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用于生物控制植物病原体的系统和方法

阅读:450发布:2020-05-14

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1.一种植物病原体生物控制系统,包括以下步骤:
-产生具有抑制RNaselll活性的基因修饰内生细菌;
-用核酸结构转化所述基因修饰内生细菌,所述核酸结构包含编码至少一种小抑制性核糖核酸(siRNA)的多核苷酸,所述小抑制性核糖核酸(siRNA)能够形成针对植物病原体中至少一个目标序列的双链RNA(dsRNA)或发夹(hpRNA);
-将所述基因修饰的内生细菌引入植物;并且
-表达所述核酸结构足够时间以诱导所述植物中的RNA干扰(RNAi)机制,其中所述RNAi机制导致植物病原体中所述至少一个目标序列的下调。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述将所述基因修饰的内生细菌引入植物的步骤包括选自以下组的步骤:通过一次或多次浸泡、喷雾、注射、雾化释放、环境雾化释放、源中的环境雾化释放、冻干、冷冻干燥、微胶囊化、干燥、在水性载体中、在溶液中、刷洗、敷料、滴涂和涂覆。
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述植物是单子叶植物和/或双子叶植物。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述植物选自以下之一:谷物、玉米、小麦、水稻、大麦、燕麦、高粱、小米、向日葵、红花、花、大豆、菜籽油、苜蓿、拟南芥、大麻、土豆、芸苔、花生、烟草、热带水果及花卉、香蕉、浮萍、唐菖蒲、甘蔗、菠萝、红枣、洋葱、菠萝、腰果、开心果、鲜花、观赏植物、针叶树、落叶类、葡萄、柑橘、玫瑰、苹果、桃子、草莓、杏仁、咖啡、橡树、豆类、豆科植物、西瓜、南瓜、卷心菜、萝卜、芥末、仙人掌、山核桃、亚麻、红薯、大豆、椰子、鳄梨、甜菜、香瓜和蔬菜。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述植物病原体包含选自以下组的植物病原体:植物病毒;植物类病毒;真菌害虫、食草动物和霉菌。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述植物病毒选自以下之一:烟草花叶病毒(TMV);
番茄斑点枯萎病毒(TSWV);番茄黄叶卷曲病毒(TYLCV);黄瓜花叶病毒(CMV);铃薯病毒y(PVY);花椰菜花叶病毒(CaMV);非洲木薯花叶病毒(ACMV);梅痘病毒(PPV);雀麦花叶病毒(BMV);马铃薯病毒X(PVX);柑橘衰退病毒、大麦黄矮病毒、马铃薯卷叶病毒和番茄和丛生矮缩病毒。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述目标序列系选:病毒关键区序列、病毒家族的保守序列及不同病毒家族成员间的保守序列。
8.根据权利要求6所述的方法,其中所述抑制的目标序列选自:所述烟草花叶病毒中的复制酶基因、运动蛋白、外壳蛋白;所述番茄斑点枯萎病毒中的糖蛋白(GPs)、NSm蛋白、NSs蛋白、病毒RNA基因组片段L、M、S;所述番茄黄叶卷曲病毒中的V1、V2、C1、C2、C3、C4、VI蛋白;
所述黄瓜花叶病毒中的la、2a2b蛋白、3a、外壳蛋白;所述马铃薯病毒Y中的PI、HC-Pro、P3、
6kl、CI、6k2、Nia、Nib、CP;所述花椰菜花叶病毒中的运动蛋白、两种蚜虫传播因子(P2和/或P3)、衣壳蛋白前体(P4)、蛋白酶多蛋白前体、P5、P6蛋白;所述非洲木薯花叶病毒中的AVI、AV2、AC1、AC2、AC3、AC4、BCl、BV1;所述梅痘病毒中的PI、HC-Pro、P3、6k1、CI、6k2、Nia、Nib、CP;所述雀麦花叶病毒中的la、2a、运动蛋白、外壳蛋白;所述马铃薯病毒X中的复制酶、TGB1、TGB2、TGB3、外壳蛋白。
8.根据权利要求4所述的方法,所述真菌选自:稻瘟病菌;灰霉病菌;柄锈菌属;禾谷镰刀菌;尖孢镰刀菌;小麦白粉病菌;禾生球腔菌;炭疽病属;黑粉菌;亚麻锈菌;大豆锈菌;立枯丝核菌。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述目标序列选自:真菌必需基因的关键区序列、必需基因家族的保守序列和不同病毒家族成员中的保守必需基因。
10.根据权利要求1、7和9所述的方法,其中所述目标序列选自:RNA的非编码区,RNA的编码区;所述目标序列含有RNA的剪接位点。
11.根据权利要求1所述的方法,其中所述核酸结构是质粒。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述质粒被修饰以包括来自质粒组的目标序列,所述质粒由以下组成:pAD-WRKY-GHY1;PAD-ADH-GHY2;pOXB-WRKY-GHY3;POXB-ADH-GHY4;
PAD-WRKY-GHY5;hpRNApAD-ADH-GHY6;和hpRNA pAD-WRKY-GHY7。
13.根据权利要求1所述的方法,其中所述siRNA与启动子可操作地连接,所述siRNA配置成能够形成针对植物病原体中至少一种目标序列的双链RNA(dsRNA)或发夹(hpRNA)。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述启动子包含选自下组的启动子:非组成型启动子;诱导型启动子、病原体诱导型启动子;组织优选启动子;组织特异性启动子、植物特异性启动子或组成型启动子。
15.根据权利要求1所述的方法,其中所述具有抑制RNaseIII的基因修饰内生细菌选自:酸杆菌、放线菌、α-变形菌、装甲菌、拟杆菌、β-变形菌、δ-变形菌、厚壁菌、γ-变形菌、TM7、芽孢杆菌、大肠杆菌。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述基因修饰内生细菌是M-JM109-GHY2。
17.根据权利要求15所述的方法,其中所述基因修饰内生细菌是枯草芽孢杆菌CCB422。
18.根据权利要求15所述的方法,其中所述基因修饰内生细菌是大肠杆菌HT27或
HT115。
19.根据权利要求1和18所述的方法,其中所述具有抑制RNaseIII的基因修饰内生细菌包含具有超囊泡活性的基因修饰内生细菌JC8031,和/或具有一种或多种营养缺陷的基因修饰内生细菌,所述营养缺陷足以增强与其他细菌的纳米管形成。
20.根据权利要求1所述的方法,其中所述siRNA在整个植物中迁移。
21.根据权利要求1所述的方法,其中所述表达所述核酸结构足够时间以诱导所述植物中的RNA干扰(RNAi)机制,其中所述RNAi机制导致植物病原体中所述至少一个目标序列的下调的步骤包括,连续表达所述核酸结构并由此在所述植物中启动持续RNAi机制的步骤,其中所述持续RNAi机制使植物对所述植物病原体感染具有比野生型植物更大的抗性。
22.根据权利要求1所述的方法,还包括共表达至少一种辅助基因的步骤。
23.根据权利要求1所述的方法,还包括针对植物病原体中至少一种不同目标序列共表达至少一种其它siRNA分子的步骤。
24.根据权利要求22所述的方法,其中所述辅助基因选自:VrrA;SID1;SID2;AGOl;
AG02,AG07;YmdB;YmdB;Staufen;RDE-4;hlyA;Sec-和Tat-分泌信号肽;一种或多种细胞穿透肽(CPPs);Tat;触足肽;ACC脱酶;一种或多种韧皮部RNA转运蛋白;PP2-A1;PSRP1;
DRB1;DRB4;HEN1和STVl。
25.根据权利要求23所述的方法,其中所述共表达的辅助基因是从所述核酸结构和/或在所述基因修饰的内生细菌中转化的第二核酸结构。
26.根据权利要求5所述的方法,其中所述植物包含病原体感染的植物。
27.根据权利要求1所述的方法,其中所述植物包含未被所述植物病原体感染的植物。
28.根据权利要求9所述的方法,其中所述真菌植物病原体的所述一种目标序列选自:
在所述稻瘟病度中的MoABCl、MoMAC1及MoPMK1、Iug6、Iug9及Iug18、MoMpg1、MoEmpl、MoMhpl、MoMsp1、MC69和Slp1;在所述灰霉病菌中的Bcpgl和BMP1;所述柄锈菌属中的APK、亲环蛋白、磷酸酶调节亚基、分泌蛋白等;禾谷镰刀菌中的MAP1和MAP激酶gpmk1;尖孢镰刀菌中的MAP激酶、pg1、致病相关基因、分泌蛋白;小麦白粉病菌中的效应基因Avra10、致病相关基因、分泌蛋白;禾生球腔菌中的致病相关基因、MgSlt2,ABC转运蛋白基因MgAtr1和MgAtr2、分泌蛋白;炭疽病属中的CMK1和Clk1,致病相关基因蛋白质10、分泌蛋白;黑粉菌中的致病相关基因、Kpp2、ukc1、分泌蛋白;和亚麻锈菌中的致病相关基因、分泌蛋白。
29.根据权利要求1所述的方法,其中所述小抑制性核糖核酸(siRNA)被配置为下调植物病原体的至少一种必需基因,所述小抑制性核糖核酸(siRNA)具有一种或多种特异性RNA基序,所述RNA基序可掺入dsRNA以促进其通过植物韧皮部的传输。
30.一种向植物递送抑制性RNA分子的跨界系统,包括以下步骤:
-产生具有抑制RNaseIII活性的基因修饰内生细菌;
-用核酸结构转化所述基因修饰的内生细菌,所述核酸结构包含编码至少一种小抑制性核糖核酸(siRNA)的多核苷酸,所述多核苷酸被配置为下调植物病原体的至少一种必需基因;
-将所述基因修饰内生细菌引入植物;
-表达所述核酸结构足够时间以诱导所述植物中的RNA干扰(RNAi)机制,其中所述RNAi机制导致植物病原体中所述至少一个目标序列的下调。
31.根据权利要求30所述的向植物递送抑制性RNA分子的跨界系统,其中所述siRNA包含与所述植物病原体至少一种必需基因的目标序列完全或部分互补的一种或多种hpRNA。
32.根据权利要求31所述的向植物递送抑制性RNA分子的跨界系统,其中所述将基因修饰内生细菌引入植物的步骤包括选自下组的步骤:通过一次或多次浸泡、喷雾、注射、雾化释放、环境雾化释放、水源中的环境雾化释放、冻干、冷冻干燥、微胶囊化、干燥、在水性载体中、在溶液中、刷洗、敷料、滴涂和涂覆。
33.根据权利要求31所述的向植物递送抑制性RNA分子的跨界系统,其中所述植物是单子叶植物和/或双子叶植物。
34.根据权利要求33所述的向植物递送抑制性RNA分子的跨界系统,其中所述植物选自:谷物、玉米、小麦、水稻、大麦、燕麦、高粱、小米、向日葵、红花、棉花、大豆、菜籽油、苜蓿、拟南芥、大麻、土豆、芸苔、花生、烟草、热带水果及花卉、香蕉、浮萍、唐菖蒲、甘蔗、菠萝、红枣、洋葱、菠萝、腰果、开心果、鲜花、观赏植物、针叶树、落叶类、葡萄、柑橘、玫瑰、苹果、桃子、草莓、杏仁、咖啡、橡树、豆类、豆科植物、西瓜、南瓜、卷心菜、萝卜、芥末、仙人掌、山核桃、亚麻、红薯、大豆、椰子、鳄梨、甜菜、香瓜和蔬菜。
35.根据权利要求34所述的向植物递送抑制性RNA分子的跨界系统,其中所述植物病原体包含选自以下组的植物病原体:植物病毒;植物类病毒;真菌;害虫、食草动物和霉菌。
36.根据权利要求35所述的向植物递送抑制性RNA分子的跨界系统,其中所述植物病毒选自以下之一:烟草花叶病毒(TMV);番茄斑点枯萎病毒(TSWV);番茄黄叶卷曲病毒(TYLCV);黄瓜花叶病毒(CMV);马铃薯病毒Y(PVY);花椰菜花叶病毒(CaMV);非洲木薯花叶病毒(ACMV);梅痘病毒(PPV);雀麦花叶病毒(BMV);马铃薯病毒X(PVX);柑橘衰退病毒、大麦黄矮病毒、马铃薯卷叶病毒和番茄和丛生矮缩病毒。
37.根据权利要求36所述的向植物递送抑制性RNA分子的跨界系统,其中所述病毒植物病原体的至少一个必须基因选自:病毒关键区序列、病毒家族的保守序列及不同病毒家族成员间的保守序列。
38.根据权利要求37所述的向植物递送抑制性RNA分子的跨界系统,其中所述病毒植物病原体的必需基因选自:所述烟草花叶病毒中的复制酶基因、运动蛋白、外壳蛋白;所述番茄斑点枯萎病毒中的糖蛋白(GPs)、NSm蛋白、NSs蛋白、病毒RNA基因组片段L、M、S;所述番茄黄叶卷曲病毒中的V1、V2、C1、C2、C3、C4、VI蛋白;所述黄瓜花叶病毒中的la、2a2b蛋白、3a、外壳蛋白;所述马铃薯病毒Y中的PI、HC-Pro、P3、6kl、CI、6k2、NIa、Nib、CP;所述花椰菜花叶病毒中的运动蛋白、两种蚜虫传播因子(P2和/或P3)、衣壳蛋白前体(P4)、蛋白酶多蛋白前体、P5、P6蛋白;所述非洲木薯花叶病毒中的AVI、AV2、AC1、AC2、AC3、AC4、BCl、BV1;所述梅痘病毒中的PI、HC-Pro、P3、6k1、CI、6k2、NIa、Nib、CP;所述雀麦花叶病毒中的la、2a、运动蛋白、外壳蛋白;所述马铃薯病毒X中的复制酶、TGB1、TGB2、TGB3、外壳蛋白。
39.根据权利要求35所述的向植物递送抑制性RNA分子的跨界系统,其中所述真菌选自:稻瘟病菌;灰霉病菌;柄锈菌属;禾谷镰刀菌;尖孢镰刀菌;小麦白粉病菌;禾生球腔菌;
炭疽病属;黑粉菌;亚麻锈菌;大豆锈菌;立枯丝核菌。
40.根据权利要求39所述的向植物递送抑制性RNA分子的跨界系统,其中所述真菌植物病原体的至少一种必需基因选自:真菌必需基因的关键区序列、真菌基因家族的保守序列和不同真菌基因家族成员中的保守序列。
41.根据权利要求40所述的向植物递送抑制性RNA分子的跨界系统,其中所述真菌植物病原体的至少一种必需基因选自:在所述稻瘟病度中的MoABCl、MoMAC1及MoPMK1、Iug6、Iug9及Iug18、MoMpg1、MoEmpl、MoMhpl、MoMsp1、MC69和Slp1;在所述灰霉病菌中的Bcpgl和BMP1;所述柄锈菌属中的APK、亲环蛋白、钙调磷酸酶调节亚基、分泌蛋白等;禾谷镰刀菌中的MAP1和MAP激酶gpmk1;尖孢镰刀菌中的MAP激酶、pg1、致病相关基因、分泌蛋白;小麦白粉病菌中的效应基因Avra10、致病相关基因、分泌蛋白;禾生球腔菌中的致病相关基因、MgSlt2,ABC转运蛋白基因MgAtr1和MgAtr2、分泌蛋白;炭疽病属中的CMK1和Clk1,致病相关基因蛋白质10、分泌蛋白;黑粉菌中的致病相关基因、Kpp2、ukc1、分泌蛋白;和亚麻锈菌中的致病相关基因、分泌蛋白。
42.根据权利要求30所述的向植物递送抑制性RNA分子的跨界系统,其中所述核酸结构是质粒。
43.根据权利要求42所述的向植物递送抑制性RNA分子的跨界系统,其中所述质粒被修饰以包括来自质粒组的基因序列:pAD-WRKY-GHY1;PAD-ADH-GHY2;POXB-WRKY-GHY3;pOXB-ADH-GHY4;pAD-WRKY-GHY5;hpRNA pAD-ADH-GHY6;和hpRNA pAD-WRKY-GHY7。
44.根据权利要求42所述的向植物递送抑制性RNA分子的跨界系统,其中所述核酸结构包含编码至少一种小抑制性核糖核酸(siRNA)的多核苷酸,所述siRNA被配置为下调至少一种植物病原体的必需基因,并与启动子连接。
45.根据权利要求44所述的向植物递送抑制性RNA分子的跨界系统,其中所述启动子包含选自下组的启动子:非组成型启动子;诱导型启动子、病原体诱导型启动子;组织优选启动子;组织特异性启动子、植物特异性启动子或组成型启动子。
46.根据权利要求30所述的向植物递送抑制性RNA分子的跨界系统,其中所述具有抑制RNaseIII的基因修饰内生细菌选自:酸杆菌、放线菌、α-变形菌、装甲菌、拟杆菌、β-变形菌、δ-变形菌、厚壁菌、γ-变形菌、TM7、芽孢杆菌、大肠杆菌。
47.根据权利要求46所述的向植物递送抑制性RNA分子的跨界系统,其中所述基因修饰内生细菌是M-JM109-GHY2。
48.根据权利要求46所述的向植物递送抑制性RNA分子的跨界系统,其中所述基因修饰内生细菌是枯草芽孢杆菌CCB422。
49.根据权利要求46所述的向植物递送抑制性RNA分子的跨界系统,其中所述基因修饰内生细菌是大肠杆菌HT27或HT115。
50.根据权利要求30和49所述的向植物递送抑制性RNA分子的跨界系统,其中所述具有抑制RNaseIII的基因修饰内生细菌包含具有超囊泡活性的基因修饰内生细菌JC8031,和/或具有一种或多种营养缺陷的基因修饰内生细菌,所述营养缺陷足以增强与其他细菌的纳米管形成。
51.根据权利要求30所述的向植物递送抑制性RNA分子的跨界系统,其中所述siRNA在整个植物中迁移。
52.根据权利要求30所述的向植物递送抑制性RNA分子的跨界系统,其中所述表达所述核酸结构足够时间以诱导所述植物中的RNA干扰(RNAi)机制,其中所述RNAi机制导致植物病原体中所述至少一个目标序列的下调的步骤包括,包括连续表达所述核酸结构并由此在所述植物中启动持续RNAi机制的步骤,其中所述持续RNAi机制使植物对所述植物病原体感染具有比野生型植物更大的抗性。
52.根据权利要求30所述的向植物递送抑制性RNA分子的跨界系统,还包括共表达至少一种辅助基因的步骤。
53.根据权利要求52所述的向植物递送抑制性RNA分子的跨界系统,其中所述辅助基因选自:VrrA;SID1;SID2;AGOl;AG02,AG07;YmdB;YmdB;Staufen;RDE-4;hlyA;Sec-和Tat-分泌信号肽;一种或多种细胞穿透肽(CPPs);Tat;触角足肽;ACC脱氨酶;一种或多种韧皮部RNA转运蛋白;PP2-A1;PSRP1;DRB1;DRB4;HEN1和STVl。
54.根据权利要求30所述的向植物递送抑制性RNA分子的跨界系统,其中所述小抑制性核糖核酸(siRNA)被配置为下调植物病原体的至少一种必需基因,所述小抑制性核糖核酸(siRNA)具有一种或多种特异性RNA基序,所述RNA基序可掺入dsRNA以促进其通过植物韧皮部的传输。
55.一种抑制植物中病原体的方法,包括以下步骤:
-产生具有抑制RNaseIII活性的基因修饰内生细菌;和
-用核酸结构转化所述基因修饰的内生细菌,所述核酸结构包含编码至少一种小抑制性核糖核酸(siRNA)的多核苷酸,所述siRNA被配置为通过植物中RNA干扰(RNAi)机制的诱导下调植物病原体的至少一种必需基因;
-将所述基因修饰内生细菌引入植物。
56.一种评估对癌症受试者施用组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂疗法治疗的功效或有效性的方法,该方法包括比较:
-在时间t0从受试者获得的第一样品中测量的生物标记的表达水平,其中所述标记是选自表4中确定的组的生物标记;在时间tj从受试者获得的第二样品中的生物标记的水平;
和,
-其中第二样品中生物标记水平相对于第一样品的变化表明组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂治疗对于治疗受试者的癌症是有效的。
57.根据权利要求56所述的方法,其中所述比较在一定范围的时间内重复。
58.一种评估植物中RNA介导的病原体抑制效果的方法,该方法包括比较:
-确定在时间t0从植物获得的第一样品中测量的植物病原体靶基因的表达水平,
-产生抑制RNaseIII活性的基因修饰内生细菌,其中所述具有核酸结构的基因修饰内生细菌包含编码至少一种小抑制性核糖核酸(siRNA)的多核苷酸,所述小抑制性核糖核酸(siRNA)能够形成针对植物病原体中至少一个靶基因的双链RNA(dsRNA)或发夹(hpRNA);
-在时间t1将所述基因修饰的内生细菌引入植物;并且
-允许表达所述核酸结构以在所述植物中诱导RNA干扰(RNAi)机制,其中所述RNAi机制导致植物病原体中所述至少一种目标序列的下调;和
-确定在时间t2从植物获得的第一样品中测量的所述植物病原体靶基因的表达水平。
59.权利要求58所述的方法,其中所述比较在一定范围的时间内重复。
60.一种治疗病原体感染的植物的方法,包括以下步骤:
-引入有效量的具有抑制RNaseIII活性的基因修饰内生细菌,其中具有核酸结构的所述基因修饰的内生细菌包含包含编码至少一种小抑制性核糖核酸(siRNA)的多核苷酸,所述小抑制性核糖核酸(siRNA)能够形成针对植物病原体中至少一个目标序列的双链RNA(dsRNA)或发夹(hpRNA)。
60.一种产生抗虫植物的方法,包括以下步骤:
-产生具有抑制RNaseIII活性的基因修饰内生细菌;
-用核酸结构转化所述基因修饰的内生细菌,所述核酸结构包含编码至少一种小抑制性核糖核酸(siRNA)的多核苷酸,所述小抑制性核糖核酸(siRNA)能够形成针对害虫或食草动物中至少一个必须基因的双链RNA(dsRNA)或发夹(hpRNA);
-将所述基因修饰的内生细菌引入植物;
-表达所述核酸结构足够时间以诱导所述植物中的RNA干扰(RNAi)机制,其中所述RNAi机制导致针对害虫或食草动物中至少一种必需基因的hpRNA的dsRNA积累,所述害虫或食草动物具有由害虫和/或食草动物消耗的植物,使得针对害虫中至少一种必需基因的hpRNA的dsRNA诱导RNA干扰(RNAi)机制,导致在所述害虫和/或食草动物中至少一种必需基因的抑制。
61.根据权利要求60所述的方法,其中所述经基因修饰的内生细菌可定殖于害虫肠道。
62.根据权利要求60所述的方法,其中所述siRNA包含与昆虫的至少一个外骨骼基因的目标序列完全或部分互补的一种或多种hpRNA。
63.根据权利要求62所述的方法,其中所述病毒害虫或食草动物的至少一种必需基因选自害虫或食草动物的关键区序列、害虫或食草动物家族的保守序列以及不同害虫或草食动物家族成员之间的保守序列。
64.根据权利要求63的所述方法,其中所述具有抑制RNaseIII活性的基因修饰内生细菌是芽孢杆菌和/或大肠杆菌。
