本发明涉及一种新的酸性聚环醚抗菌素，其结构为： 其中Me为甲基，其绝对立体化学如上所示；还涉及该化合物的药 用阳离子盐；含该抗菌素的家禽，牛或猪的营养饲料组合物及用于 治疗或预防猪痢疾的家禽用抗球虫剂或用作牛或猪的助长剂；还涉 及制备该抗菌素的发酵方法和在上述发酵方法中产生该抗菌素的微 生物Actionmadura sp.。

化合物(I)是酸性聚环醚类抗菌素的一个新成员。这类抗菌 素包括人们十分熟悉的化合物如莫能菌素(The Merck Index 10th Ed.，Merk and Co.，Inc.，Rahway， N.J. 1983，monograph no.6100)，尼日利亚菌素 (Loc.cit.，monograph no.6390)，甲基盐霉素 (Loc.cit.，mongraph no.6271)，拉沙里菌素 (Loc.cit.，monograph no.5204)和盐霉素 (Loc.cit.，monograph no.8193)。Westley 对此课题已有综述：“聚醚抗菌素”，Adv.Appl.Microbio.， vol.22，pp.177-223(1977)。在结构上与本发 明的化合物密切相关的是利迪霉素，分别由Hamill等在美国专利 4,528,822中和KusaKabe等在欧洲专利申请书158,179 中公开，也可参见Tetrahedron Letters，vol.28，pp. 3357-3360(1987)和J.Antibiotics，vol 40，pp.237-237(1987)。利迪霉素的四氢呋喃 β-环上有α-氢，而本发明化合物是α-甲基。这些化合物一般 用作球虫抑制剂，饲料添加助长剂和(或)抗猪痢疾剂。

当Actinomadura sp.ATcc 53708在有氧环境的液 体培养基中发酵时，产生一种新的酸性聚环醚抗菌素，其结构如式 (I)所示。

本发明涉及上述式(I)的化合物，包括其药用阳离子盐，及 其制备方法。该制备方法包括在含可吸收碳和氮源的液体营养培养 基中，使上述的Actionmadura sp.ATCC 53708发 酵，直到生成要求量的上述式(I)化合物，最好于有氧环境中进 行发酵。在治疗或预防猪痢疾中，就用作抗球虫剂和/或助长剂而 言，并不需要将化合物(I)从发酵液中分离出来制成基本纯净 的化合物，而只需用粗产品即可，可用混有菌丝体(过滤发酵液所 得)的沉淀物，也可用通过喷雾干燥或冰冻干燥整个发酵液而得到 的固体。

所说的药用阳离子盐包括(但并不局限于)如下盐类：钠盐， 钾盐，钙盐，铵盐，N，N ′-二苄基乙二胺的盐，N-甲基葡酰 胺(甲基葡铵)的盐和二乙醇胺的盐。最好的阳离子盐是钾和钠盐。

本发明也涉及营养饲料组合物，牛或猪的营养饲料组合物，该 组合物包括有效量的式(I)化合物以促进生长和/或改善上述牛 或猪饲料的利用率；涉及其它家禽的营养饲料组合物，其中含有效量 的式(I)化合物，用以控制所述家禽的球虫感染。

本发明还涉及一种促进生长和/或增加猪或牛饲料利用率的方 法，该法包括给予上述猪或牛能促进生长或促进饲料利用率的一定 量的式(I)化合物，最好以营养饲料组合物的形式给予；一种预 防或治疗猪痢疾的方法，该法包括给予猪有效量的式(I)化合物， 预防或治疗上述猪痢疾；和一种控制家禽球虫感染的方法，该法包 括给予所述家禽抗球虫有效量的式(1)化合物，特别是以营养饲 料的形式给予。

最后，本发明涉及Actinomadura sp.ATCC 53708 的生物学纯培养方法，所说的培养方法是在含可吸收碳和氮源的液 体营养培养基中发酵时，能产生要求量的式(I)化合物的培养方 法，包括上述冰冻干燥型培养方法。

