑、卢立康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、阿巴康唑、氟康唑、艾沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、雷夫康唑、特康唑、伏立康唑、阿巴芬净、阿莫罗芬、布替萘芬、萘替芬、特比萘芬、阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净、苯甲酸、环吡酮、氟胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、灰黄霉素、卤普罗近、水蓼二醛、托萘酯、结晶紫、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、妥布霉素、巴龙霉素、壮观霉素、格尔德霉素、除莠霉素、利福昔明、链霉素、氯碳头孢、厄他培南、多利培南、亚胺培南、美罗培南、头孢羟氨苄、头孢唑林、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢吡肟、头孢洛林酯、头孢比罗、替考拉宁、万古霉素、替拉凡星、氯洁霉素、林可霉素、达托霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素、螺旋霉素、氨曲南、呋喃唑酮、呋喃妥因、利奈唑胺、泊西唑利德、雷得唑来、特地唑胺、阿莫西林、氨苄青霉素、阿洛西林、羧苄青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、青霉素G、替莫西林、替卡西林、克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦、克拉维酸、杆菌肽、粘菌素、多粘霉素B、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酮酸、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星、司帕沙星、替马沙星、磺胺米隆、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶银、磺胺地索辛、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺、柳氮磺吡啶、磺胺异噁唑、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、复方新诺明、Sulfonamidochrysoidine、地美环素、强力霉素、米诺环素、土霉素、四环素、氯法齐明、氨苯砜、卷曲霉素、环丝氨酸、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、利福布汀、利福喷汀、链霉素、胂凡纳明、氯霉素、磷霉素、夫西地酸、甲硝唑、莫匹罗星、平板霉素、奎奴普丁、达福普汀、甲砜霉素、替加环素、替硝唑、甲氧苄啶、遗传霉素、诺尔丝菌素、潮霉素、博来霉素和嘌呤霉素。
19.权利要求16所述的方法,其中所述显性选择性标记是营养标记。
20.权利要求19所述的方法,其中所述营养标记选自亚磷酸特异性氧化还原酶、α-酮戊二酸依赖性次磷酸双加氧酶、碱性磷酸酶、氨腈水合酶、三聚氰胺脱氨酶、氰尿酸酰胺水解酶、缩二脲水裂合酶、尿素酰胺裂合酶、氰尿酰胺氨基水解酶、鸟嘌呤脱氨酶、磷酸二酯酶、磷酸三酯酶、亚磷酸氢化酶、甘油磷酸二酯酶、对硫磷水裂合酶、亚磷酸脱氢酶、二苯并噻吩脱硫酶、芳族脱亚磺酸酶、NADH依赖性FMN还原酶、氨基嘌呤转运蛋白、羟胺氧化还原酶、转化酶、β-葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、淀粉酶、纤维素酶和支链淀粉酶。
21.权利要求16所述的方法,其中所述细胞是原核细胞。
22.权利要求21所述的方法,其中所述细胞是细菌细胞。
23.权利要求16所述的方法,其中所述细胞是真核细胞。
24.权利要求23所述的方法,其中所述细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、丝状真菌细胞、原生生物细胞、藻类细胞、禽细胞、植物细胞或昆虫细胞。
25.权利要求16所述的方法,其中所述显性选择性标记的所述结构域经由蛋白结合基序缔合。
26.权利要求25所述的方法,其中所述蛋白结合基序是亮氨酸拉链基序、Src同源2结构域、Src同源3结构域、磷酸酪氨酸结合结构域、LIM结构域、不育α基序结构域、PDZ结构域、FERM结构域、钙调理蛋白同源结构域、普列克底物蛋白同源结构域、WW结构域或WSxWS基序。
27.权利要求16所述的方法,其中所述多核苷酸在载体中被引入所述细胞。
28.权利要求16所述的方法,其中所述多核苷酸是质粒、质粒的片段、或线性化的质粒。
29.权利要求16所述的方法,其中所述多核苷酸整合到所述细胞的基因组中。
30.一种细胞,包含至少两个位于所述细胞的基因组中不同位置并编码显性选择性标记的不同结构域的核酸序列,其中所述显性选择性标记的所述不同结构域缔合以形成功能性选择性标记;并且没有个体核酸序列编码所述功能性显性选择性标记。
31.权利要求30所述的细胞,其中所述显性选择性标记是抗药性标记。
32.权利要求31所述的细胞,其中所述抗药性标记赋予对选自以下的药物的抗性:两性霉素B、克念菌素、菲律宾菌素、哈霉素、那他霉素、制霉菌素、龟裂杀菌素、联苯苄唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、异康唑、酮康唑、卢立康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、阿巴康唑、氟康唑、艾沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、雷夫康唑、特康唑、伏立康唑、阿巴芬净、阿莫罗芬、布替萘芬、萘替芬、特比萘芬、阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净、苯甲酸、环吡酮、氟胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、灰黄霉素、卤普罗近、水蓼二醛、托萘酯、结晶紫、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、妥布霉素、巴龙霉素、壮观霉素、格尔德霉素、除莠霉素、利福昔明、链霉素、氯碳头孢、厄他培南、多利培南、亚胺培南、美罗培南、头孢羟氨苄、头孢唑林、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢吡肟、头孢洛林酯、头孢比罗、替考拉宁、万古霉素、替拉凡星、氯洁霉素、林可霉素、达托霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素、螺旋霉素、氨曲南、呋喃唑酮、呋喃妥因、利奈唑胺、泊西唑利德、雷得唑来、特地唑胺、阿莫西林、氨苄青霉素、阿洛西林、羧苄青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、青霉素G、替莫西林、替卡西林、克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦、克拉维酸、杆菌肽、粘菌素、多粘