64.根据权利要求64所述的方法,其中所述基因修饰内生细菌选自:M-JM109-GHY2;枯草芽孢杆菌CCB422、HT27、HT115、JC8031。
65.根据权利要求64所述的方法,还包括共表达至少一种辅助基因的步骤。
66.根据权利要求65的方法,其中所述辅助基因选自:VrrA;SID1;SID2;AGOl;AG02,AG07;YmdB;YmdB;Staufen;RDE-4;hlyA;Sec-和Tat-分泌信号肽;一种或多种细胞穿透肽(CPPs);Tat;触角足肽;ACC脱氨酶;一种或多种韧皮部RNA转运蛋白;PP2-A1;PSRP1;DRB1;
DRB4;HEN1和STVl。

说明书全文

用于生物控制植物病原体的系统和方法

[0001] 本申请以2016年12月6日提交的美国临时申请号62/430,671为优先权。上述申请的整个说明书附图通过引用整体并入本文。
[0002] 序列表
[0003] 本申请包含序列表,该序列表已经以ASCII电子格式提交,并且其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

[0004] 本发明的领域一般涉及植物分子生物学和植物生物技术。更具体地,它涉及抑制靶基因表达或下调靶基因的结构和方法。本发明技术还涉及植物病原体,害虫和/或食草动物的生物控制。具体地,本发明可涉及通过经基因修饰的细菌递送抑制性RNA分子来生物控制疾病传播植物病原体的新技术,系统和方法。

背景技术

[0005] 据估计,全球共有2,500多种农作物的驯化涉及人工选择所需的性状,以提高收获产品的产量和质量。虽然在高投入环境中培育农艺目标已成功提高了全球作物生产,但它倾向于生产具有相对低平多样性的现代作物品种。这种减少的遗传多样性可能限制在非最佳条件下适合作物生产的品种的可获得性。在驯化植物中,由于选择了其他适宜的性状,植物的防御性状可能缺乏或表现得较弱。这对提高作物生产的可持续性提出了特殊的挑战,因为这表明现代品种在农药使用受限的低投入系统中表现不佳。虽然作物生产力在过去一个世纪中有所提高,但由杂草、害虫和疾病所造成的全球作物减产总量可高达40%(Oerke和Dehne,2004年)。在所有植被系统中,叶子、汁液和根系食草动物去除了超过20%的净植物生产力(Agrawal,2011)。尽管近几十年来农药使用量有所增加,但这些损失还是发生了(Oerke和Dehne,2004),这突显出有需要在不太依赖化学品投入的情况下,开发可持续的病原体和害虫控制方法。
[0006] 疾病控制通常是通过使用为抵抗多种疾病而培育的植物,以及通过作物轮作、使用无病原体种子、适当的种植日期和植物密度、控制田间水分和农药使用等植物栽培方法来实现和/或加强的。在大区域和许多作物物种中,据估计,在较发达的环境中,疾病通常每年减少10%的植物产量,但在较不发达的环境中,因疾病而造成的产量损失通常超过20%。虽然传统的栽培技术在农业产量方面取得了显著进步,但这种技术无法解决对植物种群的所有威胁。这种威胁在现金和农作物方面尤其严重。
[0007] 考虑到这些趋势,关注在植物病原体会直接威胁到世界各地种植者生产的食物、饲料纤维的质量和丰度越来越多。不同的方法可以使用在来预防、减轻或控制植物疾病。除了传统的农艺和园艺实践外,种植者往往被迫依赖化学肥料杀虫剂。在过去的100年中,这些农业方法对作物生产力和质量的显著提高作出了重大的贡献。然而,过度使用和滥用农用化学品造成的环境污染,以及一些农药反对者散布的恐慌,导致人们对在农业中使用农药的态度发生了相当大的变化。今天,化学农药的使用有着严格的规定,而从市场上消除可靠和有效的化学品存在着政治压力。此外,植物疾病在自然生态系统中的传播可能妨碍化学品的成功应用,因为这些应用可能必须达到的规模。
[0008] 解决杀虫剂和除草剂的使用和/或过度使用的一种方法是开发转基因植物。使用基因工程技术修饰转基因植物DNA。目的是为植物引入一种新的特性,该特性不是在物种中天然存在的。转基因植物可含有人工插入的一种或多种基因。插入的基因序列称为转基因,它可以来自不相关的植物或来自完全不同的物种。此类转基因植物的例子可能包括插入编码蛋白质的基因,例如抗病毒蛋白质复合物、杀虫剂或代谢途径酶,这些蛋白质可将前体如β-胡萝卜素转化为维生素A。在植物中插入基因组合的目的是使其尽可能有用和高效。然而,这种转基因植物系统也具有若干科学和实际缺点。
[0009] 在一个例子中,已经开发了转基因植物以通过表达基于Bt的毒素来控制特定的昆虫/害虫。已证明Bt杀虫蛋白的表达最初是有效的,该Bt杀虫蛋白有助于使易感昆虫中的肠上皮细胞膜透化。然而,这种方法仅限于某些特定作物来管理某些特定害虫,并且也存在威胁,因一些昆虫可能对Bt产生抗性。转基因植物系统的其他限制可能包括其选择和生成是困难且费时的。例如,转基因菌株的发育可能受到成功繁殖种子或允许转基因植物物种在任何给定环境中自然生长和扩散的能力的限制。此外,反对使用转基因植物也产生了巨大的社会压力。西方和欧洲国家的运动试图阻止在食品中使用转基因植物。此外,有机和非转基因产品的新市场在过去十年中同时出现,这使得非转基因植物能够以市场溢价出售。最后,作为一个例子,许多转基因植物受大型农业集团的控制,使转基因植物的种子供应受到限制,从而抑制它们在许多第三世界国家的广泛使用。
[0010] 为了解决某些局限性,植物性微生物,例如内生细菌等,可以用作有益基因的递送载体,以及对不需要的基因的遗传抑制,例如引起植物疾病的基因。植物可能在细胞内以及在其表面上包含许多有益细菌,包括根、叶和茎组织。与植物相关的内生和异位细菌包括以下亚类:酸杆菌(Acido bacteria)、放线菌(Actinobacteria)、α-变形菌(Alphaproteo bacteria)、装甲菌(Armatimonadetes)、拟杆菌(Bacteriodes)、β-变形菌(Betaproteobacteria)、δ-变形菌(Deltaproteobacteria)、厚壁菌(Firmicutes)、γ-变形菌(Grammaproteobacteria)、TM7、芽孢杆菌(Bacillus)、大肠杆菌(Escherichia)等。
[0011] 这些细菌中的许多可以在体外快速培养,并且可以进行基因工程来表达外源RNA分子,这些外源RNA分子可能通过目前表征不佳的跨界传递系统提供给植物(Baulcombe,2015;Kim等,2014;Arguel等,2012)。例如,已经证明番茄病原真菌可以将sRNA递送至植物,并且真菌sRNA可以通过脉管系统组织在整个植物中动员(Baulcombe,2015;Weiberg和Jin,
2015)。来自转基因植物的siRNA的跨界递送也已成功证明并用于控制摄取siRNA的线虫(Bakheti等,2005;Knip等,2014)。
[0012] 此外,为灭活蚊子色酸代谢的必需基因HKT,而分别在微藻细胞质和叶绿体中产生的siRNA和dsRNA的跨界递送,已被证明可抑制3-羟基犬尿氨酸转氨酶(“HKT”)的表达并导致蚊子死亡率升高(Kumar等,2015)。然而,与真核生物相反,细菌不具有能够从dsRNA前体产生siRNA的Dicer/RISC复合物。然而,如上所述,这些系统在其应用和商业可行性方面仍然知之甚少且效率低下。因此,抑制性RNA分子向植物细菌递送从而控制以植物为食的病原体、害虫和食草动物并不令人惊讶。例如,一些人试图将dsRNA或sRNA直接应用于植物以控制基因表达,但是由于降解,生产RNA的成本很高并且RNA的寿命有限。(参见,Nature Plants 3,Article number:16207(2017)doi:10.1038/nplants.2016.207)相反,这里描述的新系统导致dsRNA或sRNA的连续产生,而不需要明显的成本,因为抑制性RNA是由转基因细菌制成的。
[0013] 上述关于通过有效的细菌递送抑制性RNA分子来生物控制植物和/或食草动物种群中流行性疾病的问题,可能代表了长期以来对有效和经济地这一问题的需求。尽管可能已经有了实施要素,但在某种程度上可能缺乏满足这种需求的实际尝试。这可能是由于本领域普通技术人员未能充分了解或理解所涉及的问题和挑战的性质。
[0014] 由于缺乏理解,满足这些长期需求的尝试可能无法有效地解决这里发现的一个或多个问题或挑战。这些尝试甚至可能导致本发明技术所采取的技术方向偏离,甚至可能导致本发明技术的成果在一定程度上被认为是本领域某些人所采取的方法的意外结果。如下面将更详细讨论的,本发明的技术克服了传统植物病原体控制系统的局限性,同时满足了真正有效的载体生物控制策略的目标。

发明内容

[0015] 一般的,本发明的技术涉及控制植物病原体和害虫的新策略,包括植物病原体、植物病毒、真菌病原体、昆虫害虫等。具体地,本发明可包括用于选择植物病原体和食草动物的生物控制的新技术、系统和方法。
[0016] 在一些实施例中,本发明涉及与病毒基因组同源的抑制性RNA的新型跨界递送,其有效地下调或消除病毒蛋白的病毒复制和翻译。
[0017] 一个优选的实施例可包括一种发夹RNA/dsRNA分子的新型跨界递送,其对靶向病原体编码RNA有着降解作用,导致编码蛋白质积累水平的降低。这种新型跨界递送可以通过基因修饰的内生细菌感染植物来完成,该基因修饰的内生细菌携带编码与病原体编码或调节性RNA序列同源的调节性dsRNA的核苷酸结构。
[0018] 另一个优选的实施例可包括靶向病毒病原体编码蛋白质的发夹RNA的新型跨界递送,其导致病毒蛋白质积累水平的降低。这种新型跨界递送可以通过基因修饰的内生细菌感染植物来完成,该基因修饰的内生细菌携带编码与目标病原体蛋白质同源的发夹RNA的核苷酸结构。
[0019] 另一个优选的实施例可包括靶向真菌病原体编码蛋白质的发夹RNA的新型跨界递送,其导致真菌蛋白质积累水平的降低。这种新型跨界递送可以通过基因修饰的内生细菌感染植物来完成,该基因修饰的内生细菌携带编码与目标病原体蛋白质同源的发夹RNA的核苷酸结构。
[0020] 一个优选的实施例可包括靶向有害生物编码蛋白质的发夹RNA的新型跨界递送,其导致病毒蛋白质积累水平的降低。这种新型跨界递送可以通过基因修饰的内生细菌感染植物来实现,该基因修饰的内生细菌携带编码同源或针对目标病原体蛋白质的发夹RNA的核苷酸结构。
[0021] 在一个优选的实施例中,本发明可以包括通过引入基因工程微生物使用新型跨界机制来控制植物传播的疾病因子的创新系统和策略,从而使植物病原体丧失能力、潜在地杀死和/或防止复制。该基因工程微生物可以靶向失活病原体中参与繁殖、致病性和/或一般代谢的特定靶基因,其使用抑制性RNA分子如hpRNA,dsRNA,shRNA,siRNA或microRNAs,,这些RNA分子的表达可导致靶基因的靶mRNA的周转。感兴趣的独特靶向基因的实例包括病毒外壳蛋白,真菌细胞壁基因,昆虫外骨骼组分基因和真菌和昆虫中代谢基因的物种特异性独特mRNA靶。
[0022] 其他实施例包括抑制性RNA分子,例如hpRNA,dsRNA,shRNA,siRNA和微小RNA,在工程内生细菌中的表达,该工程内生细菌可在植物根、茎、叶和生殖器官中发现。在该实施例中,本发明的技术可以包括用于敲除必需或其他靶向植物病原体和/或食草动物基因的各种跨界机制。在某些实施例中,这可以通过将工程微生物引入表达特定的抑制性RNA分子的植物中来实现,所述特定的抑制性RNA分子可以下调致病性或繁殖等所需或必需的目标植物、病原体和/或食草动物基因。本发明技术的其他实施例包括具有各种启动子和其他遗传元件的遗传结构,例如质粒等,以允许内生细菌、植物和/或食草动物系统中特定的抑制性RNA分子和其他蛋白质的靶向水平表达。
[0023] 根据一个方面,本发明提供了通过植物细胞中的序列同源性靶向下调病原体基因的方法和用于该方法的核酸结构,以及用于核酸结构的抑制性RNA多核苷酸,例如作为hpRNA或退火的dsRNA。该方法包括将能够产生抑制性RNA的核酸结构并在足够的时间内表达该核酸结构以产生siRNA(小干扰RNA)或微小RNA(miRNA),其中siRNA/miRNA抑制目标病原体基因或序列的表达。miRNA结构包含编码能够形成双链RNA(dsRNA)或发夹(hpRNA)的修饰RNA前体的多核苷酸,其中修饰RNA前体包含修饰的miRNA和与修饰的miRNA互补的序列,其中修饰miRNA是被修饰为(i)与目标序列完全或部分互补的miRNA。如本领域众所周知的,pre-miRNA形成发夹,在某些情况下,双链区可以非常短,例如,长度不超过21-25bp。核酸结构可以进一步包含与多核苷酸可操作地连接的启动子。
[0024] 在一些实施例中,如下文更详细描述的,细胞可以是植物细胞,单子叶植物或双子叶植物,包括但不限于玉米、小麦、水稻、大麦、燕麦、高粱、小米、向日葵、红花、花、大豆、菜籽油、苜蓿、拟南芥。一些实施例可以包括本文所述的植物,也可以是特定的双子叶作物,例如苹果、葡萄、柑橘、梨、桃、李子、桔子、柠檬、酸橙、葡萄柚、石榴、橄榄、花生、烟草等。并且,所述植物可以是园艺植物,例如玫瑰、万寿菊、报春花、山茱萸、紫罗兰、天竺葵等。在其他实施例中,所述植物可以是烟草,如本塞姆氏烟草,烟草。下面提供了其他示例。启动子可以是病原体诱导启动子或其他诱导启动子。修饰的miRNA与靶RNA结合导致靶RNA切割。靶RNA的靶序列可以是基因的非编码未翻译区、编码序列、内含子或剪接位点。
[0025] 根据另一方面,本发明提供了一种编码修饰植物miRNA或siRNA前体的分离多核苷酸,该修饰前体能够形成dsRNA或发夹,并且包括修饰的miRNA和与所述修饰的miRNA互补的序列,其中所述修饰的miRNA是修饰为(i)与目标序列完全或部分互补的miRNA。多核苷酸的表达产生一个mRNA前体,其在宿主细胞中加工以提供抑制靶序列表达的成熟mRNA。抑制性RNA多核苷酸可由核酸结构(例如质粒)形成,其可通过基因修饰的微生物(例如内生细菌)或中和的致病细菌递送至植物。核酸结构可进一步包含可操作地连接到多核苷酸的启动子。启动子可以是病原体诱导启动子或其他诱导启动子。修饰mRNA与靶RNA结合导致靶RNA切割。靶RNA的靶序列可以是基因的非编码未翻译区、编码序列、非编码序列或剪接位点。
[0026] 根据另一方面,本发明提供用于抑制多种靶序列的抑制性RNA核酸结构。核酸结构包含至少两个且最多45个或更多个多核苷酸,每个多核苷酸编码能够形成dsRNA或发夹的miRNA前体。如本文所述,每个miRNA基本上与靶标互补或被修饰为与靶标互补。在一些实施例中,每个编码前体miRNA结构中的每个多核苷酸分别置于单一启动子的控制下;在一些实施例中,编码前体miRNA的多个多核苷酸可被操作地连接在一起,使得它们可以置于单个启动子的控制下。启动子可以与多个miRNA结构可操作地连接,或者它可以与单个启动子可操作地连接。启动子可以是病原体诱导型启动子或其他诱导型启动子。在一些实施例中,多个多核苷酸彼此连接以便在表达时形成单个转录物。多核苷酸在核酸结构中的表达产生多个miRNA前体,其在宿主细胞中加工以提供多个成熟的miRNA,每个miRNA都抑制靶序列的表达。在一个实施例中,每个成熟的miRNA与每个靶RNA的结合导致每个靶RNA的切割。靶RNA的靶序列可以是基因的非编码非翻译区、编码序列、基因的非编码非翻译区、非编码序列或剪接位点。抑制性RNA多核苷酸可以由核酸结构(例如质粒)形成,其可以通过基因修饰的微生物(例如内生细菌)或中和的致病细菌递送至植物。
[0027] 根据另一方面,本发明提供了用于通过基因修饰的细菌将抑制性RNA分子递送至植物细胞的方法和组合物。这种基因修饰的细菌可包括基因修饰以有效且稳定地产生抑制性RNA分子,例如dsRNA和hpRNA。在一些实施例中,这种经基因修饰的细菌可能已经被修饰以具有降低或没有可以降解细菌中存在的dsRNA的RNA酶III活性。在一些实施例中,这些基因修饰的细菌可以被修饰为包括RNA酶III的敲除,或表达具有降低或没有酶活性的突变型RNA酶III。
[0028] 在某些实施例中,组合物通过编码与靶序列区域具有实质性互补的抑制RNA来选择性地抑制靶基因的表达。mRNA/siRNA在核酸结构中提供,当转录成RNA时,预测其形成发夹结构,由细胞加工以生成成熟的小RNA/siRNA,然后抑制靶基因或序列的表达,如下文所述。
[0029] 在其他实施例中,提供核酸结构以编码任何特定靶病原体基因的抑制性RNA。例如,这可以编码在例如质粒上,该质粒可以通过能够在植物细胞中或周围定殖的基因修饰细菌表达,并且表达抑制性RNA并将其递送至植物细胞用于miRNA加工,从而抑制靶病原体基因,如本文所述。可以将任何抑制性RNA插入到结构中,使得编码的抑制性RNA选择性地靶向并抑制靶病原体基因。
[0030] 在附加实施例中,提供抑制靶序列的方法。该方法采用上述结构,其中将抑制性RNA分子设计为目标序列的一个区域,并插入到结构中,如细菌质粒。例如,通过内生细菌引入细胞后,产生细菌内的miRNA并将其递送至植物细胞,并抑制靶序列的表达,如本文所述。在一些实施例中,基因修饰细菌可通过选择或遗传操作超囊泡化来表现。在一个特定实施例中,这种超囊泡化可能有助于细菌质粒产生的抑制性RNA分子有效转运到周围细胞、细胞表面或其他细胞植物结构中。
[0031] 在某一实施例中,靶基因或序列可以是内源性植物基因或异源基因。靶基因也可以是来自植物病原体的基因,例如致病细菌或病毒、线虫、食草动物、昆虫或霉菌或真菌。提供了一种包含结构和/或miRNA的植物、细胞和种子。通常,细胞是来自植物的细胞,但也考虑到其他真核细胞,包括但不限于酵母、昆虫、线虫或动物细胞。植物细胞包括单子叶植物和双子叶植物的细胞。本发明还提供了包含结构和/或miRNA的植物和种子。还提供了包含结构的病毒和原核细胞。
[0032] 在一些实施例中,靶基因或序列(术语通常可互换)选自植物病原体。包含针对靶基因或病原体的抑制性RNA分子的植物或细胞预期对病原体的敏感性降低和/或抗性增加。在一些实施例中,抑制性RNA分子由核酸结构编码,例如细菌质粒进一步在内生细菌中表达并包含可操作连接的启动子。在一些实施例中,启动子是病原体诱导型启动子。
[0033] 本发明的一个目的包括开发细菌dsRNA稳定化和递送系统以阻断植物中的靶基因表达和病毒复制。据了解,dsRNA产生和向植物的递送是涉及dsRNA生物发生、输出、稳定、导入宿主和调节病原体复制失活的多组分过程。
[0034] 本发明的一个目的包括增强dsRNA从细菌向植物宿主细胞的转移的系统和方法。在某些实施例中,这可包括使用细菌菌株和辅助基因增强dsRNA的产生、稳定、输出和/或递送。例如,某些类型的细菌已经开发出多种分子分泌系统,以使包括毒素和蛋白质在内的各种分子能够进入宿主生物体。下面描述了六种不同的细菌分泌系统。这六种分泌系统具有共同的和独特的作用模式。II型和V型分泌系统是两个步骤的过程,其中蛋白质首先通过细菌的内膜(IM)然后通过外膜(OM)运输。为了通过I型,III型和IV型分泌系统的分泌,将材料直接转移到细胞外环境或宿主细胞中。III型系统是病原菌对因子转运的特异性系统,包括直接注入宿主细胞。独特的VI型分泌系统使细菌能够将大量复杂的蛋白质和脂质分泌到由细菌外膜形成的细胞外囊泡中的细胞外环境中。然后这些囊泡与宿主细胞融合以递送它们的货物。
[0035] 本发明的目的、优点和新颖特征以及进一步的适用范围将部分地在下面的详细描述中结合附图阐述,并且部分地对于本领域技术人员而言是显而易见的。在检查以下内容时,或者可以通过实践本发明来学习。借助于所附权利要求中特别指出的手段和组合,可以实现和获得本发明的目的和优点。

附图说明

[0036] 图1:hpRNA载体pAD-WRKY-GHY1的图谱。
[0037] 图2:hpRNA载体pAD-ADH-GHY2的图谱。
[0038] 图3:hpRNA载体pOXB-WRKY-GHY3的图谱。
[0039] 图4:hpRNA pOXB-ADH-GHY4的图谱。
[0040] 图5:hpRNA pAD-WRKY-GHY5的图谱。
[0041] 图6:hpRNA pAD-ADH-GHY6的图谱
[0042] 图7:hpRNA pAD-WRKY-GHY7的图谱。
[0043] 图8:PCR分析以验证RNasell1突变体的成功构建。
[0044] 图9:培状芽胞杆菌53522菌株的识别。泳道M:lkb梯状条带。泳道1:用XhoI消化PminiT-16s rRNA。泳道2:用XhoI消化PminiT-23s rRNA。泳道3:用XhoI消化PminiT-motB。泳道4:用XhoI消化PminiT-内切葡聚糖酶。泳道5:用XhoI消化PminiT-rncA。
[0045] 图10:7dpi后烟草渗入的症状。(At:根癌农杆菌;TMV:pJL-TRBOG;MJM109:M-JM109-GHY2(RNasell1突变体,无抗生素);GHY5:pAD-WRKY-GHY5;GHY6:pAD-ADH-GHY6;GHY3:pOXB-WRKY-GHY3;GHY4:pOXB-ADH-GHY4)
[0046] 图11a:在紫外线照射健康和渗透的烟草叶片时检测到的症状和GFP信号
[0047] 图l1b:7dpi紫外线照射下烟草的TMV-GFP信号。
[0048] 图11c:在7dpi的紫外线照射下,由M-JM109-GHY2/pAD-WRKY-GHY1处理的烟草的TMV-GFP信号。
[0049] 图12:显示hpRNA效率的时间过程图像。抑制TMV编码的GFP信号在烟草植物中的传播。
[0050] 图13:在烟草中用蜡状芽孢杆菌CCB422/pAD-WRKY-GHY5进行烟草浸润。
[0051] 图14:具有hpRNA的超囊泡大肠杆菌菌株HT27抑制本塞姆氏烟草全叶浸润中At/TMV信号的扩散。
[0052] 图15:hpRNA介导的GFP信号在模式植物生物体中抑制效率的时间进程演示。