能产生本发明式(I)的聚环醚抗菌素的培养方法选用微生物 Actinodura sp.，该培养物作为典型培养物，收集于The American Type Culture Collection，Rock- ville，Maryland中，登记号为ATCC 53708。该 培养物永久存放于The American Type culture Collection，Rockville，Maryland，在授予专利 权后的整个专利有效期内，公众可从那里得到该培养物。在申请尚 未批准期间，可根据申请号37CFR1.14和35USC122 获得该培养物。当专利批准后，对公众获得该保存培养物的限制将 不可改变地被取消。

这个新的培养物是由在Tuzla，Istanbul，Turkey采 集的土壤样品中衍生而得到的，并由Pfizer InC.的培养物保 存中心鉴别为N777-1。由Dr.L.H.Huang对其进行 了描述和分类。发现该培养物能产生小面积的放线属菌丝，一种产 生短孢子链的需氧菌丝体和一种无碎片的基质菌丝体。全细胞分析 的结果表明它属于Actinomadura类。

将上述微生物的倾面培养物接种于ATCC 172肉汤中，在 摆床上于28℃生长4天。然后离心20分钟，用灭菌蒸馏水洗三 次，接种在常用于鉴别放射线菌的培养基上。

该培养物于28℃培养，按一定时间观察培养结果，通常是 14天观察记录一次。其颜色用通用专门术语加以描述，但准确的 描述根据用The color Harmony Manual，fourth edition的色片加以比较而确定。全细胞氨基酸和糖的分析方 法采用下列参考文献中描述的方法，参见：Becker等Appl. Microbiol.，Vol.12，pp.421-423(1964)； Staneck等，Appl.Microbiol.，vol.28，pp. 226-231(1974)和Lechevalier，J.Lab. Clin.Med.，vol.71，pp.934-944(1968)。

培养物鉴别如下：

酵母提取物-麦芽提取物琼脂培养基(ISP2#培养基， Difco)：生长良好，具有黑灰色到黑色(接近灰色系列5ih， 5ml)小点的膏体(2，ca)已发酵，表面有皱纹：需氧菌丝 体无至稀少，无色；膏体反面具有黑色(接近灰色系列5ml)小 点，微黄色(2ca，2ea)；无可溶性色素。

燕麦片琼脂培养基(ISP3#培养基，Difco)：生长一 般，膏体(2ca)，稍有发酵，表面光滑：需氧菌丝体无至稀少， 无色；膏体反面(2ca)，可溶性色素膏体(2ca)。

无机盐-淀粉琼脂培养基(ISP4#培养基，Difco)： 生长不良，膏体(2ca)，薄，表面光滑；需氧菌丝体无至稀少， 无色；膏体反面(2ca)；无可溶性色素。

甘油-天门冬氨酰胺琼脂培养基(ISP5#培养基，Difco)： 生长不良至一般，膏体(2ca)，薄，表面光滑，无需氧菌丝体； 膏体反面(2ca)：无可溶性色素。

蔡氏(Czapek)-蔗糖琼脂培养基(Waksman，“The Actinomycetes”，V.2，培养基1#，P.328， 1961)：生长一般至良好，膏体(2ca)，中度发酵，表面 光滑，无需氧菌丝体；膏体反面(2ca)；无可溶性色素。

葡萄糖-天门冬氨酰胺琼脂培养基(同上，培养基2#)：生 长一般，膏体(2ca)，薄至中度发酵，表面光滑至有皱纹，无 需氧菌丝体；膏体反面(2ca)；无可溶性色素。

Gordon和Smith′s酪氨酸琼脂培养基(Gordon和 Smith，J.Bacteriol，69：147-150，1955)： 生长一般至良好，膏体(2ca)，轻微至中度发酵，表面光滑至 有皱纹，无需氧菌丝体；膏体反面(2ca)；可溶性色素淡黄色 (2ea)。

苹果酸钙琼脂培养基(Waksman，Bacteriol，Rev. 21，1-29，1957)：生长不足，膏体(2ca)，薄， 表面光滑；无需氧菌丝体，膏体反面(2ca)，无可溶性色素。