霉素B、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酮酸、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星、司帕沙星、替马沙星、磺胺米隆、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶银、磺胺地索辛、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺、柳氮磺吡啶、磺胺异噁唑、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、复方新诺明、Sulfonamidochrysoidine、地美环素、强力霉素、米诺环素、土霉素、四环素、氯法齐明、氨苯砜、卷曲霉素、环丝氨酸、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、利福布汀、利福喷汀、链霉素、胂凡纳明、氯霉素、磷霉素、夫西地酸、甲硝唑、莫匹罗星、平板霉素、奎奴普丁、达福普汀、甲砜霉素、替加环素、替硝唑、甲氧苄啶、遗传霉素、诺尔丝菌素、潮霉素、博来霉素和嘌呤霉素。
33.权利要求30所述的细胞,其中所述显性选择性标记是营养标记。
34.权利要求33所述的细胞,其中所述营养标记选自亚磷酸特异性氧化还原酶、α-酮戊二酸依赖性次磷酸双加氧酶、碱性磷酸酶、氨腈水合酶、三聚氰胺脱氨酶、氰尿酸酰胺水解酶、缩二脲水裂合酶、尿素酰胺裂合酶、氰尿酰胺氨基水解酶、鸟嘌呤脱氨酶、磷酸二酯酶、磷酸三酯酶、亚磷酸氢化酶、甘油磷酸二酯酶、对硫磷水裂合酶、亚磷酸脱氢酶、二苯并噻吩脱硫酶、芳族脱亚磺酸酶、NADH依赖性FMN还原酶、氨基嘌呤转运蛋白、羟胺氧化还原酶、转化酶、β-葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、淀粉酶、纤维素酶和支链淀粉酶。
35.权利要求30所述的细胞,其中所述细胞是原核细胞。
36.权利要求35所述的细胞,其中所述细胞是细菌细胞。
37.权利要求30所述的细胞,其中所述细胞是真核细胞。
38.权利要求37所述的细胞,其中所述细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、丝状真菌细胞、原生生物细胞、藻类细胞、禽细胞、植物细胞或昆虫细胞。
39.权利要求30所述的细胞,其中所述显性选择性标记的所述不同结构域经由蛋白结合基序缔合。
40.权利要求39所述的细胞,其中所述蛋白结合基序是亮氨酸拉链基序、Src同源2结构域、Src同源3结构域、磷酸酪氨酸结合结构域、LIM结构域、不育α基序结构域、PDZ结构域、FERM结构域、钙调理蛋白同源结构域、普列克底物蛋白同源结构域、WW结构域或WSxWS基序。
41.权利要求30所述的细胞,其中所述细胞包含恰好两种核酸序列,其各自编码显性选择性标记的不同结构域,其中由所述多核苷酸编码的两种不同的结构域在所述细胞中缔合以形成所述功能性显性选择性标记。
42.一种试剂盒,包含至少两种编码显性选择性标记的不同结构域的不同的多核苷酸,其中所述显性选择性标记的所述不同结构域能够缔合以形成完整的显性选择性标记;并且没有个体多核苷酸编码所述完整的显性选择性标记。
43.权利要求42所述的试剂盒,其中所述选择性标记是抗药性标记。
44.权利要求43所述的试剂盒,其中所述抗药性标记赋予对选自以下的药物的抗性:两性霉素B、克念菌素、菲律宾菌素、哈霉素、那他霉素、制霉菌素、龟裂杀菌素、联苯苄唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、异康唑、酮康唑、卢立康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、阿巴康唑、氟康唑、艾沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、雷夫康唑、特康唑、伏立康唑、阿巴芬净、阿莫罗芬、布替萘芬、萘替芬、特比萘芬、阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净、苯甲酸、环吡酮、氟胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、灰黄霉素、卤普罗近、水蓼二醛、托萘酯、结晶紫、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、妥布霉素、巴龙霉素、壮观霉素、格尔德霉素、除莠霉素、利福昔明、链霉素、氯碳头孢、厄他培南、多利培南、亚胺培南、美罗培南、头孢羟氨苄、头孢唑林、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢吡肟、头孢洛林酯、头孢比罗、替考拉宁、万古霉素、替拉凡星、氯洁霉素、林可霉素、达托霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素、螺旋霉素、氨曲南、呋喃唑酮、呋喃妥因、利奈唑胺、泊西唑利德、雷得唑来、特地唑胺、阿莫西林、氨苄青霉素、阿洛西林、羧苄青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、青霉素G、替莫西林、替卡西林、克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦、克拉维酸、杆菌肽、粘菌素、多粘霉素B、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酮酸、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星、司帕沙星、替马沙星、磺胺米隆、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶银、磺胺地索辛、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺、柳氮磺吡啶、磺胺异噁唑、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、复方新诺明、Sulfonamidochrysoidine、地美环素、强力霉素、米诺环素、土霉素、四环素、氯法齐明、氨苯砜、卷曲霉素、环丝氨酸、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、利福布汀、利福喷汀、链霉素、胂凡纳明、氯霉素、磷霉素、夫西地酸、甲硝唑、莫匹罗星、平板霉素、奎奴普丁、达福普汀、甲砜霉素、替加环素、替硝唑、甲氧苄啶、遗传霉素、诺尔丝菌素、潮霉素、博来霉素和嘌呤霉素。
45.权利要求42所述的试剂盒,其中所述显性选择性标记是营养标记。
46.权利要求45所述的试剂盒,其中所述营养标记选自亚磷酸特异性氧化还原酶、α-酮戊二酸依赖性次磷酸双加氧酶、碱性磷酸酶、氨腈水合酶、三聚氰胺脱氨酶、氰尿酸酰胺水解酶、缩二脲水裂合酶、尿素酰胺裂合酶、氰尿酰胺氨基水解酶、鸟嘌呤脱氨酶、磷酸二酯酶、磷酸三酯酶、亚磷酸氢化酶、甘油磷酸二酯酶、对硫磷水裂合酶、亚磷酸脱氢酶、二苯并噻吩脱硫酶、芳族脱亚磺酸酶、NADH依赖性FMN还原酶、氨基嘌呤转运蛋白、羟胺氧化还原酶、转化酶、β-葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、淀粉酶、纤维素酶和支链淀粉酶。
