新型除草剂抗性基因
阅读：480发布：2024-02-03
专利汇可以提供新型除草剂抗性基因专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了编码甲基转移酶的新型多核苷酸和多肽。本发明提供了表达此处公开的甲基转移酶并对 植物 生长素类 除草剂 有抵抗 力 的新型植物。本发明还提供了已经转化了一种或多种其他除草剂抗性基因的转基因植物，从而使得该植物能够耐受植物生长素类除草剂和一种或多种其他除草剂的施用。，下面是新型除草剂抗性基因专利的具体信息内容。
1.一种转基因植物细胞，包括编码具有甲基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码所述蛋白质，而且所述多核苷酸在严紧条件下与SEQ ID NO：1或其完全互补物杂交。
2.如权利要求1所述的转基因植物细胞，其中所述多核苷酸的表达诱导所述细胞对植物生长素类除草剂抵抗或耐受。
3.如权利要求1所述的转基因植物细胞，其中所述多核苷酸编码SEQID NO：2。
4.如权利要求1所述的转基因植物细胞，所述植物细胞进一步包括第二个异源基因，以使得所述植物细胞对第二种除草剂耐受。
5.如权利要求1所述的转基因植物细胞，其中所述植物细胞为双子叶细胞。
6.如权利要求1所述的转基因植物细胞，其中所述植物细胞为单子叶细胞。
7.一种转基因植物，包括多个如权利要求1、2、3或4所述的细胞，其中所述多核苷酸的表达赋予所述植物对植物生长素类除草剂的耐受性。
8.一种控制杂草的方法，所述方法包括向包含植物和杂草的区域过度喷洒/施用包括植物生长素类除草剂的组合物，所述植物包括多个如权利要求1所述的植物细胞。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述植物为大豆、玉米、拟南芥、烟草、棉花、油菜、稻、小麦、草皮、紫花苜蓿、三叶草、牧场草、水果植物、蔬菜或观赏性植物。
10.如权利要求8或9所述的方法，其中所述植物进一步包括草甘膦抗性基因，而且所述方法进一步包括向所述植物和所述杂草施用草甘膦。
11.如权利要求10所述的方法，所述植物进一步包括第三种除草剂抗性基因，而且所述方法进一步包括向所述植物和所述杂草施用第三种除草剂。
12.一种转基因植物，包括编码包括SEQ ID NO：2的甲基转移酶的异源多核苷酸，所述转基因植物对植物生长素类除草剂有抵抗力。
13.如权利要求12所述的转基因植物，所述植物进一步包括至少一种另外的除草剂抗性基因。
14.如权利要求12或13所述的转基因植物，其中所述植物进一步包括昆虫抗性基因，所述昆虫抗性基因来自选自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、光杆状菌属(Photorhabdus)和致病杆菌属(Xenorhabdus)的有机体。
15.如权利要求12或13所述的转基因植物，其中所述植物进一步包括农艺学特征基因，所述农艺学特征选自真菌抗性、胁迫耐受性、提高的产量、改善的油属性、改善的纤维质量、病毒抗性、延迟成熟、耐寒性和耐盐性。
16.如权利要求12所述的转基因植物，其中所述植物包括源自选自下组来源的生物杀虫剂：日本甲虫芽孢杆菌(Bacillus popilliae)、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)、苏云金芽孢杆菌aizawai亚种(B.thuringiensis subsp.Aizawai)、苏云金芽孢杆菌Kurstaki亚种(B.thuringiensis subsp.Kurstaki)、苏云金芽孢杆菌Tenebrionis亚种(B.thuringiensis subsp.Tenebrionis)、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、苹果蠹蛾颗粒体病毒(Cydia pomonella granulosis virus)、道格拉斯冷杉草丛蛾NPV(Douglas fir tussock moth NPV)、舞毒蛾NPV(gypsy moth NPV)、谷实夜蛾NPV(Helicoverpa zea NPV)、印度谷螟颗粒体病毒(Indian meal moth granulosis virus)、绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、蝗虫微孢子虫(Nosema locustae)、拟青霉(Paecilomyces.fumosoroseus)、淡紫拟青霉菌(P.lilacinus)、发光杆菌(Photorhabdus luminescens)、甜菜夜蛾NPV(Spodoptera exigua NPV)、胰蛋白酶调节抑制因子(trypsin modulating oostatic factor)、嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophilus)和伯氏致病杆菌(X.bovienii)。
17.如权利要求12所述的转基因植物，其中所述植物包含整合有选自Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F、Cry1A.105、Cry2Ab2、Cry3A、mir Cry3A、Cry3Bb1、Cry34、Cry35和VIP3A的保护性杀虫剂的植物。
18.如权利要求12所述的转基因植物，其中所述植物是单子叶或双子叶植物。
19.包括权利要求1-6所述的植物细胞的种子。
20.从权利要求19的种子生长的植物。
21.如权利要求12所述的植物的可再生部分、后代或无性繁殖体。
22.一种选择转化的植物细胞的方法，包括将多个植物细胞用编码包含SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸转化，将所述细胞在包含一定浓度的植物生长素类除草剂的组合物中生长，所述浓度的植物生长素类除草剂允许表达所述多核苷酸的转化细胞生长，而杀死或抑制非转化细胞的生长。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述方法用于选择转化的植物。
24.一种控制场地中杂草的方法，包括在场地中种植至少一种转基因植物的种子，所述种子包含编码包含SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸，并向所述场地的至少部分施加包含植物生长素类除草剂的组合物。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述植物对第二除草剂具有抵抗力，所述第二除草剂选自草甘膦、草铵膦、咪草烟、氯磺隆、麦草畏、甲基磺草酮、异噁氟草和氟丙嘧草酯。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述植物为单子叶植物。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述单子叶植物选自玉米、稻、小麦、大麦、黑麦、暖季和冷季型草坪草、燕麦、高粱和牧场草。
28.如权利要求24所述的方法，其中所述第一除草剂为植物生长素类除草剂，而且所述植物为双子叶植物。
29.如权利要求24所述的方法，其中所述植物为选自棉花、烟草、油菜和大豆的双子叶植物。
30.如权利要求24所述的方法，其中所述方法包括施加第二除草剂，而且所述植物对所述第二除草剂具有抵抗力。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述植物生长素类除草剂和第二除草剂被依次施用。
32.如权利要求30所述的方法，其中所述植物生长素类除草剂和第二除草剂被同时施用。
33.如权利要求24所述的方法，其中所述植物对草甘膦具有抵抗力。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述草甘膦抗性是由编码EPSPS(5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶)或GAT的多核苷酸所赋予的。
35.一种物质组合物，包括：
a)编码包含SEQ ID NO：2的多肽或编码SEQ ID NO：2的多肽片段的多核苷酸序列，所述多肽或片段具有甲基转移酶活性和/或能够赋予植物对植物生长素类除草剂抗性；
b)与SEQ ID NO：1有至少70％同一性而且编码具有甲基转移酶活性和/或能够赋予植物对植物生长素类除草剂抗性的多肽的多核苷酸序列；
c)多核苷酸序列，包括(a)或(b)中所述的多核苷酸序列的至少8个连续核苷酸；
d)与(a)、(b)或(c)中所述的多核苷酸互补的多核苷酸；
e)在低、中或高严紧条件下与(a)、(b)、(c)或(d)中所述的多核苷酸序列杂交的多核苷酸；
f)包括(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中所述的多核苷酸序列的基因构建体；
g)包括(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中所述的多核苷酸或基因构建体的载体；
h)包括如(g)中所述的载体、(f)中所述的基因构建体或(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中任一个所述的多核苷酸的宿主细胞；
i)分离的多肽，所述多肽包括SEQ ID NO：2或具有甲基转移酶活性和/或能够赋予植物对植物生长素类除草剂抗性的SEQ ID NO：2的片段。
36.一种分离的载体，包括有效连接到编码SEQ ID NO：2或具有甲基转移酶活性的SEQ ID NO：2片段的多核苷酸的启动子。
37.如权利要求36所述的载体，其中所述启动子为植物启动子。
38.如权利要求36所述的载体，包括选自木薯脉花叶病毒启动子、CaMV 35S启动子、玄参花叶病毒启动子、稻肌动蛋白启动子、菜豆球蛋白启动子、拟南芥泛素10启动子、玉米泛素启动子、拟南芥Act2启动子、拟南芥泛素11启动子和拟南芥泛素3启动子的启动子。
39.如前述任一项权利要求所述的方法、植物、可再生植物部分、后代、无性繁殖体、植物细胞或多肽，其中所述植物生长素类除草剂如表1或表2或图2或图4或图5或图6中所述。
新型除草剂抗性基因
[0001] 发明背景
[0002] 目前有许多类型用于控制杂草的除草剂。一种非常流行的除草剂是草甘膦。已经开发了抗草甘膦的农作物，例如玉米、大豆、油菜、棉花、甜菜、小麦、草皮(turf)和稻。所以，例如，可以对活跃生长有草甘膦抗性大豆的田地进行喷洒来控制杂草，而不会显著破坏大豆植株。
[0003] 90年代中期，利用引入遗传工程化的草甘膦耐受的农作物(GTC)，农业上种植者能够利用简单、便利、灵活、廉价的工具来前所未有地控制广谱的阔叶杂草和草本杂草。随后，生产者很快采用了GTC，并在许多情况下放弃了许多已经接受的最好的农艺学实践，
例如轮作、轮作操作的除草剂模式(herbicide mode of action rotation)、罐混(tank
mixing)、机械控制杂草与化学和培养控制杂草的结合。目前在美国和其他地区可商购草甘膦耐受的大豆、棉花、玉米和油菜。
例如轮作、轮作操作的除草剂模式(herbicide mode of action rotation)、罐混(tank
mixing)、机械控制杂草与化学和培养控制杂草的结合。目前在美国和其他地区可商购草甘膦耐受的大豆、棉花、玉米和油菜。
[0004] 紫花苜蓿是引入的第一个多年生GTC，增加了在数年时间内对同样的作物和土地重复使用草甘膦的机会。更多的GTC(例如小麦、稻、甜菜、草皮等)已准备好介入未决的
全球市场占有率。许多其他的草甘膦抗性物种在实验至开发的阶段(例如甘蔗、向日葵、
甜菜、豌豆、胡萝卜、黄瓜、莴苣、洋葱、草莓、西红柿和烟草；像杨树和枫香树(sweetgum)这样的林业物种；和像金盏花、矮牵牛和秋海棠这样的园艺物种；参见“isb.vt.edu/cfdocs/fieldtestsl.cfm，2005”网站)。另外，最近这些年草甘膦的费用急剧降低，以至于常规的除草程序很少能有效地与草甘膦GTC系统在价格和性能上面竞争了。
全球市场占有率。许多其他的草甘膦抗性物种在实验至开发的阶段(例如甘蔗、向日葵、
