一株苏云金芽孢杆菌ST8及其杀虫基因和应用
阅读：308发布：2024-02-08
专利汇可以提供一株苏云金芽孢杆菌ST8及其杀虫基因和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一株具有 杀虫活性 的苏 云 金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株ST8，其保藏编号为CGMCC No.3923。它具有3个抗虫基因，分别是cry8Kb1、cry8Pal、cry8Qal，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3所示。本发明提供的菌株ST8对为害粮食、 棉 花、油料、蔬菜，以及其他经济作物、花卉、草坪等多种 植物 的鞘翅目地下 害虫 具有较高的杀灭活性。本发明还提供了菌株ST8在制备植物 杀虫剂 、提高植物抗虫活性和培育转基因植物方面的应用。，下面是一株苏云金芽孢杆菌ST8及其杀虫基因和应用专利的具体信息内容。
1.苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株ST8，其保藏编号为CGMCC No.3923。
2.如权利要求1所述苏云金芽孢杆菌ST8，其特征在于，含有3种抗虫基因cry8Kb1、cry8Pa1、cry8Qa1，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3所示。
3.含有权利要求1所述苏云金芽孢杆菌ST8的菌剂。
4.权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌ST8或其发酵产物或权利要求3所述的菌剂在提高植物抗虫性中的应用。
5.含有权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌ST8或其发酵产物或权利要求3所述的菌剂的杀虫剂。
6.权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌ST8或其发酵产物或权利要求3所述的菌剂在制备杀虫剂中的应用。
7.如权利要求5所述的杀虫剂或权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的杀虫剂为杀鞘翅目金龟科类昆虫的杀虫剂。
8.权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌ST8或其发酵产物或权利要求3所述的菌剂在制备转基因植物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的植物包括棉花、油料作物、蔬菜、花卉和/或草。
10.以权利要求1所述苏云金芽孢杆菌ST8为有效成分的制剂在农业上的应用。
一株苏云金芽孢杆菌ST8及其杀虫基因和应用
技术领域
背景技术
[0002] 在人类生产过程中，虫害是造成农业生产损失及影响人类健康的重要因素，据FAO统计，全世界农业生产每年因虫害造成的经济损失高达14％，病害损失达12％，草害损失达11％。损失额高达1260亿美元，相当于中国农业总产值的一半，英国的4倍多。农业类害虫主要集中在鳞翅目与同翅目之中，鞘翅目金龟甲总科内部分昆虫，如蛴螬，也是重要的世界性分布地下害虫，危害双子叶和单子叶粮食作物、多种蔬菜、油料、芋、棉、牧草以及花卉和果、林等播下的种子及幼苗，并且为害期长，从播种到收获均能为害，造成缺苗断垄，甚至绝收，还会影响品质。大量调查表明，蛴螬在地下害虫中为害居首位，占总地下害虫量的70-80％上。主要有暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela Motschulsky)、华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita faldermann)、铜绿丽金龟(Anomala carpulenta Motsch)等，在我国华北地区如河北、山东等地危害较为严重。
[0003] 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白(Insectididal crystal proteins，简称ICPs)，ICPs是由cry基因编码的，该蛋白对敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。近几十年来，Bt已广泛应用于控制多种鳞翅目、双翅目、鞘翅目等害虫。此外，Bt还对膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多种害虫及植物病原线虫、螨类、原生动物有控害作用。目前在农田害虫、森林害虫及卫生害虫的防治中Bt已成为化学合成农药的有力替代品，Bt还是转基因抗虫工程植物重要的基因来源。