酪蛋白琼脂培养基(Gordon和Smith，同上)：生长良 好，膏体(2ca)，发酵，表面光滑至有皱纹，无需氧菌丝体； 膏体反面淡黄色(2ea)；有微黄色(2ga)可溶性色素。

Bennett′s琼脂培养基(Waksman，Loc.Cit.，培 养基30#，P.331)：生长良好，膏体(2ca)，发酵， 有皱纹，无需氧菌丝体；膏体反面淡黄色(2ca，2ea)；有 淡黄色可溶性色素(2ea)。

Emerson′s琼脂培养基(同上，培养基28#，P.331)： 生长一般，淡黄色膏体(2ca，2ea)，发酵，有皱纹，无需 氧菌丝体；膏体反面微黄色(2ic)；无可溶性色素。

营养琼脂培养基(同上，培养基14#，P.330)：生长 差至一般，膏体(2ca)，薄至微有发酵，有皱纹，无需氧菌丝 体；膏体反面淡黄色(2ic)；无可溶性色素。

明胶琼脂培养基(Gordon和Mihm，J.Bacteriol. 73，15-27，1957)：生长良好，膏体(2ca)，发 酵，有皱纹，无需氧菌丝体；膏体反面淡黄色(2ca，2ea)； 可溶性色素淡黄色(2ea)。

淀粉琼脂培养基(同上)：生长良好，膏体(2ca)，发酵， 有皱纹，无需氧菌丝体；膏体反面淡黄色(2ca，2ea)；无 可溶性色素。

土豆胡萝卜琼脂培养基(Lechevalier，Lab.Clin. Med.，71，934-944，1968，但只用30g土豆， 2.5g胡萝卜和20g琼脂)：生长差一般，灰白色(接近灰色 系列2ba)，薄，表面光滑；需氧菌丝体无至稀少，无色；膏体 反面(2a)无色；无可溶性色素。

自来水琼脂培养基(2％)：生长差，膏体(2ca)，无色； 膏体反面无色(2ca)；无可溶性色素。

Gauze′s矿物盐培养基1(Gauze等，Problems in the classification of Antagonistic Actinomycetes，English Ed.，P.13，1957)： 生长差至一般，膏体(2ca)，薄，表面光滑；需氧菌丝体无至 稀少，无色；膏体反面(2ca)；无可溶性色素。

Gauze′s有机培养基2(同上)：生长良好，膏体(2ca)， 发酵，有皱纹，无需氧菌丝体：膏体反面淡黄色(2ca，2ea)； 无可溶性色素。

形态学性质：在无机盐-淀粉琼脂培养基上培养3周后观察其 形态学性质为：需氧菌丝体无色，膏体白色；孢子链呈直线，弯曲 或钩形，每条孢子链有2-9个孢子；孢子呈球形，卵形至椭圆形， 直径0.8-1.4微米或1.1-1.8×0.8-1.2微米； 表面光滑，如扫描电子显微镜所见。

生物化学性质：无黑色素生成；无硫化氢生成；明胶被液化； 无淀粉水解；硝酸盐未被还原成亚硝酸盐；在Jensen′s或 Levine和Schoenlein纤维素肉汤中不生长，也不分解； 不凝固也胨化牛奶；酪蛋白消化阳性；酪氨酸消化阴性；苹果酸钙 消化阴性。碳水化物利用情况：可利用葡萄糖，阿拉伯糖，果糖， 甘露糖醇，鼠李糖，蔗糖，木糖，阿东糖醇，纤维二糖，甘油，麦 芽糖，核糖，淀粉和海藻糖；不能利用肌醇，棉籽糖，己六糖，赤 鲜糖，半乳糖，乳糖，甘露糖，松三糖，密二糖，α-甲基-D- 葡葡糖甙，柳醇，山梨糖醇和山梨糖。