甜菜、豌豆、胡萝卜、黄瓜、莴苣、洋葱、草莓、西红柿和烟草；像杨树和枫香树(sweetgum)这样的林业物种；和像金盏花、矮牵牛和秋海棠这样的园艺物种；参见“isb.vt.edu/cfdocs/fieldtestsl.cfm，2005”网站)。另外，最近这些年草甘膦的费用急剧降低，以至于常规的除草程序很少能有效地与草甘膦GTC系统在价格和性能上面竞争了。
[0005] 在栽培者面对草甘膦抗性的杂草或变化为更加难控制的杂草物种时，可以通过罐混或与可控制遗漏杂草的其他除草剂交替使用来弥补草甘膦的缺点。在许多情况下控制阔
叶的其他杂草的一个惯用罐混物(tankmix)参与者是2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。2，
4-D已经在农艺上应用并在非作物情况下用于广谱的阔叶杂草控制达60年。虽然已经报道
了许多的耐受物种的个别例子，但是2，4-D仍然是最广泛使用的除草剂之一。2，4-D的进一步应用的一个限制是其对于双子叶作物例如大豆或棉花的选择性非常差，所以2，4-D通常
不用于(而且一般不靠近)敏感的双子叶作物。此外，由于可能发生的对禾本科作物造成
伤害的这种性质，从某种程度上限制了2，4-D的应用。2，4-D联合草甘膦已经用于在种植免耕法大豆和棉花之前提供更加稳健的除草处理；但是，由于这些双子叶物种对2，4-D的敏
感性，这些除草处理必须在种植之前至少14-30天进行。
叶的其他杂草的一个惯用罐混物(tankmix)参与者是2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。2，
4-D已经在农艺上应用并在非作物情况下用于广谱的阔叶杂草控制达60年。虽然已经报道
了许多的耐受物种的个别例子，但是2，4-D仍然是最广泛使用的除草剂之一。2，4-D的进一步应用的一个限制是其对于双子叶作物例如大豆或棉花的选择性非常差，所以2，4-D通常
不用于(而且一般不靠近)敏感的双子叶作物。此外，由于可能发生的对禾本科作物造成
伤害的这种性质，从某种程度上限制了2，4-D的应用。2，4-D联合草甘膦已经用于在种植免耕法大豆和棉花之前提供更加稳健的除草处理；但是，由于这些双子叶物种对2，4-D的敏
感性，这些除草处理必须在种植之前至少14-30天进行。
发明内容
[0006] 本发明提供对诸如2，4-D等植物生长素类除草剂有抵抗力的新型植物。在本发明一些发明中，此处公开的植物还对其他除草剂有抵抗力。在本发明的这些方面，也可向植物引入异源的草甘膦-、ALS-(咪唑啉酮、磺酰脲)、芳氧基链烷酸酯-、HPPD-、PPO-和/或草
铵膦抗性基因，以提供对多种除草剂的耐受性。本发明的多个其他方面提供编码能够用于
失活植物生长素类除草剂的甲基转移酶的核酸和多肽序列。
铵膦抗性基因，以提供对多种除草剂的耐受性。本发明的多个其他方面提供编码能够用于
失活植物生长素类除草剂的甲基转移酶的核酸和多肽序列。
[0007] 序列简要说明
[0008] SEQ ID NO：1是编码甲基转移酶PtJBMT3的核酸序列。
[0009] SEQ ID NO：2是SEQ ID NO：1编码的翻译蛋白质序列。
[0010] 表格简要说明
[0011] 表1：示例性可商购植物生长素类除草剂。
[0012] 表2：用植物生长素类除草剂进行的PtJBMT和PtJBMTm3相对活性检测。
[0014] 图1：PtJBMTm3对底物的示例性甲基化。
[0015] 图2：示例性植物生长素类除草剂和PtJBMTm3对除草剂底物的相对活性(相对于对底物2，4-D的ptJBMTm3活性)。
[0016] 图3：PtJBMTm3的序列(SEQ ID NO：1)。活性位点残基用黑体并双下划线表示。
[0017] 图4：PtJBMTm3的其他可能除草剂底物。
[0018] 图5：WO/2009/046090中公开的示例性植物生长素类除草剂。该结构包括的多种取代基和化合物如下：
[0019] A)A代表N或CR5；
[0020] R1代表C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C2-C4烷氧基烷基、C2-C4烷硫烷基、C2-C4烯基、C2-C4卤代烯基、C2-C4烷氧基烯基、C2-C4烷硫基烯基(thioalkylalkenyl)、C2-C4炔基或C2-C4卤代炔基、甲酰基、C2-C4烷基羰基、C2-C4卤代烷基羰基；
[0021] R2代表C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6卤代烯基或
[0022] 其中
[0023] W1代表H或卤素；
[0024] X1代表H、卤素、硝基、氰基、甲酰基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C2-C4烷氧基烷基、C2-C6烷基羰基、C1-C6烷基硫、C1-C6烷基亚磺酰基、C1-C6烷基磺酰基、C2-C4烯氧基、C2-C4炔氧基、C2-C4烯硫基、C2-C4炔硫基、C1-C6卤代烷基、C2-C6卤代烯基、C2-C6卤代炔基、C1-C6卤代烷氧基、C2-C4卤代烷氧基烷基、C2-C6卤代烷基羰基、C1-C6卤代烷硫基、C1-C6卤代烷基亚磺酰基、C1-C6卤代烷基磺酰基、C3-C6三烷基甲硅烷基、C2-C4卤代烯氧基、C2-C4卤代炔氧基、C2-C4卤代烯硫基、C2-C4卤代炔硫基、-C(O)OR7、-C(O)NR6R7、-CR6NOR7、-NR6R7、-NR6OR7、-NR6SO2R7、-NR6C(O)R7、-NR6C(O)OR7、-NR6C(O)NR6R7或-NCR6NR6R7；
[0025] Y1代表H、卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基、C2-C6烯基或C2-C6卤代烯基，或者，当X1和Y1一起时代表-O(CH2)nCH2-或-O(CH2)nO-其中n＝1或2；且
[0026] Z1代表H或卤素；
[0027] R3和R4独立地表示H、C1-C6烷基、C3-C6烯基、C3-C6炔基、羟基、C1-C6烷氧基、氨基、C1-C6酰基、C1-C6烷氧羰基(carboalkoxy)、C1-C6烷基氨甲酰基、C1-C6烷基磺酰基、C1-C6三烷基甲硅烷基或C1-C6二烷基膦酰基，或者R3和R4与N一起表示5-或6-元饱和环；且
[0028] R5代表H或卤素；
[0029] R6表示H、C1-C4烷基或C1-C4卤代烷基；且
[0030] R7表示C1-C4烷基或C1-C4卤代烷基；
[0032] B)如A)所述的化合物，其中R3和R4独立地代表H或C1-C6烷基；
[0033] C)如A或B所述的化合物，其中所述羧酸基团的可农用衍生物为可农用盐、酯和酰胺；
[0034] D)如A或B或C所述的化合物，其中R1为C1-C2烷基、C1-C2卤代烷基、C2-C3烯基或C2-C3卤代烯基；
[0035] E)如D所述的化合物，其中R1为乙烯基；
[0036] F)如A、B、C、D或E中任一个所述的化合物，其中R2为环丙基；
[0037] G)如A、B、C、D或E中任一个所述的化合物，其中R2为
[0038]
[0039] X1代表H、卤素、硝基、氰基、甲酰基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C2-C4烷氧基烷基、C2-C6烷基羰基、C1-C6烷硫基、C1-C6烷基亚磺酰基、C1-C6烷基磺酰基、C2-C4烯氧基、C2-C4炔氧基、C2-C4烯硫基、C2-C4炔硫基、C1-C6卤代烷基、C2-C6卤代烯基、C2-C6卤代炔基、C1-C6卤代烷氧基、C2-C4卤代烷氧基烷基、C2-C6卤代烷基羰基、C1-C6卤代烷硫基、C1-C6卤代烷基亚磺酰基、C1-C6卤代烷基磺酰基、C3-C6三烷基甲硅烷基、C2-C4卤代烯氧基、C2-C4卤代炔氧基、C2-C4卤代烯硫基、C2-C4卤代炔硫基、-C(O)OR7、-C(O)NR6R7、-CR6NOR7、-NR6R7、-NR6OR7、-NR6SO2R7、-NR6C(O)R7、-NR6C(O)OR7、-NR6C(O)NR6R7或-NCR6NR6R7；
[0040] Y1代表H、卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基、C2-C6烯基或C2-C6卤代烯基，或者，当X1和Y1一起时代表-O(CH2)nCH2-或-O(CH2)nO-其中n＝1或2；且
[0041] Z1代表H或卤素；
[0042] R5代表H或卤素；
[0043] R6表示H、C1-C4烷基或C1-C4卤代烷基；且
[0044] R7表示C1-C4烷基或C1-C4卤代烷基；
[0045] H)H中所述的化合物，其中W1代表H或F，X1代表H、卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基或-NR6R7，Y1代表C1或卤代甲基，且Z1代表H或F；
[0046] I)具有如下化学式的化合物
[0047]
[0048] X1代表H、卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基或-NR6R7；
[0049] Y1代表C1或卤代甲基；
[0050] Z1代表H或F；和羧酸基团的可农用衍生物；或
[0051]
[0052] X1代表H、卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基或-NR6R7；
[0053] Y1代表C1或卤代甲基；
[0054] Z1代表H或F；和羧酸基团的可农用衍生物。
[0055] 图6：WO/2005/063721中公开的示例性植物生长素类除草剂。该结构包括的多种取代基和化合物如下：
[0056] A)R1是任选地被1-5个R5取代的环丙基、任选地被1-5个R6取代的异丙基、或任7
选地被1-3个R 取代的苯基；
选地被1-3个R 取代的苯基；
[0057] R2是((O)jC(R15)(R16))kR；
[0058] R是CO2H或CO2H的除草有效的衍生物；
[0059] R3是卤素、氰基、硝基、OR20、SR21或N(R22)R23；
[0060] R4是-N(R24)R25或-NO2；
[0061] R5和R6各自独立地为卤素、C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，C2-C6烯基，C2-C6卤代烯基，C1-C3烷氧基，C1-C2卤代烷氧基，C1-C3烷硫基或C1-C2卤代烷硫基；
[0062] R7各自独立地为卤素、氰基、硝基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C3-C6环烷基、C3-C6卤代环烷基、C1-C4羟基烷基、C2-C4烷氧基烷基、C2-C4卤代烷氧基烷基、C2-C4烯基、C2-C4卤代烯基、C3-C4炔基、C3-C4卤代炔基、羟基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C2-C4烯氧基、C2-C4卤代烯氧基、C2-C4炔氧基、C3-C4卤代炔氧基、C1-C4烷硫基、C1-C4卤代烷硫基、C1-C4烷基亚磺酰基、C1-C4卤代烷基亚磺酰基、C1-C4烷基磺酰基、C1-C4卤代烷基磺酰基、C2-C4烯硫基、C2-C4卤代烯硫基、C2-C4烯基亚磺酰基、C2-C4卤代烯基亚磺酰基、C2-C4烯基磺酰基、C2-C4卤代烯基磺酰基、C3-C4炔硫基、C3-C4卤代炔硫基、C3-C4炔基亚磺酰基、C3-C4卤代炔基亚磺酰基、C3-C4炔基磺酰基、C3-C4卤代炔基磺酰基、C1-C4烷基氨基、C2-C8二烷基氨基、C3-C6环烷基氨基、C4-C6(烷基)环烷基氨基、C2-C6烷基羰基、C2-C6烷氧基羰基、C2-C6烷基氨基羰基、C3-C8二烷基氨基羰基、C3-C6三烷基甲硅烷基、苯基、苯氧基和5-或6-元杂芳环、各个苯基、45
苯氧基和5-或6-元杂芳环可选地被独立地选自R 的一个至三个取代基独立取代；或两个
相邻的R7一起形成-OCH2O-、-CH2CH2O-、-OCH(CH3)O-、-OC(CH3)2O-、-OCF2O-、-CF2CF2O-、-OCF
15