[0004] 自1981年Schnepf从菌株HD-1Dipel中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因以来，人们已经分离克隆了470多种ICPs的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类。迄今发现的对蛴螬具有杀虫活性的Bt基因主要有cry3、cry8、cry18、cry23、cry37、cry43等类基因(Shu C.，et al.2009，Characterization of two novel cry8 genes from Bacillus thuringiensis strain BT185.Current Microbiology，58(4)：389-392.)，其中研究最多的是cry8类基因，cry8类基因由1160-1210个氨基酸组成，分子量为128-137kDa，对金龟子科、象甲科、叶甲科等多种鞘翅目害虫具有特异的杀虫活性(Crickmore N.，et al.1998.Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins.Microbiol Mol Biol Rev，62：807-813)。1992年，Ohba等在世界上首次从Bt菌株中筛选出对金龟子幼虫具有特异杀虫活性的新菌株(Bt.subsp.japonensis BuiBui)(Ohba M.，et al.，1992.Aunique isolate of Bacillus thuringiensis serovar japonensis with a high larvicidal activity specific for scarabaeid beetles，Letters in Applied Microbiology，14：
54-57)，1994年从中克隆了一种新的杀虫基因cry8Ca(Sato R.，et al.1994.Cloning，heterologous expression，and localization of a novel crystal protein gene from Bacillus thuringiensis serovar japonensis strain buibui toxic to scarabaeid insects.Curr.Microbiol.28：15-19)。 美国Mycogen公 司从Bt菌 株PS50C分离 的Cry8Aa1和Cry8Ba1对花金龟Cotinis sp有明显的杀虫活性(US Patent 5554534)(Tracy E.Michaels，Kenneth E.Narva，Foncerrada，1994.Bacillus thuringiensis toxins active against scarab pests.USP5554534.)。美国从Bt菌株中分离了两种基因cry8Bb1和cry8Bc1基因，发现对马铃薯甲虫，西方玉米根叶甲，南方玉米根叶甲具有显著的杀虫效果并已用于转基因抗虫玉米的开发(Abad，et al.2002.Genes encoding novel proteins with pesticidal activity against Coleopterans.WO 02/34774 A2)。在我国，河北省农科院植保所和河北农业大学近年先后筛选获得多株对黄褐丽金龟(A.exoleta)和铜绿丽金龟(A.corpulenta)的幼虫具有特异杀虫活性的Bt菌株，室内生测死亡率均达100％(冯书亮等.2000.一株对金龟子类幼虫具有杀虫活性的苏云金杆菌新分离株.中国生物防治，
16(2)：74-78)。2004年中国农业科学院植物保护所Bt185分离了一株对暗黑鳃金龟幼虫高效(LC50，0.94cfu/ml)的菌株Bt185，并从中克隆了四个种新的cry8类基因：cry8Ea1，cry8Ea2，cry8Fa1，cry8Ha1。目前绝大部分此类杀虫基因均被国外科研究机构或种子公司进行了专利保护；因此，对这些Bt资源进行挖掘和开发是一项紧迫而又有价值的工作，拥有自主知识产权，对于基因克隆、工程菌构建和抗虫转基因植物均具有重要的理论意义和应用价值。