[0053] 图16:siRNA迁移的症状限制了TMV-GFP在7dpi时通过叶片结构的扩散。
[0054] 图17:MJM1 09-GHY2/pAD-WRKY-GHY5衍生的siRNA限制了烟草植物模型中TMV-GFP信号的扩散。
[0055] 图18a-b:siRNA限制模型烟草植物中TMV-GFP信号的扩散。
[0056] 图19a-c:BX53522/pAD43-25和Bc53522/pAD-WRKY-GFfY5在自然光和暴露于异硫氰酸荧光素(FITC)下放大4倍的菌落。A)在自然光下以4倍放大倍数观察到的Bc53522/pAD43-25菌落;B)暴露于FITC下以4倍放大倍数观察到的Bc53522/pAD43-25菌落,显示绿色信号;C)在自然光下以4倍放大倍数观察到的Bc53522/pAD-WRKY-GHY5菌落;D)暴露于FITC下以4倍放大倍数观察到的Bc53522/pAD-WRKY-GETY5的菌落,显示无信号。
[0057] 图20a-c:示例性烟草植物中蜡状芽孢杆菌53522的定殖。A)对烟草接种的蜡状芽孢杆菌没有表现出对植物的有害症状。B)紫外线下的GFP信号。C)荧光立体显微镜下植物不同区域的GFP信号。
[0058] 图21:靶向病毒编码的GFP的发夹RNA的跨界递送导致病毒蛋白质积累水平的降低。A)枯草芽孢杆菌CCB422介导的hpRNA跨界递送成功触发宿主的RNAi反应,导致烟草植物中病毒GFP积累的显著减少。B)TMV-GFP感染和TMV-GFP+pAD-WRKY-GHY5(CCB422)浸润样品中GFP蛋白水平的量化。GFP信号归一化为RBCL。TMV-GFP复制#1用作参考C)病毒GFP蛋白在与编码hpRNA触发剂的HT27共浸润的TMV样品中不可检测。来自免疫检测的GFP3c信号。RBCL作为上样对照(旁氏染色)。
[0059] 图22:通过HT27/pAD-WRKY-GHY5监测TMV-GFPmRNA的抑制的qPCR。关于用表达hpRNA的细菌感染的植物中的GFP mRNA抑制的qPCR数据与对照(仅TMV-GFP,TMV-GFP加无hpRNA的细菌)。
[0060] 表格和序列表也在此处提供,并且是说明书的一部分。

具体实施方式

[0061] 本发明包括多个方面,可以以不同的方式组合。提供以下描述以列出元件并描述本发明的一些实施例。这些元件与初始实施例一起列出,但是应理解,它们可以以任何方式和任何数量组合以产生另外的实施例。不应将各种描述的实施例和优选实施例解释为仅将本发明限定于明确描述的系统、技术和应用。此外,应理解该描述支持并包含所有不同实施例、系统、技术、方法、装置和应用的描述和权利要求,其包括任何数量的公开元件、单独的每个元件、以及在本申请或后续申请中所有元件的任何和所有不同排列和组合。
[0062] 本发明公开了用于植物病原体、害虫侵扰和食草动物(所有这些通常统称为植物病原体)的基因控制的方法和组合物。还提供了鉴定植物病原体、害虫和/或草食动物生命周期中所需的一个或多个基因的方法,该基因用作增强siRNA介导干扰的靶基因。编码抑制性RNA分子的DNA质粒载体可用于抑制一个或多个对植物病原体生长、存活、发育和/或繁殖所必需的靶基因。本发明还描述了可被设计成有效感染、产生和递送这种抑制性RNA分子的基因修饰内生细菌或其他微生物。
[0063] 在一些实施例中,本发明提供了通过核酸分子对靶基因转录后抑制表达或抑制的方法,该核酸分子与植物病原体中靶基因的编码或非编码序列互补。在这些和进一步实施例中,害虫或草食动物可以摄取一个或多个从核酸分子的全部或部分转录的dsRNA、siRNA、miRNA和/或hpRNA分子,这些分子与靶基因的编码或非编码序列互补,从而提供植物保护作用。
[0064] 本发明技术的一个实施例可包括通过基因工程微生物感染将抑制性RNA分子引入目标植物细胞的系统和方法。在一个实施例中,本发明可提供可在植物细胞内表达一种或多种抑制性RNA分子的基因工程微生物,例如细菌,真菌甚至病毒。在某些实施例中,此类抑制性RNA分子可以启动生物过程,其中抑制性RNA分子通常通过导致细胞内特定靶向mRNA分子的破坏来抑制或敲低基因表达。其他实施例可以将抑制性RNA分子引入植物系统,其抑制植物发病机理所必需的基因。此类实施例可包括将抑制性RNA分子引入植物系统中,其可靶向病毒外壳蛋白,真菌细胞壁基因,靶向抑制参与DNA和RNA复制和产生的基因的独特的物种特异性基因序列,昆虫外骨骼成分基因,物种特异性代谢基因和食草动物。
[0065] 其他优选的实施例可包括抑制性RNA分子的改进递送系统,例如通过使用稳定因子,例如稳定蛋白质等。本发明技术的另一个优选实施例可以包括改进的系统,其通过共同递送smRNA或dsRNA前体稳定蛋白或hpRNA/dsRNA细胞内转运蛋白来促进植物细胞内抑制性RNA分子的递送。在一个实施例中,可以将特异性RNA基序掺入dsRNA中,其可促进其通过例如植物韧皮部的递送,或直接将smRNA加载至特定效应复合物。其他实施例可包括基因修饰的微生物,其可包括可进一步共表达具有加工酶活性的特定蛋白质的遗传结构。
[0066] 其他类似的实施例可以包括将微生物引入植物系统中,其可以表达或甚至过表达可以增强调动抑制性RNA分子和/或基因(其可激活可以靶向致病途径的次级下游宿主基因)的各种基因。
[0067] 本发明的一个优选实施例可以是提供叶和根内生及外生细菌,其可进一步经基因工程来表达抑制性RNA分子,例如与病原体基因组同源的dsRNA、shRNA、hpRNA(在一些实施例中,其可包含来自位于dsRNA发夹环的目标生物的内含子)、siRNA和microRNA,并再次靶向负责生长、繁殖、代谢或致病性的关键或必需基因。这些抑制性RNA分子可通过宿主DICER/RISC复合物介导的-21-22核苷酸siRNA的产生,来灭活和/或敲除这些必须的靶向基因在植物病毒、真菌和昆虫病原体和害虫中的表达。这个过程通常被称为RNA干扰或RNAi。
[0068] 在本文中使用的RNA干扰(RNAi)是一种生物机制,其导致由双链RNA(dsRNA)分子触发(例如由hpRNA提供)的转录后基因沉默(PTG),以阻止特定基因的表达。例如,在一个优选实施例中,可以实现RNA干扰,因为短hpRNA分子可直接进入细胞质,一起退火形成dsRNA,然后被Dicer酶切割成短片段。这种酶Dicer可以将dsRNA加工成在3'末端有2个核苷酸的突出端的21-22个核苷酸片段,小干扰RNA(siRNAs)。siRNA的反义链特异于核酸内切酶蛋白复合物(RNA诱导沉默复合物,RISC),随后靶向同源RNA并将其在特定位置降解,导致蛋白质表达的敲低。
[0069] 可将hpRNA、dsRNA、shRNA、siRNA和microRNA种类递送至植物的内生细菌包括亚中的细菌:酸杆菌(Acidobacteria)、放线菌(Actinobacteria)、α-变形杆菌(Alphaproteobacteria)、装甲菌(Armatimonadetes)、拟杆菌(Bacteriodes)、β-变形菌(Betaproteobacteria)、δ-变形菌(Deltaproteobacteria)、厚壁菌(Firmicutes)、γ-变形菌(Grammaproteobacteria)、TM7、芽孢杆菌(Bacillus)、大肠杆菌(Escherichia)等。在一个优选实施例中,内源性、内生性或任何可能感染或以其他方式定殖植物或生活在植物表面叶、茎或根中的细菌,可通过人工制造的遗传结构(例如可产生抑制性RNA分子的质粒)转化。这种质粒可以通过缀合作用被构建为可转移到其他细菌,在某些情况下,缀合作用允许广泛的环境接种,以及植物后代和摄取植物物质的任何害虫或草食动物之间的垂直传播作为实例。
[0070] 在该实施例中,此类结构可包括转录调节部分,例如启动子、终止子、共激活子和共抑制子以及可在原核和真核系统中调节的类似控制元件。此类系统可以允许控制系统内表达的抑制性RNA分子的类型、时间和量。其他实施例可包括可通过外部因素诱导的基因结构,例如植物细胞内特定蛋白质或化合物的存在,例如响应于植物病原体产生的应激相关蛋白质,甚至包括植物病原体等产生的蛋白质和其他前体化合物。
[0071] 在另一个优选的实施例中,本发明的技术可以包括系统和方法,其中产生一种或多种抑制性RNA分子基因转化的叶和根内生和外生细菌可以被递送至目标植物门和/或物种,其中抑制性RNA分子可以灭活和/或敲低靶病毒、真菌以及昆虫病原体和食草动物的表达。在某些实施例中,可以使用选择的微生物,例如已知对一种门或甚至某个物种特异的细菌。在另一个实施例中,抑制性RNA分子的转录激活和促进可取决于某些因子的存在,该因子可能对一种门,或甚至某种植物或食草动物物种具有特异性。另外的实施例可以包括增加的毒力因子,例如表面蛋白的表达或抑制以及特定植物门或甚至特定植物物种的输入因子,以及可能的抑制细菌因子,例如表面或其他副产物蛋白质,其例如可以通过可以使宿主植物细胞发起免疫型防御的细胞内宿主受体来识别。
[0072] 在另一个优选的实施例中,本发明的技术可以包括用于跨界递送病原体的系统和方法以及可进一步由一种或多种蛋白质或蛋白质复合物稳定的物种特异性抑制性RNA分子。在某些实施例中,此类稳定蛋白可包括选自植物RNA病毒、番茄丛矮病毒的P19蛋白,该番茄丛矮病毒有助于抑制植物的RNA沉默反应。在某些实施例中,例如P19蛋白通常作为二聚体可以识别并结合siRNA。以这种方式,P19蛋白可以隔离siRNA,无论是外源的还是内源的,从而阻止siRNA加载到Argonaute蛋白中并形成RISC(RNA诱导的沉默复合物)。
[0073] 在另一个优选的实施例中,本发明的技术可以包括将RNA动员基序掺入抑制性RNA分子,例如dsRNA,以促进细菌合成的RNA通过植物韧皮部的传递,并且可以在细菌中与靶向灭活病原体和食草动物必需基因的物种RNA共表达。例如,胞间连丝和韧皮部形成简单的网络,其介导直接的细胞间通信和整个植物的运输。选择的内源RNA,病毒RNA,通过该网络避免特定细胞或器官之间的通信。如上所述,在一个优选的实施例中,可以产生抑制性RNA分子以含有与细胞因子相互作用从而促进跨细胞边界运输的序列/结构基序。
[0074] 在某些实施例中,表达不同序列/结构基序的多种抑制性RNA分子可同时表达。在该实施例中,不同的序列/结构基序可以允许识别特定基序,从而允许抑制性RNA分子跨多个特定细胞边界和/或细胞类型的多方向运输。此类基序可进一步配置为在某些门和/或物种内表现出特定活性或非活性。
[0075] 本发明技术的又一个实施例可以包括开发具有降低RNase III表达或灭活RNase III功能或活性(通常称为抑制活性)的新型细菌菌株。RNA酶III表达和/或活性的这种降低或失活可以抑制或降低RNA酶III介导的dsRNA加工成较小的RNA种类。
[0076] 另外的实施例可包括过表达RNase III的新型细菌菌株,从而增强dsRNA对较小RNA种类的加工。本发明的技术还可以包括开发细菌表达编码病毒siRNA的dsRNA的系统和方法,以触发次级宿主(植物)RNA依赖性RNA聚合酶依赖性表达次级siRNA,从而靶向病毒和真菌失活。上述系统中的每一个可以体现在遗传结构中,所述遗传结构可以包括转录调节元件,例如启动子、终止子、共激活剂和共抑制子以及可以在原核和真核系统中调节的其他控制元件。此类系统可以允许控制在系统内表达的例如RNA酶III或其他蛋白质的类型、时间和量。另外的实施例可包括可通过外部因素诱导的遗传结构,例如植物细胞内特定蛋白质或化合物的存在,例如响应植物病原体产生的应激相关蛋白质或甚至由植物病原体产生的蛋白质和其他前体化合物等。
[0077] 本发明技术的另一个实施例可以包括促进植物宿主、外源或基因修饰的细菌菌株过表达的系统和方法,该细菌菌株具有已知可增强调动siRNA的基因。例如,如表5-8和下文所示,在下面第一列中鉴定的某些蛋白质的过表达可以增强整个受试植物或其他系统中的siRNA动员。
[0078] 在一个优选的实施例中,本发明技术的另外的实施例可以一种新型系统,其跨界递送和表达与病原体基因组/基因同源的hpRNA,并且有效地下调或消除病原体生长、新陈代谢或致病性等所必需的必需蛋白质的病毒复制和翻译。
[0079] 本发明技术另外的实施例可以包括一种新型系统,其在植物根、茎、叶和生殖器官中发现的工程内生细菌中跨界递送和表达抑制性RNA分子,例如dsRNA、shRNA、siRNA和microRNA。在该实施例中,本发明的技术可以包括用于敲除靶基因的各种跨界机制,例如,其可以允许增强耐寒、耐热、耐盐、耐干旱和非生物胁迫以及整合各种植物物种的新特性,包括昆虫/害虫/病原体抗性和增强的营养输出,仅举几例。
[0080] 在另一个优选的实施例中,内生细菌的RNase III突变体抑制感染了病原体的植物中的蛋白质,该内生细菌含有编码靶向抑制该病原体蛋白质的发夹dsRNA的质粒,该蛋白质表达病原体基因组编码的病原体基因。
[0081] 一个优选的实施例包括dsRNA的内生细菌递送,在植物中加工成siRNA并抑制一种或多种病原体编码的基因。在另一个优选的实施例中,dsRNA的内生细菌递送可包括不含或抑制RNase III的细菌RNase III突变体,其含有编码发夹dsRNA的质粒,靶向抑制可抑制感染所述病原体的植物中的所述蛋白质的病原体蛋白。
[0082] 本发明的一个实施例提供了通过引入一种或多种基因修饰的细菌来增强植物对植物病原体如病毒和真菌疾病的抗性的方法,所述细菌可天然地定殖该目标植物,编码或干扰本文所述的RNA分子,使得含有异源DNA的植物产生干扰RNA分子,例如hpRNA,并且该干扰RNA分子能杀死目标植物病原体,或抑制一种或多种目标植物的致病或关键基因的表达。
[0083] 另一个实施例提供了增强植物对病毒性疾病的抗性的方法,其中植物对目标病毒病的抗性大于野生型植物对目标病毒病的抗性。另一个实施例提供了增强植物对害虫的抗性的方法,其中植物对目标害虫的抗性大于野生型植物对目标害虫的抗性。另一个实施例提供了增强植物对食草动物的抗性的方法,其中植物对目标食草动物的抗性大于野生型植物对目标食草动物的抗性。
[0084] 本发明人证明的另一个实施例可包括产生病原体抗性植物。在该优选实施例中,通过宿主的RNAi机制靶向病原体的必需RNA转录物可导致必需的病原体RNA降解,因此不能将病原体的必需mRNA转化为蛋白质。在该实施例中,通过新的跨界递送抑制性RNA分子(例如与病原体编码的蛋白质同源的发夹RNA)来增强植物宿主的RNAi防御,可通过触发植物宿主中的smRNA的生源而导致病原体编码的蛋白质积累的丧失或减少,最终赋予对病原体感染的抗性。
[0085] 本发明人证明的另一个实施例可包括产生病毒病原体抗性植物。在该优选实施例中,植物可以被内生细菌细菌感染,产生与必需病毒编码蛋白同源的hpRNA。这些hpRNA转录物可能由宿主的RNAi机制加工,导致必需的病毒RNA降解,因此无法将病毒病原体的必需mRNA转化为蛋白质。在该实施例中,通过新的跨界递送抑制性RNA分子(例如与病毒编码的蛋白质同源的发夹RNA)来增强植物宿主的RNAi防御可以通过触发植物宿主中的smRNA生物发生,从而导致病毒编码累积的丧失或减少,最终赋予对病原体感染的抗性。
[0086] 在一个实施例中,本发明可包括使用蜡状芽孢杆菌作为表达质粒的内生细菌,该质粒编码靶向抑制植物细胞中表达的病原体蛋白的hpRNA。在一个实施例中,该蜡状芽孢杆菌菌株可以被基因修饰为RNase III缺陷,其中缺陷可能意味着RNase III表达降低或RNase III功能失活。在优选的实施例中,该菌株可包括如本文所述的菌株53522。
[0087] 在一个实施例中,本发明可以包括使用枯草芽孢杆菌作为表达质粒的内生细菌,所述质粒编码靶向抑制植物细胞中表达的病原体蛋白的hpRNA。在一个实施例中,该枯草芽孢杆菌菌株可以被基因修饰为RNase III缺陷。在一个优选的实施例中,缺陷可能意味着RNase III表达降低,或RNase III功能失活,该菌株可包括如本文所述的菌株CCB422。
[0088] 在一个实施例中,本发明可包括使用大肠杆菌作为表达质粒的内生细菌,该质粒编码靶向抑制植物细胞中表达病原体蛋白的hpRNA。在一个实施例中,该菌株可以被基因修饰为RNase缺陷。在一个实施例中,该菌株可以是天然的,或经基因修饰以表达超囊泡化的基因型/表型。在优选的实施例中,该菌株可包括如本文所述的菌株HT27。
[0089] 在一个实施例中,本发明可包括使用芽孢杆菌作为表达质粒的内生细菌,所述质粒编码靶向抑制植物细胞中表达的病原体蛋白的hpRNA。在一个实施例中,该菌株可以被基因修饰为RNase缺陷。在一个实施例中,该菌株可以是天然的,或经基因修饰以表达超囊泡化的基因型/表型。在优选的实施例中,该菌株可包括如本文所述的菌株HT27。
[0090] 在某些其他实施例中,由这些内生细菌菌株中的一种或多种产生的hpRNA可以从感染或引入的原始位点迁移遍及植物、叶、根或茎。在某些其他实施例中,由这些内生细菌菌株中的一种或多种产生的hpRNA可以从感染或引入的原始位点迁移遍及植物、叶、根或茎,并阻止植物病原体迁移/信号的迁移。
[0091] 此外,另一个实施例包括组合物,所述组合物包含经基因修饰的细菌,所述细菌经配置以定殖目标植物并递送一种或多种抑制性RNA分子,从而抑制一种或多种植物病原体必需基因,以及提供增加的病原体抗性,如本文所公开的方法,作为对感染险的植物或已经感染目标病原体的植物的局部治疗
[0092] 在某些实施例中,可以包括使用细菌菌株和辅助基因,其增强dsRNA产生、稳定、输出和/或递送到植物细胞或植物病原体所在位置。如上所述,细菌已经发展出多个分泌系统,包括:
[0093] I型分泌系统(TISSs),例如大肠杆菌中的溶血素分泌系统,是简单的三方系统,促进各种大小的蛋白质通过革兰氏阴性细菌的细胞包膜。它们由ATP结合盒(ABC)转运蛋白或质子-反向转运蛋白,桥接内膜(IM)和外膜(OM)的衔接蛋白和外膜孔组成。它们在没有稳定的周质中间体的情况下一步分泌底物。TISS参与属于RTX(重复毒素)蛋白家族、细胞表面层蛋白、蛋白酶、脂肪酶、细菌素和血液获得蛋白的细胞毒素的分泌。
[0094] II型分泌系统(T2SSs)是使用两步机制进行易位的多组分机器。在第一步中,前体效应蛋白通过Sec易位子或Tat途径移位通过内膜易位。一旦进入周质,效应蛋白就被T2SS通过外膜易位。T2SS易位子由12-16种蛋白质组分组成,可在细菌膜、细胞质和周质中发现。T2SS显示出与IV型菌毛组装机制的进化关系。
[0095] III型分泌系统(T3SSs),也称为注射体,介导一步分泌机制,被许多植物和动物病原体使用,包括沙门氏菌、志贺氏菌、耶尔森氏菌、肠致病性和肠出血性大肠杆菌和绿脓杆绿假单胞菌。T3SS由肠沙门氏菌亚种所示。血清型沙门氏菌感染系统使用入侵(Inv)和Prg蛋白(见下图)。T3SS以独立于Sec的方式将效应蛋白递送到真核宿主细胞的细胞质中。T3SS在遗传、结构和功能上与细菌鞭毛相关。它们由20多种不同的蛋白质组成,形成跨越细菌细胞包膜的大的超分子结构。
[0096] IV型分泌系统是在革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌中发现的多功能系统,其分泌多种底物,从单一蛋白质到蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA复合物。这些系统以是根癌农杆菌VirB/D系统为例。
[0097] V型分泌系统(T5SSs)包括自转运蛋白和双伴侣分泌系统。T5SS分两步易位底物。自转运蛋白,例如来自脑膜炎奈瑟氏球菌的NalP,是一种多结构域蛋白,在Sec依赖性过程中作为前体蛋白分泌在内膜上。随后,蛋白质的易位蛋白结构域插入外膜并促进载客结构域的表面定位。在双伴侣分泌系统中,单独的易位蛋白(TpsB)通过外膜介导效应蛋白(TpsA)的分泌。在一个简单的两步过程中,超过700种具有自动聚集、粘附、侵袭、细胞毒性、血清抗性、细胞间扩散和蛋白水解等功能的蛋白质使用这两种分泌系统穿过内膜和外膜。
[0098] VI型分泌系统(T6SSs)是最近发现的分泌系统,其存在于几种病原体中,例如铜绿假单胞菌、肠聚集性大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌和鼠疫耶尔森氏菌。T6SS是多组件系统,可以由12到25个子单元组成。
[0099] 本发明的一个实施例可包括利用细菌分泌系统来增强dsRNA向植物宿主的递送。在一个优选的实施例中,本发明可包括用于增强细菌IV型分泌系统以将dsRNA递送至植物细胞的系统。例如,植物病原体根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)使用IV型分泌系统将VirD2-单链DNA复合物以及毒力蛋白VirD5,VirE2,VirE3和VirF递送到宿主细胞中。一个实施例可以包括将dsRNA结合蛋白与Vir蛋白的融合可以促进dsRNA递送至昆虫细胞。
[0100] 在一个实施例中,本发明可包括用于增强细菌VI型分泌系统以将dsRNA递送至细胞的系统。在该优选实施例中,细菌基因yfgL的过表达可以增强磷脂酰甘油(膜脂)合成和囊泡产生和出芽。在另一个实施例中,hns基因的突变(调节许多毒力因子的全局调节因子)可以增加大肠杆菌囊泡的产生。在另一个实施例中,缺失LPS O-抗原侧链的沙门氏菌和铜绿假单胞菌突变体也显示出囊泡形成增加。
[0101] 在一个实施例中,本发明可包括用于增强dsRNA进入植物细胞的系统的稳定和调动。一些实施例可包括但不限于:
[0102] -共表达或过表达对细胞间RNA的调动至关重要的核苷酸转移酶(MUT2)
[0103] -已经发现衍生自dsRNA的MicroRNA富含T细胞分泌的囊泡,该dsRNA具有被泛素化hnRNPA2B I结合的基序,