47.权利要求42所述的试剂盒,其中所述显性选择性标记的所述不同结构域经由蛋白结合基序缔合。
48.权利要求47所述的试剂盒,其中所述蛋白结合基序是亮氨酸拉链基序、Src同源2结构域、Src同源3结构域、磷酸酪氨酸结合结构域、LIM结构域、不育α基序结构域、PDZ结构域、FERM结构域、钙调理蛋白同源结构域、普列克底物蛋白同源结构域、WW结构域或WSxWS基序。
49.权利要求42所述的试剂盒,其中所述多核苷酸在载体中。
50.权利要求42所述的试剂盒,其中所述多核苷酸是质粒、质粒的片段、或线性化的质粒。
51.权利要求42所述的试剂盒,其中所述试剂盒包含恰好两种不同的多核苷酸。

说明书全文

减少功能蛋白的平基因转移

[0001] 相关申请本申请要求2014年3月3日提交的美国临时专利申请系列号61/947,051的权益,该申请
通过引用由此并入。
[0002] 背景水平基因转移(HGT)是基因通过除了有性或无性生殖之外的机制由一种生物体至另一
种生物体的传播。许多过程可以导致HGT。例如,在一些情况下,病毒或逆转录病毒将在细胞之间随同或取代病毒序列来包装和转移细胞遗传物质。遗传物质还将通过内源性细菌过程在原核生物之间传递,所述内源性细菌过程包括细菌转化(环境DNA的摄取与表达)和缀合(彼此接触的细菌之间的DNA转移)。
[0003] HGT是一种关键机制,微生物通过该机制传播传达存活或生长优势的基因,如抗生素抗性基因,和毒因子。例如,在一个种类的细菌中负责抗生素抗性的基因可以通过上述各种HGT机制转移至其它种类的细菌,导致形成新的抗生素抗性菌株。
[0004] 当传达存活优势的基因人为设计到生物体中时,HGT的险是一个问题。具体而言,HGT介导的选择性标记(在特定细胞培养条件下促进细胞存活的基因)由工程化微生物向天然微生物的传播在许多领域(包括医药、农业和研究)中可能存在问题。例如,选择性标记,包括抗生素抗性基因,通常在微生物学中用以促进从其它方面(otherwise)类似细胞群中选择含有所需遗传物质的罕见细胞。不幸的是,在实验微生物中使用抗生素抗性基因作为选择性标记的研究者要冒基因将水平转移到毒力微生物中,赋予该毒力微生物抗生物抗性并更难以医学治疗的风险。即使当受体微生物并非毒力时,抗生素抗性基因的传播也会使得抗生素效力降低,增加细胞培养污染的风险。类似地,HGT可导致基因修饰作物中的除草剂抗性基因转移到入侵植物种类中,使得入侵植物具有除草剂抗性并且更难以控制。
[0005] 因此,对于降低功能性选择性标记由基因修饰生物体向环境的水平基因转移风险的新组合物和方法存在显著的需要。
[0006] 概述本文中提供的是用于减少功能蛋白的水平基因转移的方法与组合物。在一些实施方案
中,通过在至少两个空间上不同的核酸序列上分别编码蛋白质(例如显性选择性标记)的结构域来降低水平基因转移的风险。设计分离的结构域使得各个体结构域自身是非功能性的,但是结构域一起的共表达导致它们缔合以形成功能蛋白。因为功能蛋白的转移将要求将编码该蛋白的个体结构域的多个空间上不同的核酸序列的每一个转移到单一细胞中,因此大大降低了功能蛋白水平转移的风险。
[0007] 在一些方面,本文中提供的是生成表达功能性选择性标记的细胞的方法,该方法包括向细胞中引入至少两种编码显性选择性标记的不同结构域的不同的多核苷酸。在一些实施方案中,引入恰好两种不同的多核苷酸。在一些实施方案中,所述显性选择性标记的不同结构域缔合以形成功能性显性选择性标记。在一些实施方案中,没有个体多核苷酸编码该功能性显性选择性标记。在一些实施方案中,该多核苷酸在载体中被引入该细胞。在某些实施方案中,该多核苷酸是质粒、质粒的片段、或线性化的质粒。在一些实施方案中,不同的多核苷酸整合到该细胞的基因组中的不同位置。在一些实施方案中,该多核苷酸被靶向以整合到该细胞的基因组中的不同位置(例如通过同源重组)。在一些实施方案中,该多核苷酸整合到该细胞的基因组中的随机位置。
[0008] 在一些方面,本文中提供的是生成表达功能性显性选择性标记的细胞的方法,该方法包括向表达显性选择性标记的第一结构域的细胞中引入编码该显性选择性标记的第二结构域的多核苷酸。在一些实施方案中,该第一结构域与第二结构域缔合以形成功能性显性选择性标记。在一些实施方案中,该多核苷酸不编码该功能性显性选择性标记;并且该细胞在转染前不表达该功能性显性选择性标记。在一些实施方案中,该多核苷酸在载体中被引入该细胞。在某些实施方案中,该多核苷酸是质粒、质粒的片段、或线性化的质粒。在一些实施方案中,该多核苷酸整合到该细胞的基因组中。在一些实施方案中,该多核苷酸被靶向以整合到该细胞的基因组中的不同位置(例如通过同源重组)。在一些实施方案中,该多核苷酸整合到该细胞的基因组中的随机位置。
[0009] 在某些方面,本文中提供的是包含至少两个位于该细胞的基因组中不同位置并编码显性选择性标记的不同结构域的核酸序列的细胞。在一些实施方案中,该显性选择性标记的不同结构域缔合以形成功能性选择性标记。在一些实施方案中,没有个体核酸序列编码该功能性显性选择性标记。在一些实施方案中,该细胞包含恰好两个核酸序列,其各自编码显性选择性标记的不同结构域,其中该多核苷酸编码的两个不同结构域在细胞中缔合以形成该功能性显性选择性标记。
[0010] 在一些方面,本文中提供的是包含至少两种编码显性选择性标记的不同结构域的不同的多核苷酸的试剂盒。在一些实施方案中,所述显性选择性标记的不同结构域能够缔合以形成完整的显性选择性标记。在一些实施方案中,没有个体多核苷酸编码完整的显性选择性标记。在一些实施方案中,该多核苷酸在载体中。在一些实施方案中,该多核苷酸是质粒、质粒的片段、或线性化的质粒。在一些实施方案中,该试剂盒包含恰好两种不同的多核苷酸。在一些实施方案中,该试剂盒进一步包含细胞。
[0011] 在一些实施方案中,所述显性选择性标记是抗药性标记。在一些实施方案中,抗药性标记赋予对选自以下的药物的抗性:两性霉素B、克念菌素、菲律宾菌素、哈霉素、那他霉素、制霉菌素、龟裂杀菌素、联苯苄唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、异康唑、康唑、卢立康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、阿巴康唑、氟康唑、沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、雷夫康唑、特康唑、伏立康唑、阿巴芬净、阿莫罗芬、布替芬、萘替芬、特比萘芬、阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净、苯甲酸、环吡酮、氟胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、灰黄霉素、卤普罗近、水蓼二、托萘酯、结晶紫、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、妥布霉素、巴龙霉素、壮观霉素、格尔德霉素、除莠霉素、利福昔明、链霉素、氯头孢、厄他培南、多利培南、亚胺培南、美罗培南、头孢羟苄、头孢唑林、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢吡肟、头孢洛林酯(Ceftaroline