2CF2O-或-CH＝CH-CH＝CH-；R 为H、卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、羟基、C1-C4烷氧基或C2-C4烷基羰基氧；
苯氧基和5-或6-元杂芳环可选地被独立地选自R 的一个至三个取代基独立取代；或两个
相邻的R7一起形成-OCH2O-、-CH2CH2O-、-OCH(CH3)O-、-OC(CH3)2O-、-OCF2O-、-CF2CF2O-、-OCF
15
2CF2O-或-CH＝CH-CH＝CH-；R 为H、卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、羟基、C1-C4烷氧基或C2-C4烷基羰基氧；
[0063] R16为H、卤素、C1-C4烷基或C1-C4卤代烷基；或
[0065] R20为H、C1-C4烷基或C1-C3卤代烷基；
[0066] R21为H、C1-C4烷基或C1-C3卤代烷基；
[0067] R22和R23独立地为H或C1-C4烷基；
[0068] R24为H、用1-2个R30可选取代的C1-C4烷基、1-2个R31可选取代的C2-C4烯基、或32 24 33 34 35 36 37
1-2个R 可选取代的C2-C4炔基；或R 为C(＝O)R 、硝基、OR 、S(O)2R 、N(R )R 或N＝
62 63
C(R )R ；
1-2个R 可选取代的C2-C4炔基；或R 为C(＝O)R 、硝基、OR 、S(O)2R 、N(R )R 或N＝
62 63
C(R )R ；
[0069] R25为H、用1-2个R30或C(＝O)R33可选取代的C1-C4烷基；或
[0070] R24和R25一起形成选自-(CH2)4-、-(CH2)5-、-CH2CH＝CHCH2-和-(CH2)2O(CH2)2-的38
基团、各个基团可选地用1-2个R 取代；或
基团、各个基团可选地用1-2个R 取代；或
[0071] R24和R25一起形成＝C(R39)N(R40)R41或＝C(R42)OR43；
[0072] 各个R30、R31和R32独立地为卤素、C1-C3烷氧基、C1-C3卤代烷氧基、C1-C3烷硫基、C1-C3卤代烷硫基、氨基、C1-C3烷基氨基、C2-C4二烷基氨基或C2-C4烷氧基羰基；
[0073] 各个R33独立地为H、C1-C14烷基、C1-C3卤代烷基、C1-C4烷氧基、苯基、苯氧基或苄氧基；
[0074] R34为H、C1-C4烷基、C1-C3卤代烷基或CHR66C(O)OR67；
[0075] R35为C1-C4烷基或C1-C3卤代烷基；
[0076] R36为H、C1-C4烷基或C(＝O)R64；
[0077] R37为H或C1-C4烷基；
[0078] 各个R38独立地为卤素、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、C1-C3卤代烷氧基、C1-C3烷硫基、C1-C3卤代烷硫基、氨基、C1-C3烷基氨基、C2-C4二烷基氨基或C2-C4烷氧基羰基；
[0079] R39为H或C1-C4烷基；
[0080] R40和R41独立地为H或C1-C4烷基；或
[0081] R40和R41一起形成-(CH2)4-、-(CH2)5-、-CH2CH＝CHCH2-或-(CH2)2O(CH2)2-；
[0082] R42为H或C1-C4烷基；
[0083] R43为C1-C4烷基；
[0084] 各个R45独立地为卤素、氰基、硝基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C3-C6环烷基、C3-C6卤代环烷基、C2-C4烯基、C2-C4卤代烯基、C3-C4炔基、C3-C4卤代炔基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C1-C4烷硫基、C1-C4卤代烷硫基、C1-C4烷基亚磺酰基、C1-C4烷基磺酰基、C1-C4烷基氨基、C2-C8二烷基氨基、C3-C6环烷基氨基、C4-C6(烷基)环烷基氨基、C2-C4烷基羰基、C2-C6烷氧基羰基、C2-C6烷基氨基羰基、C3-C8二烷基氨基羰基或C3-C6三烷基甲硅烷基；
[0085] R62为H、C1-C4烷基或可选地用1-3个R65取代的苯基；
[0086] R63为H或C1-C4烷基；or
[0087] R62和R63一起形成-(CH2)4-或-(CH2)5-；
[0088] R64为H、C1-C14烷基、C1-C3卤代烷基、C1-C4烷氧基、苯基、苯氧基或苄氧基；
[0089] 各个R65独立地为CH3、C1或OCH3；
[0090] R66为H、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基；
[0091] R67为E、C1-C4烷基或苄基；
[0092] j为0或1；和
[0093] k为0或1；
[0094] 只要：
[0095] (a)当k为0，则j为0；
[0096] (b)当R2为CH2ORa其中Ra为H、可选取代地烷基或苄基，则R3不是氰基；
[0097] (c)当R1为每个间位被C1取代的苯基时，该苯基还在对位被R7取代；
[0098] (d)当R1为对位被R7取代的苯基时，该R7不是叔丁基、氰基或任选取代的苯基；
[0099] (e)当R1为任选地被1-5个R6取代的环丙基或异丙基时，则R不是C(＝W)N(Rb)c d e e b c
S(O)2-R-R 其中W为O、S、NR 或NOR ；R 为氢、C1-C4烷基、C2-C6烯基或C2-C6炔基；R 为直f e e d
接键或CHR、O、NR 或NOR ；R 为具有5至6个环原子的任选取代的杂环或碳环芳基，该基
e
团任选地与芳香或非芳香5或6元环稠合；各个R 独立地为H、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基
f
或苯基；和R 为H、C1-C3烷基或苯基；和
S(O)2-R-R 其中W为O、S、NR 或NOR ；R 为氢、C1-C4烷基、C2-C6烯基或C2-C6炔基；R 为直f e e d
接键或CHR、O、NR 或NOR ；R 为具有5至6个环原子的任选取代的杂环或碳环芳基，该基
e
团任选地与芳香或非芳香5或6元环稠合；各个R 独立地为H、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基
f
或苯基；和R 为H、C1-C3烷基或苯基；和
[0100] (f)化学式I的化合物不是二乙基6-氨基-5-硝基-2-苯基-4-嘧啶丙二酸盐；
[0101] B)如A所述的化合物，其中
[0102] R2为CO2R12、CH2OR13、CH(OR46)(OR47)、CHO、C(＝NOR14)H、C(＝NNR48R49)H、(O)jC(R15)16 17 18 19 50 51 52 53 54
(R )CO2R 、C(＝O)N(R )R 、C(＝S)OR 、C(＝O)SR 、C(＝S)SR 或C(＝NR )YR ；
(R )CO2R 、C(＝O)N(R )R 、C(＝S)OR 、C(＝O)SR 、C(＝S)SR 或C(＝NR )YR ；
[0103] R12为H、-CH[C(O)O(CH2)m]、-N＝C(R55)R56；或选自C1-C14烷基、C3-C12环烷基、C4-C12烷基环烷基、C4-C12环烷基烷基、C2-C14烯基、C2-C14炔基和苯基的基团，各个基团任选地被1-3个R27取代；或
[0104] R12为连接化学式I中两个嘧啶环系统中每一个的羧酸酯功能团CO2R12的二价基团，该二价基团选自-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-和-CH(CH3)CH2-；
[0105] R13为H、用1-3个R28任选取代的C1-C10烷基或苄基；
[0106] R14为H、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基或苄基；
[0107] R17为用1-3个R29任选取代的C1-C10烷基或苄基；
[0108] R18为H、C1-C4烷基、羟基、C1-C4烷氧基或S(O)2R57；
[0109] R19为H或C1-C4烷基；
[0110] 各个R27独立地为卤素、氰基、羟基羰基、C2-C4烷氧基羰基、羟基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C1-C4烷硫基、C1-C4卤代烷硫基、氨基、C1-C4烷基氨基、C2-C4二烷基氨44
基、-CH[O(CH2)n]或任选地用1-3个R 取代的苯基；或
基、-CH[O(CH2)n]或任选地用1-3个R 取代的苯基；或
[0111] 两个R27合在一起为-OC(O)O-或-O(C(R58)(R58))1-2O-；或
[0112] 两个R27合在一起为氧原子，与它们所连接的碳原子形成羰基部分；
[0113] 各个R28独立地为卤素、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C1-C4烷硫基、C1-C4卤代烷硫基、氨基、C1-C4烷基氨基或C2-C4二烷基氨基；或
[0114] 两个R28合在一起为氧原子，与它们所连接的碳原子形成羰基部分；
[0115] 各个R29独立地为卤素、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C1-C4烷硫基、C1-C4卤代烷硫基、氨基、C1-C4烷基氨基或C2-C4二烷基氨基；
[0116] 各个R44独立地为卤素、C1-C4烷基、C1-C3卤代烷基、羟基、C1-C4烷氧基、C1-C3卤代烷氧基、C1-C3烷硫基、C1-C3卤代烷硫基、氨基、C1-C3烷基氨基、C2-C4二烷基氨基或硝基；
[0117] R46和R47独立地为C1-C4烷基或C1-C3卤代烷基；或
[0118] R46和R47一起形成-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)-或-(CH2)3-；
[0119] R48为H、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C2-C4烷基羰基、C2-C4烷氧基羰基或苄基；
[0120] R49为H、C1-C4烷基或C1-C4卤代烷基；
[0121] R50、R51和R52为H；或选自C1-C14烷基、C3-C12环烷基、C4-C12烷基环烷基、C4-C12环烷基烷基、C2-C14烯基和C2-C14炔基的基团，各个基团任选地被1-3个R27取代；
[0122] Y为O、S或NR61；
[0123] R53为H、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、C2-C4烷氧基烷基、OH或C1-C3烷氧基；
[0124] R54为C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基或C2-C4烷氧基烷基；或
[0125] R53和R54一起形成-(CH2)2-、-CH2CH(CH3)-或-(CH2)3-；
[0126] R55和R56独立地为C1-C4烷基；
[0127] R57为C1-C4烷基、C1-C3卤代烷基或NR59R60；
[0128] 各个R58独立地选自H和C1-C4烷基；
[0129] R59和R60独立地为H或C1-C4烷基；
[0130] R61为H、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基或C2-C4烷氧基烷基；
[0131] m为2至3的整数，且
[0132] N为1至4的整数；
[0133] C)如B所述的化合物，其中R3为卤素；
[0135] E)如D所述的化合物，其中R2为CO2R12、CH2OR13、CHO或CH2CO2R17；
[0136] F)如E所述的化合物，其中R24为H、C(O)R33或用R30可选取代的C1-C4烷基；R25为24 25 39 40 41
H或C1-C2烷基；或R 和R 一起形成＝C(R )N(R )R ；
H或C1-C2烷基；或R 和R 一起形成＝C(R )N(R )R ；
