超氧化物歧化酶的提纯方法
专利汇可以提供超氧化物歧化酶的提纯方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种提纯超 氧 化物歧化酶的方法，该方法中采用冻融技术使红血球膜破裂，提高超氧化物歧化酶的产量。用 超滤 技术平衡和浓缩含超氧化物歧化酶的溶液可缩短流程周期和节约大量 磷酸 钾 缓冲液。该方法中省去了常用的洗涤猪血步骤，大大缩短了流程周期，采用即时浓度洗脱方法，保证超氧化物歧化酶的纯度。所以该方法周期短、产量高、成本低、方法简单，适宜于批量生产超氧化物歧化酶。，下面是超氧化物歧化酶的提纯方法专利的具体信息内容。
1、一种超氧化物歧化酶的提纯方法，工艺流程有如下步骤：
(1)新鲜猪血经抗凝、防腐后，静置、离心，
(2)将红血球在低温下冷冻，然后用蒸馏水融化，
(3)溶化液用酒精和丙酮抽提，
(4)抽提液用磷酸钾盐析，
(5)盐析后的溶液用丙酮沉淀，再用磷酸钾缓冲液溶解，
(6)溶解液用超滤器平衡、浓缩，
(7)浓缩液用柱层析法分离，淋洗浓度为即时洗脱浓度，
(8)含盐的SOD溶液用超滤器脱盐，
(9)脱盐的SOD纯品液干冻成粉。
2、如权利要求1所述的提纯方法，其特征在于抗凝剂为ACD，防腐剂为正丁醇。
3、如权利要求1、2所述的提纯方法，其特征在于红血球冷冻温度为-10℃以下，蒸馏水温度为40-50℃，冷冻时间为4小时以上。
4、如权利要求1、2所述的提纯方法，其特征在于超滤器的超滤膜截留分子量小于30000。
5、如权利要求3所述的提纯方法，其特征在于超滤器的超滤膜截留分子量小于30000。
本发明属于生化物的提纯方法，涉及一种超氧化物歧化酶的提纯。超氧化物歧化酶（SOD）广泛地分布在动植物体内，是生命细胞在其代谢活动中不可缺少的具有十分重要保护作用的酶，它在机体内通过歧化作用，清除对机体有强烈毒性的超氧化物自由基O-2，其催化歧化作用如下：
2O-2+2H+→O2+H2O2
鉴于超氧化物歧化酶的上述作用，因此，它对人体由于O-2引起的许多疾病和损伤均有明显的治疗和减轻作用。如红斑狼疮、急性炎症、类风湿性关节炎以及由于放疗和化疗所造成的癌患者白细胞数锐减等症。所以，超氧化物歧化酶是项很有开发前途的药用酶制剂。
1979年波兰学者H.Bartkowink等报道了由猪血中提取超氧化物歧化酶的方法（Comp.Biochem.Physiol.，Vol 62B，61-66，1979），其方法如下：
1.新鲜猪血抗凝后，洗涤、离心压积和水溶。用ACD抗凝剂加入新鲜猪血中，然后用三倍于猪血体积的0.9%NaCl溶液洗三次，然后离心压积红细胞，最后用与压积红细胞等体积的水溶解红细胞，得溶血液。
2.溶血液用冷酒精和冷氯仿抽提，得含SOD的抽提液。
3.抽提液用K2HPO4盐析，保留上层盐析相。
4.盐析相加丙酮沉淀蛋白质，再在沉淀蛋白质中加入磷酸钾缓冲液，得上层液。
5.将上层液透析，透析后溶液离心。
6.用离心后的上层液加入DE32柱层析进行层析，得含盐的SOD纯品液。
7.将含盐的SOD纯品液用G25层析柱脱盐。
8.将脱盐的SOD纯品液冻成干粉。
该方法中需用大量NaCl溶液洗涤血液，工作量较大且费时;用透析法平衡溶液浓度，速度慢;特别是该法产量较低，只有167.5mg SOD/10000ml猪血。所以该方法周期长、成本高、产量低、不宜大批生产。
本发明的目的在于提供一种适应工厂批量生产、流程周期短、产量高的提纯方法，使产品成本低，具有商业竞争力。本发明的流程中省去 了对猪血的洗涤步骤，大大缩短了流程周期;用冻融法使红细胞膜全部破裂，SOD得到最大限度的释放，大大增加了产量;用超滤法平衡浓缩蛋白质溶液，可以缩短流程周期和节约磷酸钾缓冲液;在层析柱分离时用即时洗脱方法保证SOD的纯度。