其它阳性试验包括乙酸盐和丙酮酸盐的利用；七叶灵水解；及 黄嘌呤的分解。下面的试验是阴性结果：苯甲酸盐，柠檬酸盐，糊 精，乳酸盐，苹果酸盐，肉豆蔻酸盐，草酸盐，苯酚，丙酸盐和丁 二酸盐的利用；腺嘌呤和酪氨酸的分解；马尿酸盐的水解。

温度关系：

21℃        28℃        37℃        45℃

生长良好    生长良好    生长良好    生长良好

分细胞分析：全细胞水解物含有内消旋-二氨基庚二酸，葡萄 糖，半乳糖，madurose，甘露糖和核糖。

N777-1培养物具有下列特征：膏体基质菌丝体；短而无 色的菌丝体，短孢子链，呈直线，曲线或钩形；孢子表面光滑。它 利用葡萄糖，蔗糖，木糖，阿东糖醇，纤维二糖，甘油，麦芽糖， 核糖，淀粉，海藻糖，乙酸盐和丙酮酸盐。分解黄嘌呤，次黄嘌呤 和七叶灵。全细胞水解物含内消旋-二氨基庚二酸和madurose。 因此，培养物N777-1属于Actinomadura类，如H. Lechevalier所认定。

已知的Actinomadura类培养物具有相同的膏体基质菌丝 体和/或相同的生物化学性质，这些培养物包括A.Cremea subsp，rifamycini，A.madurae subsp. simaoensis，和A.routienii。

培养物N777-1与A.cremea subsp.rifamy- cini的区别在于：孢子表面光滑，不能还原硝酸盐，不能利用棉 籽糖，能利用阿拉伯糖和鼠李糖。

培养物N777-1与A.madurae subsp.simaoe- nsis的区别在于：膏体基质菌丝体是无色而不是桔棕色，需氧菌 丝体是无色而不是无色至粉白色，不能还原硝酸盐，不能分解酪氨 酸，能分解黄嘌呤。与A.routienii比较，其区别在于没有 假孢子囊，不能水解淀粉，不能凝固牛奶，能利用甘露糖醇，果糖 和甘油。

培养物N777-1在大多数生物化学试验中相似于A. albolutea，但与后者的区别是不能水解淀粉，不能凝固牛奶， 膏体基质菌丝体不是棕至深棕色，孢子链是短的而不是长的。

根据上述数据，培养物N777-1被认为是Actinoma- dura类的一个成员，称之为Actinomadura Sp.，它已被 收存于the American Type Culture Collection 登记号为ATCC53708。

用本发明的Actinomadura Sp.很容易产生本发明的抗 菌素化合物(I)。方法是使该微生物在约24°-36℃生长于 搅拌和通气环境中，培养基包括碳水化合物如糖、淀粉、甘油；有 机氮物质如大豆蛋白肉、酪氨酸、酵母提取物；生长物质如可溶谷 物、鱼肉、棉籽肉；含微量元素的矿物盐如Fe、Co、Cu、 Zn等；及作为缓冲剂的碳酸钙或磷酸盐。培养完成之后，通过下 述方法很容易得到抗菌素：在PH4.0-8.0，用有机溶剂如正 丁醇、甲基异丁基酮或氯仿提取；滤出含沉淀抗菌素的菌丝体，滤 液弃去；或更简单，喷雾干燥或冰冻干燥整个肉汤培养物。也可以 用上述有机溶剂之一提取菌丝体或肉汤干燥物。如果需要纯化的抗 菌素，可采用标准分离方法如浓缩、形成盐或游离酸、色层析、沉 淀和/或结晶，将其从有机溶剂中分离出来，见下述实施例。

接通常的方法进行发酵：将无性繁殖细胞从已接种Actino- madura Sp.ATCC 5508的斜面或Roux瓶中挖出， 接种于合适的培养基上面制得接种物。产生的无性繁殖细胞依次用 于接种含有合适生长培养基的摇瓶或接种罐。也可从摇瓶接种接种 接种罐。生长一定时间(摇瓶通常120-144小时，接种罐 168-196小时)后，将摇瓶或接种罐的无性繁殖细胞肉汤在 无菌条件下接种于含合适于生长的培养基的发酵罐内。生长完成后 (通常约120-196小时)，按上述的一般方法或按下述的特 殊方法获得上述的抗菌素化合物的粗品或纯品。