fosamil)、头孢比罗、替考拉宁、万古霉素、替拉凡星、氯洁霉素、林可霉素、达托霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素、螺旋霉素、氨曲南、呋喃唑酮、呋喃妥因、利奈唑胺、泊西唑利德、雷得唑来(Radezolid)、特地唑胺(Torezolid)、阿莫西林、氨苄青霉素、阿洛西林、羧苄青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素、氟氯西林、美洛西林、甲西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、青霉素G、替莫西林、替卡西林、克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦、克拉维酸、杆菌肽、粘菌素、多粘霉素B、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酮酸(Nalidixic acid)、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星、司帕沙星、替沙星、磺胺米隆、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺地索辛、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺(Sulfanilimide)、柳氮磺吡啶、磺胺异噁唑、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、复方新诺明、Sulfonamidochrysoidine、地美环素、强力霉素、米诺环素、土霉素、四环素、氯法齐明、氨苯砜、卷曲霉素、环丝氨酸、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、利福布汀、利福喷汀、链霉素、胂凡纳明、氯霉素、磷霉素、夫西地酸、甲硝唑、莫匹罗星、平板霉素(Platensimycin)、奎奴普丁、达福普汀、甲砜霉素、替加环素、替硝唑、甲氧苄啶、遗传霉素、诺尔丝菌素、潮霉素、博来霉素和嘌呤霉素。
[0012] 在一些实施方案中,该显性选择性标记是营养标记。在一些实施方案中,该营养标记选自磷酸特异性氧化还原酶(Phosphite specific oxidoreductase)、α-酮戊二酸依赖性次磷酸双加氧酶(Alpha-ketoglutarate-dependent hypophosphite dioxygenase)、性磷酸酶、氨腈水合酶、三聚氰胺脱氨酶、氰尿酸酰胺水解酶(Cyanurate amidohydrolase)、缩二脲水裂合酶(Biuret hydrolyase)、尿素酰胺裂合酶(Urea 
amidolyase)、氰尿酰胺氨基水解酶(Ammelide aminohydrolase)、嘌呤脱氨酶、磷酸二酯酶、磷酸三酯酶、亚磷酸氢化酶(Phosphite hydrogenase)、甘油磷酸二酯酶、对硫磷水裂合酶、亚磷酸脱氢酶(Phosphite dehydrogenase)、二苯并噻吩脱硫酶(Dibenzothiophene desulfurization enzyme)、芳族脱亚磺酸酶(Aromatic desulfinase)、NADH依赖性FMN还原酶、氨基嘌呤转运蛋白、羟胺氧化还原酶、转化酶、β-葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、淀粉酶、纤维素酶和支链淀粉酶(Pullulonase)。
[0013] 在一些实施方案中,该细胞是原核细胞,如细菌细胞。在一些实施方案中,该细胞是真核细胞,如哺乳动物细胞、酵母细胞、丝状真菌细胞、原生生物细胞、藻类细胞、禽细胞、植物细胞或昆虫细胞。
[0014] 在一些实施方案中,该显性选择性标记的不同结构域经由蛋白结合基序缔合。在一些实施方案中,该蛋白结合基序是亮氨酸拉链基序、Src同源2结构域、Src同源3结构域、磷酸酪氨酸结合结构域、LIM结构域、不育α基序结构域(sterile alpha motif domain)、PDZ结构域、FERM结构域、调理蛋白同源结构域、普列克底物蛋白(plexkstrin)同源结构域、WW结构域或WSxWS基序。
[0015] 附图简述图1描述了使用DLP-SVM-接合法的斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)膦酸脱氢酶
(phosphonate dehydrogenase)基因ptxD的结构域接头预测的结果。
[0016] 图2描述了使用DROP法的斯氏假单胞菌膦酸脱氢酶基因ptxD的结构域接头预测的结果。
[0017] 图3描述了通过用于斯氏假单胞菌膦酸脱氢酶基因ptxD的两种不同方法:DLP-SVM-接合法(SVM)和DROP法(DROP)预测的接头区的营养品(aliment)。阴影矩形显示两种方法之间的重叠。箭头显示用于设计两种单独表达的结构域的蛋白质断裂的点。
[0018] 图4是经由融合至N-pxtD和C-ptxD结构域的反平行亮氨酸接头之间的卷曲螺旋相互作用的斯氏假单胞菌膦酸脱氢酶结构域N-pxtD和C-ptxD的翻译后组装的示意图。
[0019] 图5是用于在解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)菌株NS18中表达斯氏假单胞菌膦酸脱氢酶基因ptxD的ptxD构建物的图谱。载体ptxD在转化前通过PacI/NotI限制酶切消化来线性化。2u ori:酿酒酵母(S. cerevisiae)复制起点;pMB1 ori:大肠杆菌(E. coli) pMB1复制起点;AmpR:用作用氨苄青霉素选择的标记的bla基因;PR2:解脂耶氏酵母 GPD1启动子-931至-1;ptxD:斯氏假单胞菌膦酸脱氢酶基因ptxD;TER1:终止后的解脂耶氏酵母 CYC1终止子300 bp;Sc URA3:用于在酵母中选择的酿酒酵母URA3营养缺陷型标记。
[0020] 图6是用于在解脂耶氏酵母菌株NS18中表达和组装斯氏假单胞菌膦酸脱氢酶基因ptxD的N-pxtD和C-ptxD结构域的ptxD断裂构建物的图谱。载体ptxD-断裂在转化前通过PacI/NotI/PmeI限制酶切消化来线性化。2u ori:酿酒酵母复制起点;pMB1 ori:大肠杆菌pMB1复制起点;AmpR:用作用氨苄青霉素选择的标记的bla基因;PR2:解脂耶氏酵母GPD1启动子-931至-1;N-ptxD:斯氏假单胞菌膦酸脱氢酶基因ptxD的N端结构域;N-ZIP:N端蛋白质结构域的亮氨酸拉链;TER1:终止后的解脂耶氏酵母 CYC1终止子300 bp;PR22:酿酒酵母TEF1启动子-412至-1;C-ZIP:用于C端蛋白质结构域的设计的亮氨酸拉链;C-ptxD:斯氏假单胞菌膦酸脱氢酶基因ptxD的C端结构域;TER2:终止后的酿酒酵母CYC1终止子275 bp;Sc URA3:用于在酵母中选择的酿酒酵母URA3营养缺陷型标记。
[0021] 图7提供了斯氏假单胞菌膦酸脱氢酶基因ptxD的DNA和蛋白质序列。
[0022] 图8提供了斯氏假单胞菌膦酸脱氢酶基因ptxD的N端和C端结构域的DNA和蛋白质序列。
[0023] 图9提供了斯氏假单胞菌膦酸脱氢酶基因ptxD的N端和C端结构域的亮氨酸拉链的DNA和蛋白质序列。