[0137] G)如F所述的化合物，其中R2为CO2R12；且R24和R25为H；
[0138] H)如G所述的化合物，其中R12为H、C1-C4烷基或苄基；或
[0139] I)如A所述的化合物，其中所述化合物选自下组：
[0140] 甲基6-氨基-5-溴-2-环丙基-4-嘧啶羧酸盐、
[0141] 乙基6-氨基-5-溴-2-环丙基-4-嘧啶羧酸盐、
[0142] 苯基甲基6-氨基-5-溴-2-环丙基-4-嘧啶羧酸盐、
[0143] 6-氨基-5-溴-2-环丙基-4-嘧啶羧酸单钠盐、
[0144] 甲基6-氨基-5-氯-2-环丙基-4-嘧啶羧酸盐、
[0145] 苯基甲基6-氨基-5-氯-2-环丙基-4-嘧啶羧酸盐、
[0146] 6-氨基-5-氯-2-环丙基-4-嘧啶羧酸单钠盐、
[0147] 乙基6-氨基-5-氯-2-环丙基-4-嘧啶羧酸盐、
[0148] 甲基6-氨基-5-氯-2-(4-氯苯基)-4-嘧啶羧酸盐、
[0149] 乙基6-氨基-5-氯-2-(4-氯苯基)-4-嘧啶羧酸盐、
[0150] 6-氨基-5-氯-2-(4-氯苯基)-4-嘧啶羧酸、
[0151] 乙基6-氨基-2-(4-溴苯基)-5-氯-4-嘧啶羧酸盐、
[0152] 甲基6-氨基-2-(4-溴苯基)-5-氯-4-嘧啶羧酸盐、和
[0153] 6-氨基-2-(4-溴苯基)-5-氯-4-嘧啶羧酸。
具体实施方式
[0154] 2，4-D抗性基因的开发及其向作物植物和观赏植物内的引入为杂草控制提供了极好的选择，特别是当赋予2，4-D抗性的基因与赋予其他除草剂抗性或耐受性的其他基因联
用时。本发明公开的甲基转移酶的另一个优点是其在表达该基因的植物中赋予对病原真菌
抵抗力的能力。
用时。本发明公开的甲基转移酶的另一个优点是其在表达该基因的植物中赋予对病原真菌
抵抗力的能力。
[0155] 现在已经鉴定了一种新型基因(PtJBMTm3)，当其在植物中表达时，能够使得在不存在对植物生长素类除草剂有固有耐受性的植物上可以使用包括植物生长素类除草剂的
组合物。在呈现一定程度的植物生长素类除草剂耐受的植物中，这种耐受能够通过引入
PtJBMTm3并在该植物细胞中表达PtJBMTm3来增强。现在只含有PtJBMTm3的植物可以用两
种或更多种植物生长素类除草剂组合物依次处理或同时处理，这样的植物将减少被这些除
草剂伤害的风险。植物生长素类除草剂的非限制性实例列于表1、表2、图2和图4-6。植物
生长素类除草剂的其他非限制性实例包括环丙嘧啶酸(aminoacyclopyrachlor)、喹草酸和
WO/2009/046090(参见图5)和WO/2005/063721(参见图6)中公开的植物生长素类除草剂，
其公开在此通过引用整体合并入本申请作为参考。对于本领域技术人员来说明显的是，已
知许多植物生长素类除草剂。通常这些除草剂以可农用盐(例如钾、钠)和/或酯(例如
甲基酯、乙基酯、异辛基酯、甲基庚基酯、乙基己基酯等)的形式提供。因此，包括PtJBMTm3的植物将对这些除草剂呈现一定程度的耐受，而且能够用这些除草剂处理而不会招致显著
的伤害。
组合物。在呈现一定程度的植物生长素类除草剂耐受的植物中，这种耐受能够通过引入
PtJBMTm3并在该植物细胞中表达PtJBMTm3来增强。现在只含有PtJBMTm3的植物可以用两
种或更多种植物生长素类除草剂组合物依次处理或同时处理，这样的植物将减少被这些除
草剂伤害的风险。植物生长素类除草剂的非限制性实例列于表1、表2、图2和图4-6。植物
生长素类除草剂的其他非限制性实例包括环丙嘧啶酸(aminoacyclopyrachlor)、喹草酸和
WO/2009/046090(参见图5)和WO/2005/063721(参见图6)中公开的植物生长素类除草剂，
其公开在此通过引用整体合并入本申请作为参考。对于本领域技术人员来说明显的是，已
知许多植物生长素类除草剂。通常这些除草剂以可农用盐(例如钾、钠)和/或酯(例如
甲基酯、乙基酯、异辛基酯、甲基庚基酯、乙基己基酯等)的形式提供。因此，包括PtJBMTm3的植物将对这些除草剂呈现一定程度的耐受，而且能够用这些除草剂处理而不会招致显著
的伤害。
[0156] 此外，当在植物细胞中表达时，PtJBMTm3可提供对病原真菌的植物内(in planta)保护。因此，提供了一种提高植物对病原真菌抗性的方法，包括在植物或植物细胞中表达足以赋予对该病原真菌抗性的量的PtJBMTm3基因产物。在本发明的这一方面，针对没有转化PtJBMTm3的对照植物或作为对照的已经转化了其他基因(不能赋予病原真菌抗性的基因)
的植物测定了对病原真菌抗性的增加。可以控制的病原真菌的非限制性实例包括亚洲大豆
锈病、大豆尾孢菌和玉米的灰色叶斑病。
的植物测定了对病原真菌抗性的增加。可以控制的病原真菌的非限制性实例包括亚洲大豆
锈病、大豆尾孢菌和玉米的灰色叶斑病。
[0157] 本发明的另一方面提供了在转基因植物中将PtJBMTm3与草甘膦耐受特性(和/或其他除草剂耐受特性)的结合。因此，可以在相同的作物/植物上使用草甘膦和植物生
长素类(例如2，4-D)除草剂。本领域技术人员可知，这类除草剂能够在包括两种或更多种
除草剂(例如草甘膦和2，4-D)的罐混物中同时应用。此外，可以进行单独/依次施用单独
的除草剂组合物作为种植前、出土前、萌芽后-直接、放置(layby)或萌芽后杂草控制。这
些除草剂组合物的单独/依次施用可以间隔约2小时至约3个月的时间。
长素类(例如2，4-D)除草剂。本领域技术人员可知，这类除草剂能够在包括两种或更多种
除草剂(例如草甘膦和2，4-D)的罐混物中同时应用。此外，可以进行单独/依次施用单独
的除草剂组合物作为种植前、出土前、萌芽后-直接、放置(layby)或萌芽后杂草控制。这
些除草剂组合物的单独/依次施用可以间隔约2小时至约3个月的时间。
[0158] 如上所述，可向植物或植物细胞中引入一个或多个赋予另外的除草剂抗性或耐受性的基因。例如，赋予：草甘膦抗性(例如抗性植物或细菌EPSPS)；草甘膦氧化还原酶(例
如，GOX或GAT)；草铵膦抗性(例如，Pat或bar)；针对抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的除草剂
的抗性(例如，AHAS，Csr1或SurA)；溴草腈抗性(例如，Bxn)；对HPPD(4-羟基苯基-丙酮
酸酯-双加氧酶)的除草剂抑制剂的抗性；对茄红素去饱和酶(PDS)的除草剂抑制剂的抗
性；对光系统II抑制性除草剂的抗性(例如，psbA)；对光系统I抑制性除草剂的抗性；对原卟啉原氧化酶IX(PPO)-抑制的除草剂的抗性(例加，PPO-1)；对苯基脲除草剂的抗性(例
加，CYP76B1)；对麦草畏类除草剂的抗性(例如，麦草畏-降解酶，例如US 20030135879中
公开的，其通过引用在此整体合并)；对植物生长素类除草剂的抗性(例如，AAD12赋予对苯氧基和吡啶氧基植物生长素的抗性)的基因和ACCase抑制剂能用于提供对给定除草剂的
抗性。
如，GOX或GAT)；草铵膦抗性(例如，Pat或bar)；针对抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的除草剂
的抗性(例如，AHAS，Csr1或SurA)；溴草腈抗性(例如，Bxn)；对HPPD(4-羟基苯基-丙酮
酸酯-双加氧酶)的除草剂抑制剂的抗性；对茄红素去饱和酶(PDS)的除草剂抑制剂的抗
性；对光系统II抑制性除草剂的抗性(例如，psbA)；对光系统I抑制性除草剂的抗性；对原卟啉原氧化酶IX(PPO)-抑制的除草剂的抗性(例加，PPO-1)；对苯基脲除草剂的抗性(例
加，CYP76B1)；对麦草畏类除草剂的抗性(例如，麦草畏-降解酶，例如US 20030135879中
公开的，其通过引用在此整体合并)；对植物生长素类除草剂的抗性(例如，AAD12赋予对苯氧基和吡啶氧基植物生长素的抗性)的基因和ACCase抑制剂能用于提供对给定除草剂的
抗性。
[0159] 可以通过上述基因赋予对其的抗性或耐受性的除草剂的实例包括但不限于：ALS抑制剂，例如磺酰脲类(如：氯嘧磺隆、甲磺隆、玉嘧黄隆、甲基噻吩磺隆
(thifensulfuron-methyl)、苯磺隆、氯磺隆、吡氯黄隆、烟嘧磺隆、嘧磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆)；咪唑啉酮类(imidazoloninones)例如灭草烟、咪草啶酸、咪草烟或灭草喹；三唑嘧啶磺苯胺类(triazolopyrimidine sulfonanilide)(例如唑嘧磺胺盐、唑嘧磺胺、双氟磺草胺、氟唑啶草、唑草磺胺和五氟磺草胺)；嘧啶硫代苯甲酸(pyrimidinylthiobenzoate)
类(例如双嘧苯甲酸和嘧硫苯甲酸)；和氟酮磺隆。HPPD抑制性除草剂的一些实例包括但不
限于tembotrione、苯吡唑草酮(topramezone)、甲基磺草酮、异噁氟草和磺草酮。PPO抑制性除草剂包括但不限于，酰亚胺苯氧乙酸、氟噁嗪酮、氟哒嗪草酯(flufenpyr)、氟唑草酯、达草氟、氟丙嘧草酯、氟酮唑草、磺胺草唑和联苯醚类(例如氟锁草醚、氟磺胺草醚、乳氟禾草灵和氟硝草醚)。
(thifensulfuron-methyl)、苯磺隆、氯磺隆、吡氯黄隆、烟嘧磺隆、嘧磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆)；咪唑啉酮类(imidazoloninones)例如灭草烟、咪草啶酸、咪草烟或灭草喹；三唑嘧啶磺苯胺类(triazolopyrimidine sulfonanilide)(例如唑嘧磺胺盐、唑嘧磺胺、双氟磺草胺、氟唑啶草、唑草磺胺和五氟磺草胺)；嘧啶硫代苯甲酸(pyrimidinylthiobenzoate)
类(例如双嘧苯甲酸和嘧硫苯甲酸)；和氟酮磺隆。HPPD抑制性除草剂的一些实例包括但不
限于tembotrione、苯吡唑草酮(topramezone)、甲基磺草酮、异噁氟草和磺草酮。PPO抑制性除草剂包括但不限于，酰亚胺苯氧乙酸、氟噁嗪酮、氟哒嗪草酯(flufenpyr)、氟唑草酯、达草氟、氟丙嘧草酯、氟酮唑草、磺胺草唑和联苯醚类(例如氟锁草醚、氟磺胺草醚、乳氟禾草灵和氟硝草醚)。
[0160] 不仅PtJBMTm3可以单独使用或与赋予其他除草剂抗性的基因联合使用，包含PtJBMTm3的植物(单独或与赋予除草剂抗性的其他基因联合)也可以用提供附加特征(例
如昆虫抗性、真菌抗性或胁迫耐受性、提高产量、改善油属性(oil profile)和/或提高纤
维质量)的核酸转化。
如昆虫抗性、真菌抗性或胁迫耐受性、提高产量、改善油属性(oil profile)和/或提高纤
维质量)的核酸转化。
[0161] 核酸和多肽
[0162] 如上所述，本发明提供了分别指定为PtJBMTm3(SEQ ID NO：1)和PtJBMTm3(SEQ ID NO：2)的核酸和多肽。PtJBMTm3具有甲基化植物生长素类除草剂的能力。此外，当在植物细胞中表达时，PtJBMTm3还可提供对多种病原真菌的抗性。因此，本发明还提供了在植物
内和/或体外甲基化2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和其他植物生长素类除草剂的方法，包
括将植物生长素类除草剂与包括SEQ ID NO：2的多肽在允许植物生长类除草剂甲基化的条
件(例如在诸如S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的辅因子存在下)下接触。
内和/或体外甲基化2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和其他植物生长素类除草剂的方法，包
括将植物生长素类除草剂与包括SEQ ID NO：2的多肽在允许植物生长类除草剂甲基化的条
件(例如在诸如S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的辅因子存在下)下接触。
[0163] 所以，本发明的一个方面提供了包括SEQ ID NO：2(PtJBMTm3)的多肽。在本发明的上下文中，术语“寡肽”、“多肽”、“肽”和“蛋白质”可以互换使用；然而应理解的是，本发明不涉及天然形式的多肽，也就是说，它们不是在其天然环境中，而是可能已经分离或通过从天然来源纯化得到，或已从基因操作制备的宿主细胞得到(例如所述多肽或其片段由宿
