一种氮氧自由基及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本
发明涉及化合物的制备和应用技术领域，特别涉及一种氮氧自由基及其制备方法和应用。
背景技术
[0002]
百草枯又名紫精、紫罗
碱，化学名称是1-1-二甲基-4-4-联吡啶阳离子盐，对人体毒性极大，且无特效解毒药，口服中毒死亡率极高，已被20多个国家禁止或者严格限制使用，百草枯的毒性机理为当百草枯进入细胞后，在其中诱导了一系列的
氧化还原反应，消耗细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
磷酸、细胞色素P450还原酶等多种酶，导致超氧阴离子、羟基自由基等具有强氧化性的自由基
水平升高，诱导脂质物质过氧化反应等，引起细胞膜的结构改变，导致细胞氧化凋亡。氮氧自由基从前一直被研究其与
金属离子配位后的顺
磁性，但最近，又有研究者发现其对于自由基的清除能
力非常卓越。氮氧自由基作为一种新型的自由基清除剂，其可以在质子化的超氧化氢自由基的作用下转化为氧合胺离子，而氧合胺离子又可以被超氧阴离子还原为氮氧自由基。因此，如果将氮氧自由基用作百草枯诱导的细胞氧化损伤的保护剂，预期可以开发出一种新型的
治疗百草枯中毒的药物。
发明内容
[0003] 解决的技术问题：本发明提供一种氮氧自由基及其制备方法和应用，本发明提供的氮氧自由基易于合成，采用了催化剂使得合成条件易得，重现性好，同时对百草枯诱导的细胞氧化具有明显的保护作用。
[0004] 技术方案：氮氧自由基，结构式为：
[0005]
[0006] 其中R为
萘基，连接位点为萘基上的α
碳或β碳。
[0007] 所述氮氧自由基的具体结构式如下所示：
[0008]
[0009] 氮氧自由基a化学名为1,3-二羟基-2-(1-萘基)-4,4,5,5-四甲基咪唑烷
酮，该自由基的分子式为C17H19N2O2，分子量为283.34，结构单元属斜方晶系，空间群为Pbca，晶胞参数为
[0010]
[0011] 氮氧自由基b化学名为1,3-二羟基-2-(2-萘基)-4,4,5,5-四甲基咪唑烷酮，该自由基的分子式为C17H19N2O2，分子量为283.34，结构单元属斜方晶系，空间群为P212121，晶胞参数为
[0012]
[0013] 氮氧自由基的制备方法，包括以下步骤：A.以2-硝基丙烷为原料，将氢氧化钠和液溴加入其中，分别与2-硝基丙烷发生取代反应，所述2-硝基丙烷、氢氧化钠、液溴的摩尔比为2:1:1，取代之后的产品再在回流条件下进行缩合反应，得到产物2,3-二甲基-2,3-二硝基
丁烷；B.以2,3-二甲基-2,3-二硝基丁烷为原料，用
乙醇-水作为
溶剂，再向其中加入
氯化铵，用锌粉作为还原剂，得到2,3二甲基-2,3二羟胺基丁烷溶液，再向溶液中加入
醛以及金属催化剂，最后再加入高碘酸钠进行氧化反应，得到相应的氮氧自由基溶液；所述2,3-二甲基-2,3-二硝基丁烷、氯化铵、锌粉、醛、高碘酸钠的摩尔比例为1:1:10:1:2；乙醇-水的体积比例为3:(1-2)；C.向其中加入产物重量2倍的重结晶溶剂，在低温5-10℃下重结晶得到相应的氮氧自由基。
[0014] 上述步骤B中的催化剂为乙酸镍，加入的量为1％mol。
[0015] 上述步骤B中的醛为1-萘甲醛；步骤C中的重结晶剂为二氯甲烷和甲基异丁基醚，制备出1,3-二羟基-2-(1-萘基)-4,4,5,5-四甲基咪唑烷酮。
[0016] 上述步骤B中的醛为2-萘甲醛，所述步骤C中的重结晶剂为三氯甲烷和正己烷，制备出1,3-二羟基-2-(2-萘基)-4,4,5,5-四甲基咪唑烷酮。
[0017] 上述氮氧自由基在制备抗氧化损伤药物中的应用。
[0018] 上述氮氧自由基在制备治疗百草枯诱导的细胞氧化损伤药物中的应用。
[0019] 治疗百草枯中毒的药物，有效成分为
权利要求2所述的氮氧自由基。
[0020] 合成路线：
[0021]
[0022] 本发明制备的一种对百草枯诱导细胞氧化损伤具有保护作用的氮氧自由基，通过体外细胞实验：细胞首先向其中加入一定浓度的百草枯溶液作为对比组，再取两组细胞，同时加入相同浓度的百草枯溶液和不同浓度梯度的两种氮氧自由基溶液，经MTT细胞毒性实验，流式细胞术检测细胞凋亡，发现本发明合成的两种氮氧自由基能够有效的减轻经百草枯诱导的人体正常
肺上皮样细胞氧化损伤。