[0024] 详述概览
本文中提供的方法与组合物(例如方法、细胞、核酸、多肽、蛋白质和试剂盒)消除或显著减少编码功能蛋白的遗传因子(包括但不限于,编码功能性显性选择性标记的遗传因子)的水平转移。
[0025] 水平基因转移导致耐药性在病原体之间扩散。因此,由于细菌和其它生物体产生抗药性机制,其随后通过水平基因转移扩散至其它生物体,新发现的和人工的抗生素可经时丧失其效力。
[0026] 由于抗药性和营养选择标记通常用于生物体的遗传工程,标记由工程化生物体转移到环境中显现医学和农业风险。例如,显性选择性标记的水平转移提高了病原体获得抗药性的可能性,并由此变得更难以治疗或预防人类、家畜和作物中的疾病。此外,标记从遗传工程生物体向天然生物体的无意扩散也降低了设计成基因修饰生物体的竞争优势,并且,结果,提高了被不期望的天然生物体污染的风险。因此,水平基因转移可以提高生物反应器被不合意的抗生素抗性微生物污染的风险和作物被除草剂抗性入侵植物种类污染的风险。
[0027] 因此,在一些实施方案中,本文中提供的是通过在至少两个空间上不同的核酸序列上分别编码显性选择性标记的结构域来降低水平基因转移风险的组合物和方法,其中单独的各个体结构域不能充当选择性标记,但是编码的结构域的共表达导致它们缔合以形成功能性选择性标记。由于个体标记结构域并非功能性的(除了与其它结构域组装时),所以个体结构域通过水平基因转移向其它生物体的转移不会赋予受体生物体选择优势。因此,非宿主生物体获得组装功能性显性选择性标记所必需的所有结构域的概率显著低于单一水平基因转移事件的概率。
[0028] 定义冠词“一个(种)”(“a”和“an”)在本文中用于指一个(种)或超过一个(种)(即至少一个(种))该冠词的语法对象。通过举例方式,“一个要素”指的是一个要素或多于一个要素。
[0029] 术语“结构域”指的是蛋白质的氨基酸序列的一部分,其能够折叠成独立于该蛋白质其余部分的稳定三维结构。天然蛋白质结构域通常通过结构域接头来连接。从蛋白质的氨基酸序列中识别结构域和结构域接头的方法在本领域中是已知的,并包括例如Ebina等人在Biopolymers 92:1-8 (2009)中描述的DLP-SVM-接合法(通过引用以其全部由此并入),和DROP法,其描述在Ebina等人的Bioinformatics 27:487-494 (2001)(通过引用以其全部由此并入)中。
[0030] 术语“显性选择性标记”指的是允许表达该选择性标记的细胞在特定细胞培养条件下生长和/或存活的选择性标记。显性选择性标记可以与“阴性选择性标记”形成对照,所述阴性选择性标记指的是防止表达该选择性标记的细胞在特定细胞培养条件下生长和/或存活的选择性标记。如果单一选择性标记允许表达该选择性标记的细胞在特定细胞培养条件下生长和/或存活,但是防止表达该选择性标记的细胞在其它细胞培养条件下生长和/或存活的话,则该选择性标记有可能既是显性选择性标记又是阴性选择性标记。
[0031] 本文中所用的术语“营养源”包括可以由细胞用于促进细胞生长和/或存活的任何材料,包括碳源。
[0032] 本文中所用的术语“质粒”指的是与生物体的基因组DNA物理分离的环状DNA分子。质粒可以在被引入到宿主细胞之前线性化(在本文中称为线性化的质粒)。线性化的质粒不是自我复制的,但是可整合到生物体的基因组DNA中并用生物体的基因组DNA来复制。
[0033] 术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用。它们指的是任意长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸,或其类似物)的聚合形式。多核苷酸可具有任何三维结构,并可实施任何功能。下面是多核苷酸的非限制性实例:基因或基因片段的编码区或非编码区、由连分析确定的基因座(locus)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸,例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话,对核苷酸结构的修饰可在组装聚合物之前或之后进行(impart)。多核苷酸可经进一步修饰,如通过与标记组分缀合。在本文中提供的所有核酸序列中,U核苷酸可与T核苷酸互换。
[0034] 术语“载体”指的是核酸可以由此在生物体、细胞或细胞组分之间传播和/或转移的手段。载体包括质粒、线性DNA片段、病毒、噬菌体、前病毒、噬菌粒、转座子和人工染色体等等,其可能或可能不能够自主复制或整合到宿主细胞的染色体中。
[0035] 用于减少功能蛋白的水平基因转移的方法在一些方面,本文中提供的是生成具有降低的水平转移编码功能蛋白的核酸序列的可
能性的细胞的方法。在一些实施方案中,这通过设计该细胞使得该蛋白被表达为至少两个由单独的表达盒编码的单独的结构域来实现。各个表达的结构域在单独被表达时是非功能性的,但是当该结构域一起被表达时,它们缔合形成功能蛋白。在一些实施方案中,该蛋白是显性选择性标记。
[0036] 在一些实施方案中,该方法包括向细胞中引入至少两种编码该蛋白的不同结构域的不同的多核苷酸。在一些实施方案中,将该功能蛋白分为2、3、4、5、6或更多个单独的结构域。在一些实施方案中,恰好引入两种不同的多核苷酸。在一些实施方案中,各单独的结构域在引入该细胞的一种单独的多核苷酸上被编码。在一些实施方案中,将单独的多核苷酸同时引入该细胞(例如在单一共转染中)。在一些实施方案中,将单独的多核苷酸依次引入该细胞(例如在连续转染中)。由此,在一些实施方案中,将编码该蛋白的一个结构域的单一多核苷酸引入包含(例如在其基因组中)编码该蛋白的不同结构域的核酸序列的细胞中。在一些实施方案中,该单独的结构域由单独的表达盒编码。该单独的表达盒可以在分开的多核苷酸上或在单一多核苷酸上。在一些实施方案中,该多核苷酸是质粒、质粒的片段、或线性化的质粒。
[0037] 在某些实施方案中,本文中描述的方法可以应用于任何细胞类型。在一些实施方案中,该细胞是原核细胞,如细菌细胞。在一些实施方案中,该细胞是真核细胞,如哺乳动物细胞、酵母细胞、丝状真菌细胞、原生生物细胞、藻类细胞、禽细胞、植物细胞或昆虫细胞。
[0038] 在一些实施方案中,该细胞是微生物。在一些实施方案中,该微生物是耶氏酵母属(Yarrowia)、Arxula属、酵母菌属(Saccharomyces)、Ogataea属、毕赤酵母属(Pichia)或埃希氏菌属(Escherichia)的物种。在一些实施方案中,该微生物选自解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、Ogataea polymorpha、毕赤酵母(Pichia pastoris)、Arxula adeniovorans和大肠杆菌(Escherichia coli)。
[0039] 在某些实施方案中,该多核苷酸可以使用本领域中已知的任何方法引入该细胞。例如,在一些实施方案中,该多核苷酸在载体中被引入。一种类型的载体是“质粒”,其指的是附加NDA节段可以连接到其中的环状双链DNA环。在一些实施方案中,该质粒在引入该细胞之前线性化。另一种类型的载体是病毒载体,其中附加DNA节段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入其中的宿主细胞(例如具有细菌复制起点的细菌载体和游离型真核载体)中自主复制。其它载体(例如非游离型真核载体)可以在引入宿主细胞中时整合到该宿主细胞的基因组中,并由此与宿主基因组一起复制。