54-57)，1994年从中克隆了一种新的杀虫基因cry8Ca(Sato R.，et al.1994.Cloning，heterologous expression，and localization of a novel crystal protein gene from Bacillus thuringiensis serovar japonensis strain buibui toxic to scarabaeid insects.Curr.Microbiol.28：15-19)。 美国Mycogen公 司从Bt菌 株PS50C分离 的Cry8Aa1和Cry8Ba1对花金龟Cotinis sp有明显的杀虫活性(US Patent 5554534)(Tracy E.Michaels，Kenneth E.Narva，Foncerrada，1994.Bacillus thuringiensis toxins active against scarab pests.USP5554534.)。美国从Bt菌株中分离了两种基因cry8Bb1和cry8Bc1基因，发现对马铃薯甲虫，西方玉米根叶甲，南方玉米根叶甲具有显著的杀虫效果并已用于转基因抗虫玉米的开发(Abad，et al.2002.Genes encoding novel proteins with pesticidal activity against Coleopterans.WO 02/34774 A2)。在我国，河北省农科院植保所和河北农业大学近年先后筛选获得多株对黄褐丽金龟(A.exoleta)和铜绿丽金龟(A.corpulenta)的幼虫具有特异杀虫活性的Bt菌株，室内生测死亡率均达100％(冯书亮等.2000.一株对金龟子类幼虫具有杀虫活性的苏云金杆菌新分离株.中国生物防治，
16(2)：74-78)。2004年中国农业科学院植物保护所Bt185分离了一株对暗黑鳃金龟幼虫高效(LC50，0.94cfu/ml)的菌株Bt185，并从中克隆了四个种新的cry8类基因：cry8Ea1，cry8Ea2，cry8Fa1，cry8Ha1。目前绝大部分此类杀虫基因均被国外科研究机构或种子公司进行了专利保护；因此，对这些Bt资源进行挖掘和开发是一项紧迫而又有价值的工作，拥有自主知识产权，对于基因克隆、工程菌构建和抗虫转基因植物均具有重要的理论意义和应用价值。
[0005] 自本世纪初发现苏云金芽胞杆菌至今已有100多年的历史，在农作物和园艺植物害虫、森林害虫以及卫生害虫的防治方面得到广泛的应用，也起到良好的效果。但是频繁地使单一Bt杀虫蛋白的必然结果是因害虫的适应而产生对Cry类蛋白的抗性；目前，许多昆虫种群已相继在不同程度上对杀虫晶体蛋白产生了抗性。上世纪80年中期开始，抗性问题不断在实验室及田间试验中得到证实(Mc GaugheyW.H.1985.Insect resistance to the biological insecticide Bacillus thuringiensis.Science.229：193-195)，原因主要是持续使用单品种及亚致剂量的Bt以及Bt转基因抗虫植物的应用造成昆虫种群长期受到杀虫剂的选择压力。1985年，Mc Gaughey报道仓库谷物害虫印度谷螟(Plodia interpunctella)在Dipel(Bt subsp.kurstaik HD-1的商品制剂)的选择压力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高剂量选择压力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次证实大田中的小菜蛾对Bt杀虫剂产生了明显的抗性(Tabashnik B.E，et al.1994.Reversal of resistance to Bacillus thuringiensisin Plutella xylostella.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91：4120-4124)，上世纪90年代以来，在我国应用Bt杀虫剂时间较长的深圳、广州、上海等地，发现Bt杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降，意味着抗性已经形成(冯夏.1996.广东小菜蛾对苏云金杆菌的抗性研究.昆虫学报，39(3)：238-244；
Hofte H.，et al.1988.Monoclonal antibody analysis and insecticidal spectrum of three types of lepidopteran-specific insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis.Appl.Environ.Microbiol.54：2010-2017)。目前发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对Bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性(Schnepf，E.，et al.1998.Bacillus thuringiensis and its pesticidal Crystal proteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev.65(3)：775-806)。