用标准方法试验式(I)化合物的体外抗菌活性，这些标准方 法可测定化合物抗一种或几种微生物的最小抑菌浓度(MIC) (单位：mcg/ml)。其中方法之一是由《抗菌素敏感性试验 的国际合作研究》(Ericcson and Sherris，Acta. Pathologica et Microbiologia Scandinav Supp.217，Section B：64-68〔1971〕)推荐 的方法，该法利用脑心浸渍(BHI)琼脂和接种物重复装置。将 过夜生长试管稀释100售后用作标准接种物(将含20,000 -100,000细胞的约0.002ml菌液放于琼脂表面； 20ml BHI琼脂/盘)。试验药物的最初浓度为200mcg/ ml，每次稀释2倍，其制备12个稀释液。在37℃18小时后 观察培养皿时单菌落消失。受试微生物的敏感性(MIC)被确定 为：用肉眼判断，对微生物的生长能够产生完全抑制时，化合物的 最低浓度。如其它骤环醚抗菌素一样，本发明的式(I)化合物对 革兰氏阳性菌和Treponema hyodysenteriae(猪痢疾 的致病菌)均有抗菌作用，见表(I)。

                    表I

         式(I)化合物的体外抗菌活性 微生物                         菌株Na        MIC，mcg/ml Clostridium  perfringens     10A006        0.39

                           10A009        0.20 Actinomyces  pyogenes        14D002        0.39

                           14D008        0.39

                           14D011        0.39 Treponema  hyodysenteriae    94A001        0.20

                           94A002        0.20

                           94A007        0.20

通过下述方法可得到式(I)化合物抗鸡球虫感染的有效数据。 用充分混合的含有化合物(I)或其钠盐和/或钾盐的谷糠饲料喂 30-50天的来克亨健康小公鸡，24小时后，每只小公鸡口服 接种试验的Eimeria类卵囊，对照组(30-50天的小鸡) 喂不含化合物(I)或其盐的谷糠饲料，24小时后同样接种，作 为感染对照组。还有一组30-50天的小鸡喂以同样的不含抗菌 素的谷糠饲料，但不用球虫感染，作为正常对照组。对于E. acervulina感染组，五天后评价治疗效果，六天后评价所有 其它指标。

测量抗球虫活性所用的标准按J.E Lynch的方法分为0 -4损伤等级，参见“抗球虫活性的初步评价新方法”，Am.J. Vet.Res.，22，324-326，1961；和依据J. Johnson和W.H.Reid提出的改良评分法对其它类分0- 3级，参见“Anticoccidial Drugs.Lesion Sco- ring Techniques in Battery and Floor Pen Experiments in Chicks”，Exp.Parasit. 28，30-36，1970.用治疗组的损伤分数除以感染对照 组的损伤分数便得到抗菌活性。实验表明，当小鸡谷糠饲料中含 1.0-25ppm的化合物(I)和其阳离子盐时，对Eime- ria tenella，E.acervulina，E.maxima，E. brunetti和E.necatrix感染具有优良的抗菌活性。例 如，对于敏感的E.tenella，式(I)化合物在5ppm时便 显示出100％的损伤控制。

本发明的式(I)化合物也可与其它已知的抗球虫剂合用，这 些抗球虫剂包括上面引证的美国专利4,582,822中Hamill 等限定的抗球虫剂，如硝卡巴嗪，4，4′-二硝基碳酰苯胺或萘 酰胺。