[0040] 某些载体能够引导它们可操作地连接的基因的表达(表达载体)。本文中提供的表达载体能够促进宿主细胞中的编码结构域的表达,这意味着该表达载体包括一个或更多个基于要用于表达的宿主细胞所选择的调节序列(例如启动子、增强子),该调节序列可操作地连接到要表达的核酸序列。表达载体的设计可以取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平等等的因素。
[0041] 该多核苷酸可以经由常规转化或转染技术引入原核或真核宿主细胞中。转化和转染技术的实例包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染、电穿孔、光学转染、原生质体融合、impalefection、流体输送(hydrodynamic delivery)、使用基因枪、磁转染和粒子轰击。多核苷酸也可以通过用病毒载体(例如腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体)感染该细胞来引入。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可见于Sambrook等人(Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)和其它实验室手册。
[0042] 在一些方面,本文中提供的是可用于实施本文中描述的方法的试剂盒。在一些实施方案中,该试剂盒包括至少两种编码显性选择性标记的不同结构域的不同的多核苷酸。在一些实施方案中,该显性选择性标记的不同结构域能够缔合以形成完整的显性选择性标记。在一些实施方案中,没有个体多核苷酸编码完整的显性选择性标记。在一些实施方案中,该多核苷酸在载体中。在一些实施方案中,该多核苷酸是质粒、质粒的片段、或线性化的质粒。在一些实施方案中,该试剂盒包含恰好两种不同的多核苷酸。在一些实施方案中,该试剂盒进一步包含细胞。在一些实施方案中,该细胞是真核细胞,如哺乳动物细胞、酵母细胞、丝状真菌细胞、原生生物细胞、藻类细胞、禽细胞、植物细胞或昆虫细胞。在一些实施方案中,该试剂盒进一步包含转染试剂。在一些实施方案中,该试剂盒进一步包含使用说明书
[0043] 具有降低的水平基因转移的细胞在某些方面,本文中提供的是具有降低的水平转移其表达的蛋白(例如显性选择性标
记)的可能性的细胞。在一些实施方案中,该细胞是原核细胞,如细菌细胞。在一些实施方案中,该细胞是真核细胞,如哺乳动物细胞、酵母细胞、丝状真菌细胞、原生生物细胞、藻类细胞、禽细胞、植物细胞或昆虫细胞。
[0044] 在一些实施方案中,该细胞是微生物。在一些实施方案中,该微生物是耶氏酵母属、酵母菌属(Saccharomyces)、Ogataea属、毕赤酵母属、Arxula属或埃希氏菌属的物种。在一些实施方案中,该微生物选自解脂耶氏酵母、酿酒酵母、Ogataea polymorpha、毕赤酵母、Arxula adeniovorans和大肠杆菌。
[0045] 在一些实施方案中,该细胞含有至少两种位于该细胞中空间上不同位置处的编码蛋白质的不同结构域的核酸序列。在一些实施方案中,该显性选择性标记的不同结构域缔合以形成功能性选择性标记。在一些实施方案中,没有个体核酸序列编码该功能性显性选择性标记。在一些实施方案中,使用本文中描述的方法生成该细胞。
[0046] 在一些实施方案中,所述两种核酸序列位于该细胞的基因组中的不同位置处。在一些实施方案中,所述两种核酸序列位于不同的染色体上。在一些实施方案中,所述两种核酸序列位于该细胞内不同的染色体外因子(例如质粒)上。在一些实施方案中,一个核酸序列位于该细胞的基因组DNA中,且另一核酸序列位于染色体外因子上。在一些实施方案中,至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000个碱基对分隔所述核酸序列。
[0047] 显性选择性标记在一些实施方案中,本文中提供的是作为单独的结构域表达的显性选择性标记,所述
结构域独立地为非功能性的,但是能够缔合以形成显性选择性标记。在一些实施方案中,本文中提供的是编码此类显性选择性标记和显性选择性标记结构域的核酸分子、细胞或生物体。
[0048] 在一些实施方案中,该显性选择性标记是抗药性标记。抗药性标记是在被细胞表达时,允许该细胞在通常将抑制细胞生长和/或存活的药物存在下生长和/或存活的显性选择性标记。表达抗药性标记的细胞可以通过在该药物的存在下生长该细胞来选择。在一些实施方案中,该抗药性标记是抗生素抗性标记。在一些实施方案中,该抗药性标记赋予对选自以下的药物的抗性:两性霉素B、克念菌素、菲律宾菌素、哈霉素、那他霉素、制霉菌素、龟裂杀菌素、联苯苄唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、异康唑、酮康唑、卢立康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、阿巴康唑、氟康唑、艾沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、雷夫康唑、特康唑、伏立康唑、阿巴芬净、阿莫罗芬、布替萘芬、萘替芬、特比萘芬、阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净、苯甲酸、环吡酮、氟胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、灰黄霉素、卤普罗近、水蓼二醛、托萘酯、结晶紫、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、妥布霉素、巴龙霉素、壮观霉素、格尔德霉素、除莠霉素、利福昔明、链霉素、氯碳头孢、厄他培南、多利培南、亚胺培南、美罗培南、头孢羟氨苄、头孢唑林、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢吡肟、头孢洛林酯、头孢比罗、替考拉宁、万古霉素、替拉凡星、氯洁霉素、林可霉素、达托霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素、螺旋霉素、氨曲南、呋喃唑酮、呋喃妥因、利奈唑胺、泊西唑利德、雷得唑来、特地唑胺、阿莫西林、氨苄青霉素、阿洛西林、羧苄青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、青霉素G、替莫西林、替卡西林、克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦、克拉维酸、杆菌肽、粘菌素、多粘霉素B、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酮酸、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星、司帕沙星、替马沙星、磺胺米隆、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶银、磺胺地索辛、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺、柳氮磺吡啶、磺胺异噁唑、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、复方新诺明、Sulfonamidochrysoidine、地美环素、强力霉素、米诺环素、土霉素、四环素、氯法齐明、氨苯砜、卷曲霉素、环丝氨酸、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、利福布汀、利福喷汀、链霉素、胂凡纳明、氯霉素、磷霉素、夫西地酸、甲硝唑、莫匹罗星、平板霉素、奎奴普丁、达福普汀、甲砜霉素、替加环素、替硝唑、甲氧苄啶、遗传霉素、诺尔丝菌素、潮霉素、博来霉素和嘌呤霉素。