主细胞重组生产，或通过化学合成重组制备，而且，可选地，从宿主细胞或反应混合物中纯化)。在本申请文件中，术语“寡肽”、“多肽”、“肽”和“蛋白质”还用来指代通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羧基之间的肽键互相连接的一系列残基，通常是L-氨基酸。本发明还提
供了包括SEQ ID NO：2的多肽和/或SEQ ID NO：2的多肽片段，其中所述片段当在植物中
表达时，具有甲基化植物生长素类除草剂底物，或赋予病原真菌或植物生长素除草剂抗性
的能力。
主细胞重组生产，或通过化学合成重组制备，而且，可选地，从宿主细胞或反应混合物中纯化)。在本申请文件中，术语“寡肽”、“多肽”、“肽”和“蛋白质”还用来指代通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羧基之间的肽键互相连接的一系列残基，通常是L-氨基酸。本发明还提
供了包括SEQ ID NO：2的多肽和/或SEQ ID NO：2的多肽片段，其中所述片段当在植物中
表达时，具有甲基化植物生长素类除草剂底物，或赋予病原真菌或植物生长素除草剂抗性
的能力。
[0164] 根据本发明的多肽片段，通常包括SEQ ID NO：2的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、2122、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、
38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、
63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、
88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、
110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、
129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、
148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、
167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、
186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、
205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、
224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、
243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、
262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、
281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、
300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、
319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、
338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、
357、358、359、360、361、362、363或364个连续的氨基酸的连续片段。某些实施方式提供了其中氨基酸从该多肽的C-末端和/或N-末端删除的SEQ ID NO：2的片段，条件是没有删
除其活性位点残基(参见图3)。此处公开的任何SEQ ID NO：2片段都保持了当在植物中
表达时甲基化植物生长素类除草剂底物的生物学活性和/或赋予病原真菌或植物生长素
类除草剂抗性的能力。
38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、
63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、
88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、
110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、
129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、
148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、
167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、
186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、
205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、
224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、
243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、
262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、
281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、
300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、
319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、
338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、
357、358、359、360、361、362、363或364个连续的氨基酸的连续片段。某些实施方式提供了其中氨基酸从该多肽的C-末端和/或N-末端删除的SEQ ID NO：2的片段，条件是没有删
除其活性位点残基(参见图3)。此处公开的任何SEQ ID NO：2片段都保持了当在植物中
表达时甲基化植物生长素类除草剂底物的生物学活性和/或赋予病原真菌或植物生长素
类除草剂抗性的能力。
[0165] 本文所述的片段可以通过用蛋白水解酶(例如胰蛋白酶、糜蛋白酶或胶原酶)或化学试剂(例如溴化氰(CNBr))裂解本发明的多肽得到。或者，多肽片段可以在高度酸化
的环境中产生，例如在pH 2.5的环境中。这样的多肽片段还可通过化学合成的方法，或用
转化了本发明的表达载体的宿主同样很好地制备。转化后的宿主细胞包含在调节和/或表
达这些多肽片段的适宜元件的控制下允许这些片段表达的核酸。
的环境中产生，例如在pH 2.5的环境中。这样的多肽片段还可通过化学合成的方法，或用
转化了本发明的表达载体的宿主同样很好地制备。转化后的宿主细胞包含在调节和/或表
达这些多肽片段的适宜元件的控制下允许这些片段表达的核酸。
[0166] “变体多肽”(或多肽变体)应理解为指代相对于天然多肽呈现某些修饰的多肽。这些修饰可包括删除、添加或取代至少一个氨基酸、平截、延长、嵌合融合、突变或呈现翻译后修饰的多肽。在这些同源性变体多肽中，那些包括与全长多肽(SEQ ID NO：2)呈现至少
(或至少约)20.00％至99.99％(包括99.99％)同一性的氨基酸序列的同源性变体多肽是
本发明的另一方面。取上述同一性百分比范围作为包括和提供对介于20.00％和多至包括
99.99％的范围间，以0.01％的间隔的任何分数百分比的书面描述和支持。这些百分比是纯粹统计学的，而且两个多肽序列之间的差异可随机分布并跨越整个序列全长。因此，变体多肽可与本发明的多肽序列可具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、
36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、
61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、
86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的同一性。在优选的实施方式中，变体或修饰的多肽与SEQ IDNO：2呈现至少60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、
74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或
99％的同一性。通常同一性百分比参照全长、天然和/或自然产生的多肽(例如SEQ IDNO：
2)计算。在一切情况下，变体多肽保持SEQ ID NOs：2中所述多肽相关活性的至少一种，特别是甲基化植物生长素类底物的能力、当在植物中表达时赋予植物生长素类除草剂抗性的
能力或当在植物中表达时赋予病原真菌抗性的能力。
(或至少约)20.00％至99.99％(包括99.99％)同一性的氨基酸序列的同源性变体多肽是
本发明的另一方面。取上述同一性百分比范围作为包括和提供对介于20.00％和多至包括
99.99％的范围间，以0.01％的间隔的任何分数百分比的书面描述和支持。这些百分比是纯粹统计学的，而且两个多肽序列之间的差异可随机分布并跨越整个序列全长。因此，变体多肽可与本发明的多肽序列可具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、
36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、
61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、
86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的同一性。在优选的实施方式中，变体或修饰的多肽与SEQ IDNO：2呈现至少60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、
74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或
99％的同一性。通常同一性百分比参照全长、天然和/或自然产生的多肽(例如SEQ IDNO：
2)计算。在一切情况下，变体多肽保持SEQ ID NOs：2中所述多肽相关活性的至少一种，特别是甲基化植物生长素类底物的能力、当在植物中表达时赋予植物生长素类除草剂抗性的
能力或当在植物中表达时赋予病原真菌抗性的能力。
[0167] 在一些实施方式中，变体多肽在图3中鉴定的活性位点残基中不包含氨基酸取代，而且氨基酸取代可以在多个其他氨基酸中进行。在另外的实施方式中，氨基酸取代可以在活性位点残基中进行。在另外的实施方式中，提供了其中几个(即5至10个、1至5个、
1至3个、1和2个或只有1个)氨基酸被以任何组合取代、删除或添加的变体。特别优选
的是沉默取代、添加或删除，其不会改变该蛋白质的性质和活性(即甲基化植物生长素类
底物(除草剂)的能力、当在植物中表达时赋予植物对植物生长素类除草剂抗性和/或病
原真菌抗性的能力)。适宜的氨基酸取代的实例如下所述。例如，在下文提供的组中的氨基酸可以互相取代。或者，保守的/同义的氨基酸可以取代表3中所示的给定氨基酸。在一
切情况下，变体多肽保持SEQ ID NOs：2中所述多肽相关活性的至少一种，特别是甲基化植物生长素类底物的能力、当在植物中表达时赋予植物生长素类除草剂抗性的能力和/或当
在植物中表达时赋予病原真菌抗性的能力。任何氨基酸取代都应该是“保守的”、“同义的”或“安全的”取代，其通常限定引入具有足够相似化学性质(例如碱性、带正电荷的氨基酸应该被另一个碱性、带正电荷的氨基酸取代)的氨基酸取代，以保持该分子的结构和生物
