确定的微生物组合物
阅读：79发布：2020-05-13
专利汇可以提供确定的微生物组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文公开了包含一组确定的 微 生物 物种(例如，3种、16种、18种、19种、21种或22种微生物物种)的细胞的组合物。还公开了使用所述微生物组合物的方法，所述方法包括使 土壤 、 植物 、植物部分或 种子 与所述组合物 接触 。所述微生物组合物还用于降解诸如含几丁质的 生物材料 之类的生物材料的方法中。，下面是确定的微生物组合物专利的具体信息内容。
1.一种组合物，所述组合物包含包括以下各项或由以下各项组成的微生物物种的细胞：德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、嗜盐枝芽孢杆菌(Virgibacillus halophilus)、棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)、巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)、千叶类芽孢杆菌(Paenibacillus chibensis)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、小鳟鱼大洋芽孢杆菌(Oceanobacillus oncorhynchi)、灿烂类芽孢杆菌(Paenibacillus lautus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、酒乳杆菌(Lactobacillus vini)、库氏类芽孢杆菌(Paenibacillus cookii)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌(Lactobacillus casei/paracasei)，以及弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)。
2.一种组合物，所述组合物包含包括以下各项或由以下各项组成的微生物物种的细胞：德氏乳杆菌、嗜盐枝芽孢杆菌、棕色固氮菌、巴氏梭菌、灰色链霉菌、假单胞菌属、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属、解淀粉芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酒乳杆菌、枯草芽孢杆菌、布氏乳杆菌、巨大芽孢杆菌、巴氏醋杆菌、拜氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌，以及弯曲芽孢杆菌。
3.一种组合物，所述组合物包含包括以下各项或由以下各项组成的微生物物种的细胞：德氏乳杆菌、嗜盐枝芽孢杆菌、棕色固氮菌、巴氏梭菌、千叶类芽孢杆菌、灰色链霉菌、假单胞菌属、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属、解淀粉芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、灿烂类芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酒乳杆菌、库氏类芽孢杆菌、布氏乳杆菌、巨大芽孢杆菌、巴氏醋杆菌、拜氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌，以及弯曲芽孢杆菌。
4.一种组合物，所述组合物包含包括以下项或由以下项组成的微生物物种的细胞：德氏乳杆菌、嗜盐枝芽孢杆菌、棕色固氮菌、巴氏梭菌、灰色链霉菌、假单胞菌属、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属、解淀粉芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酒乳杆菌、枯草芽孢杆菌、布氏乳杆菌、巨大芽孢杆菌、巴氏醋杆菌、拜氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌，以及弯曲芽孢杆菌。
5.一种组合物，所述组合物包含包括以下各项或由以下各项组成的微生物物种的细胞：德氏乳杆菌、棕色固氮菌、巴氏梭菌、灰色链霉菌、假单胞菌属、恶臭假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酒乳杆菌、枯草芽孢杆菌、布氏乳杆菌、巨大芽孢杆菌、巴氏醋杆菌、拜氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌，以及弯曲芽孢杆菌。
6.一种组合物，所述组合物包含包括以下各项或由以下各项组成的微生物物种的细胞：德氏乳杆菌、棕色固氮菌、巴氏梭菌、千叶类芽孢杆菌、灰色链霉菌、假单胞菌属、恶臭假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、灿烂类芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酒乳杆菌、库氏类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、布氏乳杆菌、巨大芽孢杆菌、巴氏醋杆菌、拜氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌，以及弯曲芽孢杆菌。