对于家禽球虫病的预防或控制，用合适的载体将本发明的化合 物以口服的形式给予家禽，方便的给药方法是将其含于饮水中或 家禽饲料中，以便随着饮水或食物摄取治疗量的抗菌素。最好以浓 缩液的形式直接计量将抗菌剂加入饮水中，或以预混合物或浓缩物 的形式直接加入饲料中。为了将药物掺入饲料中，常用置于载体中 的治疗剂预混合物或浓缩物。治疗剂可以是基本纯的(如，游离酸 或其药用盐)，也可是分析过的粗产品如湿的或干的菌丝体，或全 肉汤培养干燥物。象描述的那样，合适的载体是液体或固体，如水， 各种粉；例如大豆饼粉，亚麻籽饼粉，玉米棒子芯粉和矿物盐混合 物常常被用于家禽饲料。特别有效的载体是家禽饲料本身，即少量 的家禽饲料。载体使活性物质容易均匀地分散于与之混合的饲料中。 因为需要本发明的活性成份的量很小，所以这是十分重要的。重要 的是将活性物充分混入预混合物中，然后再将预混合于饲料中。因 此，可将活性成份分散或溶解于适当的油载体中，如大豆油，玉米 油，棉籽油等，或挥发性有机溶剂中，然后再与载体混合。浓缩物 中活性物质的比例可任意改变，因为通过将适当比例的预混合物与 饲料混合，可调节最终饲料中活性物质的量，以得到一个理想的治 疗剂含量。

饲料生产者将高效浓缩物与上述的蛋白质源载体如大豆饼粉和 其它粉混合，得到适合于直接喂家禽的浓缩补充物。在这种情况下， 可允许家禽吃普通饲料。也可将上述浓缩补充物直接加入家禽饲料 中，获得一种含治疗有效量的一种或数种本发明化合物的营养平衡 饲料。用标准方法如双壳混合机充分混合该混合物，以保证均一性。

就用于家禽而言，本文描述的化合物的使用浓度随情况不同而 变化：生长期，使用连续的低浓度，即：在鸡生长期的前5-12 周，连续低浓度起到有效的预防作用。就治疗已发生的感染而言， 需要较高浓度以克服感染，饲料中化合物(I)的浓度一般为约 1.0-25ppm，最好是约2.5-12.5ppm。当药物 混入饮水中给药时，根据每天食物的平均消耗量和饮水消耗量的重 量比确定给药浓度，使日服药剂量相等。

用含有不同浓度的式(I)化合物或其盐的饲料喂试验组动物， 可直接测得式(I)化合物或其盐促进猪或牛生长和/或增加食物 利用率的活性。因此，英国专利说明书1,197,826详述了 一种评价饲料中抗菌素活性的体外瘤胃方法。

就用于预防或治疗猪痢疾，或就促进牛或猪生长和/或增加饲 料利用率而言，式(I)化合物或其盐最好作为饲料添加剂给药。 按照十分相似于上面所描述的制备家禽饲料的方法制备的饲料，值 得注意的是在制备的饲料中治疗剂是均匀分散态。此合物(I)在牛 或猪饲料中使用的浓度一般为约0.25-25ppm，对于反刍 动物，式(I)化合物可做成大丸药口服给药，该大丸药停留在瘤 胃网状囊中，在一个较长的时期(如4-8周)内以基本恒定的速 率释放治疗剂，每天可提供相当于上述饲料添加所提供的剂量，即：

平均每天剂量(mg)＝〔0.25至25(ppm)〕×平 均每天饲料消耗量(kg)