[0104] -具有miR-1289结合位点和序列基序(以茎环结构呈现的CUGCC)的RNA,
[0105] -具有非模板化3'尿苷的MicroRNA
[0106] -细胞中的内源性RNA可以调节miRNA分选成细胞外囊泡。
[0107] -共表达或过表达Ago2蛋白
[0108] -鉴定了在将RNA导入细胞中具有相对良好表征作用的四种秀丽隐杆线虫蛋白(Winston等,2002)。在另外两个筛选中发现了相同基因的其他等位基因-喂食(喂食RNAi缺陷)筛选(Timmons等,2003)和rsd(RNAi扩散缺陷)筛选。
[0109] -共表达溴病毒P19蛋白以促进shRNA稳定和递送至细胞
[0110] -在分泌效应蛋白和dsRNA结合蛋白之间表达的融合蛋白,例如,参与dsRNA加工的Argonaut(Ago)蛋白,促进shRNA稳定和递送到宿主细胞中。
[0111] -共表达或过表达下表5-8中鉴定的任何基因。
[0112] -作为本文所述发明的一部分,使用下表7中鉴定的任何菌株。
[0113] 此外,另一实施例包含组合物,该组合物包括一种基因修饰细菌,其被配置成定殖目标植物并递送一种或多种抑制性RNA分子,从而以抑制一种或多种植物病原体必需基因,以及提供增加的病原体抗性,根据本文所公开的方法以空中处理有感染风险的植物或已感染目标病原体的植物。在优选实施例中,这种空中处理可包括气溶胶、液体或干燥细菌或孢子应用。
[0114] 在一个实施例中,该植物是单子叶植物或单子叶植物的细胞。例如,单子叶植物属于禾本科和谷类。非限制性示例性单子叶植物物种包括谷物、热带水果和花卉、香蕉、玉米、大米、大麦、浮萍、唐菖蒲、甘蔗、菠萝、枣、洋葱、大米、高粱、草坪草和小麦。
[0115] 在另一实施例中,该植物是双子叶植物或双子叶植物的细胞。例如,双子叶植物选自漆树科(例如腰果、开心果)、菊科(例如紫菀和所有其他复合花)、芸苔科(例如卷心菜、芜菁和其他芥末)、仙人掌科(例如仙人掌)、葫芦科(例如西瓜、南瓜)、大戟科(例如木薯)、豆科(例如,豆类和所有其他豆类)、壳斗科(例如,橡树)、天竺葵(例如,天竺葵)、胡桃科(例如,山核桃)、林科(例如,亚麻)、锦葵科(例如,棉花)、木犀科(例如,橄榄、灰烬、丁香)、蔷薇科(例如,玫瑰、苹果、桃子、草莓、杏仁)、茜草科(例如,咖啡)、芸香科(例如,桔子和其他柑橘类植物f果实)、茄科(如土豆、西红柿、烟草)、山茶科(如茶)和维他科(如葡萄)。
[0116] 术语“植物”或“目标植物”包括对病原体可持续的任何植物。它还包括整株植物、植物器官、整株植物或植物器官的后代、胚胎、体细胞胚胎、胚胎样结构、原球茎、原球茎样体(PLB)和植物细胞的悬浮液。植物器官包括,例如,茎部营养器官/结构(例如,叶、茎和茎)、根、花和花器官/结构(例如,苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚胎、胚乳和种皮)和果实(成熟子房)、植物组织(例如,血管组织、地面组织)以及类似的)和细胞(例如,保卫细胞、卵细胞、毛状体等)。可用于本发明方法中的植物种类通常与适于本文所述的分子生物学和植物育种技术的高等和低级植物种类一样广泛,具体来说是被子植物(单子叶和双子叶植物,包括真双子叶植物。它包括各种倍性水平的植物,包括非整倍体、多倍体、二倍体、单倍体和半合子。本文所述的转基因植物可以是单子叶作物,例如高粱、玉米、小麦、水稻、大麦、燕麦、黑麦、谷子和小黑麦。本发明还可包括大麻科(Cannabaceae)和其他大麻菌株(Cannabis),例如一般的苜蓿(C.ativa)。
[0117] 其他感兴趣的植物种类的104个例子包括但不限于玉米(玉蜀黍),芸苔属(例如,甘蓝型油菜,白菜型油菜,芥菜型油菜),尤其是那些用作种子油来源的芸苔属植物、苜蓿(紫花苜蓿)、水稻(栽培稻)、黑麦(黑麦属)、高粱(高丹草,高粱)、谷子(例如珍珠稗(御谷)、猪黍(黍)、谷子(小米是粟)、龙爪稷(龙爪粟)、向日葵(太阳花)、红花(刺红花)、小麦(普通小麦)、大豆(黄豆)、烟草(普通烟)、土豆(铃薯)、花生(落花生),棉花(海岛棉,陆地棉)、红薯(甘薯)、木薯(树薯)、咖啡(咖啡属)、椰子(可可椰子)、菠萝(凤梨)、柑橘树(柑橘属)、可可(可可树)、茶(野茶树)、香蕉(芭蕉类)、鳄梨(油果)、无花果(映日果)、番石榴(芭乐)、芒果(杧果)、橄榄(油橄榄)、木瓜(番木瓜)、腰果(鸡腰果)、澳洲坚果(夏威夷果)、扁桃仁(巴旦仁)、甜菜(红菾菜)、甘蔗(甘蔗属)、燕麦、大麦;蔬菜、观赏植物和针叶树。蔬菜包括番茄(西红柿)、生菜(例如莴苣)、青豆(四季豆)、利马豆(菜豆)、豌豆(香豌豆属),以及黄瓜属,例如黄瓜(小黄瓜)、哈密瓜(甜瓜)和香瓜(甜瓜籽)。观赏植物包括杜鹃花(杜鹃属)、绣球花(八仙花)、木槿花(木槿属)、玫瑰(玫瑰属)、郁金香(郁金香属)、水仙花(水仙属)、矮牵牛(牵牛花)、康乃馨(香石竹)、一品红(圣诞红)和菊花。可用于实施本发明的针叶树包括,例如,火炬松(日本五须松)、湿地松(沼泽松)、杰克松(北美黄松)、美国黑松(小千松类)和蒙特利松树(辐射松)、花旗松(黄杉)、西杉(加拿大铁杉)、西加杉(白云杉)、红杉(加州红木)、杉(胶冷杉)和胶枞(香脂冷杉)等真冷杉以及西红杉(西部红松)和阿拉斯加黄杉(黄扁柏)等雪松。在具体实施例中,本发明的植物是农作物(例如,如上所述,玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、谷子、烟草等)。
[0118] “植物病原体”或“病原体”是指感染植物或植物成分的生物(细菌、病毒、原生生物、藻类或真菌)。例如霉菌、真菌和腐烂,其通常利用孢子感染植物或植物成分(如水果、蔬菜、谷物、茎、根)。“植物病原体”还包括植物中致病性或致病作用所必需的所有基因,或者通过它们的抑制或消除,这些作用被减少或消除。
[0119] 在一个较佳实施例中,本发明可应用于以下一或多种非限制性植物病毒群,包括病原体基因靶点(通常称为基因靶点)或必需基因,其将被本领域普通技术人员所识别并可在无需过度实验的情况下获得:
[0120]
[0121]
[0122] 其他植物病原菌可能包括:柑橘衰退病毒、大麦黄矮病毒、马铃薯卷叶病毒和番茄和丛生矮缩病毒。
[0123] 在一个较佳实施例中,本发明可应用于以下一或多种非限制性植物真菌病原体,包括病原体基因靶点(通常称为基因靶点)或必需基因,其将被本领域普通技术人员所识别并获得,无需过多实验:
[0124]
[0125]
[0126] 可以靶向在细胞(优选植物细胞)中表达的任何基因。在细胞中表达的基因是转录产生RNA(例如miRNA)和(可选)蛋白质的基因。靶基因可以是内源基因或外源或外来基因(即转基因或病原体基因)。例如,由于病毒递送构造的基因组整合而存在于细胞基因组中的转基因可以使用本发明的抑制性RNA进行调节。外源基因可以整合到宿主基因组(优选染色体DNA)中,或者它可以存在于额外的染色体遗传结构上,例如质粒或粘粒。例如,靶基因可以存在于通过本文所述的新型跨界方法引入干扰RNA的细胞基因组中,或类似地存在于能够感染上述生物体或细胞的病原体(例如病毒、细菌、真菌或原生动物)基因组中。
[0127] 优选地,靶基因是细胞的内源基因或相对于细胞基因组的异源基因,例如病原体基因。优选地,病原体的基因来自能够感染真核生物的病原体。最优选地,所述病原体选自如上所述的病毒、细菌、真菌和线虫。通过在植物中表达本发明的抑制性RNA,不仅植物基因可以作为基因沉默的靶基因,而且还可以作为感染植物或食用植物(作为食物或饲料)的生物的基因。因此,靶基因也可以是动物或植物病原体的基因。靶基因优选选自植物中的基因或感染病原体的植物中的基因。优选地,靶基因的表达(通过表达的RNA或蛋白质测量)减少,抑制或减弱至少10%,优选至少30%或40%,优选至少50%或60%,更优选至少80%,最优选至少90%或95%或100%。
[0128] 目标产物(例如转录物或蛋白质)的水平可在整个生物体(例如植物、害虫或草食动物)中降低,或目标产物的这种降低可局限于有机体的一个或多个特定器官或组织中。例如,产品的水平可以在植物的一种或多种组织和器官中降低,包括但不限于:根、块茎、茎、叶、茎秆、果实、浆果、坚果、树皮、豆荚、种子和花。首选器官是植物的种子。使用本发明的方法可以调节多种靶基因,包括植物中的基因,以及植物感染或食用病原体、动物甚至人类的基因。优选地,靶基因选自由植物内源性、转基因或来自植物感染性病原体的基因组成的组。更优选地,从病毒、真菌、细菌、昆虫和线虫组成的组中选择植物感染性病原体。
[0129] 在病原体的情况下,靶基因或必需基因可能是家养基因或其他基因,其对于病原体的生存能力或增殖至关重要。靶基因的衰减或沉默可能有各种影响(也取决于靶基因的性质)。优选地,沉默或减弱所述靶基因会导致损失或减少病原体的有害影响,即致病性或农艺性状。所述农艺性状可以从组合中优选,其组合包含抗病性、抗除草剂性、抗生物或非生物胁迫的抗性和改善的营养价值。在这种情况下,例如,靶基因可以优选地选自参与蛋白质、肽、脂肪酸、脂类、蜡、油、淀粉、糖、水化合物、香料、气味、毒素、类胡萝卜素、激素聚合物、类黄、存储蛋白质、酚酸、生物、木质素、单宁纤维素、糖蛋白和糖脂的合成和/或降解的基因。所有这些序列都是本领域技术人员所熟知的,并且本领域技术人员(例如GenBank)可以很容易地从DNA数据库中获得。
[0130] 在某些实施例中,抑制性RNA分子的新型跨界递送,即本发明的方法和手段特别适用于在真核细胞或生物体中,特别是在植物细胞和植物中获得病原体(例如,病毒或线虫)抗性。预期通过在宿主生物体(如植物)中转录产生的抑制性RNA分子(或由此衍生的dsRNA分子)可以在整个生物体内全身性扩散。因此,可以降低移植到包含本发明基因的转基因种群植物的非转基因接穗的细胞中核酸的表型表达(反之亦然),该方法在园艺、葡萄栽培或水果生产中可能很重要。对诸如蛛形纲动物、真菌、昆虫、线虫、原生动物、病毒、细菌和疾病等植物病原体的抗性,可以通过降低对某种病原体的生长、生存、某些发育阶段(例如化蛹)或增殖至关重要的基因表达来实现。适当的减少可以完全抑制上述步骤,但也可以延迟一个或多个步骤。这可能包括植物基因,例如,允许病原体进入,但也可以是病原体同源基因。优选地,抑制性RNA(例如hpRNA或由其衍生的dsRNA)是针对病原体的基因。例如,植物可以用上述药剂的适当制剂处理,例如喷雾或撒粉;然而,植物本身也可以包括转基因生物体形式的药剂,并将其传递给病原体,例如以胃毒的形式。各种病原体的各种必需基因是本领域技术人员已知的(例如,线虫抗性:WO 93/10251,W O 94/171 94)。
[0131] 本文所述抑制性RNA分子的新型跨界递送方法的另一方面提供了一种方法,其中所抑制的靶基因编码植物病原体(例如昆虫或线虫)中的蛋白质。在这方面,一种方法包括将包含DNA(例如质粒)的核酸结构引入到病原体靶向植物的基因组中,所述DNA结构被转录成抑制性RNA(例如hpRNA),所述抑制性RNA形成至少一个dsRNA分子,其当病原体(例如,昆虫或线虫)摄取或感染来自所述植物的细胞时时,有效地降低病原体中靶基因的表达。在优选实施例中,基因抑制对病原体是致命的。作为病原体,最优选的是真菌性病原体,其范围尚未在其他地方列出,如致病疫霉、雪腐镰刀菌、禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌、尖孢镰刀菌、小麦白粉病菌、稻瘟病菌、向日葵菌核病、颖枯壳针孢、叶枯病菌、黑斑病菌、根朽病菌、以及线虫类,如马铃薯金线虫、马铃薯白线虫、甜菜胞囊线虫、燕麦胞囊线虫、茎线虫、Angumatritici和北方根结线虫。
[0132] 例如,通过降低病毒外壳蛋白、病毒复制酶、病毒蛋白酶、结构蛋白、毒素等的表达,可以获得对病原性病毒的抗性。大量植物病毒和合适的靶基因是本领域普通技术人员已知的。本发明的方法和组合物特别适用于获得抗线虫的植物(对于靶基因,参见例如WO 92/21717、WO 93/10251、WO 94/17194)。
[0133] 本发明还提供了获得病原体抗性生物,特别是植物的方法,包括向生物体细胞提供本发明的抑制性RNA分子的步骤,所述抑制性RNA分子能够在真核细胞中提供至少一个部分双链RNA分子,所述抑制性RNA分子包含a)至少一个第一核糖核苷酸序列,其与病原体至少一个基因的目标核苷酸序列的至少一部分基本相同,b)至少一个第二核糖核苷酸序列与所述第一核苷酸序列基本上互补并且能够与所述第一核苷酸序列杂交以形成双链RNA结构,和c)位于所述第一和所述第二核糖核苷酸序列之间的至少一个第三核糖核苷酸序列至少包含一个可移除的RNA元件,可以通过真核细胞的RNA加工机制移除,而无需随后分别共价连接包含所述第一和第二核糖核苷酸序列的所得序列。优选地,所述第一核糖核苷酸序列具有65%至100%的序列同一性,优选75至100%,更优选85至100%,最优选95至100%,具有至少部分基因组的核苷酸序列。病原体。更优选地,病原体选自病毒、细菌、真菌和线虫。
[0134] 由于本发明涉及基因修饰细菌的生产并涉及重组DNA技术,因此提供以下定义以帮助描述本发明。本文所用的术语“分离的”、“纯化的”或“生物学上纯的”是指大体上或基本上不含在其天然状态下或在制备材料时通常伴随材料的组分的材料。在一个示例性实施例中,使用分析化学技术如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法测定纯度和均一性。作为制剂中存在的主要种类的核酸或特定细菌基本上是纯化的。在一个示例性实施例中,术语“纯化的”表示在电泳凝胶中基本上产生一条带的核酸或蛋白质。通常,分离的核酸或蛋白质具有以范围表示的纯度水平。该组分纯度范围的下限为约60%,约70%或约80%,并且纯度范围的上限为约70%,约80%,约90%或约90%以上。
[0135] 术语“接触”(与植物):如本文所用,关于核酸分子,术语与生物体(例如,植物、害虫或食草动物)“接触”或“摄取”包括核酸分子内化进入生物体,例如但不限于:生物体摄取分子(例如,通过喂食);使生物体与包含核酸分子的组合物接触;用包含核酸分子的溶液浸泡生物体;用包含核酸分子的组合物注射生物体;用含有核酸分子的气溶胶组合物喷洒生物体。
[0136] 本文所用的术语“表达”或“编码序列的表达”(例如,基因或转基因)是指核酸转录单元(包括例如基因组DNA或cDNA)的编码信息被转化为细胞的可操作性,非操作性或结构性部分的过程,通常包括蛋白质的合成。基因表达可能受外部信号的影响;例如,将细胞、组织或生物体置于增加或减少基因表达的试剂中。基因的表达也可以在从DNA到RNA再到蛋白质的任何路径上进行调节。基因表达的调节例如通过控制转录、翻译、RNA转运和加工、中间分子例如mRNA的降解,或在特定蛋白质分子生成后,对其活化、失活、区域化或降解,或其组合。可以通过本领域已知的任何方法在RNA水平或蛋白质水平上测量基因表达,包括但不限于Northern印迹,RT-PCR,Western印迹,或体外、原位或体内蛋白质活性测定。
[0137] 术语“核酸”或“核酸分子”包括单链和双链形式的DNA、单链形式的RNA和双链形式的RNA(dsRNA)。术语“核苷酸序列”或“核酸序列”是指核酸的有义链和反义链作为单独的单链或双链体。术语“核糖核酸”(RNA)包括lRNA(抑制性RNA)、dsRNA(双链RNA)、siRNA(小干扰RNA)、mRNA(信使RNA)、miRNA(micro-RNA)、hpRNA(发夹RNA)、tRNA(转移RNA),无论是否带有相应的酰化氨基酸,和cRNA(互补RNA)。术语“脱核糖核酸”(DNA)包括cDNA、基因组DNA和DNA-RNA杂合体。本领域技术人员将术语“核酸区段”和“核苷酸序列区段”或更一般地“区段”理解为包括基因组序列、核糖体RNA序列、转移RNA序列、信使RNA序列、操纵子序列和编码或可适于编码的较小工程化核苷酸序列肽、肽、多肽或蛋白质的功能性术语。
[0138] 如本文所用,“发夹RNA(hpRNA)”是指任何自退火双链RNA分子。在最简单的表示中,发夹RNA由退火RNA链构成的双链茎组成,通过单链RNA环连接,也称为“锅柄RNA”。然而,术语“发夹RNA”还旨在包括更复杂的二级RNA结构,其包含自退火双链RNA序列,但也包括内部凸起和环。适宜的特定二级结构将由RNA分子的自由能决定,并且可以使用诸如FOLDRNA的适当软件来预测其不同的状态(Zuker和Stiegler(1981)Nucleic Acids Res 9(1):133-48;Zuker,M.(1989)Methods En-zymol.180:262-288)。
[0139] 在本发明的其他实施例中,通过RNAi抑制一种或多种植物病原体基因产物的表达可以通过发夹RNA(hpRNA)干扰或含内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰获得。对于hpRNA干扰,设计表达盒以表达与其自身杂交的RNA分子,以形成包含单链环区和碱基配对茎的发夹结构。碱基配对茎区包含对应于编码基因产物的全部或部分内源信使RNA的有义序列,所述基因产物的表达将被抑制,在这种情况下,是本文所述的细胞色素P450多肽,以及与有义序列完全或部分互补的反义序列。或者,碱基配对茎区可以对应于控制编码待抑制目标多肽基因表达的启动子序列的一部分。因此,分子的碱基配对茎区通常决定RNA干扰的特异性。hpRNA分子在抑制内源基因的表达方面是高效的,其诱导的RNA干扰被后代植物遗传。参见,例如,Chuang和Meyerowitz(2000)Proc.N atl Acad,Sci.USA 97:4985-4990;
Stoutjesdijk et al.(2002)Plant Physiol.129:1723-1731;和Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet 4:29-38。使用hpRNA干扰来抑制或沉默基因表达的方法描述于例如ChuangandMeyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA  97:4985-4990;
Stoutjesdijketal.(2002)Plant Physiol.129:1723-1731;Waterhouse and Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4:29-38;Pandolfmi et al.BMC Biotechnology 3:7,以及美国专利号20030175965中;其中的每一个都通过引用结合到本文中。Panstruga et al.(2003)Mol.Biol Rep.30:135-140已经描述了hpRNA结构在体内沉默基因表达效率的瞬时测定法,在此引入作为参考。
[0140] 对于ihpRNA,干扰分子具有与hpRNA相同的一般结构,但RNA分子另外包含能够在表达ihpRNA的细胞中剪接的内含子。内含子的使用使剪接后发夹RNA分子中环的大小最小化,这增加了干扰的效率。参见,例如,Smithetal.(2000)Nature407:319-320。事实上,Smith等人使用ihpRNA介导的干扰显示100%抑制内源基因表达。使用ihpRNA干扰抑制内源性植物基因表达的方法描述于例如Smithet al(2000)Nature 407:319-320;Wesley et al.(2001)Plant J 27:581-590;Wang and Waterhouse(2001)Curr.Opin.Plant Biol.5:146-150;Waterhouse and Helliwell(2003)Nat Rev.Genet.4:29-38;Helliwell and Waterhouse(2003)Methods 30:289-295,以及美国专利公开号20030180945中,其每一篇在此引入作为参考。
[0141] 如本文所用,寡核苷酸上一种短核酸聚合物。寡核苷酸可由较长的核酸片段裂解或单个核苷酸前体聚合形成。自动合成器可以合成长达数百个碱基对的寡核苷酸。因为寡核苷酸可能与互补的核苷酸序列结合,所以它们可以被用作检测DNA或RNA的探针。由DNA(寡脱氧核糖核苷酸)组成的寡核苷酸可用于PCR,这是一种扩增DNA和RNA(逆转录成cDNA)序列的技术。在PCR中,寡核苷酸通常被称为“引物”,它允许DNA聚合酶延伸寡核苷酸并复制互补链。
[0142] 术语“基因”或“序列”是指以某种方式可操作地连接到能够调节基因产物(例如多肽或功能性RNA)表达的适当调节序列的编码区。基因包括在编码区(开放阅读框,ORF)之前(上游)和之后(下游)的DNA的未翻译调节区(例如启动子、增强子、阻遏物等),以及在适用的情况下各个编码区(即外显子)之间的插入序列(即内含子)。本文所用术语“结构基因”意指转录成mRNA的DNA序列,而后被翻译成特定多肽特有的氨基酸序列。
[0143] 核酸分子可包括通过自然发生的和/或非自然发生的核苷酸键连接在一起的天然存在的和修饰的核苷酸中的一种或两种。核酸分子可经化学或生物化学修饰,或可含有非天然或衍生的核苷酸碱基,如本领域技术人员容易理解的那样。例如,这种修饰包括标记、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰(例如,不带电的键:例如,甲基膦酸脂、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等);带电的键:例如,硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等;悬垂部分:例如肽;嵌入剂:例如吖啶、补骨脂素等;螯合剂;烷基化剂;和修饰连接物:例如α端基异位核酸等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑构象,包括单链构象、双链构象、部分双链构象、三链构象、发夹构象、圆形构象和挂构象。