7.一种组合物，所述组合物包含包括以下项或由以下项组成的微生物物种的细胞：具有与SEQ ID NO：3-24中的每一者具有至少99％序列相同性的16S rDNA序列的微生物。
8.一种组合物，所述组合物包含包括以下项或由以下项组成的微生物物种的细胞：具有与SEQ ID NO：3-8、10、11、13-18以及20-24中的每一者具有至少99％序列相同性的16S rDNA序列的微生物。
9.一种组合物，所述组合物包含包括以下项或由以下项组成的微生物物种的细胞：具有与SEQ ID NO：3-7和SEQ ID NO：9-24中的每一者具有至少99％序列相同性的16S rDNA序列的微生物。
10.一种组合物，所述组合物包含包括以下项或由以下项组成的微生物物种的细胞：具有与SEQ ID NO：3-7、10、11、13-18以及20-24中的每一者具有至少99％序列相同性的16S rDNA序列的微生物。
11.一种组合物，所述组合物包含包括以下项或由以下项组成的微生物物种的细胞：具有与SEQ ID NO：3-8、10、11、14、16-18、20-22以及24中的每一者具有至少99％序列相同性的16S rDNA序列的微生物。
12.一种组合物，所述组合物包含包括以下项或由以下项组成的微生物物种的细胞：具有与SEQ ID NO：3-14、16-22以及24中的每一者具有至少99％序列相同性的16S rDNA序列的微生物。
13.一种组合物，其包含美国典型培养物保藏中心保藏号PTA-123288、PTA-123298和/或PTA-123289。
14.权利要求13的组合物，其包含ATCC保藏号PTA-123288和PTA-123289
15.权利要求13的组合物，其包含ATCC保藏号PTA-123298和PTA-123289。
16.一种组合物，其包含：
至少一种具有氮代谢活性的微生物物种的细胞，所述微生物物种选自由以下项组成的组：巴氏醋杆菌、棕色固氮菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌、嗜盐枝芽孢杆菌、拜氏梭菌、巴氏梭菌、库氏类芽孢杆菌、灿烂类芽孢杆菌、假单胞菌属和灰色链霉菌；
至少一种盐耐受5％NaCl的微生物物种的细胞，所述微生物物种选自由以下项组成的组：巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、芽孢杆菌属、弯曲芽孢杆菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌、灿烂类芽孢杆菌、恶臭假单胞菌和假单胞菌属；
至少一种具有磷酸盐和/或钙增溶活性的微生物物种的细胞，所述微生物物种选自由以下项组成的组：拜氏梭菌、巴氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌、布氏乳杆菌、酒乳杆菌、德氏乳杆菌和灿烂类芽孢杆菌；
至少一种具有纤维素分解和/或几丁质分解活性的微生物物种的细胞，所述微生物物种选自由以下项组成的组：巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、芽孢杆菌属、弯曲芽孢杆菌、拜氏梭菌、巴氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌、酒乳杆菌、灿烂类芽孢杆菌、千叶类芽孢杆菌和灰色链霉菌；
至少一种具有苹果酸代谢活性的微生物物种的细胞，所述微生物物种选自由以下项组成的组：巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、芽孢杆菌属、弯曲芽孢杆菌、库氏类芽孢杆菌、灿烂类芽孢杆菌、千叶类芽孢杆菌、恶臭假单胞菌、假单胞菌属和灰色链霉菌；
至少一种具有植物激素产生活性的微生物物种的细胞，所述微生物物种选自由以下项组成的组：巴氏梭菌、酒乳杆菌和布氏乳杆菌；
至少一种具有铁代谢活性的微生物物种的细胞，所述微生物物种选自由以下项组成的组：巴氏梭菌和拜氏梭菌；和/或
它们中的两者或更多者的组合。
17.权利要求1至16中任一项的组合物，其进一步包含以下项中的一者或多者的细胞：
南半球脱硫弯曲孢菌(Desulfosporosinus meridiei)、亚硝化侏儒菌属(Nitrosopumilus sp.)、苔藓虫海杆菌(Marinobacter bryozoorum)、固氮氧化亚铁钩端螺旋菌(Leptospirillum ferrodiazotrophum)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。
18.权利要求1至17中任一项的组合物，其进一步包含以下项中的一者或多者：几丁质、壳聚糖、葡糖胺、氨基酸和液体肥料。
19.一种方法，其包括使土壤、植物、植物部分或种子与权利要求1至18中任一项的组合物接触。
20.权利要求19的方法，所述方法还包括使所述土壤、植物、植物部分或种子与几丁质、壳聚糖、葡糖胺和氨基酸中的一者或多者接触。
21.权利要求19或权利要求20的方法，其进一步包括使所述土壤、植物、植物部分或种子与HYT B、HYT C和HYT D中的一者或多者接触。
22.权利要求19至21中任一项的方法，其进一步包括使所述土壤、植物、植物部分或种子与液体肥料接触。