[0049] 在一些实施方案中,该显性选择性标记是营养标记。营养标记是在被细胞表达时,允许该细胞使用特定营养源生长和/或存活的显性选择性标记。表达营养标记的细胞可以通过在受限的营养条件下生长该细胞来选择,在所述条件下表达该营养标记的细胞能够存活和/或生长,但是缺少该营养标记的细胞不能存活和/或生长。在一些实施方案中,该营养标记选自亚磷酸特异性氧化还原酶、α-酮戊二酸依赖性次磷酸双加氧酶、碱性磷酸酶、氨腈水合酶、三聚氰胺脱氨酶、氰尿酸酰胺水解酶、缩二脲水裂合酶、尿素酰胺裂合酶、氰尿酰胺氨基水解酶、鸟嘌呤脱氨酶、磷酸二酯酶、磷酸三酯酶、亚磷酸氢化酶、甘油磷酸二酯酶、对硫磷水裂合酶、亚磷酸脱氢酶、二苯并噻吩脱硫酶、芳族脱亚磺酸酶、NADH依赖性FMN还原酶、氨基嘌呤转运蛋白、羟胺氧化还原酶、转化酶、β-葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、淀粉酶、纤维素酶和支链淀粉酶。
[0050] 在一些实施方案中,本文中描述的显性选择性标记作为单独的结构域表达,所述结构域单独地为非功能性的,但是能够与其它结构域缔合形成功能性显性选择性标记。该显性选择性标记的单独的结构域可以使用本领域已知的方法来识别。例如,该单独的结构域可以基于该显性选择性标记的晶体结构来识别,或基于该显性选择性标记的氨基酸序列来识别。从蛋白质的氨基酸序列中识别结构域和结构域接头的方法在本领域中是已知的,并包括例如在Ebina等人, Biopolymers 92:1-8 (2009)中描述的DLP-SVM-接合法和在Ebina等人, Bioinformatics 27:487-494 (2001)中描述的DROP法。通常,该显性选择性标记的结构域对结构域之间的结构域接头中的位置处的单独表达来划分(devided for)。
[0051] 在一些实施方案中,该显性选择性标记的结构域固有地能够缔合以形成功能性显性选择性标记。在一些实施方案中,该显性选择性标记的结构域设计成经由蛋白结合基序来缔合。在此类情况下,该显性选择性标记的结构域作为包括显性选择性标记结构域和蛋白结合基序两者的融合蛋白表达。在大多数情况下,将选择蛋白结合基序连接到结构域的位置,使得在结构域缔合后形成的复合物类似于天然蛋白的结构。由此,在一些实施方案中,该蛋白结合基序连接到位于天然蛋白的N端的结构域的C端。在一些实施方案中,该蛋白结合基序连接到位于天然蛋白的C端的结构域的N端。
[0052] 在一些实施方案中,任何蛋白结合基序可用于促进显性选择性标记结构域的缔合。蛋白结合基序的实例包括亮氨酸拉链、Src同源2结构域、Src同源3结构域、磷酸酪氨酸结合结构域、LIM结构域、不育α基序结构域、PDZ结构域、FERM结构域、钙调理蛋白同源结构域、普列克底物蛋白同源结构域、WW结构域或WSxWS基序。
[0053] 在一些实施方案中,该蛋白结合基序是亮氨酸拉链基序。亮氨酸拉链是常见的三维蛋白结构基序,其常充当二聚结构域。亮氨酸拉链氨基酸序列在本领域中是已知的。例如,在图9中提供了示例性亮氨酸拉链序列,并描述在Ghosh等人,J.Am.Chem.Soc.122:5658 (2000)中。
[0054] 在一些实施方案中,该蛋白结合基序是Src同源2结构域(SH2结构域)。SH2结构域是大约100个氨基酸的广泛(broadly)保守的蛋白质结构域,其允许含有此类结构域的蛋白质结合到其它蛋白质上的磷酸化酪氨酸残基。SH2结构域序列在该领域中是已知的并在许多物种中发现,包括在超过100种人类基因中。许多SH2结构域序列在本领域中是已知的。含有SH2结构域的人蛋白的实例包括ABL1、ABL2、BCAR3、CHN2、DAPP1、HCK、SLA、SOCS1、SOCS2、SOCS3、TEC、TNS、VAV1、YES1和ZAP70。
[0055] 在一些实施方案中,该蛋白结合基序是Src同源3结构域(SH3结构域)。SH3结构域是在大约300种由人基因组编码的蛋白质中发现的大约60个氨基酸的小的、高度保守的蛋白质结构域。SH3结构域具有特征性β-桶状折叠(beta-barrel fold),其由排列成两个紧密堆积的反平行β折叠(β sheet)的五条或六条β链组成。SH3结构域通常结合到结合配偶体(binding partner)中的富含脯氨酸的肽。被SH3结构域结合的富含脯氨酸的肽常具有X-P-p-X-P的共有序列,X代表脂族氨基酸,P总是代表脯氨酸,而p有时为脯氨酸。含有SH3结构域的人蛋白的实例包括CDC24、CDC25、PI3激酶、GRB2、SH3D21和STAC3。
[0056] 在一些实施方案中,该蛋白结合基序是磷酸酪氨酸结合结构域(PTB结构域)。磷酸酪氨酸结合结构域是结合到磷酸酪氨酸的蛋白质结构域。磷酸酪氨酸结合结构域的实例在通过结合到NPXY基序与β整合蛋白的胞质尾区相互作用的张力蛋白的C端中发现。含有PTB结构域的人蛋白的实例包括APBA1、APBA2、EPS8、EPS8L1、TENC1、TNS、DOC1、FRS2、IRS1和TLN1。
[0057] 在一些实施方案中,该蛋白结合基序是LIM结构域。LIM结构域是由两个被二-氨基酸残基疏水性接头分隔的邻接锌指结构域组成的蛋白质结构域(structural domain)。LIM结构域初始在蛋白质Lin11、Isl-1和Mec-3中被识别,但是已经在真核生物和原核生物两者中的许多其它蛋白质中被识别。LIM结构域的序列特征为[C]-[X]2-4-[C]-[X]13-19-[W]-[H]-[X]2-4-[C]-[F]-[LVI]-[C]-[X]2-4-[C]-[X]13-20-C-[X]2-4-[C]。
[0058] 在一些实施方案中,该蛋白结合基序是不育α基序结构域(SAM结构域)。SAM结构域是在宽范围的真核蛋白中发现的尺寸为大约70个氨基酸的蛋白质相互作用结构域。Sam结构域以具有两个大界面的小的五螺旋束形式排列。SAM结构域常与其它SAM结构域二聚。例如,真菌蛋白Ste50p的SAM结构域与Ste11p的SAM结构域相互作用以促进形成异二聚体复合物。
[0059] 在一些实施方案中,该蛋白结合基序是PDZ结构域。PDZ结构域是在宽范围的生物体(包括细菌、酵母、植物、病毒和动物)中发现的80-90个氨基酸的常见结构域。PDZ结构域通过β折叠增加(augmentation)结合到其它蛋白质的C端的短区域。存在大约260种人PDZ结构域,许多蛋白质含有多个PDZ结构域。含有PDZ结构域的人蛋白的实例包括Erbin、Htra1、Htra2、Htra3、PSD-95、SAP97、CARD11和PTP-BL。PDZ结构域常与其它蛋白质结构域(包括SH3结构域)缔合。