学功能。在表3中提供了这种“保守的”“同义的”或“安全的”取代的实例，而且文献提供了许多模型，基于这些模型，保守氨基酸取代的选择能够在对蛋白质的序列和/或结构的
统计学和物理-化学研究的基础上进行(Rogov S.I.和Nekrasov A.N.，2001)。蛋白质设
计实验已经表明氨基酸特定子集的应用能够产生可折叠而且有活性的蛋白质，协助氨基酸
“同义”替代的分类，这种分类能够更容易地适应蛋白质结构，而且能用于检测功能和结构类似物和旁系同源物(Murphy L.R.等人，2000)。同义和优选同义氨基酸的组示于表3中。
或者，本申请提供了下列各组中氨基酸残基能够互相替代的实施方式：(i)Ala，Val，Leu和Ile；(ii)Ser和Thr；(iii)Asp和Glu；(iv)Asn和Gln；(v)Lys和Arg；或(vi)Phe和Tyr。
在一切情况下，变体多肽保持SEQ ID NOs：2中所述多肽相关活性的至少一种，特别是甲基化植物生长素类底物的能力、当在植物中表达时赋予病原真菌抗性或植物生长素类除草剂
抗性的能力。
1至3个、1和2个或只有1个)氨基酸被以任何组合取代、删除或添加的变体。特别优选
的是沉默取代、添加或删除，其不会改变该蛋白质的性质和活性(即甲基化植物生长素类
底物(除草剂)的能力、当在植物中表达时赋予植物对植物生长素类除草剂抗性和/或病
原真菌抗性的能力)。适宜的氨基酸取代的实例如下所述。例如，在下文提供的组中的氨基酸可以互相取代。或者，保守的/同义的氨基酸可以取代表3中所示的给定氨基酸。在一
切情况下，变体多肽保持SEQ ID NOs：2中所述多肽相关活性的至少一种，特别是甲基化植物生长素类底物的能力、当在植物中表达时赋予植物生长素类除草剂抗性的能力和/或当
在植物中表达时赋予病原真菌抗性的能力。任何氨基酸取代都应该是“保守的”、“同义的”或“安全的”取代，其通常限定引入具有足够相似化学性质(例如碱性、带正电荷的氨基酸应该被另一个碱性、带正电荷的氨基酸取代)的氨基酸取代，以保持该分子的结构和生物
学功能。在表3中提供了这种“保守的”“同义的”或“安全的”取代的实例，而且文献提供了许多模型，基于这些模型，保守氨基酸取代的选择能够在对蛋白质的序列和/或结构的
统计学和物理-化学研究的基础上进行(Rogov S.I.和Nekrasov A.N.，2001)。蛋白质设
计实验已经表明氨基酸特定子集的应用能够产生可折叠而且有活性的蛋白质，协助氨基酸
“同义”替代的分类，这种分类能够更容易地适应蛋白质结构，而且能用于检测功能和结构类似物和旁系同源物(Murphy L.R.等人，2000)。同义和优选同义氨基酸的组示于表3中。
或者，本申请提供了下列各组中氨基酸残基能够互相替代的实施方式：(i)Ala，Val，Leu和Ile；(ii)Ser和Thr；(iii)Asp和Glu；(iv)Asn和Gln；(v)Lys和Arg；或(vi)Phe和Tyr。
在一切情况下，变体多肽保持SEQ ID NOs：2中所述多肽相关活性的至少一种，特别是甲基化植物生长素类底物的能力、当在植物中表达时赋予病原真菌抗性或植物生长素类除草剂
抗性的能力。
[0168] 在本发明的另一方面，多肽也可包括一种或多种异源多肽序列(例如促进本发明多肽纯化的标签，(参见例如美国专利No.6,342,362，在此通过引用整体并入本申请作
为参考；Altendorf等人，1999-WWW，2000；Baneyx 1999；Eihauer等人，2001；Jones等人，
1995；Margolin 2000；Puig等人，2001；Sassenfeld 1990；Sheibani 1999；Skerra等人，
1999；Smith 1998；Smyth等人，2000；Unger 1997，各自通过引用整体并入本申请作为参考)，或者可从卖主商购的标签，例如STRATAGENE(La Jolla，CA)，NOVAGEN(Madison，WI)，QIAGEN，Inc.，(Valencia，CA)，or InVitrogen(San Diego，CA)。
为参考；Altendorf等人，1999-WWW，2000；Baneyx 1999；Eihauer等人，2001；Jones等人，
1995；Margolin 2000；Puig等人，2001；Sassenfeld 1990；Sheibani 1999；Skerra等人，
1999；Smith 1998；Smyth等人，2000；Unger 1997，各自通过引用整体并入本申请作为参考)，或者可从卖主商购的标签，例如STRATAGENE(La Jolla，CA)，NOVAGEN(Madison，WI)，QIAGEN，Inc.，(Valencia，CA)，or InVitrogen(San Diego，CA)。
[0169] 本发明又一方面提供：
[0170] a)编码包括SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸序列或编码一个或编码SEQ ID NO：2的多肽片段的多核苷酸；
[0171] b)与SEQ ID NO：1具有至少70％同一性而且编码具有甲基转移酶活性多肽的多核苷酸序列或包括SEQ ID NO：1的多核苷酸；
[0172] c)多核苷酸序列，包括(a)或(b)中所述的多核苷酸序列的至少8个连续核苷酸；
[0173] d)与(a)、(b)或(c)中所述的多核苷酸互补的多核苷酸；
[0174] e)在低、中或高严紧条件下与(a)、(b)、(c)或(d)中所述的多核苷酸杂交的多核苷酸；
[0175] f)包括(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中所述的多核苷酸序列的基因构建体；
[0176] g)包括(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中所述的多核苷酸或基因构建体的载体；
[0177] h)包括如(g)中所述的载体、(f)中所述的基因构建体或(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中任一个所述的多核苷酸的宿主细胞；或
[0178] i)包括如(g)中所述的载体、(f)中所述的基因构建体或(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中任一个所述的多核苷酸的转基因植物、植物细胞或植物部分；
[0179] 本发明的基因构建体也可包含另外的调节元件，例如启动子和增强子和可选的选择标记物。还落入本发明范围内的有包含此处所述的基因构建体或有效连接到调节元件
(例如启动子或增强子)的编码上述多肽的多核苷酸的载体或表达框。这些载体和表达框
还可包含其他转录控制序列。这些载体和表达框可进一步包括选择性标记物。表达框可包
含有效连接到控制元件将要共转化到所述有机体中的至少一个附加的基因。或者，可以在
多表达框上提供附加的基因和控制元件。这样的表达框与多个限制性酶切位点一起提供，
以插入处于调节区域的转录调节下的本发明序列。表达框可另外包含有效连接到控制元件
的选择性标记基因。
(例如启动子或增强子)的编码上述多肽的多核苷酸的载体或表达框。这些载体和表达框
还可包含其他转录控制序列。这些载体和表达框可进一步包括选择性标记物。表达框可包
含有效连接到控制元件将要共转化到所述有机体中的至少一个附加的基因。或者，可以在
多表达框上提供附加的基因和控制元件。这样的表达框与多个限制性酶切位点一起提供，
以插入处于调节区域的转录调节下的本发明序列。表达框可另外包含有效连接到控制元件
的选择性标记基因。
[0180] 表达框将以转录的5′-3′方向包括：转录和翻译起始区域、本发明的DNA序列和转录和翻译终止区域。转录起始区域、启动子可以是宿主细胞天然(同源的(analogous))
或外来的(异源的)。另外，启动子可以是天然序列或合成序列。“外来的”是指该转录起
始区域/启动子不是发现于该转录起始区域要引入的天然植物的转录起始区域/启动子。
此处使用的嵌合基因包括有效连接到与其异源的转录起始区域的编码序列。
或外来的(异源的)。另外，启动子可以是天然序列或合成序列。“外来的”是指该转录起
始区域/启动子不是发现于该转录起始区域要引入的天然植物的转录起始区域/启动子。
此处使用的嵌合基因包括有效连接到与其异源的转录起始区域的编码序列。
[0181] 本发明的另一方面提供了克隆和/或表达此处教导的多核苷酸序列的载体。本发明的载体也可包括允许所述核苷酸序列在给定宿主细胞中表达和/或分泌所必须的元件。
该载体可包含启动子、翻译起始和终止信号，以及调节转录的适当区域。在某些实施方式
中，载体可稳定地保持在宿主细胞中，而且可以可选地包含指导翻译后蛋白质分泌的信号
序列。根据使用的宿主细胞选择这些不同的元件。载体可整合入宿主基因组内，或可选地，为自主复制的载体。
该载体可包含启动子、翻译起始和终止信号，以及调节转录的适当区域。在某些实施方式
中，载体可稳定地保持在宿主细胞中，而且可以可选地包含指导翻译后蛋白质分泌的信号
序列。根据使用的宿主细胞选择这些不同的元件。载体可整合入宿主基因组内，或可选地，为自主复制的载体。
[0182] 本发明还提供了此处公开的多核苷酸序列编码的多肽或肽片段表达，包括在允许所述多肽表达的条件下用本发明的多核苷酸转化的宿主细胞的培养，和可选的回收所表达
的多肽。
的多肽。
[0183] 此处公开的多核苷酸序列也可由核酸序列调节，以使得所述蛋白质或肽在转化了该重组DNA分子的宿主细胞中表达。例如，蛋白质或肽的表达可由本领域已知的任何启
动子/增强子控制。可用于控制表达的启动子包括但不限于CMV-IE启动子、SV40早期启
动子区域(Benoist和Chambon 1981)、包含在劳斯氏肉瘤病毒的3′长末端重复中的启
动子(Yamamoto等人，1980)、单纯疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人，1981)、金属硫蛋白
基因的调节序列(Brinster等人，1982)；包含例如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff
等人，1978)或tac启动子(deBoer等人，1983)等启动子的原核载体；还参见“Useful
proteins from recombinant bacteria”出自Scientific American，1980，242：74-94；包括胭脂碱合成酶启动子区域(Herrera-Estrella等人，1983)或花椰菜花叶病毒35S RNA
启动子(Gardner等人，1981)的植物表达启动子，和光合酶核酮糖二磷酸羧化酶的启动
子(Herrera-Estrella等人，1984)；来自酵母或真菌的启动子元件，例如Gal 4启动子、
ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子和/或碱性磷酸酶启动子。其他适宜
的启动子包括木薯脉花叶病毒启动子、CaMV 35S启动子、玄参花叶病毒启动子、稻肌动蛋白启动子(或其他植物来源的肌动蛋白启动子)、菜豆球蛋白启动子、拟南芥泛素10启动子、
玉米泛素启动子、拟南芥Act2启动子、拟南芥泛素11启动子和拟南芥泛素3启动子的启动
子。
动子/增强子控制。可用于控制表达的启动子包括但不限于CMV-IE启动子、SV40早期启
动子区域(Benoist和Chambon 1981)、包含在劳斯氏肉瘤病毒的3′长末端重复中的启
动子(Yamamoto等人，1980)、单纯疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人，1981)、金属硫蛋白
基因的调节序列(Brinster等人，1982)；包含例如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff
等人，1978)或tac启动子(deBoer等人，1983)等启动子的原核载体；还参见“Useful
proteins from recombinant bacteria”出自Scientific American，1980，242：74-94；包括胭脂碱合成酶启动子区域(Herrera-Estrella等人，1983)或花椰菜花叶病毒35S RNA