[0144] 如本文关于DNA所用,术语“编码序列”、“结构核苷酸序列”或“结构核酸分子”是指当置于适当调节序列的控制下时,通过转录和mRNA最终翻译成多肽的核苷酸序列。关于RNA,术语“编码序列”是指翻译成肽、多肽或蛋白质的核苷酸序列。编码序列的边界由5'末端的翻译起始密码子和3'末端的翻译终止密码子决定。编码序列包括但不限于:基因组DNA、cDNA、EST和重组核苷酸序列。
[0145] 本文使用的术语“基因组”是指在细胞核内发现的染色体DNA,也指在细胞亚细胞组分中发现的细胞器DNA。适用于细菌的术语“基因组”是指细菌细胞内的染色体和质粒。在本发明的一些实施例中,可以将DNA分子引入到细菌中,使得DNA分子整合到细菌的基因组中。在这些和进一步的实施例中,DNA分子可以是染色体整合的或作为稳定质粒或位于稳定质粒中。
[0146] 本文在两个核酸或多肽序列的上下文中使用的术语“序列同一性”或“同一性”是指当在特定比较窗口上对齐以获得最大对应性时两个序列中的残基相同。
[0147] 如本文所用,术语“序列同一性百分比”可以指通过在比较窗口上比较两个最佳比对序列(例如,核酸序列)确定的值,其中与参考序列(不包括添加或缺失)相比,比较窗口中的序列部分可以包含添加或缺失以优化两个序列的对齐。通过确定两个序列中出现相同核苷酸或氨基酸残基的位置数,得出匹配位置的数量,将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数,再将结果乘以100,产生序列同一性的百分比。与参考序列相比,在每个位置相同的序列被称为与参考序列100%相同,反之亦然。
[0148] 对齐序列用于比较的方法是本领域熟知的。各种程序和对齐算法被描述,例如:Smith and Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482;Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443;Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444;
Higgins and Sharp(1988)Gene 73:237-44;Higgins and Sharp(1989)CABIOS 5:151-3;
Corpet et al.(1988)Nucleic  Acids Res.16:10881-90;Huang et al.(1992)
Comp.Appl.Biosci.8:155-65;Pearson et al.(1994)Methods Mol.Biol.24:307-31;
Tatiana et al.(1999)FEMS Microbiol.Lett.174:247-50。序列比对方法和同源性计算的详细考虑可以在例如Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10中找到。国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部对齐搜索工具(BLASTTM;Altschul et al.(1990))可从多个来源获得,包括国家生物技术信息中心(马里兰州贝塞斯达)和互联网,用于与多个序列分析程序相关联。关于如何使用该程序确定序列同一性的描述可在因特网上在BLAST TM的“帮助”部分下获得。为了比较核酸序列,可以使用默认BLOSUM62矩阵设置为默认参数来使用BLAST TM(Blastn)程序的“Blast 2序列”功能。当通过该方法评估时,与参考序列具有甚至更大相似性的核酸序列将显示出越来越高的百分比同一性。
[0149] 如本文所用,术语“可杂交的”和“互补的”表示足够程度的互补性的术语,使得在核酸分子和目标核酸分子之间发生稳定和特异性结合。两个核酸分子之间的杂交涉及在两个核酸分子的核酸序列之间形成反平行对齐。然后两个分子能够与相对链上的相应碱基形成氢键,从而形成双链体分子,如果其足够稳定,则可使用本领域熟知的方法检测。核酸分子不需要与其目标序列100%互补即可特异性杂交。然而,为了使杂交具有特异性,杂交必须存在的序列互补量是所用杂交条件的函数,并且可以在50%-100%之间。
[0150] 如本文所用,关于连续核酸序列的术语“同源的”是指在适当条件下与参考核酸序列杂交的连续核苷酸序列。例如,同源序列可具有约70%-100%,或更通常80%-100%的序列同一性,例如约81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%、99.5%、100%。实质同源性与特异性杂交密切相关。例如,当存在足够程度的互补性时,核酸分子是特异性可杂交的,以避免在需要特异性结合的条件下(例如,在严格杂交条件下)核酸与非目标序列的非特异性结合。
[0151] 术语“可操作地连接”在提及调节序列和编码序列时是指调节序列影响连接的编码序列的表达。“调节序列”或“控制元件”是指影响转录、RNA加工或稳定性的时间和水平/量,或相关编码序列翻译的核苷酸序列。调节序列可包括启动子、翻译先导序列、内含子、增强子、茎环结构、抑制子结合序列、终止序列、多聚腺苷酸化、识别序列等。特定的调节序列可以位于可操作地与其连接的编码序列的上游和/或下游。而且,与编码序列可操作连接的特定调节序列可位于双链核酸分子的相关互补链上。
[0152] 本文使用的术语“启动子”是指DNA的一个区域,其可以位于转录起点的上游,并且可以参与RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以启动转录。启动子可以与在细胞中表达的编码序列可操作地连接,或启动子可以与编码信号序列的核苷酸序列可操作地连接,所述信号序列可以与在细胞中表达的编码序列可操作地连接。“植物启动子”可以是能够在植物细胞中启动转录的启动子。发育控制下的启动子的实例包括在某些组织中优先启动转录的启动子,例如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织。这种启动子被称为“组织优先”。仅在某些组织中启动转录的启动子被称为“组织特异性的”。“细胞类型特异性”启动子主要驱动一种或多种器官中某些细胞类型的表达,例如根或叶中的血管细胞。“诱导型”启动子可以是受环境控制的启动子。可通过诱导型启动子启动转录的环境条件的实例包括厌氧条件和光的存在。组织特异性、组织优选性、细胞类型特异性和诱导型启动子构成“非组成型”启动子的类别。“组成型”启动子是在大多数环境条件下或在大多数细胞或组织类型中可能具有活性的启动子。
[0153] 任何诱导型启动子均可用于本发明的一些实施例中。参见Ward et al.(1993)Plant Mol.Biol.22:361-366。对于诱导型启动子,转录速率响应于诱导剂而增加。示例性诱导型启动子一般实例包括但不限于:来自ACEI系统的响应于铜的启动子、来自玉米的响应于苯磺酰胺除草剂安全剂的In2基因、来自TnlO的Tet抑制子和来自类固醇激素基因的诱导型启动子,其转录活性可由糖皮质激素诱导(Schena  et  al.(1991)Proc Natl.Acad.Sci.USA 88:0421)。
[0154] 如本文所用,术语“转化”或“基因修饰的”是指一种或多种核酸分子转移到细胞中。当核酸分子被细菌稳定复制时,微生物被转化为细菌中的核酸分子“转化”或“基因修饰”。如本文所用,术语“转化”或“基因修饰的”包括可以将核酸分子引入的所有技术,例如细菌。
[0155] 术语“载体”是指DNA、RNA、蛋白质或多肽能被引入宿主的一些方法。将要引入宿主的多核苷酸、蛋白质和多肽本质上可以是治疗性的或预防性的,可编码或是抗原的,在性质上是可以调节的等等。有各种类型的载体,包括病毒、质粒、噬菌体、粘粒和细菌。
[0156] “表达载体”是能够在选定的宿主细胞或生物体中复制的核酸。表达载体可以作为自主结构进行复制,或者可以整体或部分整合到宿主细胞染色体或细胞器的核酸中,或者它用作穿梭以将外来DNA递送到细胞,从而与宿主细胞基因组一起复制。因此,表达载体是能够在选定的宿主细胞、细胞器或生物体(例如质粒、病毒、人工染色体、核酸片段)中复制的多核苷酸,以及表达载体上的某些基因(包括目的基因)被转录并翻译成细胞、细胞器或生物体内的多肽或蛋白质,或本领域已知的任何合适的结构,其包含“表达盒”。相反,如本文实施例中所述,“盒”是包含本发明表达载体部分的多核苷酸。盒的使用有助于表达载体的组装。表达载体是复制子,例如质粒、噬菌体、病毒、嵌合病毒或粘粒,并且含有与表达控制序列可操作连接的所需多核苷酸序列。
[0157] 当表达控制序列控制和调节该多核苷酸序列的转录和/或翻译时,多核苷酸序列与表达控制序列(例如,启动子和任选的增强子)可操作地连接。
[0158] 除非另有说明,否则特定核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)、互补(或补体)序列和反向互补序列,以及明确指出的序列。具体地,简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个选定(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(参见例如Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka et al,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);和Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes8:91-98(1994))。由于核酸密码子的简并性,可以使用各种不同的多核苷酸来编码相同的多肽。下文表1a包含关于哪些核酸密码子编码哪种氨基酸的信息。
[0159] 表1a氨基酸核酸密码子
[0160]
[0161] 不可商购的寡核苷酸和多核苷酸可以化学合成,例如,根据Beaucage and Caruthers,Tetrahedron Letts.22:1859-1862(1981)首次描述的固相亚磷酰胺三酯方法。或使用Van Devanter et al.,Nucleic Acids Res.12:6159-6168(1984)中描述的自动合成仪。用于合成寡核苷酸和多核苷酸的其他方法是本领域已知的。寡核苷酸的纯化通过天然丙烯酰胺凝胶电泳或通过阴离子交换HPLC进行,如Pearson&Reanier,J.Chrom.255:137-
149(1983)所述。
[0162] 术语“重组”当与诸如细胞、核酸、蛋白质或载体等词语一起使用时,表明细胞、生物体、核酸、蛋白质或载体已经通过引入异源核酸或蛋白质,或天然核酸或蛋白质的改变,或细胞来自如此修饰的细胞而被修饰。因此,例如,重组细胞可以表达在细胞的天然(非重组或野生型)形式中未发现的基因,或表达在其他方面异常表达(过表达、表达不足或根本不表达)的天然基因。
[0163] 术语“大概”和“大约”是指总量、水平、价值或数量变化高达30%,或在另一个实施例中变化多达20%,在第三个实施例中总量、水平、价值或数量变化高达10。如本文所用,单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代,除非上下文另有明确说明。例如,术语“细菌”包括单个细菌和多个细菌。
[0164] 这里使用的“抑制”或“沉默”或“压抑”可互换使用,表示目标序列产物相对于其在野生型生物体中的正常表达水平的表达下调。抑制包括相对于野生型表达水平表达降低约10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、
85%、90%、95%或100%。“有效量”是足以导致植物病原体的抑制或压抑的抑制性RNA的量。
[0165] 如本文所用,关于提及核酸的“异源性”是来源于外来物种的核酸,或者是人工合成的,或者,如果来自同一物种,则通过人为干预从其组成和/或基因组位点的天然形式进行实质性修饰。异源性蛋白质可能来源于外来物种,或者,如果来源于同一物种,则通过人为干预从其原始形式进行实质性修饰。“宿主细胞”是指含有引入的核酸结构并支持该结构的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可能是原核细胞,如大肠杆菌或真核细胞,如真菌、酵母、昆虫、两栖动物、线虫或哺乳动物细胞。或者,宿主细胞是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞。单子叶宿主细胞的一个例子是玉米宿主细胞。
[0166] 多核苷酸序列可能与靶基因的选定区域具有实质同一性、实质同源性或实质互补性。如本文所用,“实质同一性”和“实质性同源性”表示彼此具有序列同一性或同源性的序列。通常,基本相同或基本同源的序列将具有约75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,其中序列同一性百分比基于整个序列,并使用现有默认参数(GCG,GAP版本10,Accelrys,SanDiego,CA)通过GAP对齐确定。
GAP使用Needeman和Wunsch((1970)J Mol Biol 48:443-453)的算法找到两个完整序列的对齐方式,其最大化匹配数并最小化序列间隙数。具有100%标识的序列是相同的。”实质互补性”是指互为互补并能基对的序列。在描述互补序列时,如果第一个序列中的所有核苷酸与第二个序列碱基配对,则这些序列是完全互补的。
[0167] 具体实施例
[0168] 实施例1:演示了编码发夹(hp)RNA结构的细菌质粒的构建,所述结构编码靶向绿色荧光蛋白(GFP)的折返RNA。
[0169] 如本发明人所演示的,使用来自New England BioLabs Inc.的 HiFi DNA组装克隆试剂盒构建编码质粒载体的hpRNA。这里,作为示例性实施例,构建7个hpRNA载体以靶向从pJL-TRBO-G(Lindbo 2007)表达的编码mRNA的绿色荧光蛋白(GFP)。
[0170] 这些质粒的图谱如下图所示:1=7:pAD-WRKY-GHY1(图1),pAD-ADH-GHY2(图2),pOXB-WRKY-GHY3(图3),pOXB-ADH-GHY4(图4),pAD-WRKY-GHY5(图5),pAD-ADH-GHY6(图6)。使用TMV运动蛋白设计的一种hpRNA:pAD-WRKY-GHY7(图7)被构建以靶向来自PJL-TRBO-G的运动蛋白和GFP。粗体碱基是重叠序列。斜体碱基是插入序列。
[0171] 在上述七种hpRNA中,本发明人通过GFP有义片段、间插内含子和GFP反义片段连接到用XbaI+NsiI消化的骨架质粒pAD43-25(Dunn and Handelsman 1999)构建了五种穿梭载体pAD-WRKY-GHY1、pAD-ADH-GHY2、pAD-WRKY-GHY5、pAD-ADH-GHY6和pAD-WRKY-GHY7。使用XbaI消化的pSF-OXB 19(Oxford Genetics Biology Engineered)的骨架质粒构建两种载体pOXB-WRKY-GHY3和pOXB-ADH-GHY4。
[0172] 用于在质粒中构建hpRNA插入物和用于DNA测序的示例性引物如下表1所示。所有hpRNA图谱均使用SnapGeneTM软件制作。
[0173] 实施例2:证明在GFP基因靶标的有义链和反义链之间编码插入内含子的细菌质粒的构建。
[0174] 一种来自拟南芥推定的WRKY型DNA结合蛋白的内含子,长度为287bp,并且克隆自质粒pJawohB-RNAi(登录号AF404854)(表9:SEQ ID NO.26)。
[0175] 本发明人从Zea mays乙醇脱氢酶内含子Adhl产生另一个内含子,长度为566bp,并克隆自质粒pMCG161(登录号AY572837)(表9:SEQ ID NO.27-29)。
[0176] 实施例3:证明示例性hpRNA的构建和序列表。
[0177] 在该实施例中,构建了包含了列于下表10的SEQ ID NO.30-36的示例性hpRNA。
[0178] 实施例4:证明构建用于稳定表达dsRNA结构的RNase1H突变细菌菌株。
[0179] 在该实施例中,本发明人使用示例性大肠杆菌菌株JM109(DE3)构建RNaselII突变+体(基因型:endAl,recAl,gyrA96,thi,hsdR17(rk-,mk),relA1,supE44,λ-,Δ(lac-proAB),[F',trdD36,proAB,ladIqZΔM15],1DE3.Promega,USA)。通过使用由质粒pSIJ8表达的Red介导同源重组系统制备两种大肠杆菌RNase1H突变体(Jensen et al.2015)。
[0180] 使用用于大肠杆菌菌株K-12亚菌株MG1655(NCBI参考序列号:NC_000913.3)rnc基因的DNA序列进行RNase1H突变体的设计。引物RNaseIII50-5和RNaseIII50-3用于扩增具有rnc基因的50-bp同源序列的卡那霉素抗性基因。通过使用 High-Fidelity DNA聚合酶扩增具有KanR的靶向PCR片段。质粒pKD4用作模板(Yin et al.2009)。将具有KanR的靶向PCR片段连接至Pmini T2.0载体,获得Pmini4T质粒,然后使用Pmini-4T作为模板,通过使用硫代磷酸化引物Ec_phos_50-5和Ecjthos 50-3扩增靶向片段。根据Jensen等(Jensen et al.,2015)产生突变体。含有卡那霉素抗性标记的突变体标记为M-JM109-GHY1。突变体消除卡那霉素。抗性被标记为M-JM109-GHY2并且可以用于将hpRNA递送至植物。引物如表2所示。用于验证突变体的PCR扩增分析示于图1中。
[0181] 实施例5:证明PCR分析以确认构建RNase1H突变细菌菌株,从而稳定表达hpRNA结构。
[0182] 如图8A-C所示,本发明人进行了PCR分析以验证大肠杆菌RNaselll突变体的成功构建。同样,如图8A所示,产生PCR分析以验证突变体M-JM109-GITY1。泳道1-16:用引物JD-5和JD-3以及M-JM109-GHY1进行菌落PCR,预期片段大小为1,936bp;野生型是879bp。提取可能的正确突变体4、13、14、15和16,并将它们接种在LB(卡那霉素,50μg/ml)培养基中,培养过夜以进一步鉴定。突变体13和15生长良好。这两种突变体用于本发明人的进一步鉴定。
[0183] 如图8B所示,进一步鉴定纯化的突变体13和15。分析了两个菌落。泳道1-3:分别用引物JD-5和JD-3、JD-5和Cat-3以及Cat-5和TD-3分析第一个菌落突变体;泳道4-6:分别用引物JD-5和JD-3、JD-5和Cat-3以及Cat-5和JD-3分析第二菌落突变体;泳道7:用JD-5和JD-3扩增野生型JM109(DE3)。正确的突变体大小PCR产物为1936bp(用引物JD-5和JD-3扩增)、
1664bp(用引物JD-5和Cat-3扩增)和1787bp(用引物Cat-5和JD-3扩增))。所有DNA测序结果都是正确的,含有卡那霉素抗性标记的正确突变体标记为M-JM109-GHY1。
[0184] 如图8C所示,用引物JD-5和JD-3对卡那霉素抗性基因进行的PCR消除突变体,预期片段大小为543bp。泳道1-8:用引物JD-5和JD-3扩增的八个单独突变体。将没有卡那霉素抗性标记的正确突变体标记为M-JM109-GHY2。(参考泳道=Mi:100bp DNA梯形带;泳道M2:1Kb DNA梯形带。)所有PCR产物都被送去测序并且所有测序结果在表11中确认并复制。(SEQ ID NO.37-39)
[0185] 实施例6:作为细菌dsRNA介导的病毒编码基因沉默的示例性实施例,证明使用含有编码hpRNA分子的质粒的基因修饰大肠杆菌RNasell1突变体,以渗入植物叶子,表达并递送dsRNA或hpRNA到植物中以加工成siRNA,从而灭活TMV编码的GFP。
[0186] 这里,本发明人使用了含有指示质粒的两种大肠杆菌RNase III突变体(一种枯草芽孢杆菌CCB422RNasell1突变体)渗入叶片,表达并将dsRNA或hpRNA递送到要加工成siRNA的植物中以灭活烟草花叶病毒(TMV)编码的GFP,从而证明细菌dsRNA介导的病毒编码基因的沉默。
[0187] 本发明人根据Lindbo(Lindbo2007)使用含有编码hpRNA的质粒的细菌进行了烟草浸润测定,其中所述hpRNA靶向抑制GFP基因。浸润后(dpi)5、7或9天,在UV照射下观察现象并检测GFP信号。在该实施例中使用两种烟草物种:烟草(Nicotiana tabacum)和本氏烟(Nicotiana benthamiana)。例如,作为示例性实施例,在图11A中证明了在健康和渗透的烟草叶的UV照射下检测到渗透症状和GFP信号。
[0188] 本发明人进一步证明TMV编码的GFP由载体pJL-TRBO-G表达(Lindbo 2007)。将该载体转化为根癌农杆菌(At)中,并与含有不同hpRNA的细菌RNasell1突变体共渗透。使用分光仪测定细菌浓度,并将所有细菌浓度调节至0.9950-1.0050之间的OD600。本发明人进一步证明hpRNA抑制TMV-GFP信号,并通过共浸润含有hpRNA的细菌与含有载体pJL-TRBO-G的农杆菌GV3101来证实。使用的RNasell1突变体和hpRNA列于表3中。