这种控制释放大丸药的例子参见Cardinal的美国专利 4,601,893。

下面的实施例是对本发明的解释，而不是加以限制。 实施例1

Actinomadura Sp.ATCC53708的发酵及化合 物(I)钠盐的分离

Actinomadura Sp.的最初培养是用ATCC53708 培养物接种在斜面或Roux瓶的固体培养基上，制备的ATCC培 养基№172含如上成份：

                             克/升

葡萄糖                       10

可溶淀粉                     20

酵母提取物                   5

酪蛋白酶水解物               1

碳酸钙                       1

蒸馏水加至1000ml，并用

KOH调PH至7.0，加入琼脂       20

选用下述任何一个培养基制备摇瓶培养基：

C ′                         克/升

西瑞糖                       10

大豆粉                       10

玉米发酵固体                 5

玉米淀粉                     10

NaCl                         5

CoCl2                       0.002

CaCO3                       1

JDYTT                   克/升

西瑞糖                  10

玉米淀粉                5

玉米浸渍液              5

酪蛋白酶水解物          5

CoCl2                  0.002

CaCO3                  3

将100ml培养基加入300ml摇瓶中，在120℃和 15P.S.i.消毒30分钟，冷却后，用上述Actinoma- dura SP.斜面培养物的无性繁殖细胞混悬液接种，接种瓶放 于移动距离为1.5-2.5英寸，摇动频率为150-200次 (CPM)的摇床上，于28℃振摇5-7天。

同时预备5升的发酵瓶，其中含3升上述C′或JDYTT培 养基或下述培养基：

UK1-2                       克/升

西瑞糖                      45

大豆粉                      10

玉米浸渍液                  10

CoCl2                      0.002

MgSO4                      0.10

CaCO3                      3

MnSO4                      0.10

FeSO4                      0.10 加入抗泡沫剂(聚丙二醇P2000，含10％(重量)环氧乙烷 1ml)，密闭发酵瓶，在120℃和15p.s.i.灭菌45 分钟，然后用摇瓶培养物(约3％接种物)接种，在30℃发酵 120-168小时，同时搅拌并通入空气，搅拌速度为每分钟 1700转(RPM)，每分钟通入的空气量与液体的体积之比为 1∶1。

当发酵完成(根据对B.subtilis ATCC6633的抗 菌培养检测)后，停止发酵，在天然PH下用硅藻土过滤，使沉淀结 块在甲醇中浆化，减压浓缩，用2-3倍体积的水稀释，然后用 1/3或1/2体积的甲基异丁基酮或正丁醇提取2次，通过虹吸 或离心分出有机层，减压浓缩，得式(I)抗菌素粗品，为粘稠油 状物。

用Bacillus subtilis ATCC 6633或金黄色葡 萄球菌ATCC6538的敏感菌  株检查肉汤培养基和提取后的 液体的生物活性。肉汤培养基和提取后  液体的成份可用Anal- tech硅胶GF板检查，以乙酸乙酯作为洗脱剂。层析后的层析板 用香草醛试剂(3g香草醛溶于75ml乙醇中，加上25ml 85％磷酸)喷洒，并加热至80℃，式(I)的抗菌素产品显紫 色圆点。也可将层析板涂一层含有金黄色葡萄球菌或B.subti- lis菌，并加有2，3，5-三苯基-2H-四氮唑氯化物-水合 物的琼脂，然后于37℃保温16小时，可检出抗菌素(粉色背景 上呈白点)。

预备含0.7升C′或JDYTT培养基的摇瓶可进行大规模 的发酵。摇瓶接种物在28℃发酵5-7天，然后用于接种分别含 100或4000升UK1-2培养基的200或6000升发酵 罐。每罐约需1升接种物，发酵7-10天后，收集发酵物。

用50升甲基异丁基酮在天然PH值提取小批量发酵(100升) 的全部发酵液，用旋风釜和旋转蒸发器减压浓缩有机提取液至油状， 该油状物混于正己烷中，于500g的硅胶柱上层析两次。第一次 用乙酸乙酯洗脱，第二次用CHCl3∶丙酮(1∶1)洗脱。收集 的各洗脱部分，用上述薄板层析法鉴别。第二次硅胶柱层析的活性 洗脱液再于florisil上层析，用CHCl3∶CH3OH(19∶1) 作洗脱剂。合并各部分洗脱液，用稀H3PO4振摇，然后用磷酸氢 二钠缓冲液振摇，使其形成钠盐，用Na2SO4干燥，蒸馏，残留 物于乙醚中结晶，分离出式(I)化合物的钠盐915mg， m.p.245-249℃，〔α〕D25＝-19.0°(C＝1， CH3OH)。