[0023] 有益效果：本发明制备的一种对百草枯诱导细胞氧化损伤具有保护作用的氮氧自由基，能够有效的保护人体正常肺上皮样细胞经百草枯诱导引起的细胞氧化损伤，对于制备新型的百草枯解毒药具有巨大的潜力价值。本发明制备氮氧自由基的方法反应条件温和，合成步骤简单，原料易得，产率高，重现性好，在醛的反应中加入乙酸镍作为一种催化剂，使得此步反应条件要求大大降低，反应时间减短，同时使用的新型重结晶溶剂使得最终产品纯度高，得到的晶体易于进行单晶衍射测试。
附图说明
[0024] 图1为一种氮氧自由基(a、b)的
晶体结构图；
[0025] 图2为一种氮氧自由基(a、b)的晶胞堆积图；
[0026] 图3为一种氮氧自由基(a、b)的
X射线粉末衍射图；
[0027] 图4为一种氮氧自由基(a、b)的红外图；
[0028] 图5为一种氮氧自由基(a、b)的质谱图；
[0029] 图6为MTT法测定经百草枯处理的相对细胞存活率；
[0030] 图7为MTT法测定经百草枯和氮氧自由基处理的相对细胞存活率；
[0031] 图8为流式细胞术检测氮氧自由基a对细胞凋亡的保护作用；
[0032] 图9为流式细胞术检测氮氧自由基b对细胞凋亡的保护作用。
具体实施方式
[0033] 为进一步解释本发明内容，以下结合较佳的
实施例，对本发明进行详尽的描述。
[0034] 实施例1：
[0035] 将4.5g(0.05mol)的2-硝基丙烷和9mL 6mol/L的氢氧化钠溶液加入至100mL三颈烧瓶内，在
冰水浴下磁力搅拌反应0.5h，再用恒压滴液漏斗将4g(0.025mol)的液溴逐滴滴加至烧瓶中，待滴加结束后，再向其中加入15mL的无水乙醇，继续在冰浴下搅拌0.5h，然后撤去冰浴，升温至90℃，回流2h，停止反应，待反应液自然冷却至室温后，析出大量白色固体，过滤，用无水乙醇和蒸馏水洗涤数次，
真空干燥，得到白色片状晶体40.13g，产率为91.2％，此产物为2,3-二甲基-2,3-二硝基丁烷。
[0036] 称取2.5g(0.025mol)的氯化铵至100mL的单颈烧瓶中，再向其中加入50mL体积比为3:2的乙醇-水溶液，超声溶解，溶解后再向其中加入4.4g(0.025mol)的2,3-二甲基-2,3-二硝基丁烷，冰水浴搅拌0.5h，然后分批加入16.25g(0.25mol)的高纯锌粉，锌粉加完后，在冰水浴下继续搅拌0.5h，然后撤去冰水浴，常温下搅拌2h，抽滤，得无色溶液。
[0037] 向上述溶液中加入3.9g(0.025mol)得1-萘甲醛以及0.07g(1％mol)的乙酸镍，室温搅拌反应6h，出现乳白色浑浊，抽滤，用体积比为3:2的乙醇-水溶液洗涤几次，干燥得乳白色固体。
[0038] 向上述乳白色固体中加入100mL二氯甲烷搅拌制成悬浊液，再向其中加入10.7g(0.05mol)高碘酸钠溶于90mL的水配制而得到的溶液，溶液变为蓝紫色，反应20min，分液，取下层有机相，上层水相再用20mL的二氯甲烷萃取两次，合并有机相，加入无水
硫酸钠干燥，过滤，旋蒸至固体，再向其中加入20mL二氯甲烷和30mL甲基异丁基醚，低温避光结晶，两天后得蓝紫色晶体5.3g，产率为74.9％，此产物为1,3-二羟基-2-(1-萘基)-4,4,5,5-四甲基咪唑烷酮(自由基a)。ESI-MS(m/z):284[M+H]+。IR(KBr,cm-1):3482，2975，1522，1360，1225，755，738。单晶结构解析：分子式为C17H19N2O2，分子量为283.34，结构为斜方晶系，空间群为Pbca，晶胞参数为
[0039] 表1氮氧自由基a的晶体学数据
[0040]
[0042]
[0043]
[0044] 实施例2：
[0045] 将4.5g(0.05mol)的2-硝基丙烷和9mL 6mol/L的氢氧化钠溶液加入至100mL三颈烧瓶内，在冰水浴下磁力搅拌反应0.5h，再用恒压滴液漏斗将4g(0.025mol)的液溴逐滴滴加至烧瓶中，待滴加结束后，再向其中加入15mL的无水乙醇，继续在冰浴下搅拌0.5h，然后撤去冰浴，升温至90℃，回流2h，停止反应，待反应液自然冷却至室温后，析出大量白色固体，过滤，用无水乙醇和蒸馏水洗涤数次，真空干燥，得到白色片状晶体40.13g，产率为91.2％，此产物为2,3-二甲基-2,3-二硝基丁烷。
[0046] 称取2.5g(0.025mol)的氯化铵至100mL的单颈烧瓶中，再向其中加入50mL体积比为3：2的乙醇-水溶液，超声溶解，溶解后再向其中加入4.4g(0.025mol)的2,3-二甲基-2,3-二硝基丁烷，冰水浴搅拌0.5h，然后分批加入16.25g(0.25mol)的高纯锌粉，锌粉加完后，在冰水浴下继续搅拌0.5h，然后撤去冰水浴，常温下搅拌2h，抽滤，得无色溶液。