[0189] 如图10-11B所示,本发明人证明了各自表达不同hpRNA的MJM109和HT27都显示出对TMV编码的GFP信号扩散的抑制。本发明人显示穿梭hpRNA载体产生更好的GFP表达抑制。在该示例性实施例中,与HT27相比,MJM109显示出更好的结果。
[0190] 进一步如图11C所示,本发明人已经表明,具有不同hpRNA的MJM109和HT27对TMV编码的GFP信号的扩散显示出不同的抑制。本发明人证明穿梭hpRNA载体具有更好的GFP表达抑制。例如,与HT27相比,MXM109显示出对TMV-GFP信号的抑制增强。本发明人证明,所有hpRNA都可以产生可以在植物中产生RNAi效应的dsRNA结构,这与图11B和其他地方显示的疾病症状一致。
[0191] 图10说明:
[0192] -At:根癌农杆菌;TMV:pJL-TRBO-G;MJM109:M-JM109-GHY2(RNasell1突变体,无抗生素);GHY5:pAD-WRKY-GHY5;GHY6:pAD-ADH-GHY6;GHY3:pOXB-WRKY-GHY3;和GHY4:pOXB-ADH-GHY4。
[0193] 图11说明:
[0194] -At:根癌农杆菌;TMV、TMV表达GFP:pJL-TRBO-G(TMV绿色荧光信号);MJM109:M-JM109-GHY2(RNasell1突变体,无抗生素);HT27,RNaselll突变体,四环素抗性;GHY5:pAD-WRKY-GHY5;GHY6:pAD-ADH-GHY6;GHY3:pOXB-WRKY-GHY3;GHY4:pOXB-ADH-GHY4。
[0195] -A和G:At/TMV;
[0196] -B:At/TMV+M JM 109;
[0197] -H:At/TMV+HT27;
[0198] -C:At/TMV+MJM109/GHY5;
[0199] -D:At/TMV+M JM 109/GHY6;
[0200] -E:At/TMV+MJM109/GHY3;
[0201] -F:At/TMV+MJM109/GHY4;
[0202] -I:At/TMV+HT27/GHY5;
[0203] -J:At/TMV+HT27/GHY6;
[0204] -K:At/TMV+HT27/GHY3;和
[0205] -L:At/TMV+HT27/GHY4。
[0206] 实施例7:证明hpRNA抑制模型烟草植物中TMV编码的GFP信号的扩散。
[0207] 如图12所示,本发明人证明,在At/TMV感染后,烟草植物在6天的时间内接种hpRNA。本发明人证明,在三天内,hpRNA的表达可以抑制TMV编码的GFP信号的扩散。
[0208] 图12说明:
[0209] -A:hpRNAs接种1天后;
[0210] -B:hpRNAs接种2天后;
[0211] -C:hpRNAs接种3天后;
[0212] -D:hpRNAs接种4天后;
[0213] -E:hpRNAs接种5天后;和
[0214] -F:hpRNAs接种6天后。
[0215] 实施例8:证明用烟草中的枯草芽孢杆菌CCB422/pAD-WRKY-GHY5浸润烟草植物[0216] 参照图13,本发明人证明了表达hpRNA的基因修饰枯草芽孢杆菌可成功渗透并抑制烟草中At/TMV信号的扩散。在该实施例中,本发明人证明了具有hpRNA的CCB422可以显著抑制At/TMV信号的扩散。
[0217] 图13说明:
[0218] -At:根癌农杆菌;TMV:pJL-TRBO-G(TMV绿色荧光信号);CCB422(枯草芽孢杆菌RNasell1突变体,大观霉素和卡那霉素抗性);GHY5:pAD-WRKY-GHY5,每次处理重复三次。红色箭头表示渗透区域。
[0219] -A:空白阴性对照
[0220] -B:At/TMV(TMV表达的GFP)
[0221] -C:CCB422(仅是不含有质粒的细菌)
[0222] -D:CCB422/GHY5(具有质粒但没有TMV的细菌)
[0223] -E:TMV+CCB422/GHY5(TMV和hpRNA)
[0224] 实施例9:超囊泡细菌菌株显示出在烟草中抑制At/TMV信号扩散的能力增强。
[0225] 如图14所示,本发明人证明了表达hpRNA的基因修饰枯草芽孢杆菌可成功渗透并抑制烟草中At/TMV信号的扩散。在该实施例中,本发明人证明了具有hpRNA的超囊泡大肠杆菌菌株HT27可显著抑制At/TMV信号的扩散。在该实施例中,本发明人证明,超囊泡菌株可以增加干扰RNA的能力,如hpRNA,抑制目标病原体基因表达。
[0226] 图14说明:
[0227] 右图:上部,三次重复At/TMV处理;下部,较低,三次重复TMV+HT27/GHY5[0228] -At:根癌农杆菌;TMV:pJL-TRBOG(TMV绿色荧光信号);HT27,RNaselll突变体,四环素抗性;GHY5:pAD-WRKY-GHY5,每次重复处理三次。
[0229] -A:空白阴性对照
[0230] -B:At/TMV
[0231] -C:HT27
[0232] -D:HT27/GHY5
[0233] -E:TMV+HT27/GHY5
[0234] 实施例10:模型植物生物中hpRNA介导的GFP信号抑制效率的时程说明。
[0235] 本发明人证明了在规定的时间过程中烟草植物中hpRNA介导的GFP信号抑制。这里,本发明人用hpRNA:MJM109-GHY2/pAD-WRKY-GHY5接种烟草植物,然后在不同日期用At/TMV接种相同的植物。通常如图15所示,在hpRNA接种后,保护模型烟草植物免受修饰的TMV病毒感染至少6dpi。本发明人在图16-17中进一步证明,hpRNA迁移到叶片7dpi内的渗透区域的不同部分。例如,在图16-17中,显示TMV-GFP在7dpi时被hpRNA包围。这证明了接种和抑制目标病毒基因的长期和持续性。
[0236] 图15说明:
[0237] -A:At/TMV接种1天后
[0238] -B:At/TMV接种2天后
[0239] -C:At/TMV接种3天后
[0240] -D:At/TMV接种4天后
[0241] -E:At/TMV接种5天后
[0242] -F:At/TMV接种6天后
[0243] 实施例11:hpRNA能够有效地在烟草中产生siRNA并限制At/TMV信号在烟草中的扩散
[0244] 本发明人证明了hpRNA可以有效地在植物中产生siRNA并限制At/TMV信号的扩散和表达。在该实施例中,如上所述,衍生自MJM 109-GHY2/pAD-WRK Y-GHY5的hpRNA渗入烟草并进一步加工成siRNA。如图18所示,MJM109-GHY2/pAD-WRKY-GHY5衍生的siRNA限制了TMV-GFP信号的扩散。
[0245] 图17说明:
[0246] -黑色箭头表示At/TMV浸润处理。
[0247] -白色箭头表示hpRNA(MJM109-GHY2/pAD-WRKY-GHY5)浸润处理。
[0248] -At:根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens);
[0249] -TMV:pJL-TRBO-G(TMV绿色荧光信号)
[0250] 实施例12:siRNA可以有效地限制烟草中TMV-GFP信号的扩散。
[0251] 本发明人证明了hpRNA可以在植物中有效地产生siRNA并限制TMV-GFP信号的扩散和表达。在该实施例中,M-JM109-GHY2/pAD-WRKY-GHY7衍生的siRNA限制了TMV-GFP信号的扩散和表达(图18A)。此外,本发明人证明,CCB422/pAD-WRKY-GHY5衍生的siRNA也限制了TMV-GFP信号的扩散(图18B)。在该实施例中,本发明人证明了hpRNA可以诱导烟草中RNAi以剂量依赖的方式产生更多的RNAs,并限制TMV-GFP信号的扩散。
[0252] 图18A-B说明:
[0253] -黑色箭头表示At/TMV浸润处理。
[0254] -白色箭头表示hpRNA(MJM 109-GHY2/p AD-WRK Y-GH Y5)浸润处理。
[0255] -图18A:At:根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens);
[0256] -图18B:TMV:pJL-TRBO-G(TMV绿色荧光信号)
[0257] 实施例13:证明蜡状芽孢杆菌的鉴定和定殖。
[0258] 作为示例性实施例,本发明人证明了内生细菌蜡状芽孢杆菌,以表达编码绿色荧光蛋白的穿梭载体pAD43-25可以定殖烟草叶。
[0259] 在该示例性实施例中,蜡状芽孢杆菌53522从ATCC获得,用于鉴定的引物列于表4中。将正确的PCR片段连接到PminiT 20载体载体上,然后用XhoI消化以检查大小是否正确,然后通过DNA序列分析鉴定正确的克隆以证实蜡状芽孢杆菌菌株的特性(图9)。表12中提供了蜡状芽孢杆菌53522(UW85)测序:16S rRNA:1514bp;23S rRNA:855bp;motB:574bp;endo-b-l,4-葡聚糖酶基因:659bp,rnc基因:738bp;SCAP:无PCR条带。
[0260] 实施例14:蜡状芽孢杆菌中hpRNA的转化和表达以及接种和定殖到模型植物生物体中。
[0261] 本发明人将pAD-WRKY-GHY5的穿梭载体pAD43-25和hpRNA载体转化到蜡状芽孢杆菌53522菌株中,然后接种到示例性烟草植物中以证实GFP信号在组成型启动子Pupp下的表达。该信号由本发明人在图19中证实,模型烟草植物中转化蜡状芽孢杆菌的定殖在图20中进一步证明。
[0262] 实施例15:由发夹RNA内生细菌递送介导的病毒编码的GFP蛋白积累/感染严重性的降低。
[0263] 如上所述,预期宿主RNAi机制靶向TMV-GFP RNA转录物会导致病毒RNA降解,从而无法将病毒mRNA翻译成蛋白质。因此,预测通过跨界递送与病毒编码的GFP同源的发夹RNA来增强宿主的RNAi防御,通过触发烟草中的siRNA生物发生,导致病毒编码的GFP积累的丧失或减少,最终赋予对病毒感染的抵抗力。
[0264] 为了评估这一假设,从烟草植物的渗透区域(5dpi)收集2x0.4mm叶盘,该烟草植物感染TMV-GFP,或用TMV-GFP和携带pAD-WRKY-GHY5结构-编码病毒GFP同源发夹RNA的细菌菌株共同渗透,以及实验对照(见图21)。用100μl蛋白质提取缓冲液进行总蛋白质提取,并根据Baumberger和Baulcombe(2005),以15分钟,16,000g,4℃沉淀不溶物质。通过PAGE分离样品并通过半干转移印迹到硝酸纤维素膜上。在蛋白质印迹之前,用Ponceau S对膜进行染色,以允许定量加氧酶最大亚基(RBCL)。通过与抗GFP抗体(Millipore 3F8.2;1:10,000)温育,然后与山羊抗小鼠HRP二级抗体(Agrisera,1:20,000)一起温育来检测病毒GFP。分别使用根据制造商说明书(GE)的ECL western检测试剂盒和ChemiDoc MP成像系统(BioRad)进行信号检测和采集。用Image Lab软件(BioRad)进行GFP信号定量。
[0265] 本发明人在图21中证明了与单独浸润TMV-GFP相比,共浸润TMV-GFP病毒与编码GFP-hpRNA的内生细菌枯草芽孢杆菌CCB422(Durand等人,2012)(图21a,b)导致在受感染的植物中的GFP积累减少。值得注意的是,使用大肠杆菌HT27作为用于跨体递送的载体(图21c)的重复实验,当进行共渗透时未能检测到任何病毒编码的GFP的积累,与不受挑战的TMV感染中观察到的GFP积累形成强烈对比。我们的结果表明,与病毒基因组同源的hpRNA的跨界递送有效地下调或消除了病毒复制和病毒蛋白的翻译。
[0266] 实施例16:用于通过HT27/pAD-WRKY-GFTY5监测TMV-GFP mRNA抑制的qPCR。
[0267] L25核糖体蛋白基因mRNA水平用作烟草参考基因,靶向TMV-GFP RNA扩增的引物用于定量PCR实验(qPCR),用于分析不同生物处理中感染TMV-GFP、TMV-GFP+细菌和TMV+表达hpRNA-GFP的细菌的相对RNA水平。通过使用iwVVanaTM miRNA分离试剂盒从不同处理过的烟草叶中提取总RNA。使用EcoDryTM Premix试剂盒合成cDNA。使用iTaq TM UniversalS.GreenSupermix进行QRT-PCR。结果一般显示在图22和表6中。
[0268] 本发明人证明了由于细菌的存在导致TMV-GFP的减少(~43%)。本发明人证明,表达hpDNA-GFP细菌的GFP RNA水平降低了近90%,与增强的siRNA介导的TMV-GFP RNA水平的干扰一致。
[0269] 表格
[0270] 表1:用于构建hpRNA的引物。粗体碱基是重叠序列。斜体碱基是插入序列。(SEQ ID NO.1-25)
[0271]
[0272] 表2:用于构建M-JM109-GY1和M-JM109-GHY2的引物。加下划线的碱基是与大肠杆菌rnc基因的50bp同源序列。斜体碱基是用于扩增卡那霉素抗性标记的引物。*表示硫代磷酸酯化的引物。SEQ IDNO.45至52是从中间列的顶部到底部顺序编号。
[0273]
[0274] 表3:大肠杆菌RNasell1突变体和编码hpRNA的相关质粒,以及用于烟草植物浸润测定的农杆菌。
[0275]
[0276] 表4:用于鉴定和验证从顶部到底部或中间列编号的芽孢杆菌SEQ ID No.53至62的引物。
[0277]
[0278] 表5:附加动员基因
[0279]
[0280] 表6:用于图22中qRT-PCR的引物。
[0281]引物名字 序列(5-3) 目的和参考
L25F1 CCCCTCACCACAGAGTCTGC 烟草参考基因
L25R1 AAGGGTGTTGTTGTCCTCAATCTT (Schmidt&Delaney,2010)
TMV-GFP-F2 GATGACGGGAACTACAAGACG 本研究设计的
TMV-GFP-R2 GTTTGTGTCCGAGAATGTTTCC 扩增TMV-GFP
[0282] 表7:增强dsRNA递送的辅助基因菌株
[0283]
[0284] 表8:增强dsRNA递送的辅助基因
[0285]
[0286] 序列表
[0287] 表9:内含子序列的序列表
[0288] >WRKY_intron-287(SEQ ID NO.26)
[0289] CTCCTCCTCTGCTAACGTAAGCCTCTCTGTTTTTTTTCTCTGTTTCTTTTGAAATGAATCCAATTAGTGATGATAATCTGTGTTTGATGTATCATTGATTTAACATCTTGACAATGAATCGTGATCGGAAGTGATAAAGTTATGGGTCAACGGTTTCAAAGAGAGAGAAAGACTTTTAGAGTCAACTCTCGACTCTTTCTTAATTATGTTATTGCTATTTGTCTCTTTTCTTGAAGTCTGAACAATTCTTGGGATTGTTTTGCAGGTTCTAGCTTCTCCAACCACAG
[0290] >adhl_intron-566:(SEQ ID NO.27)
[0291] GATCAAGTGCAAAGGTCCGCCTTGTTTCTCCTCTGTCTCTTGATCTGACTAATCTTGGTTTATGATTCGTTGAGTAATTTTGGGGAAAGCTAGCTTCGTCCACAGTTTTTTTTTCGATGAACAGTGCCGCAGTGGCGCTGATCTTGTATGCTATCCTGCAATCGTGGTGAACTTATGTCTTTTATATCCTTCACTACCATGAAAAGACTAGCTAGTAATCTTTCTCGATGTAACATCGTCCAGCACTGCTATTACCGTGTGGTCCATCCGACAGTCTGGCTGAACACATCATACGATATTGAGCAAAGATCGATCTATCTTCCCTGTTCTTTAATGAAAGACGTCATTTTCATCAGTATGATCTAAGAATGTTGCAACTTGCAAGGAGGCGTTTCTTTCTTTGAATTTAACTAACTCGTTGAGTGGCCCTGTTTCTCGGACGTAAGGCCTTTGCTGCTCCACACATGTCCATTCGAATTTTACCGTGTTTAGCAAGGGCGAAAAGTTTGCATCTTGATGATTTAGCTTGACTATGCGATTGCTTTCCTGGACCCGTGCAGCTGCGG
[0292] >TMV-GFP-dsRNA-360(SEQ ID NO.28)
[0293] TGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACATGACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCTTT
[0294] >TMV-MP-dsRNA-360(SEQ ID NO.29)
[0295] TCTCGGATCTTACTACACAGCAGCTGCAAAGAAAAGATTTCAGTTCAAGGTCGTTCCCAATTATGCTATAACCACCCAGGACGCGATGAAAAACGTCTGGCAAGTTTTAGTTAATATTAGAAATGTGAAGATGTCAGCGGGTTTCTGTCCGCTTTCTCTGGAGTTTGTGTCGGTGTGTATTGTTTATAGAAATAATATAAAATTAGGTTTGAGAGAGAAGATTACAAACGTGAGAGACGGAGGGCCCATGGAACTTACAGAAGAAGTCGTTGATGAGTTCATGGAAGATGTCCCTATGTCGATCAGGCTTGCAAAGTTTCGATCTCGAACCGGAAAAAAGAGTGATGTCCGCAAAGGGAA
[0296] 表10:示例性hpRNA的序列表
[0297] >pAD-WRKY-GHYl(SEQ ID NO.30)
[0298] 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GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCGCGTGAAAGAAATTTTCGGCGCAGAGCACGTAAATGTTCAACCACACTCTGGTGCACAAGCGAACATGGCAGTATACTTCACGATTTTAGAGCAAGGCGATACAGTACTTGGTATGAATTTATCTCATGGTGGTCACTTAACACACGGAAGCCCTGTTAACTTCAGTGGAGTACAATATAATTTCGTAGAATATGGCGTGGATGCTGACTCTCACCGTATTAATTACGATGATGTATTAGCAAAAGCGAAAGAACATAAACCAAAATTAATCGTTGCAGGTGCAAGTGCATACCCTCGTGTTATCGATTTCAAGCGATTCCGTGAGATTGCAGATGAAGTGGGCGCTTATTTAATGGTTGATATGGCACATATCGCTGGTTTAGTAGCTGCTGGTTTACATCCAAATCCAGTACCACATGCACATTTCGTTACAACGACAACACATAAAACGTTACGTGGCCCGCGTGGTGGTATGATTTTATGTGAAGAGCAATTTGCAAAACAAATTGATAAATCAATCTTCCCTGGTATTCAAGGTGGTCCACTTATGCACGTAATCGCTGCAAAAGCTGTTGCGTTTGGTGAAGCACTTCAAGATGATTTCAAAACATATGCACAAAATATCATTAACAATGCGAACCGCTTAGCTGAAGGTCTTCAAAAAGAAGGACTTACACTTGTTTCTGGCGGAACAGACAATCACTTAATCTTGATTGATGTTCGTAACTTAGAAATCACAGGTAAAGTAGCAGAGCACGTATTAGATGAAGTTGGTATTACAGTGAACAAAAATACAATTCCATTTGAAACAGCAAGCCCATTTGTAACAAGTGGTGTACGTATCGGTACAGCAGCTGTAACATCTCGTGGTTTCGGTTTAGAAGAAATGGATGAAATTGCGTCACTTATTGCTTATACATTAAAAAATCATGAAAATGAAGCTGCATTAGAAGAAGTACGTAAGCGTGTAGAAGCGTTAACTAGCAAATTTCCAATGTATCCAAATCTATAATAGATTGAAGAAGACTGCCGAGACTTAATTGTTTTGGCGGTCTTTTTTGTGGACATATATTATTTTTAAAGTATGTATACAAATGATGAATAAATTTTGGCGATATAATGAAGGATACAGCTCCCATAATTGGTAAAGATACTAGATAGATTCATCGTAAAATCATGATTTTGCCAAATTTGCCCTTGAATATTAGTAGCGTTTTCTTTACAATCGTAAATAGTGTAAAAAAGCGTGCAAACGCATGAATATCATCTAAAGGAGAGATTCACATGGGAAAACTGTATGTATTTGATCCTCTAGATTTAAGAAGGAGATATACATTCTCGGATCTTACTACACAGCAGCTGCAAAGAAAAGATTTCAGTTCAAGGTCGTTCCCAATTATGCTATAACCACCCAGGACGCGATGAAAAACGTCTGGCAAGTTTTAGTTAATATTAGAAATGTGAAGATGTCAGCGGGTTTCTGTCCGCTTTCTCTGGAGTTTGTGTCGGTGTGTATTGTTTATAGAAATAATATAAAATTAGGTTTGAGAGAGAAGATTACAAACGTGAGAGACGGAGGGCCCATGGAACTTACAGAAGAAGTCGTTGATGAGTTCATGGAAGATGTCCCTATGTCGATCAGGCTTGCAAAGTTTCGATCTCGAACCGGAAAAAAGAGTGATGTCCGCAAAGGGAACTCCTCCTCTGCTAACGTAAGCCTCTCTGTTTTTTTTCTCTGTTTCTTTTGAAATGAATCCAATTAGTGATGATAATCTGTGTTTGATGTATCATTGATTTAACATCTTGACAATGAATCGTGATCGGAAGTGATAAAGTTATGGGTCAACGGTTTCAAAGAGAGAGAAAGACTTTTAGAGTCAACTCTCGACTCTTTCTTAATTATGTTATTGCTATTTGTCTCTTTTCTTGAAGTCTGAACAATTCTTGGGATTGTTTTGCAGGTTCTAGCTTCTCCAACCACAGTTCCCTTTGCGGACATCACTCTTTTTTCCGGTTCGAGATCGAAACTTTGCAAGCCTGATCGACATAGGGACATCTTCCATGAACTCATCAACGACTTCTTCTGTAAGTTCCATGGGCCCTCCGTCTCTCACGTTTGTAATCTTCTCTCTCAAACCTAATTTTATATTATTTCTATAAACAATACACACCGACACAAACTCCAGAGAAAGCGGACAGAAACCCGCTGACATCTTCACATTTCTAATATTAACTAAAACTTGCCAGACGTTTTTCATCGCGTCCTGGGTGGTTATAGCATAATTGGGAACGACCTTGAACTGAAATCTTTTCTTTGCAGCTGCTGTGTAGTAAGATCCGAGATGCATAAACTGCATCCCTTAACTTGTTTTTCGTGTGCCTATTTTTTGTGAATCGCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATACAAAACATATTTCAACACAATACAAATGGGTTAGTTAAAAAAGCAGGCCTTCTAAAGGTCTGCTTTTTTTATTTGATTATGTAATTTTTAATGCCAGGATGCCAATAAGCCATAACCTCAAATGCACCATTTGCAACCTCGTCATCTTCTTCCTCAATCTTGACCAGATCGCCGTCCTCCGCATCACCAAGATTCAGCTCTTTATGTATCTCCTTCAAAATGCCACCGTATCCAATTAACCTTCGAGCTGCCAACGCATCATCCAAGTAAAGCACCGTGTTCAGATTGTCTTCAGTCACCTTATTACCGCGCACACAATCCGTATCCTTAACCGGATATTTAGAGATTTCGCGAACAGCTTTTTGCTCCATCATTGCGTTCCGCACATCGTTTTCAATCTGTTCAGCGTCAATCTTAGCTTTACCTTTCACTCGACGAATATCGACAATTGGAGTGTAATCCAATTTCATCGCCTTTTTCCAAAGGCTCGTCCACTCCGCCTGCTTAATATAGTTTTTCCCAAAATAATTTTTCCTTACTGGTATCAACACATGAAAATGAGGATGATATGTATCTTCTTCATGATTTTTGGTAATCTCTAAAGCTCTGAAAAATCCAAGAACCGAAGTTTTTACTTTTTTGTACTGGAACAGTTTCCTAAAGCCTTCCATCATCGCAGAAATTTGTGGCTTCAGCCGTTCTCCCTTTACATTTCGAATCGTCAGCGTGAGAAAAATCCATCCGCAGCCGTACTGTCTATTGGCTTCCTCTACGATCAACTTATTGTGATAAGCAATTTTTAACGACCTGCGCCACGCACACATCGGACATAACCTCACTTTACAAAAATGGGCTTGATACAGTTTTAACTTGCCCGTCTCCGGGTCTCTCTTAAACGAAAGATACTCTGCACAACTAATTAGTTTTTCAGCCTTTTTGCCATAGTAAGGTGCCCCAATCTTACTCTCTAACGCTTCGTAATGCTCCGCCATGAGGTTCGTCCGTCTCTTTTTCCCCTTCCAATCCCGCTTTTTACCTGTTGCGGTTTTATCTTCGAGGATGCTATAATCATTTTCAGATGAATAAATCAACAAAAAAACTCCTTCTGAGCTAGTTCTCTAGCATTCTATTATTTTGATTCGACACCTTAATAATAGCAGAAGGAGTTTTTACCTGTCAAAGAACCATCAAACCCTTGATACACAAGGCTTTGACCTAATTTTGAAAAATGATGTTGTTTCTATATAGTATCAAGATAAGAAAGAAAAGGATTTTTCGCTACGCTCAAATCCTTTAAAAAAACACAAAAGACCACATTTTTTAATGTGGTCTTTATTCTTCAACTAAAGCACCCATTAGTTCAACAAACGAAAATTGGATAAAGTGGGATATTTTTAAAATATATATTTATGTTACAGTAATATTGACTTTTAAAAAAGGATTGATTCTAATGAAGAAAGCAGACAAGTAAGCCTCCTAAATTCACTTTAGATAAAAATTTAGGAGGCATATCAAATGAACTTTAATAAAATTGATTTAGACAATTGGAAGAGAAAAGAGATATTTAATCATTATTTGAACCAACAAACGACTTTTAGTATAACCACAGAAATTGATATTAGTGTTTTATACCGAAACATAAAACAAGAAGGATATAAATTTTACCCTGCATTTATTTTCTTAGTGACAAGGGTGATAAACTCAAATACAGCTTTTAGAACTGGTTACAATAGCGACGGAGAGTTAGGTTATTGGGATAAGTTAGAGCCACTTTATACAATTTTTGATGGTGTATCTAAAACATTCTCTGGTATTTGGACTCCTGTAAAGAATGACTTCAAAGAGTTTTATGATTTATACCTTTCTGATGTAGAGAAATATAATGGTTCGGGGAAATTGTTTCCCAAAACACCTATACCTGAAAATGCTTTTTCTCTTTCTATTATTCCATGGACTTCATTTACTGGGTTTAACTTAAATATCAATAATAATAGTAATTACCTTCTACCCATTATTACAGCAGGAAAATTCATTAATAAAGGTAATTCAATATATTTACCGCTATCTTTACAGGTACATCATTCTGTTTGTGATGGTTATCATGCAGGATTGTTTATGAACTCTATTCAGGAATTGTCAGATAGGCCTAATGACTGGCTTTTATAATATGAGATAATGCCGACTGTACTTTTTACAGTCGGTTTTCTAATGTCACTAACCTGCCCCGTTAGTCGCCATTCGCCAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATGTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAA
[0311] 表11:RNaselll突变体的序列表
[0312] >Escherichia_coH_str._K-12_substr.MG1655_rncgene(SEQ ID NO.37)
[0313] ATGAACCCCATCGTAATTAATCGGCTTCAACGGAAGCTGGGCTACACTTTTAATCATCAGGAACTGTTGCAGCAGGCATTAACTCATCGTAGTGCCAGCAGTAAACATAACGAGCGTTTAGAATTTTTAGGCGACTCTATTCTGAGCTACGTTATCGCCAATGCGCTTTATCACCGTTTCCCTCGTGTGGATGAAGGCGATATGAGCCGGATGCGCGCCACGCTGGTCCGTGGCAATACGCTGGCGGAACTGGCGCGCGAATTTGAGTTAGGCGAGTGCTTACGTTTAGGGCCAGGTGAACTTAAAAGCGGTGGATTTCGTCGTGAGTCAATTCTCGCCGACACCGTCGAAGCATTAATTGGTGGCGTATTCCTCGACAGTGATATTCAAACCGTCGAGAAATTAATCCTCAACTGGTATCAAACTCGTTTGGACGAAATTAGCCCAGGCGATAAACAAAAAGATCCGAAAACGCGCTTGCAAGAATATTTGCAGGGTCGCCATCTGCCGCTGCCGACTTATCTGGTAGTCCAGGTACGTGGCGAAGCGCACGATCAGGAATTTACTATCCACTGCCAGGTCAGCGGCCTGAGTGAACCGGTGGTTGGCACAGGTTCAAGCCGTCGTAAGGCTGAGCAGGCTGCCGCCGAACAGGCGTTGAAAAAACTGGAGCTGGAATGA[0314] >M-JM109-GHYl-Kanymycin-resistant-mutant-1936bp(SEQ ID NO.38)
[0315] ACCGGTAAACTGAAACTGCAGCGAAGCAGTTAGCAGAACCATGTATATCAGGTCTGTTTCGTGTGCTGAATTGTTGACGCATTTATTTATTGGTATCGCATGAACCCCATCGTAATTAATCGGCTTCAACGGAAGCTGGGCTACACTTTAGCGATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCAAGATCCCCTCACGCTGCCGCAAGCACTCAGGGCGCAAGGGCTGCTAAAGGAAGCGGAACACGTAGAAAGCCAGTCCGCAGAAACGGTGCTGACCCCGGATGAATGTCAGCTACTGGGCTATCTGGACAAGGGAAAACGCAAGCGCAAAGAGAAAGCAGGTAGCTTGCAGTGGGCTTACATGGCGATAGCTAGACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTTGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAGCTTCAAAAGCGCTCTGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTAAGGAGGATATTCATATGGACCATGGCTAATTCCCATGTCAGCCGTTAACGCTGCCGACTTATCTGGTAGTCCAGGTACGTGGCGAAGCGCACGATCAGGAATTTACTATCCACTGCCAGGTCAGCGGCCTGAGTGAACCGGTGGTTGGCACAGGTTCAAGCCGTCGTAAGGCTGAGCAGGCTGCCGCCGAACAGGCGTTGAAAAAACTGGAGCTGGAATGAGCATCGATAAAAGTTACTGCGGATTTATTGCCATCGTCGGACGTCCGAACGTTGGCAAATCCACATTGTTGAACAAACTGCTGGGGCAGAAAATCTCCA
[0316] >M-JM109-GHYl-mutant-S43bp(SEQ ID NO.39)
[0317] ACCGGTAAACTGAAACTGCAGCGAAGCAGTTAGCAGAACCATGTATATCAGGTCTGTTTCGTGTGCTGAATTGTTGACGCATTTATTTATTGGTATCGCATGAACCCCATCGTAATTAATCGGCTTCAACGGAAGCTGGGCTACACTTTAGCGATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTAAGGAGGATATTCATATGGACCATGGCTAATTCCCATGTCAGCCGTTAACGCTGCCGACTTATCTGGTAGTCCAGGTACGTGGCGAAGCGCACGATCAGGAATTTACTATCCACTGCCAGGTCAGCGGCCTGAGTGAACCGGTGGTTGGCACAGGTTCAAGCCGTCGTAAGGCTGAGCAGGCTGCCGCCGAACAGGCGTTGAAAAAACTGGAGCTGGAATGAGCATCGATAAAAGTTACTGCGGATTTATTGCCATCGTCGGACGTCCGAACGTTGGCAAATCCACATTGTTGAACAAACTGCTGGGGCAGAAAATCTCCA
[0318] 表12:蜡样芽胞杆菌53522(UW85)序列的序列表
[0319] >Bc53522-16SrRNA-compIete-1514(SEQ ID NO.40)
[0320] AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTGAGAGCTTGCTCTCAAGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCG
[0321] >BC53522-23S-rRNA-complete-855(SEQ ID NO.41)
[0322] AGAGTGCGTAATAGCTCACTAGTCGAGTGACTCTGCGCCGAAAATGTACCGGGGCTAAATACACCACCGAAGCTGCGAATTGATACCAATGGTATCAGTGGTAGGGGAGCGTTCTAAGTGCAGTGAAGTCAGACCGGAAGGACTGGTGGAGCGCTTAGAAGTGAGAATGCCGGTATGAGTAGCGAAAGACGGGTGAGAATCCCGTCCACCGAATGCCTAAGGTTTCCTGAGGAAGGCTCGTCCGCTCAGGGTTAGTCAGGACCTAAGCCGAGGCCGACAGGCGTAGGCGATGGACAACAGGTTGATATTCCTGTACCACCTCTTTATCGTTTGAGCAATGGAGGGACGCAGAAGGATAGAAGAAGCGTGCGATTGGTTGTGCACGTCCAAGCAGTTAGGCTGATAAGTAGGCAAATCCGCTTATCGTGAAGGCTGAGCTGTGATGGGGAAGCTCCTTATGGAGCGAAGTCTTTGATTCCCCGCTGCCAAGAAAAGCTTCTAGCGAGATAAAAGGTGCCTGTACCGCAAACCGACACAGGTAGGCGAGGAGAGAATCCTAAGGTGTGCGAGAGAACTCTGGTTAAGGAACTCGGCAAAATGACCCCGTAACTTCGGGAGAAGGGGTGCTTTCTTAACGGAAAGCCGCAGTGAATAGGCCCAAGCGACTGTTTAGCAAAAACACAGCTCTCTGCGAAGCCGTAAGGCGAAGTATAGGGGGTGACACCTGCCCGGTGCTGGAAGGTTAAGGAGAGGGGTTAGCGTAAGCGAAGCTCTGAACTGAAGCCCCAGTAAACGGCGGCCGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAAATTCCTTGTCGGTAAGTTCTAGACCG
[0323] >BC53522-raotB-574(SEQ ID NO.42)
[0324] TCGCCTCGTTGGATGACGACTTTTACAGATTTAACGATGTTATTATTAACTTTCTTCGTATTACTAGTTGCTACATCAAAGCAAGATGCAGTAAAATTGTCAAAGATGCTTGAAAATTTTAGTGATACGGGGCAAGTAGATGCAAAAGTAATGGAAAATACAATACCAGATATTTCACATGAAAAAAATGATGAAAAAATGATCTCAAAAAAGAGAATGGATGAATTATATAAGAAGTTGAAAGCGTATGTAGATAATAACGGTATTAGTCAAGTGAATGTATATCGAGAGGATACAGGGGTAAGCGTCGTTATAGTAGATAATTTAATATTTGATACAGGCGATGCGAACGTTAAGCCCGAAGCGAAAGGGATAATAAGTCAATTAGTTGGATTTTTTCAATCCGTACCTAACCCAATTGTTGTAGAGGGACATACAGATAGTAGACCTATTCATAACGAGAAATTCCCTTCTAATTGGGAGTTATCTTCAGCACGAGCGGCAAATATGATTCACCATTTAATTGAAGTGTATAATGTGGATGATAAAAGGCTAGCTGCGGTAGGATATGCAG
[0325] >Bc53522-endoglucanase-complete-659(SEQ ID NO.43)
[0326] CCAGTAGCCAAGAATGGCCAGCAACCAGCAAGTGGATTCCAACCGCCTGATTTCATTAGTTCTGACATTTCTTTTTGATACTGCTTTTGTTTTTCAAGGTCTTTGCTTACATCACCGTACTTTTTCTTTAGCTTCTGCAGTTCAGGTTGCATTTTCTTCATTTTCGCTTGACTGCGATATTGCGAAACAGCTAATGGAATCATTGCTGAACGAATAACGAGCGTCATAATAATGATGGCAATCCCAAAGCTAGCTCCAGGTATATGATGAGCGACAAATTGAATCATAAACGAGATTGGATATACAAAATAATGATCCCAAATCCCAGTACTATGTGCATCAATTGGGGCTGCATTACTGCAACCAGATAAAACAAAAACAAATAATAATGATAAACTAACGAGCACAGCTCGGTATGATTTTAACATGTTCATTCCTCCAATGTTTCGTAATTATTTAGCGAAACATTGGTGTATACGGACCGACCTCGTCATTCTCTTCACTTGATTCTTGTCTGCGTACAGAACGAATCATTCCATATTTATAAAAAATAGAAAATAGCGGTACATTTCCCGCACTATCTTCACATGTATCAACTAGCGCAAAAGCTCTTTGTCTACCGCTTGATGCTTGTTGACGCACAAAGCGGCGATTATTCC
[0327] >Bacillus-cereus-53522-correct-rnc-738(SEQ ID NO.44)
[0328] ATGCCGTACCGAAAATATAGAGAAAAAAAATACGAAACAAAATATCGTGAAGCATTTAAAGTGTTTCAAGAAAAGATAGGTATTACGTTTACAGATGAAAAATTATTGATTCAAGCATTTACGCATTCATCGTATGTGAATGAGCATCGAAAAAAACCGCATGAAGATAATGAGCGTCTTGAATTTCTTGGAGATGCAGTATTGGAACTTACTGTATCGCAGTATCTGTTTCAAAAATATCCGACAATGAGCGAAGGAGAGTTAACAAAACTACGTGCAGCTATTGTATGTGAGCCATCTCTTGTTCGTTTTGCGAACGAATTGTCATTTGGTAGCCTTGTTTTATTAGGAAAAGGTGAAGAAATGACAGGTGGACGTGAACGACCAGCTTTATTAGCGGATGTCTTTGAAGCGTTTATTGGTGCCCTTTATCTTGATCAAGGGTTAGAAACAGTTTGGGAATTCTTAAAAGAAATTGTATATCCGAAAATTAATGAGGGTGCTTTTTCTCATGTGATGGATTATAAGAGTCAGTTACAAGAATTGATTCAGCGTGATGGTAGTGGCAATGTTGAGTATCAAATTTTGCAAGAAAAAGGACCAGCTCACAATCGAGAATTTGTGTCACGTGTTACGTTAAATAACGTAGCTTTAGGTCTTGGTAGTGGTAAGTCGAAAAAAGAAGCAGAGCAACAAGCTGCTGCAGAAGCATTGAAAAAATTAAAAGAACAACTATAA
[0329] 参考文献
[0330] 以下参考文献通过引用整体并入本文:
[0331] 1.AsheS,MajiU,SenR,Mohanty S,MaitiN.2014.Specific oligonucleotide primers for detection of endoglucanase positive Bacillus subtilis by PCR.3Biotech 4(5):461-465.