23.权利要求19至22中任一项的方法，其进一步包括使所述土壤、植物、植物部分或种子与一种或多种农药、一种或多种杀真菌剂、一种或多种除草剂、一种或多种杀虫剂、一种或多种植物激素、一种或多种植物激卫素(plant elicitor)、或它们中的两种或更多种的组合接触。
24.权利要求19至23中任一项的方法，其进一步包括在使所述土壤、植物、植物部分或种子与所述组合物接触之前活化所述组合物中的所述微生物物种。
25.权利要求19的方法，其包括：使土壤与所述组合物接触以产生经处理的土壤，以及在所述经处理的土壤中培育种子、幼苗或植物。
26.一种方法，其包括：
将含几丁质的生物来源与权利要求1至18中任一项的组合物混合以形成混合物；
发酵所述混合物；以及
将所述经发酵的混合物分离成固体级分、含水级分和脂质级分。
27.权利要求26的方法，其中所述含几丁质的生物来源包括海洋动物或海洋动物副产品、昆虫或真菌。
28.权利要求27的方法，其中所述海洋动物是海洋节肢动物。
29.权利要求28的方法，其中所述海洋节肢动物是虾、蟹类或磷虾。
30.一种通过权利要求26至29中任一项的方法制备的含水级分或固体级分。
确定的微生物组合物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2016年8月30日提交的美国临时申请No.62/381,441的权益，该美国临时申请全文以引用方式并入本文。
技术领域
[0003] 本公开涉及微生物组合物及其使用方法，特别是用于农业过程和用途的微生物组合物及其使用方法。
背景技术
[0004] 由于人口增长，食物消耗也在不断增加。另一方面，由于全球工业化、干旱、盐度以及全球变暖，可耕农地显著减少且生产力显著降低(Galamero等人，在Microbial Strategies for Crop Improvement，Springer Berlin，第1-22页，2009中)。该问题可以通过实行可持续农业来解决，可持续农业的基本原理是显著减少化学投入，诸如肥料、杀虫剂和除草剂，同时减少温室气体的排放。
[0005] 在农业中过量使用化学肥料会导致大量的环境问题，因为一些肥料含有重金属(例如，镉和铬)和高浓度的放射性核素。这些肥料在农业生态系统中构成植物中重金属和放射性核素的主要来源，并且一些肥料导致了无机污染物的积累(Savci，Int.J.Env.Sci.Dev.3：77-80，2012；Malakoff，Science 281：190-192，1998)。温室和水产养殖在旺季期间使用特别大量的化学肥料，从而导致水资源污染，以及作物产量和产品质量的劣化。鉴于化学肥料的这些缺点，有益于植物的微生物接种物作为综合养分管理策略的组分而提供了希望。
[0006] 发明概述
[0007] 本文公开了包含一组确定的微生物物种(例如，3种微生物物种、16种微生物物种、17种微生物物种、19种微生物物种、20种微生物物种、21种微生物物种，或22种微生物物种)的细胞的组合物。在一些实施方案中，组合物包含具有包括但不限于以下的功能特征或活性(诸如代谢活性)的一种或多种微生物物种的细胞：氮代谢、耐盐性、磷酸盐和/或钙盐和/或锌盐增溶活性、纤维素分解活性、几丁质分解活性、植物激素产生、铁代谢活性和/或有机物去磷酸化活性。在一些实施方案中，所述组合物包含一种或多种(诸如2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种、15种或更多种)在好氧条件下生长的微生物物种的细胞。在其他实施方案中，所述组合物包含一种或多种(诸如2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种)在厌氧条件下生长的微生物物种的细胞。在一个非限制性示例中，所述组合物包括16种在好氧条件下生长的微生物物种的细胞和6种在厌氧条件下生长的微生物物种的细胞。好氧和厌氧生长条件包括但不限于本文实施例1中描述的那些条件。
[0008] 在一个实施方案中，所述组合物包含包括以下各项或由以下各项组成的微生物物种的细胞：德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、嗜盐枝芽孢杆菌(Virgibacillus halophilus)、棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)、巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)、千叶类芽孢杆菌(Paenibacillus chibensis)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)(与嗜虫假单胞菌(P.entomophila)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)和恶臭假单胞菌(P.putida)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：17具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas
putida)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)(与科赫芽孢杆菌(B.kochii)、抱川芽孢杆菌