[0047] 向上述溶液中加入3.9g(0.025mol)得2-萘甲醛以及0.07g(1％mol)的乙酸镍，室温搅拌反应6h，出现乳白色浑浊，抽滤，用体积比为3：2的乙醇-水溶液洗涤几次，干燥得乳白色固体。
[0048] 向上述乳白色固体中加入100mL二氯甲烷搅拌制成悬浊液，再向其中加入10.7g(0.05mol)高碘酸钠溶于90mL的水配制而得到的溶液，溶液变为紫色，反应20min，分液，取下层有机相，上层水相再用20mL的二氯甲烷萃取两次，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸至固体，再向其中加入20mL三氯甲烷和30mL正己烷，低温避光结晶，两天后得紫色晶体5.8g，产率为81.4％，此产物为1,3-二羟基-2-(2-萘基)-4,4,5,5-四甲基咪唑烷酮(自由基b)。ESI-MS(m/z):284[M+H]+。IR(KBr,cm-1):3472，2957，1531，1374，1225，768，725。单晶结构解析：分子式为C17H19N2O2，分子量为283.34，结构为斜方晶系，空间群为P212121，晶胞参数为
[0049] 表3氮氧自由基b的晶体学数据
[0050]
[0051]
[0052] 表4氮氧自由基b的主要键长和键角
[0053]
[0054] 氮氧自由基化合物对百草枯诱导的细胞氧化损伤的保护作用
[0055] 用上述两种氮氧自由基进行了细胞体外实验，以探究其对百草枯诱导的细胞氧化损伤的保护作用大小。
[0056] 1.人体正常肺上皮样细胞L132细胞培养
[0057] 将L132细胞(5×105个/mL)单细胞悬液加入至含10％胎
牛血清和1％青霉素的DMEM培养基中。所有细胞在37℃，5％的CO2的湿化
培养箱中进行培养。
[0058] 2.MTT细胞毒性实验
[0059] L132细胞在96孔板上以每孔5×103个细胞的
密度进行接种。24h后，培养液替换为100μL含有不同浓度百草枯(100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L)的新鲜培养基，然后孵化24h。吸出培养液，然后每孔加入20μL 5mg/mL的MTT染料以及130μL的DMEM完全培养基,细胞继续孵育4h，吸出培养基，每孔加入150mL二甲基亚砜。用微平板阅读器(美国Thermo Scientific Varioskan Flash)在490nm处记录每孔吸光度，计算得细胞存活率。
[0060] 如图6所示，当百草枯浓度降至12.5μmol/L时，细胞的存活率明显上升，故选择百草枯的浓度为25μmol/L进行后续的细胞毒性试验。
[0061] 如图7所示，浓度为0的组别为只加了12.5μmol/L的百草枯，未加氮氧自由基的对照组，从图中可以看出，加入的两种氮氧自由基后，细胞的存活率明显上升，且当两种氮氧自由基的浓度为50μmol/L时，药效最好，对于百草枯诱导的细胞氧化损伤的保护作用最强。
[0062] 3.流式细胞术测定细胞凋亡
[0063] 采用
转染Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测
试剂盒检测百草枯诱导L132细胞凋亡。将L132细胞以每孔1×105的数量接种于6孔板中，孵育24h，然后加入5个浓度梯度的氮氧自由基。对照组为浓度为12.5μmol/L的百草枯。孵育24h后，取出培养基，PBS洗涤细胞，加入300μL的胰酶，培养箱内继续培养2分钟，然后每管加入1mL的完全培养基，收集细胞，离心，倒去培养基，每管加入500μL的Buffer，转移细胞至小管中，再加5μL的PI，避光
染色20min，再加入5μL的FITC，继续避光染色10min，用流式细胞仪检测。
[0064] 如图8、9所示，氮氧自由基的加入使得L132细胞的凋亡率明显下降，尤其是氮氧自由基的浓度为50μmol/L时，对细胞的保护作用最为显著，这与MTT细胞毒性实验的结果也相一致，更加表明了本发明制备的氮氧自由基对百草枯诱导的细胞氧化损伤具有优良的保护作用。
[0065] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