启动子(Gardner等人，1981)的植物表达启动子，和光合酶核酮糖二磷酸羧化酶的启动
子(Herrera-Estrella等人，1984)；来自酵母或真菌的启动子元件，例如Gal 4启动子、
ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子和/或碱性磷酸酶启动子。其他适宜
的启动子包括木薯脉花叶病毒启动子、CaMV 35S启动子、玄参花叶病毒启动子、稻肌动蛋白启动子(或其他植物来源的肌动蛋白启动子)、菜豆球蛋白启动子、拟南芥泛素10启动子、
玉米泛素启动子、拟南芥Act2启动子、拟南芥泛素11启动子和拟南芥泛素3启动子的启动
子。
[0184] 本发明还包括转化了本发明的载体的宿主细胞。这些细胞可以通过向宿主细胞中引入如上所述插入载体中的核苷酸序列、然后在允许本发明的多核苷酸序列复制和/或表
达的条件下培养所述细胞得到。
达的条件下培养所述细胞得到。
[0185] 可从真核或原核系统选择宿主细胞，例如细菌细胞(革兰氏阴性或革兰氏阳性)、酵母细胞(例如啤酒酵母(Saccharomyces cereviseae)或毕赤酵母(Pichia pastoris))、
动物细胞(例如中华仓鼠卵巢(CHO)细胞)、植物细胞和/或使用杆状病毒载体的昆虫细
胞。在一些实施方式中，用于表达所述多肽的宿主细胞包括但不限于，美国专利6,319,691、
6,277,375、5,643,570或5,565,335中教导的那些细胞，这些专利通过引用整体合并于此
作为参考，包括各个分别的专利中引用的所有参考文献。
动物细胞(例如中华仓鼠卵巢(CHO)细胞)、植物细胞和/或使用杆状病毒载体的昆虫细
胞。在一些实施方式中，用于表达所述多肽的宿主细胞包括但不限于，美国专利6,319,691、
6,277,375、5,643,570或5,565,335中教导的那些细胞，这些专利通过引用整体合并于此
作为参考，包括各个分别的专利中引用的所有参考文献。
[0186] 另外，可选择调节插入序列表达或以所需的特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞。在某些诱导子的存在下可提高从某些启动子的表达，因此可控制基因工程化多肽的
表达。此外，不同的宿主细胞具有蛋白质翻译和翻译后加工和修饰(例如糖基化、磷酸化)
的特征和特定机制。可选择适当的细胞系或宿主系统来保证表达的外来蛋白质所需的修饰
和加工。例如，细菌系统中的表达可用于生产不糖基化的核心蛋白质产物。酵母中的表达
可生产糖基化产物。植物细胞中的表达可用于保证植物来源蛋白质的“天然”糖基化。此
外，不同的载体/宿主表达系统可不同程度地影响加工反应。
表达。此外，不同的宿主细胞具有蛋白质翻译和翻译后加工和修饰(例如糖基化、磷酸化)
的特征和特定机制。可选择适当的细胞系或宿主系统来保证表达的外来蛋白质所需的修饰
和加工。例如，细菌系统中的表达可用于生产不糖基化的核心蛋白质产物。酵母中的表达
可生产糖基化产物。植物细胞中的表达可用于保证植物来源蛋白质的“天然”糖基化。此
外，不同的载体/宿主表达系统可不同程度地影响加工反应。
[0187] 本发明还提供了转化的植物细胞、转基因种子、转基因植物部分和转基因植物，其包含包括有效连接到控制元件的此处公开的一个或多个多核苷酸或其生物活性片段的一个或多个多核苷酸序列、基因构建体、载体或表达框。此处使用的术语“植物”包括藻类和高等植物(包括但不限于树)。因此，藻类、单子叶和双子叶植物可以用本发明的基因构建
体、根据本发明的表达框或载体转化。
体、根据本发明的表达框或载体转化。
[0188] 转基因植物此处定义为植物细胞培养物、植物细胞系、植物组织培养物、低等植物、单子叶植物、双子叶植物或从转化的植物细胞或原生质体来源的其后代或部分，其中所述转化的植物的基因组包含实验室技术引入的、在同样物种的天然非转基因植物中并非原
始存在的外来DNA。术语“转基因植物”和“转化的植物”有时候在本领域中用作同义术语来定义其DNA包含外源DNA分子的植物。适当的时候，可以为转化的植物、植物细胞或植物
部分中的表达优化编码此处定义的多肽的多核苷酸。也就是说，可以用对应于目的植物物
种的物种优选的密码子合成这些基因。可用本领域的方法合成例如植物优选的基因。参
见，例如美国专利5,380,831和5,436,391或Murray等人(1989)，其各自通过引用整体合
并于此作为参考。
始存在的外来DNA。术语“转基因植物”和“转化的植物”有时候在本领域中用作同义术语来定义其DNA包含外源DNA分子的植物。适当的时候，可以为转化的植物、植物细胞或植物
部分中的表达优化编码此处定义的多肽的多核苷酸。也就是说，可以用对应于目的植物物
种的物种优选的密码子合成这些基因。可用本领域的方法合成例如植物优选的基因。参
见，例如美国专利5,380,831和5,436,391或Murray等人(1989)，其各自通过引用整体合
并于此作为参考。
[0189] 用公知方法很容易实现用于在植物中表达多肽的基因框的构建，例如Sambrook等人(1989)和Ausubel，M.等人(1987)中公开的方法。在本发明的构建体的制备中，可操
作多种DNA片段以提供以合适方向并在合适的阅读框中(视情况而定)的DNA序列。适配
子(adapter)或接头可用来连接DNA片段，或者其它操作可用来提供方便的限制性酶切位
点、去除多余的DNA、去除限制性酶切位点等。
作多种DNA片段以提供以合适方向并在合适的阅读框中(视情况而定)的DNA序列。适配
子(adapter)或接头可用来连接DNA片段，或者其它操作可用来提供方便的限制性酶切位
点、去除多余的DNA、去除限制性酶切位点等。
[0190] 在施行这些步骤中，使用克隆来扩增用于后续向目的宿主细胞中引入的包含目的启动子/基因的载体。可使用很多种克隆载体，其中克隆载体包括在大肠杆菌
(Escherichia coli，E.coli)中有功能的复制系统和允许转化细胞选择的标记物。示例性
载体包括pBR322、pUC系列、pACYC184、Bluescript系列(Stratagene)等。所以，该序列可在适宜的限制性酶切位点处插入到载体中，得到的质粒用于转化E.coli宿主(例如E.coli
菌株HB101、JM101和DH5α)，E.coli生长在合适的营养培养基中，收获和裂解细胞，并回收该质粒。分析可包括序列分析、限制性酶切位点分析、电泳等。每个操作之后，可将用于最终构建体中的DNA序列限制性酶切并将其连接到下一个序列，其中各个部分构建体可克隆
到相同或不同的质粒中。
(Escherichia coli，E.coli)中有功能的复制系统和允许转化细胞选择的标记物。示例性
载体包括pBR322、pUC系列、pACYC184、Bluescript系列(Stratagene)等。所以，该序列可在适宜的限制性酶切位点处插入到载体中，得到的质粒用于转化E.coli宿主(例如E.coli
菌株HB101、JM101和DH5α)，E.coli生长在合适的营养培养基中，收获和裂解细胞，并回收该质粒。分析可包括序列分析、限制性酶切位点分析、电泳等。每个操作之后，可将用于最终构建体中的DNA序列限制性酶切并将其连接到下一个序列，其中各个部分构建体可克隆
到相同或不同的质粒中。
[0191] 可获得或可容易地制备用于转化植物细胞的载体。总的来说，质粒或病毒载体应该包含在给定宿主中保持和表达异源DNA序列所必需的所有的DNA控制序列。这样的控制
序列一般包括前导序列和编码翻译起始信号密码子、翻译终止密码子的DNA序列，以及编
码控制信使RNA加工的3′UTR信号的DNA序列。在任何特定物种中优化表达的适宜元件
的选择是使用本公开的教导的本领域普通技术。最后，理想地，载体应该具有能够提供允许鉴别含有该载体的宿主细胞的表型性质的标记基因。
序列一般包括前导序列和编码翻译起始信号密码子、翻译终止密码子的DNA序列，以及编
码控制信使RNA加工的3′UTR信号的DNA序列。在任何特定物种中优化表达的适宜元件
的选择是使用本公开的教导的本领域普通技术。最后，理想地，载体应该具有能够提供允许鉴别含有该载体的宿主细胞的表型性质的标记基因。
[0192] 本发明不限于任何转化植物细胞的具体方法。将DNA引入植物细胞的技术对本领域技术人员是公知的。已经描述了用于将外来的DNA传递到植物细胞中四个基本方法。
化学方法(Graham和van der Eb，1973；Zatloukal等人，1992)；包括微注射(Capecchi，
1980)、电穿孔(Wong和Neumann 1982；Fromm等人，1985；美国专利No.5,384,253)和基因
枪(Johnston和Tang，1994；Fynan等人，1993)的物理方法；病毒方法(Clapp，1993；Lu等人，1993；Eglitis和Anderson 1988；Eglitis等人，1988)；和受体介导的方法(Curiel等人，1991；Curiel等人，1992；Wagner等人，1992)。
化学方法(Graham和van der Eb，1973；Zatloukal等人，1992)；包括微注射(Capecchi，
1980)、电穿孔(Wong和Neumann 1982；Fromm等人，1985；美国专利No.5,384,253)和基因
枪(Johnston和Tang，1994；Fynan等人，1993)的物理方法；病毒方法(Clapp，1993；Lu等人，1993；Eglitis和Anderson 1988；Eglitis等人，1988)；和受体介导的方法(Curiel等人，1991；Curiel等人，1992；Wagner等人，1992)。
[0193] 利用电穿孔将DNA引入到植物细胞中对本领域技术人员来说是公知的。用植物细胞壁降解酶，例如果胶降解酶，来使接受体细胞比未处理过的细胞更易于通过电穿孔转
化。为了达到用电穿孔转化，本领域技术人员可以直接使用诸如细胞的悬浮培养物等脆性
(friable)组织或胚胎发生的愈伤组织或未成熟胚或其他器官组织(organized tissues)。
通常必须用果胶降解酶或以控制的方式机械损伤来部分降解目的植物材料的细胞壁。这种
处理过的植物材料容易通过电穿孔接受外来DNA。
化。为了达到用电穿孔转化，本领域技术人员可以直接使用诸如细胞的悬浮培养物等脆性
(friable)组织或胚胎发生的愈伤组织或未成熟胚或其他器官组织(organized tissues)。
通常必须用果胶降解酶或以控制的方式机械损伤来部分降解目的植物材料的细胞壁。这种
处理过的植物材料容易通过电穿孔接受外来DNA。
[0194] 将外来的转化DNA输送到植物细胞的另一种方法是通过微粒轰击。在此方法中，将微粒用外来的DNA包被，然后利用推进力将其输送到细胞中。这种微粒通常由钨、金、铂和相似金属制成。微粒轰击的一个优点是既不需要分离原生质体(Cristou等人，1988)也
不需要土壤杆菌感染的易感性。利用加速系统将DNA输送入玉米细胞中的方法的一个示例
性实施方式是Biolistics粒子输送系统，其可用于将包被有DNA的粒子或细胞通过筛子推
进到覆盖有悬浮培养的玉米细胞的滤器表面上。筛子分散这些粒子，以使其不会以大的聚
集体输送到受体细胞。对于轰击，优选将悬浮的细胞在滤器或固体培养基上浓缩。或者，可以将不成熟胚或其他靶细胞排列在固体培养基上。将要被轰击的细胞以合适的距离放置在
微弹载体停止板下。在轰击转化中，本领域技术人员可优化轰击前培养条件和轰击参数，以收获最大数量的稳定转化株。在该技术中，轰击的物理和生物学参数都重要。物理因素是
涉及到操作DNA/微粒沉淀的那些物理因素，或那些影响微粒飞行和速度的物理因素。生物
学因素包括在轰击前或刚刚轰击后涉及到细胞操作的所有步骤，靶细胞的渗透调节以协助
减轻轰击相关创伤，和转化DNA的性质，例如线性DNA或者完整的超螺旋质粒。
不需要土壤杆菌感染的易感性。利用加速系统将DNA输送入玉米细胞中的方法的一个示例
性实施方式是Biolistics粒子输送系统，其可用于将包被有DNA的粒子或细胞通过筛子推
进到覆盖有悬浮培养的玉米细胞的滤器表面上。筛子分散这些粒子，以使其不会以大的聚
集体输送到受体细胞。对于轰击，优选将悬浮的细胞在滤器或固体培养基上浓缩。或者，可以将不成熟胚或其他靶细胞排列在固体培养基上。将要被轰击的细胞以合适的距离放置在