Hofte H.，et al.1988.Monoclonal antibody analysis and insecticidal spectrum of three types of lepidopteran-specific insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis.Appl.Environ.Microbiol.54：2010-2017)。目前发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对Bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性(Schnepf，E.，et al.1998.Bacillus thuringiensis and its pesticidal Crystal proteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev.65(3)：775-806)。
[0006] 为避免抗性昆虫所造成的损失，寻找新的高毒力Bt菌株及基因资源是解决这个问题的有效途径，这对我国的生物防治也有着十分重要的意义。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一种具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌及其杀虫基因和应用。
[0008] 本发明提供的菌株为苏云金芽孢杆菌ST8，该菌株已于2010年6月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，保藏号为CGMCC No.3923。
[0009] 该菌株ST8细胞呈杆状，两端钝圆，能形成芽胞，同时能形成球形伴胞晶体，见附图1。菌株大小为(1.2-1.5)μm×(3.5-4.4)μm，通常单个、或两个、或短链细胞存在，一个营养细胞为一个孢子囊，每个孢子囊内含有一个芽孢，次端生，另一端有一个伴孢晶体，孢子囊不膨大。
[0010] 本发明发现该菌含有3种抗虫基因cry8Kb1、cry8Pa1、cry8Qa1，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3所示。
[0011] 本发明提供了含有苏云金芽孢杆菌ST8的菌剂。
[0013] 研究发现，本发明的菌株对鞘翅目昆虫具有较高的杀虫活性，其中对暗黑鳃金龟8 8
杀虫活性的LC50为3.06×10cfu/g，对华北大黑鳃金龟的LC50为1.14×10cfu/g。本发明提供了苏云金芽孢杆菌ST8或其发酵产物或含有该菌菌剂的杀虫剂。
杀虫活性的LC50为3.06×10cfu/g，对华北大黑鳃金龟的LC50为1.14×10cfu/g。本发明提供了苏云金芽孢杆菌ST8或其发酵产物或含有该菌菌剂的杀虫剂。
[0014] 本发明提供了苏云金芽孢杆菌ST8或其发酵产物或含有该菌的菌剂在制备杀虫剂中的应用。
[0015] 所述的杀虫剂为杀鞘翅目金龟科类昆虫的杀虫剂。
[0016] 本发明提供了苏云金芽孢杆菌ST8或其发酵产物或含有该菌的菌剂在培育转基因植物中的应用。
[0017] 所述的转基因植物可以是转基因棉花、油料作物、蔬菜、花卉和/或草。
[0018] 本发明还提供了以苏云金芽孢杆菌ST8为有效成分的制剂在农业上的应用。
[0019] 本发明提供的苏云金芽孢杆菌ST8是一种新发现的Bt资源，含有抗虫基因，具有较好的杀鞘翅目金龟科昆虫的活性，将其用于制备转基因植物，能够特异性杀灭害虫，并降低农药的使用量，降低成本，减少环境污染。目前还没有害虫或昆虫对该菌株产生抗性的报道，因此，本发明的苏云金芽孢杆菌ST8具有重要的经济价值和应用前景，适合大规模应用于提高植物的抗虫性中，可在农业生产中推广使用。
附图说明
[0020] 图1为苏云金芽孢杆菌ST8菌株的圆形伴孢晶体、芽孢(5000×)；
[0021] 图2为苏云金芽孢杆菌ST8菌株SDS-PAGE电泳分析，其中：M为蛋白质Marker；
[0022] 图3为苏云金芽孢杆菌ST8菌株中cry基因型的PCR鉴定，其中：M为DNA Marker100bp，1为cry8类基因扩增产物；
[0023] 图4为苏云金芽孢杆菌ST8中cry8全长基因的PCR扩增产物，其中：M为DNA Marker 100bp，1为cry8全长基因的PCR产物。
具体实施方式
[0025] 若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0026] 本实施例中所用的土样，来自各地不同植物根基土壤。