(B.pocheonensis)和芽孢杆菌属(菌株R-27341)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：15具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus
amyloliquefaciens)、小鳟鱼大洋芽孢杆菌(Oceanobacillus oncorhynchi)、灿烂类芽孢杆菌(Paenibacillus lautus)(例如，与灿烂类芽孢杆菌和类芽孢杆菌属(菌株Y412MC10)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：12具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、酒乳杆菌(Lactobacillus vini)、库氏类芽孢杆菌(Paenibacillus cookii)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、巴氏醋杆菌
(Acetobacter pasteurianus)、拜氏梭菌(Clostridium beijerincii)、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌(Lactobacillus casei/pracasei)，以及弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)。在另一个实施方案中，所述组合物包含包括以下各项或由以下各项组成的微生物物种的细胞：
德氏乳杆菌、嗜盐枝芽孢杆菌、棕色固氮菌、巴氏梭菌、灰色链霉菌、假单胞菌属(与嗜虫假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌密切相关，例如具有与SEQ ID NO：17具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属(与科赫芽孢杆菌、抱川芽孢杆菌和芽孢杆菌属(菌株R-27341)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：15具有至少
99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、解淀粉芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酒乳杆菌、枯草芽孢杆菌、布氏乳杆菌、巨大芽孢杆菌、巴氏醋杆菌、拜氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌，以及弯曲芽孢杆菌。在其他实施方案中，所述组合物包含包括以下项或由以下项组成的微生物物种的细胞：具有与以下项具有至少99％序列相同性的
16S rDNA序列的微生物：SEQ ID NO：3-24中的每一者；SEQ ID NO：3-8、10、11、13-18、以及
20-24中的每一者；SEQ ID NO：3-7和9-24中的每一者；SEQ ID NO：3-7、10、11、13-18、以及
20-24中的每一者；SEQ ID NO：3-8、10、11、14、16-18、20-22、以及24中的每一者；或者SEQ ID NO：3-14、16-22、以及24中的每一者。在另一个实施方案中，所述组合物包含在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)保藏号PTA-123288、PTA-123298和/或PTA-123289中的一种或多种中所含有的微生物的集合。
putida)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)(与科赫芽孢杆菌(B.kochii)、抱川芽孢杆菌
(B.pocheonensis)和芽孢杆菌属(菌株R-27341)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：15具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus
amyloliquefaciens)、小鳟鱼大洋芽孢杆菌(Oceanobacillus oncorhynchi)、灿烂类芽孢杆菌(Paenibacillus lautus)(例如，与灿烂类芽孢杆菌和类芽孢杆菌属(菌株Y412MC10)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：12具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、酒乳杆菌(Lactobacillus vini)、库氏类芽孢杆菌(Paenibacillus cookii)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、巴氏醋杆菌
(Acetobacter pasteurianus)、拜氏梭菌(Clostridium beijerincii)、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌(Lactobacillus casei/pracasei)，以及弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)。在另一个实施方案中，所述组合物包含包括以下各项或由以下各项组成的微生物物种的细胞：