[0332] 2.Dunn AK,Handelsman J.1999.A vector for promoter trapping in Bacillus cereus.Gene 226(2):297-305.
[0333] 3.Durand S,Gilet L,Condon C.2012.The essential function of B.subtilis RNaseIII is to silence foreign toxin genes.PLoS Genetics 8(12):el003181.[0334] 4.Eamens A,Wang M-B,Smith NA,Waterhouse PM.2008.RNA silencing in plants:yesterday,today,and tomorrow.Plant Physiology 147(2):456-468.
[0335] 5.Graumann P.2012.Bacillus:cellular and molecular biology.Horizon Scientific Press.
[0336] 6.Hong CE,Jo SH,Moon JY,Lee J-S,Kwon S-Y,Park JM.2015.Isolation of novel leaf-inhabiting endophytic bacteria in Arabidopsis thaliana and their antagonistic effects on phytophathogens.Plant Biotechnology Reports 9(6):451-458.
[0337] 7.Jensen SI,Lennen RM,Herrgard MJ,Nielsen AT.2015.Seven gene deletions in seven days:Fast generation of Escherichia coli strains tolerant to acetate and osmotic stress.Scientific Reports 5:17874.
[0338] 8.Lindbo JA.2007.TRBO:a high-efficiency tobacco mosaic virus RNA-based overexpression vector.Plant physiology 145(4):1232-1240.
[0339] 9.Lozano GL,Holt J,Ravel J,Rasko DA,Thomas MG,Handelsman J.2016.Draft genome sequence of biocontrol agent Bacillus cereus UW85.Genome Announcements 4(5):e00910-16.
[0340] 10.Niines C,Bajji M,Stepien V,Manso T,Torres R,Usall J,Jijakli MH.2008.Development and application of a SCAR marker to monitor and quantify populations of the postharvest biocontrol agent Pantoea agglomerans CPA-
2.Postharvest Biology and Technology 47(3):422-428.
[0341] 11.Oehrle NW,Karr DB,Kremer RJ,Emerich DW.2000.Enhanced attachment of Bradyrhizobium japonicum to soybean through reduced root colonization of internally seedborne microorganisms.Canadian Journal of Microbiology 46(7):600-606.
[0342] 12.Oliwa-StasiakK,Molnar  C,Arshak  K,Bartoszcze  M,Adley C.2010.Development of a PCR assay for identification of the Bacillus cereus group species.Journal of Applied Microbiology 108(l):266-273.
[0343] 13.Petersen DJ,Shishido M,Holl FB,Chanway CP.1995.Use of species-and strain-specific PCR primers for identification of conifer root-associated Bacillus spp.FEMS Microbiology Letters 133(l-2):71-76.
[0344] 14.Raffel SJ,Stabb EV,Milner JL,Handelsman J.1996,Genotypic and phenotypic analysis of zwittermicin A-producing strains of Bacillus cereus.Microbiology 142(12):3425-3436.
[0345] 15.Rajendran G,Sing F,Desai AJ,Archana G.2008,Enhanced growth and nodulation of pigeon pea by co-inoculation of Bacillus strains with Rhizobium spp.Bioresource Technology 99(11):4544-4550.
[0346] 16.Selvakumar G,Kundu S,Gupta AD,Shouche YS,Gupta HS.2008.Isolation and characterization of nonrhizobial plant growth promoting bacteria from nodules of Kudzu(Puerariathunbergiand)and their effect on wheat seedling growth.Current Microbiology 56(2):134-139.
[0347] 17.Smith NA,Singh SP,Wang M-B,Stoutjesdijk PA,Green AG,Waterhouse PM.2000.Gene expression:total silencing by intron-spliced hairpin RNAs.Nature 407(6802):319-320.
[0348] 18.Takiff HE,Chen S-M.1989.Genetic analysis of the mc operon of Escherichia coli.Journal of Bacteriology 171(5):2581-2590.
[0349] 19.Weisburg WG,Barns SM,Pelletier DA,Lane DJ.1991.16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.Journal of Bacteriology 173(2):697-703.[0350] 20.Yin G,Sun Z,Liu N,Zhang L,Song Y,Zhu C,Wen F.2009.Production of double-stranded RNA for interference with TMV infection utilizing a bacterial prokaryotic expression system.Applied Microbiology and Biotechnology 84(2):323-333.
[0351] 21.Baumberger N,Baulcombe DC,(2005)Arabidopsis ARGONAUTE1 is an RNA Slicer that selectively recruits microRNAs and short interfering RNAs,PNAS102(33):11928-33
[0352] 22.Durand S,Gilet L,Condon C,(2012)The Essential Function of B.subtilis RNaseIII Is to Silence Foreign Toxin Genes,Plos Genet 8(12):
el003181
[0353] 23.Schmidt,G.W.and Delaney,S.K.2010.Stable internal reference genes for normalization of real-time RT-PCR in tobacco(Nicotianatabacum)during development and abiotic stress.Molecular Genetics and Genomics.283:233-241.[0354] 24.Bindschedler,L.V.,Panstruga,R and Spanu,P.D.2016.Mildew-omics:how global analyses aid the understanding of life and evolution of powdery mildews,Frontiers in Plant Science.7:
[0355] 25.Brading,P.A.,Verstappen,E.C.,Kema,G.H.and Brown,J.K.2002.Agene-for-gene relationship between wheat and Mycosphaerella graminicola,the Septoria tritici blotch pathogen.Phytopathology.92:439-445.
[0356] 26.Cannon,P.,Damm,U.,Johnston,P.and Weir,B.2012.Colletotnchum-current status and future directions.Studies in Mycology.73:181-213.
[0357] 27.Cantu,D.,Segovia,V.,Maclean,D.,Bayles,R.,Chen,X.,Kamoun,S.,Dubcovsky,J.,Saunders,D.G.andUauy,C.2013.Genome analyses of the wheat yellow(stripe)rust pathogen Puccinia striiformis f.sp.tritici reveal polymorphic and  haustorial  expressed  secreted  proteins  as  candidate 
effectors.BMCGenomics.14:270.
[0358] 28.Chen,X.2005.Epidemiology and control of stripe rust[Puccinia striiformis f.sp.tritici]on wheat.Canadian Journal of Plant Pathology.27:314-337.
[0359] 29.Di Pietro,A.,Garcia-Maceira,F.I.,Meglecz,E.and Roncero,M.I.G.2001.A MAP kinase of the vascular wiltfungus Fusarium oxysporum is essential for root penetration and pathogenesis.Molecular Microbiology.39:
1140-1152.
[0360] 30.Di Pietro,A.and Roncero,M.I.G.1998.Cloning,expression,and role in pathogenicity of pgl encoding the major extracellular endopolygalacturonase of the vascular wilt pathogen Fusarium oxysporum.Molecular Plant-Microbe Interactions.11:91-98.
[0361] 31.Dong,Y.,Li,Y.,Zhao,M.,Jing,M.,Liu,X.,Liu,M.,Guo,X.,Zhang,X.,Chen,Y.and Liu,Y.2015.Global genome and transcriptome analyses of Magnaporthe oryzae epidemic isolate98-06 uncover novel effectors and pathogenicity-related genes,revealing gene gain and lose dynamics in genome evolution.PLoS Pathogens.11:el004801.
[0362] 32.Dufresne,M.;Bailey,J.A.,Dron,M.and Langin,T.1998.clkl,a serine/threonine protein kinase-encoding gene,is involved in pathogenicity of Colletotrichum lindemuthianum on common bean.Molecular Plant-Microbe Interactions.11:99-108.
[0363] 33.Diirrenberger,F.and Kronstad,J.1999.The ukcl gene encodes a protein kinase involved in morphogenesis,pathogenicity and pigment formation in Ustilago maydis.Molecular and General Genetics MGG.261:281-289.
[0364] 34.Flor,H.1956.The complementary genie systems in flax and flax rust.Advances in Genetics.8:29-54.
[0365] 35.Goodwin,S.B.,M'barek,S.B.,Dhillon,B.,Wittenberg,A.H.,Crane,C.F.,Hane,J.K.,Foster,A.J.,VanDerLee,T.A.,Grimwood,J.andAerts,A.2011.Finished genome of the fungal wheat pathogen Mycosphaerella graminicola reveals dispensome structure,chromosome plasticity,and stealth pathogenesis.PLoS Genetics.7:el002070.
[0366] 36.Goswami,R.S.and Kistler,H.C.2004.Heading for disaster:Fusarium graminearum on cereal crops,Molecular Plant Pathology.5:515-525.
[0367] 37.Have,A.T.,Mulder,W.,Visser,J.and VanKan,J.A.1998.The endopolygalacturonase gene Bcpgl is required for full virulence of Botrytis cinerea.Molecular Plant-Microbe Interactions.11:1009-1016.
[0368] 38.Jenczmionka,N.J.,Maier,F.J.,Losch,A.P.and Schafer,W.2003.Mating,conidiation and pathogenicity of Fusarium graminearum,the main causal agent of the head-blight disease of wheat,are regulated  by the MAP kinase gpmkl.CurrentGenetics.43:87-95.
[0369] 39.Kamper,J.,Kallmann,R.,Bolker,M.:Ma,L.-J.,Brefort,T.,Saville,B.J.,Banuett,F.,Kronstad,J.W.,Gold,S.E.and Miiller,O.2006.Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.Nature.444:97-101.[0370] 40.Lawrence,G.,Mayo,G.and Shepherd,K.1981.Interactions between genes controlling pathogenicity in the flax rust fungus[Melampsora linil].Phytopathology(USA).
[0371] 41.Lo,S.-C.C,Hipskind,J.D.and Nicholson,R.L.1999.cDNA cloning of a sorghum pathogenesis-related protein(PR-10)and differential expression of defense-related genes following inoculation with Cochliobolus heterostrophus or Colletotrichum sublineolum.Molecular Plant-Microbe Interactions.12:479-489.
[0372] 42.Mehrabi,R.,VanDerLee,T.,Waalwijk,C.and Kema,G.H.2006.MgSlt2,a cellular integrity MAP kinase  gene  of the fungal wheat  pathogen Mycosphaerella graminicola,is dispensable for penetration but essential for invasive growth.Molecular Plant-Microbe Interactions.19:389-398.
[0373] 43.Michielse,C.B.and Rep,M.2009.Pathogen profile update:Fusarium oxysporum.Molecular Plant Pathology.10:311-324.
[0374] 44.Miiller,P.,Aichinger,C,Feldbrugge,M.and Kahmann,R.1999.The MAP kinase kpp2 regulates mating and pathogenic development in Ustilago maydis.Molecular Microbiology.34:1007-1017.
[0375] 45.Nemri,A.,Saunders,D.G.,Anderson,C,Upadhyaya,N.M.,Win,J.,Lawrence,G.J.,Jones,D.A.,Kamoun,S.,Ellis,J.G.and Dodds,P.N.2014.The genome sequence and effector complement of the flax rust pathogen Melampsora lini.Frontiersin Plant Science.5:
[0376] 46.Nowara,D.,Gay,A.,Lacomme,C,Shaw,J.,Ridout,C,Douchkov,D.,Hensel,G.,Kumlehn,J.andSchweizer,P.2010.HIGS:host-induced gene silencing in the obligate biotrophic fungal pathogen Blumeria graminis.The Plant Cell.22:3130-
3141.
[0377] 47.Panwar,V.,Mccallum,B.and Bakkeren,G.2013.Host-induced gene silencing of wheat leaf rust fungus Puccinia triticina pathogenicity genes mediated by the Barley stripe mosaic virus.Plant Molecular Biology.81:595-
608.
[0378] 48.Rampitsch,C.,Bykova,N.V.,Mccallum,B.,Beimcik,E.and Ens,W.2006.Analysis of the wheat and Puccinia triticina(leaf rust)proteomes during a susceptible host-pathogen interaction.Proteomics.6:1897-1907.
[0379] 49.Stakman,E.C.and Levine,M.N.1944.Identification of physiologic races of Puccinia graminis tritici,United State Department Of Agriculture.[0380] 50.Takano,Y.,Kikuchi,T.,Kubo,Y.,Hamer,J.E.,Mise,K.and Furusawa,I.2000.The Colletotrichm lagenarium MAP kinase gene CMK1 regulates diverse aspects of fungal pathogenesis.Molecular Plant-Microbe Interactions.13:374-
383.
[0381] 51.Urban,M.,Mott,E.,Farley,T.and Hammond-Kosack,K.2003.The Fusarium graminearum MAPI gene is essential for pathogenicity and development of perithecia.Molecular Plant Pathology.4:347-359.
[0382] 52.Williamson,B.,Tudzynski,B.,Tudzynski,P.and  VanKan,J.A.2007.Botrytis cinerea:the cause of grey mould disease.Molecular Plant Pathology.8:561-580.
[0383] 53.Zheng,L.,Campbell,M.,Murphy,J.,Lam,S.and Xu,J.-R.2000.The BMPI gene is essential for pathogenicity in the gray mold fungus Botrytis cinerea.Molecular Plant-Microbe Interactions.13:724-732.
[0384] 54.Zhu,L.,Zhu,J.,Liu,Z.,Wang,Z.,Zhou,C.and Wang,H.2017.Host-induced gene silencing of rice blast fungus Magnaporthe oryzae pathogenicity genes mediated by the Brome Mosaic Virus.Genes.8:241.
[0385] 55.Zwiers,L-H.and DeWaard,M.A.2000.Characterization of the ABC transporter genes MgAtrl and MgAtr2 from the wheat pathogen Mycosphaerella graminicola.Fungal Genetics and Biology.30;115-125.
[0386] 56.Timmons L,Court DL,Fire A(2001).Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.Gene 263(1-2):103-112
[0387] 57.Glick B(2013).Bacteria with ACC deaminase csan promote plant growth and help to feed the world.Microbiological Research 169(2014):30-39[0388] 58.Pande S,Shitut S,Freund L,Westerman M,Bertels F,Colesie C,Bischofs IB,Kost C(2015).Metabolic cross-feeding via intercellular nanotubes among bacteria.Nature Comm 6:DOI:10.1038/ncomms7238
[0389] 59.Takiff HE,Chen,SM,Court DL(1989).Genetic analysis of the rnc operon of Escherichia coli.Journal of Bacteriology 171(5):2581-2590
[0390] 60.Derouiche R,Benedetti H,Lazzaroni JC,Lazdunski C,Lloubes R(1995).Protein complex within Escherichia coli inner membrane.tolA N-terminal domain interacts with TolQ and TolR proteins.J.Biological Chemistry 270:11078-11084
[0391] 61.Shin JD,Fitzgerald MC,Sutherlin M,Hunter CP(2009).The SID-1 double stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length.RNA 15:384-390[0392] 62.McEwan DL,Weisman AS,Hunter CP(2012).Uptake of extracellular double-stranded RNA by SID-2
[0393] 63.PallasV,Gomez G(2013).Phloem RNA-binding proteins as potential components of the long-distance RNA transport system.Front Plant Sci 4:130[0394] 64.Garcia-RuizH,Carbonell,Steen Hoyer J et al.(2015)Roles and programming of Arabidopsis ARGONAUTE proteins during Turnip Mosaic Virus infection.PLOS pathogens.https://doi.org/10.1371/journal.ppat,1004755
[0395] 65.Kim K,Manasherob R,Cohen SN(2008).YmdB:a stress-responsive ribonuclease-binding regulator of E.coli RNaselll activity.Genes&Development 
22:3497-3508.
[0396] 66.Ren Z,Veksler-Lublinsky I,Morrissey D,Ambros V(2016)Staufen negatively modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans.G36(5):1227-
1237
[0397] 67.Raman P,Zaghab SM,Traver EC,Jose AM(2017).The double-stranded RNA binding protein RDE-4can act cell autonomously during feeding RNAi inC.elegans.Nucleic Acids Res 45(14):8463-8473
[0398] 68.Han M,Goud S,Song L,Fedoroff N(2003).The Arabidopsis double-stranded RNA-binding protein HYL1 plays a role in microRNA-mediated gene regulation.PNAS 101(4):1093:1098
[0399] 69.Adenot X,Elmayan T,Lauressergues D,Boutet S,Bouche N,Gasciolli v,Vacheret H(2006).DRB4-depedent TAS3 tras-acting siRNAs control leaf morphology through AG07.Curr Biol 16(9):927-932
[0400] 70.Ji L,Chen X(2012).Regulation of smallRNA stability:methylation and beyond.Cell Res.22:624-636
[0401] 71.Li S,Liu K,Zhang S,Wang X,Rogers K,Ren G,Zhang C,Yu B(2017).STV1,a ribosomal protein,binds primary microRNA transcripts topromote their interaction with the processing complex in Arabidopsis.PNAS 114(6):1424-1429[0402] 72.Zhang F,Greig DI,Ling V(1993).Functional replacement of the 
hemolysin A transport signal by adifferent primary sequence.PNAS 90:421 1-
4215
[0403] 73.Natale P,Bruser T,Driessen AJM(2008).Sec-and Tat-mediated prtein secretion across the bacterial cytoplasmic membrane-Distinct translocases and mechanisms.Biochimica Biophy.Acta9:1735-1756
[0404] 74.Jones SW,Christison R,Bundell K,Voyce CJ,Brockbank SMV,Newham P,Lindsay(2005).Characterisation of ce;11-penetrating peptide-mediated peptide delivery.British Journal of Pharmacology.DOI:10.1038/sj.bjp.0706279
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