[0027] 实施例1苏云金芽孢杆菌ST8菌株的分离培养和鉴定
[0028] (1)菌株的分离培养
[0029] 土壤采自四川省成都温江地区。采用醋酸钠-抗生素分离法，称取10g土样放入装有50ml醋酸钠培养基的摇瓶中，分别加入青霉素钠盐和硫酸庆大霉素各400μg/ml，摇床培养(200r/min，30℃)4h。培养结束后取土壤悬液10ml，加入无菌的离心管3000r/min离心15min，取上层混浊液2ml于65℃水浴15min，取热处理后的混浊液0.1ml涂平板，将平板置30℃培养箱中培养。48h后从平板上挑取类似Bt的菌株涂片。发现一株含有球状晶体形态的Bt菌株(见附图1)。经用光学显微镜和电子显微镜观察，该菌株细胞呈杆状，两端钝圆，菌株大小为1.2-1.5μm×3.5-4.4μm，通常单个、或两个、或短链细胞存在，一个营养细胞为一个孢子囊，每个孢子囊内含有一个芽孢，次端生，另一端有一个伴孢晶体，孢子囊不膨大。
[0030] (2)菌株的鉴定
[0031] SDS-PAGE电泳表明，菌株ST8主要产生约130KD左右大小的蛋白(见附图2)。
[0032] 根据cry8类基因保守序列设计1对通用引物：
[0033] 5’-GTCCGAATAATCAGAATGAATATG-3’
[0034] 5’-CGTTTTGCCTCTCTCACTGCATC-3’
[0035] 扩增体系
[0036]
[0037] 扩增条件
[0038] cry8基因的扩增：
[0039]
[0040] 扩增反应产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，置凝胶成像系统中观察PCR扩增结果(见附图3)
[0041] 结果显示此菌株属于苏云金芽孢杆菌。该苏云金芽孢杆菌ST8已于2010年6月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.3923，分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。
[0042] 实施例2菌株ST8中cry8Kb1、cry8Pa1和cry8Qa1基因的克隆
[0043] 采用基因组DNA纯化试剂盒(购自赛百盛公司)提取菌株ST8的总DNA；设计其全长基因引物P1、P2(引物序列如下)；以菌株ST8总DNA为模板，用P1和P2扩增cry8全长基因，得到长约3.5kb的片段(图4)。将纯化后的PCR产物与pGEM-T载体连接，转化，挑取阳性克隆，测序，分别得到序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3。
[0044] P1：5’ATGAGTCCAAATAATCAAAAT 3’
[0045] P2：5’TTACTCTACGTCAACAATCAAT 3’
[0046] 实施例3菌株ST8的杀虫活性检测
[0047] 对鳞翅目害虫：将菌株ST8在液体LB培养基中30℃，200r/min振荡培养30h；离心收集菌体(12,000r/min，15min，4℃)，超净工作台风干，计量菌体重量；然后把菌株悬浮于蒸馏水中，配制成从1μg/ml到100ng/ml 6个不同浓度；选老嫩适中的卷心菜叶片洗净，2
晾干；紫外灯下照射15min，剪成2×2cm 大小，分放在不同浓度菌液中，浸泡5min；取出沥去多余的液体，放在消毒的培养皿中晾干，以LB液体培养基浸泡叶片作为对照，每个培养皿放4片叶片；每个培养皿选放健康的2-3龄棉铃虫30头；每处理重复3次，置室内，于3d后调查幼虫死亡情况，用SPSS 10.0软件计算LC50；结果如表1，表明菌株对这类害虫无毒杀活性。
晾干；紫外灯下照射15min，剪成2×2cm 大小，分放在不同浓度菌液中，浸泡5min；取出沥去多余的液体，放在消毒的培养皿中晾干，以LB液体培养基浸泡叶片作为对照，每个培养皿放4片叶片；每个培养皿选放健康的2-3龄棉铃虫30头；每处理重复3次，置室内，于3d后调查幼虫死亡情况，用SPSS 10.0软件计算LC50；结果如表1，表明菌株对这类害虫无毒杀活性。
[0048] 对鞘翅目害虫：Bt菌株在LB固体培养基上培养3d后，刮下并悬浮于无菌水中，采用乳糖悬浮丙酮沉淀的方法，制备成粉剂备用。将上述粉剂按照2倍等比级差梯度浓度稀释。将稀释液，加入到均匀粗细土豆丝的灭菌细土中混匀，以5-7日龄暗黑鳃金龟和华北大黑鳃金龟作为供试虫主，每个处理接虫30头，重复3次，以加入清水的处理作为空白对照，感染饲养7d、14d检查死虫数，用SPSS 10.0软件计算LC50；结果如表1，表明菌株对暗黑鳃金龟和华北大黑鳃金龟具毒杀活性。
[0049] 表1 ST8的杀虫活性
[0050]
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