德氏乳杆菌、嗜盐枝芽孢杆菌、棕色固氮菌、巴氏梭菌、灰色链霉菌、假单胞菌属(与嗜虫假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌密切相关，例如具有与SEQ ID NO：17具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属(与科赫芽孢杆菌、抱川芽孢杆菌和芽孢杆菌属(菌株R-27341)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：15具有至少
99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、解淀粉芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酒乳杆菌、枯草芽孢杆菌、布氏乳杆菌、巨大芽孢杆菌、巴氏醋杆菌、拜氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌，以及弯曲芽孢杆菌。在其他实施方案中，所述组合物包含包括以下项或由以下项组成的微生物物种的细胞：具有与以下项具有至少99％序列相同性的
16S rDNA序列的微生物：SEQ ID NO：3-24中的每一者；SEQ ID NO：3-8、10、11、13-18、以及
20-24中的每一者；SEQ ID NO：3-7和9-24中的每一者；SEQ ID NO：3-7、10、11、13-18、以及
20-24中的每一者；SEQ ID NO：3-8、10、11、14、16-18、20-22、以及24中的每一者；或者SEQ ID NO：3-14、16-22、以及24中的每一者。在另一个实施方案中，所述组合物包含在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)保藏号PTA-123288、PTA-123298和/或PTA-123289中的一种或多种中所含有的微生物的集合。
[0009] 在其他实施方案中，所述组合物包含以下微生物物种的细胞：至少一种具有氮代谢活性的微生物物种、至少一种耐受5％NaCl的微生物物种、至少一种具有磷酸盐和/或钙盐和/或锌盐增溶活性的微生物物种、至少一种具有纤维素分解和/或几丁质分解活性的微生物物种、至少一种具有苹果酸代谢活性的微生物物种、至少一种具有植物激素(例如吲哚(生长素))产生活性的微生物物种、至少一种具有铁代谢活性的微生物物种、至少一种具有有机物去磷酸化活性的微生物物种，或它们中的任何两种或更多种的组合。
[0010] 本文还公开了使用所公开的组合物的方法，所述方法包括使土壤、植物、植物部分或种子与所述组合物接触。所述微生物组合物可单独或与另外的组分(诸如几丁质、脱乙酰几丁质、葡糖胺、氨基酸和/或液体肥料)组合地施用于土壤、植物、植物部分和/或种子。
[0011] 在另外的实施方案中，所公开的微生物组合物用于降解生物材料(诸如含几丁质的生物材料)的方法中。在一些示例中，将含几丁质的材料与所公开的微生物组合物混合并进行发酵以产生发酵混合物。任选地，所述发酵混合物可以分离成固体级分和液体级分。这些级分可以随后与所公开的微生物组合物组合地用于农业应用中，或者可以用于进一步的降解过程。
附图说明
[0013] 图1是示出用于使用所公开的微生物组合物生物降解含几丁质的生物材料(例如虾废弃物)的示例性方法的示意图。
[0014] 图2是示出如所示处理的黄瓜植株的末端真叶的第33天叶面积指数(LAI)的图。
[0016] 图4是示出使用指定处理的番茄产量(绿番茄和红番茄)的图。
[0017] 图5是示出使用指定处理的玉米产量的图。
[0018] 图6是示出使用指定处理的总甘蓝产量的图。
[0020] 本文或随附序列表中列出的任何核酸和氨基酸序列是使用37 C.F.R.§1.822中定义的核苷酸碱基和氨基酸的标准字母缩写示出的。在至少一些情况下，仅示出每个核酸序列的一条链，但互补链应理解为通过对所显示的链的任何参考而被包括在内。
[0021] SEQ ID NO：1和2分别是16S rDNA正向和反向引物的核酸序列。
[0022] SEQ ID NO：3是来自被鉴定为巨大芽孢杆菌的微生物的16S rDNA核苷酸序列。
[0023] SEQ ID NO：4是来自被鉴定为干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌的微生物的16S rDNA核苷酸序列。
[0024] SEQ ID NO：5是来自被鉴定为拜氏梭菌的微生物的16S rDNA核苷酸序列。
[0025] SEQ ID NO：6是来自被鉴定为巴氏醋杆菌的微生物的16S rDNA核苷酸序列。
[0026] SEQ ID NO：7是来自被鉴定为布氏乳杆菌的微生物的16S rDNA核苷酸序列。
[0027] SEQ ID NO：8是来自被鉴定为枯草芽孢杆菌的微生物的16S rDNA核苷酸序列。
[0028] SEQ ID NO：9是来自被鉴定为库氏类芽孢杆菌的微生物的16S rDNA核苷酸序列。
[0029] SEQ ID NO：10是来自被鉴定为酒乳杆菌的微生物的16S rDNA核苷酸序列。