[0060] 在一些实施方案中,该蛋白结合基序是FERM结构域。FERM结构域是在许多细胞骨架相关蛋白质中发现的一种普遍的蛋白质分子。在大多数情况下,该FERM结构域存在于含有FERM结构域的蛋白质的N端。含有FERM结构域的蛋白质的实例包括Band 4.1、埃兹蛋白(Ezrin)、膜突蛋白(Moesin)、根蛋白(Radixin)、踝蛋白(Talin)、Merlin、NBL4和TYK2。
[0061] 在一些实施方案中,该蛋白结合基序是钙调理蛋白同源结构域(CH结构域)。CH结构域是在细胞骨架蛋白和信号转导蛋白两者中发现的一类肌动蛋白结合结构域。含有CH结构域的人蛋白的实例包括ACTN1、CLMN、DIXDC1、FLNA、IQGAP1、LCP1、MACF1、NAV2、PARVA、SMTN和VAV1。在Saraste等人, Nat.Struct.Biol. 4:175-179 (1997)中提供了示例性CH结构域的结构。
[0062] 在一些实施方案中,该蛋白结合基序是普列克底物蛋白同源结构域(PH结构域)。PH结构域是在宽范围的蛋白质中发现的大约120个氨基酸的蛋白质结构域。示例性PH结构域的结构描述在Riddihough Nat.Struct.Biol. 1:755-757 (1994)中。PH结构域具有由后接C端两亲性螺旋的两个垂直的反平行β折叠组成的结构。含有PH结构域的人蛋白的实例包括ABR、BMK、BTK、DAB2IP、DOK4、EXOC8、GAB1、IRS1、KALRN、NET1、RASA1、ROCK1、RP1和VEPH1。
[0063] 在一些实施方案中,该蛋白结合基序是WW结构域(也称为rsp5-结构域或WWP重复基序)。该WW结构域是大约40个氨基酸的模结构域,其常重复多达四次并且与特定的脯氨酸基序(包括[AP]-[P]-[P]-[AP]-Y基序)相互作用。含有来自宽范围的物种基序的WW的大量蛋白质在本领域中是已知的,包括脊椎动物YAP蛋白、NEDD4(小鼠)、RSP5(酵母)、FE65(大鼠)和DB10(烟草)。在Hu等人, Proteomics 4:643-655 (2004)中提供了对WW结构域相互作用的详细信息。
[0064] 在一些实施方案中,该蛋白结合基序是WSxWS基序。该WSxWS基序是在某些蛋白质受体(包括I型细胞因子受体)的胞外结构域中发现的蛋白质相互作用基序。在Dagil等人, Structure 20:270-282 (2012)中提供了示例性WSxWS基序的结构。含有WSxWS基序的蛋白质的实例包括IL-4受体、生长激素受体、催乳素受体、促红细胞生成素受体、IL-2受体、IL-13受体和IL-6受体。
[0065] 范例实施例1:识别营养标记ptxD中的结构域
为了证实标记结构域的单独表达降低了标记转移到其它生物体的风险,选择斯氏假单
胞菌膦酸脱氢酶基因ptxD(序列基于NCBI参考序列:YP_006457277.1提供在图7中)作为实例。当斯氏假单胞菌ptxD基因在解脂耶氏酵母中被表达时,其促进了由解脂耶氏酵母进行的亚磷酸盐(phosphite)消耗,并允许其在其中亚磷酸盐是唯一可用磷源的条件下生长。由于解脂耶氏酵母的野生型菌株不能在其中亚磷酸盐是唯一磷源的培养基上生长,ptxD在解脂耶氏酵母中充当营养标记。
[0066] 为了将ptxD基因断裂成可以单独折叠的结构域,使用两种方法预测结构域接头序列:DLP-SVM-接合(Ebina等人, Biopolymers 92:1-8 (2009))和DROP(Ebina等人, Bioinformatics 27:487-494 (2001))。图1和2分别显示了由DLP-SVM-接合法和DROP法产生的这些结构域接头预测的结果。如图3中所示,两种结构域预测方法识别了重叠的接头序列。选择共有接头序列中的位置作为将分离ptxD的N端结构域与C端结构域的点,如图3中的箭头所示。在图8中提供了所得N端结构域与C端结构域的序列。
[0067] 实施例2:产生将ptxD作为单独的N端结构域和C端结构域表达的细胞图1中识别的结构域ptxD融合到亮氨酸拉链结构域(序列提供在图9中)用于如图4中所
示的翻译后组装。该ptxD作为单独的结构域表达或作为单一蛋白质表达用于比较。通过以下两种表达构建物之一来转化解脂耶氏酵母菌株NS18(NRRL YB-392)细胞:ptxD(编码完整的ptxD蛋白,显示在图5中)或ptxD-断裂(编码单独的ptxD结构域/亮氨酸拉链融合多肽,显示在图6中)。构建物ptxD在转化之前通过PacI/NotI限制酶切消化来线性化。构建物ptxD-断裂在转化之前通过PacI/NotI/PmeI限制酶切消化来线性化。ptxD-断裂构建物的PacI/NotI/PmeI消化生成两个单独的DNA片段,其各自含有一个表达盒:一个编码N端结构域ptxD/亮氨酸拉链融合多肽,而另一个编码ptxD/亮氨酸拉链融合多肽的C端结构域。为了获得编码个体标记结构域的单独的表达盒,该ptxD-断裂构建物可以通过PacI/NotI/PmeI核酸内切酶来消化,并通过使用标准凝胶电泳和凝胶纯化技术分离含有个体表达盒的DNA片段。或者,可以对ptxD的各个结构域设计和构建单独的表达载体。
[0068] 将来自线性化的ptxD和ptxD-断裂质粒的表达盒整合到NS18菌株细胞的基因组中。对于线性化的ptxD-断裂,两种表达盒必须同时整合到酵母基因组中以使ptxD为功能性的。作为对照试验,各个ptxD结构域在解脂耶氏酵母细胞中单独表达以证明各结构域并非独立地为功能性的。
[0069] 实施例3:在将ptxD作为单独的N端结构域和C端结构域表达的细胞中降低的水平基因转移对于将ptxD作为单独结构域(NS18+ptxD-断裂)表达或作为单一多肽(NS18+ptxD)表达
的解脂耶氏酵母菌株来确定ptxD水平转移到其它生物体的速率。各菌株在含有亚磷酸盐作为磷源的确定培养基中、在摇瓶中在不具有ptxD基因的污染生物体(例如不表达ptxD基因的解脂耶氏酵母菌株NS18)的存在下生长。为了区分污染细胞与表达ptxD的菌株,预先用表达ptxD的菌株中不存在的抗生素抗性标记来转化该污染细胞。随后对菌株施以系列转移,其中细胞培养物每24-48小时用新鲜培养基稀释100倍。每次稀释细胞时,向瓶中再次加入污染细胞。持续该系列转移用于多代细胞分裂(1,000-10,000或更多),并通过将混合培养物铺在含有污染物特异性抗生素的培养基上来分离污染物细胞并测量污染细胞获得利用亚磷酸盐的能力的百分比,由此测量ptxD转移的速率。将来自NS18+ptxD-断裂菌株的水平基因转移速率与来自NS18+ptxD菌株的水平基因转移速率进行比较。
[0070] 作为用于检查与NS18+ptxD菌株相比降低的来自NS18+ptxD-断裂菌株的水平转移的水平的第二种方法,分离来自NS18+ptxD-断裂菌株和NS18+ptxD菌株的基因组DNA并将其用于转化污染生物体如酵母或细菌。为了提高将ptxD表达盒整合到污染生物体的基因组中的效率,用限制酶来消化NS18+ptxD-断裂菌株与NS18+ptxD菌株的基因组DNA。通过计算在具有限定培养基的板上的转化体和每微克用于转化的基因组DNA的作为磷源的亚磷酸盐的量来测量功能ptxD水平转移的速率。
[0071] 通过引用并入所有本文中引用的美国专利和美国公开专利申请都通过引用由此并入。
[0072] 等效方案本领域技术人员将认识到,或仅使用常规试验即能够确定对本文中描述的本发明的具
体实施方案的许多等效方案。此类等效方案意在由下列权利要求书涵盖。
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