微弹载体停止板下。在轰击转化中，本领域技术人员可优化轰击前培养条件和轰击参数，以收获最大数量的稳定转化株。在该技术中，轰击的物理和生物学参数都重要。物理因素是
涉及到操作DNA/微粒沉淀的那些物理因素，或那些影响微粒飞行和速度的物理因素。生物
学因素包括在轰击前或刚刚轰击后涉及到细胞操作的所有步骤，靶细胞的渗透调节以协助
减轻轰击相关创伤，和转化DNA的性质，例如线性DNA或者完整的超螺旋质粒。
[0195] 土壤杆菌介导的转移是用于向植物细胞引入外来DNA的广泛适用系统，因为DNA可以引入到整个的植物组织中，消除了从原生质体再生完整植株的需要。使用土壤杆菌介
导的植物整合载体将DNA引入植物细胞是本领域公知的。参见例如，Fraley等人(1985)和
Rogers等人(1987)中记载的方法。另外，Ti-DNA的整合是导致较少重排的相对精确的方
法。如Spielmann等人(1986)和Jorgensen等人(1987)中所记载的，要转化的DNA区域
由边界序列界定，而且中间DNA通常插入到植物基因组中。
导的植物整合载体将DNA引入植物细胞是本领域公知的。参见例如，Fraley等人(1985)和
Rogers等人(1987)中记载的方法。另外，Ti-DNA的整合是导致较少重排的相对精确的方
法。如Spielmann等人(1986)和Jorgensen等人(1987)中所记载的，要转化的DNA区域
由边界序列界定，而且中间DNA通常插入到植物基因组中。
[0196] 土壤杆菌转化载体能够在E.coli和土壤杆菌中复制，从而使其方便操作。并且，用于土壤杆菌介导的基因转移的载体的最近技术进展已经改善了基因和限制性酶切位点
在载体中的排列，以促进能够表达多种蛋白质或多肽的载体的构建。侧翼为用于指导插入
多肽编码基因表达的启动子和多聚腺苷酸位点的方便的多连接子区域适用于本发明的目
的。此外，包含装甲(armed)和卸甲的Ti基因的土壤杆菌可以用于所述转化。
在载体中的排列，以促进能够表达多种蛋白质或多肽的载体的构建。侧翼为用于指导插入
多肽编码基因表达的启动子和多聚腺苷酸位点的方便的多连接子区域适用于本发明的目
的。此外，包含装甲(armed)和卸甲的Ti基因的土壤杆菌可以用于所述转化。
[0197] 可以用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔和这些处理的组合的方法来达到植物原生质体的转化(参见例如Potrykus等人，1985；Marcotte等人，1988)。这些系统在
不同植物物种中的应用取决于从原生质体再生该特定物种的能力。
不同植物物种中的应用取决于从原生质体再生该特定物种的能力。
[0198] 编码PtJBMTm3的核酸向植物或植物细胞中的引入，和其后续的表达，提供了对会控制许多阔叶杂草的除草剂组合的耐受性。例如，PtJBMTm3可作为优异的除草剂耐受作物
(HTC)特征，与其他HTC特征(例如草甘膦抗性、草铵膦抗性、ALS-抑制剂(例如咪唑啉酮、
磺酰脲类、三唑嘧啶磺苯胺)抗性、溴草腈抗性、HPPD抑制剂抗性、PPO抑制剂抗性等)和/
或昆虫抗性特征(Cry1F、Cry1Ab、Cry 34/45、其他Bt.蛋白质或非杆菌来源的杀虫蛋白质)结合。另外，PtJBMTm3还用作选择性标记，以协助选择用第二基因或第二组基因遗传工程
化的植物的初级转化株。
(HTC)特征，与其他HTC特征(例如草甘膦抗性、草铵膦抗性、ALS-抑制剂(例如咪唑啉酮、
磺酰脲类、三唑嘧啶磺苯胺)抗性、溴草腈抗性、HPPD抑制剂抗性、PPO抑制剂抗性等)和/
或昆虫抗性特征(Cry1F、Cry1Ab、Cry 34/45、其他Bt.蛋白质或非杆菌来源的杀虫蛋白质)结合。另外，PtJBMTm3还用作选择性标记，以协助选择用第二基因或第二组基因遗传工程
化的植物的初级转化株。
[0199] 例如，本发明可用于商品化联合目前可得的草甘膦抗性大豆的2，4-D抗性特征的环境中。大豆是用于根据本发明转化的优选农作物的一个例子。但是，本发明可用于其他
单子叶植物(例如牧场草或草皮草，以提高对植物生长素类除草剂的抗性)和双子叶作物，
如紫花苜蓿、三叶草(clover)或多种树种。同样，2，4-D耐受或对其他植物生长素类除草
剂的耐受性可以在已经存在对植物生长素类除草剂耐受性(即使是以较低水平存在)的禾
本科作物中得到提高。提高的对植物生长素类除草剂耐受性可以为种植者提供以更高施用
率、更宽的施用时间使用这些除草剂的机会，而不会有显著的植物损伤。PtJBMTm3在植物中的表达也可用作选择性标记。
单子叶植物(例如牧场草或草皮草，以提高对植物生长素类除草剂的抗性)和双子叶作物，
如紫花苜蓿、三叶草(clover)或多种树种。同样，2，4-D耐受或对其他植物生长素类除草
剂的耐受性可以在已经存在对植物生长素类除草剂耐受性(即使是以较低水平存在)的禾
本科作物中得到提高。提高的对植物生长素类除草剂耐受性可以为种植者提供以更高施用
率、更宽的施用时间使用这些除草剂的机会，而不会有显著的植物损伤。PtJBMTm3在植物中的表达也可用作选择性标记。
[0200] 生产PtJBMTm3蛋白质的植物会优选生产足量的赋予植物对植物生长素类除草剂(以典型的除草剂施用率；典型施用率可参见公知的例如《除草剂手册)》(Weed Science
Society of America，Eighth Edition，2002))完全或部分抗性或耐受性的蛋白质。除非另外指明，除草剂“抗性”是可遗传的，而且使得植物能够在典型的除草剂对给定植物的有效处理存在下生长和繁殖，所述除草剂的有效处理如本发明申请时在出版的《除草剂手册)》的现有版本中所述。如本领域技术人员所知，即使在暴露于除草剂时有明显的一定程度的
植物损伤，该植物仍然可以被认为是“抗性的”。此处使用的术语“耐受性”和“抗性”涉及在以相同的除草剂剂量处理时，与野生型植物(即没有转化PtJBMTm3的相同属种的植物)
相比，特定植物提高的抵挡不同程度的除草剂诱导的损伤的能力。
Society of America，Eighth Edition，2002))完全或部分抗性或耐受性的蛋白质。除非另外指明，除草剂“抗性”是可遗传的，而且使得植物能够在典型的除草剂对给定植物的有效处理存在下生长和繁殖，所述除草剂的有效处理如本发明申请时在出版的《除草剂手册)》的现有版本中所述。如本领域技术人员所知，即使在暴露于除草剂时有明显的一定程度的
植物损伤，该植物仍然可以被认为是“抗性的”。此处使用的术语“耐受性”和“抗性”涉及在以相同的除草剂剂量处理时，与野生型植物(即没有转化PtJBMTm3的相同属种的植物)
相比，特定植物提高的抵挡不同程度的除草剂诱导的损伤的能力。
[0201] 如上所述，PtJBMTm3可引入到多种植物宿主中。优选的植物(和植物细胞)为玉米、拟南芥、烟草、大豆、棉花、油菜、稻、谷类(例如小麦、大麦、燕麦、黑麦、黑小麦等)、草皮、豆类饲料(例如紫花苜蓿和三叶草)、牧场草、杨树、柳枝稷(或其他生物燃料)等。根
据本发明也可以制备其他类型的转基因植物，例如水果、蔬菜、观赏植物和树木。双子叶植物和/或单子叶植物可以更加普遍地用于本发明的各个方面中(例如提高对病原真菌的抗
性和/或对植物生长素类除草剂的抗性)。
据本发明也可以制备其他类型的转基因植物，例如水果、蔬菜、观赏植物和树木。双子叶植物和/或单子叶植物可以更加普遍地用于本发明的各个方面中(例如提高对病原真菌的抗
性和/或对植物生长素类除草剂的抗性)。
[0202] 用本发明的多核苷酸转化的植物细胞可以再生为整个植株。本发明包括包含组织细胞培养物、液体培养物和平板培养物的细胞培养物。本发明植物生产的种子和/或用于
生成本发明的植物的种子也包括在本发明的范围内。其他植物组织和部分也包括在本发明
中。本发明还包括制备包括本发明的多核苷酸的植物或细胞的方法。制备这种植物的一个
优选的方法是种植本发明的种子。
生成本发明的植物的种子也包括在本发明的范围内。其他植物组织和部分也包括在本发明
中。本发明还包括制备包括本发明的多核苷酸的植物或细胞的方法。制备这种植物的一个
优选的方法是种植本发明的种子。
[0203] 本发明的一些其他方面提供了安全剂(safener)和/或植物活化剂的使用，以进一步保护植物和/或增加更多除草剂的交叉抗性。安全剂通常通过激活/表达cP450来
改善植物的免疫系统。除草剂安全剂包括解草酮、喹氧乙酸、抑害腈、抑害胺、dicyclonon、dietholate、解草唑、解草啶、解草胺、肟草安(fluxofenim)、解草呋、双苯噁唑酸、吡咯二酸(mefenpyr)、mephenate、萘二甲酸酐(naphthalic anhydride)和解草腈。
改善植物的免疫系统。除草剂安全剂包括解草酮、喹氧乙酸、抑害腈、抑害胺、dicyclonon、dietholate、解草唑、解草啶、解草胺、肟草安(fluxofenim)、解草呋、双苯噁唑酸、吡咯二酸(mefenpyr)、mephenate、萘二甲酸酐(naphthalic anhydride)和解草腈。
[0204] 除非特别说明或暗示，术语“一”(“a”，“an”)和“该”“所述”(“the”)在此处使用时表示“至少一个”。另外，术语“包括”“基本由......组成”和“由......组成”在本发明申请文件中可以互换使用。
[0205] 此处引用或参考的所有专利、专利申请、临时申请和公开出版物都通过引用以其不会与本申请文件的精确教导不一致的程度整体入本申请作为参考。
[0207] 实施例1——测定解毒活性的生化实验
[0208] PtJBMTm3的解毒活性用放射化学甲基转移酶分析来测定。用50μL体积进行该分析，该50μL体积包含50mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM的溶于水的单独的模拟植物生长素
14
的除草剂和3μM比活性为51.4mCi/mmol的 C-S-腺苷甲硫氨酸(SAM)(Perkin Elmer，
Boston，MA)。该分析通过加入SAM起始，在25℃保持30分钟，然后通过加入乙酸酯(ethanol acetate)(150μL)终止。通过14,000g离心1分钟进行相分离，然后用液体闪烁计数器
(Beckman Coulter，Fullerton，CA)对上层有机相如以前所述(D’Auria等人，2002)计数。
有机相的放射活性计数表明合成的甲基酯的数量，这些甲基酯是单独的模拟植物生长素的
除草剂的解毒产物。PtJBMT和PtJBMTm3对植物生长素类除草剂的相对检测活性示于表2
中(PtJBMTm3对茉莉酸的活性设定为1)。
14
的除草剂和3μM比活性为51.4mCi/mmol的 C-S-腺苷甲硫氨酸(SAM)(Perkin Elmer，
Boston，MA)。该分析通过加入SAM起始，在25℃保持30分钟，然后通过加入乙酸酯(ethanol acetate)(150μL)终止。通过14,000g离心1分钟进行相分离，然后用液体闪烁计数器
(Beckman Coulter，Fullerton，CA)对上层有机相如以前所述(D’Auria等人，2002)计数。
有机相的放射活性计数表明合成的甲基酯的数量，这些甲基酯是单独的模拟植物生长素的
除草剂的解毒产物。PtJBMT和PtJBMTm3对植物生长素类除草剂的相对检测活性示于表2
中(PtJBMTm3对茉莉酸的活性设定为1)。
[0209]
[0210]
[0211]
[0212] 参考文献
[0213] 美国专利No.5,384,253
[0214] 美国专利No.5,380,831
[0215] 美国专利No.5,436,391
[0216] 美国专利No.6,319,691
[0217] 美国专利No.6,277,375
[0218] 美国专利No.5,643,570
[0219] 美国专利No.5,565,335
[0220] 美国专利No.6,342,362
[0221] 美国公开的申请No.20030135879
[0222] Altendorf，K.et al.(1999-WWW，2000)“Structure and Function ofthe FoComplex of the ATP Synthase from Escherichia Coli”J.of Experimental Biology
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