本发明的工艺流程如下：
1.新鲜猪血中加入ACD抗凝剂后静置、离心。
2.将离心所得的红血球在低温下冷冻，再快速融化。冷冻温度控制在-10℃以下。
3.将溶血液用酒精和氯仿抽提。
4.抽提液进行盐析，盐析剂为磷酸钾。
5.经盐析后的溶液用丙酮沉淀蛋白，再用少量磷酸钾缓冲液溶解沉淀蛋白。
6.蛋白溶解液用超滤器平衡和浓缩，平衡液是磷酸钾缓冲液，超滤膜截留分子量不大于30000。
7.平衡浓缩液用柱层析法分离，分高中采用即时浓度洗脱，即可得含盐的SOD纯品液。
8.含盐的SOD纯品液用超滤器脱盐。
9.SOD纯品液冷冻成干粉。
本发明的实施例如下：
1.取10000ml的新鲜猪血，加2500ml ACD抗凝剂，再加50ml正丁醇起防腐作用，然后静置半小时，除去上层血浆，下层红血球用LXJ-Ⅱ型离心机压积10分钟，离心机转速为3000转/分。
ACD抗凝剂的组成是在100ml水中含1.33g枸橼酸钠、0.47g枸橼酸，3g葡萄糖。
2.把上述压积的红细胞置于-10℃冷冻6小时，然后用40℃的4700ml蒸馏水快速溶解，边搅拌边溶解，获溶血液。
3.在溶血液中加2300ml冷酒精（分析纯），边加边搅拌，加料速度为300ml/10min然后再加1400ml冷氯仿（分析纯），边加边搅拌，加料速度为150ml/10min，得含有SOD的抽提液。
冷酒精和冷氯仿均是在-10℃下预冷。
4.在SOD提取液中加3000克固体的K2HPO4·3HO盐析，边加边搅拌，取出上层相离心去沉淀（3000转/分，15分钟）。
5.在上层清液中，加2500ml冷丙酮（分析纯），边加边搅拌，然后离心（3000转/分，15分）得到1.5克的蛋白质沉淀，在沉淀中加入100ml 0.0025M磷酸钾缓冲液，用磁力搅拌器（78-1型，杭州产）搅拌20分钟，然后离心（3000转/分，15分）得上层溶解液。
6.将上述100ml溶解液用超滤器（超滤膜截留分子量为25000）浓缩至20ml左右，再加0.0025M的磷酸钾缓冲液至150ml，再用超滤器浓缩至20ml左右，然后用50ml的0.0025M磷酸钾缓冲液洗出浓缩液，避免SOD流失。
7.将上述浓缩液通过DE32（或DEAE-Sephadex A-50）层析柱，流速为10ml/min。上柱完即用100ml磷酸钾缓冲液淋洗，初始淋洗液浓度为0.0025M，在淋洗过程中，淋洗液浓度慢慢增加，以增加SOD的解吸速度，为了避免杂质蛋白的被洗出，应控制SOD在解吸下移时，其前沿距柱底1cm时，淋洗液浓度不再增加，这就是即时洗脱浓度，该方法称即时浓度洗脱法。
本淋洗液浓度的增加方法为：用流速为10ml/min，浓度为0.2M的磷酸钾溶液加入到0.0025M的磷酸钾缓冲溶液中。
DE32的柱体积为φ4×10cm。
8.上述淋洗下来的SOD溶液用超滤器脱盐。含SOD的淋洗液加入超滤器中，再加蒸馏水至超滤器的2/3处，用3磅正压进行超滤，小分子盐随水流出至10ml为止，该过程反复三次即可。
9.经脱盐的SOD纯品液放入冰箱预冻（-20℃，6小时以上），再放入冷冻干燥机内冷冻（-20℃）并干燥，半小时后温度调至-5℃，再真空干燥12小时以上。
上述获得的SOD产品，其产量可达236mg/10000ml猪血;比活性为12000肾心腺素单位/mg，与波兰的11229肾心腺素单位/mg基本一致;纯度为电泳二条带（一次上柱，70升血），美国Sigma公司从牛血中提取的 SOD为电泳五条带;流程周期较波兰的缩短三分之一时间。
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