元素分析：C45H77O14Na

计算值：C，62.47；H，8.97

实测值：C，62.89；H，9.22

C-13nmr〔溶剂CDCl3：化学位移(ppm)；括 号里的数字表示氢的数目〕：182.8(0)，110.0 (0)，106.0(0)，99.1(1)，87.2(1)，86.9(0)，86.2(1)， 86.2(0)，84.8(1)，83.4(0)，82.6(1)，80.2(1)，78.5 (1)，75.2(1)，74.8(1)，74.6(1)，66.4(1)，60.3(3)， 57.9(3)，56.9(3)，44.5(1)，39.0(1)，36.9(1)，36.8 (2)，35.9(2)，35.4(2)，35.2(2)，35.1(1)，35.0(1)， 31.3(2)，30.9(2)，30.5(1)，28.2(3)，27.1(2)，26.1 (2)，25.0(3)，21.0(3)，18.3(3)，16.7(3)，15.3(3)， 13.4(3)，13.1(3)，11.2(3)，10.7(3)，and 10.6(3).

大罐全部发酵液通过下法处理：用1800升甲基异丁基酮提 取约4000升的发酵液，用Podbielnack提取器分离出有 机溶剂，减压浓缩有机溶剂至稀浆状，用等体积甲醇研磨两次，除 去不溶的油，减压浓缩甲醇研磨液至浆状，用正己烷提取2次，合 并正己烷，用乙腈提取，乙腈待回收。环己烷减压浓缩后用硅胶色 层析，吸附有产品的硅胶放于过滤漏斗上依次用正己烷，二氯甲烷， 乙酸乙酯和丙酮解吸附。将含有活性成份的CH2Cl2和乙酸乙 酯浓缩，溶解于正己烷中，用酸水洗，然后用1％N-甲基葡胺水 溶液提取。水相用NaCl盐析，并用同体积的乙酸乙酯提取2次， 合并有机层，用活性炭处理，过滤，用PH9.0的磷酸钠缓冲液洗 涤，Na2SO4干燥，减压浓缩，乙醚中结晶，得50.8g的 钠盐(与小规模发酵的产品相同)。 实施例2

化合物(I)的游离酸形式

用一分液漏斗将上述钠盐的氯仿液与等体积的盐酸(PH2)充 分振摇可得式(I)抗菌素的游离酸。分出氯仿层，水洗，减压蒸 去溶剂得游离酸.m.p.87-90℃；〔α〕D25＝-6.9° (C＝1，甲醇)。

元素分析：C14H78O14·1/2H2O

计算值：C，63.43；H，9.34

实测值：C，63.35；H，9.53 实施例3

化合物(I)的钠盐

将上述实施例制得的游离酸(45mg)溶于100ml氯仿 中，加入碳酸钠(0.5g)水(100ml)溶液。将上述混合 物置于分液漏斗中，猛烈振摇几分钟，分出氯仿层，用新鲜氯仿洗 水层，合并氯仿提取液，用Na2SO4干燥，过滤，蒸发溶剂得 41mg钠盐，mp230-235℃。

按C45H77O14Na计算值：C，62.47；H，8.96

                  实测值：C，62.20；H，9.14 实施例4

化合物(I)的铷盐

为了制备式(I)化合物的铷盐，将游离酸(30mg)溶于 50ml氯仿中，加入碳酸铷(35mg)的水(25ml)溶液， 搅拌2小时，分出有机层，水层用同体积氯仿提取，合并氯仿提取 液，蒸发溶剂得白色固体，通过慢慢蒸发乙醚，重结晶出铷盐，得 到的结晶由Dr.J.Bordner用X衍射测定结构。 实施例5

化合物(I)的钾盐

为了制备式(I)化合物抗菌素的钾盐，将130mg游离酸 溶于100ml氯仿中，加入K2CO3(100mg)的水 (100ml)溶液，搅拌几分钟，倒入分液漏斗中，猛烈振摇几 分钟，分出有机相，减压蒸发得化合物(I)，白色粉状固体， mp，255-260℃，〔α〕D25＝-19.6°(C＝1， CHCl3)。

按C45H77O14K计算值：C，61.34；H，8.81

                 实测值：C，60.91；H，8.83