[0030] SEQ ID NO：11是来自被鉴定为地衣芽孢杆菌的微生物的16S rDNA核苷酸序列。
[0031] SEQ ID NO：12是来自被鉴定为灿烂类芽孢杆菌的微生物的16S rDNA核苷酸序列。
[0032] SEQ ID NO：13是来自被鉴定为小鳟鱼大洋芽孢杆菌的微生物的16S rDNA核苷酸序列。
[0033] SEQ ID NO：14是来自被鉴定为解淀粉芽孢杆菌的微生物的16S rDNA核苷酸序列。
[0034] SEQ ID NO：15是来自被鉴定为芽孢杆菌属的微生物的16S rDNA核苷酸序列。
[0035] SEQ ID NO：16是来自被鉴定为恶臭假单胞菌的微生物的16S rDNA核苷酸序列。
[0036] SEQ ID NO：17是来自被鉴定为假单胞菌属的微生物的16S rDNA核苷酸序列。
[0037] SEQ ID NO：18是来自被鉴定为灰色链霉菌的微生物的16S rDNA核苷酸序列。
[0038] SEQ ID NO：19是来自被鉴定为千叶类芽孢杆菌的微生物的16S rDNA核苷酸序列。
[0039] SEQ ID NO：20是来自被鉴定为弯曲芽孢杆菌的微生物的16S rDNA核苷酸序列。
[0040] SEQ ID NO：21是来自被鉴定为巴氏梭菌的微生物的16S rDNA核苷酸序列。
[0041] SEQ ID NO：22是来自被鉴定为棕色固氮菌的微生物的16S rDNA核苷酸序列。
[0042] SEQ ID NO：23是来自被鉴定为嗜盐枝芽孢杆菌的微生物的16S rDNA核苷酸序列。
[0043] SEQ ID NO：24是来自被鉴定为德氏乳杆菌的微生物的16S rDNA核苷酸序列。
[0044] SEQ ID NO：25-66和69-136是物种特异性寡核苷酸引物和探针的核苷酸序列。
[0045] SEQ ID NO：67-68是通用16S rRNA原核生物引物的核苷酸序列。
[0046] 发明详述
[0047] I.术语
[0048] 除非另有说明，否则技术术语是根据常规用法使用的。分子生物学中常见术语的定义可以在Krebs等人，Lewin’s Genes XI，由Jones and Bartlett Learning出版，2012(ISBN 1449659853)；Kendrew等人(编辑)，The Encyclopedia of Molecular Biology，由Blackwell Publishers出版，1994(ISBN 0632021829)；Robert A.Meyers(编辑)，Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference，由Wiley，John&Sons，Inc.出版，2011(ISBN 8126531789)；以及George P.Rédei，Encyclopedic Dictionary of Genetics，Genomics，and Proteomics，第2版，2003(ISBN：0-471-26821-6)中找到。
[0049] 提供以下术语和方法的解释以更好地描述本公开并指导本领域的普通技术人员实践本公开。除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一”、“一个”和“该”是指一个或多于一个。例如，术语“包含一细胞”包括单个或多个细胞，并且被认为等同于短语“包含至少一个细胞”。如本文所用，“包含”意指“包括”。因此，“包含A或B”意指“包括A、B，或A和B”，而不排除另外的要素。出于所有目的，本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都全文以引用方式并入。如有冲突，将以本说明书(包括术语解释)为准。
[0050] 尽管类似于或等效于本文所描述的方法和材料的方法和材料可以用于实践或测试所公开的技术，但是合适的方法和材料描述如下。材料、方法和示例仅是说明性的，而非旨在为限制性的。
[0051] 为了助于查阅本公开的多种实施方案，提供了以下对特定术语的解释：
[0052] 水生动物：生活在盐水或淡水中的动物。在本文所公开的具体实施方案中，水生动物包括水生节肢动物，诸如虾(shrimp)、磷虾、桡足类动物、藤壶、蟹类、龙虾(lobster)和小龙虾(crayfish)。在其他实施方案中，水生动物包括鱼。水生动物副产品包括水生动物的任何部分，特别是来源于水生动物的商业加工的部分。因此，在一些示例中，水生动物副产品包括虾的头胸部或外骨骼、蟹类或龙虾的外骨骼，或鱼皮或鱼鳞中的一者或多者。
[0053] 接触：放置成直接物理结合，包括以固体形式和液体形式两者放置。例如，可以发生一种或多种微生物(诸如微生物聚生体中的微生物)与溶液中的生物样品的接触。也可以发生一种或多种微生物(诸如微生物聚生体中的微生物)与土壤、植物和/或植物部分(诸如叶子、茎、幼苗、根和/或种子)的接触。
[0054] 培养基：一组培养条件(其在一些示例中是合成的或非天然存在的一组条件)，包括支持特定细胞群(诸如一种或多种微生物物种)的存活力、功能和/或生长的营养物。培养基通常包括诸如碳源、氮源以及用于维持pH的缓冲剂之类的组分。培养基中另外的组分还可包括激素、生长因子、蛋白酶抑制剂、蛋白质水解产物、剪切力保护剂、蛋白质、维生素、微量元素、无机盐、矿物质和/或脂质中的一者或多者。
[0055] 培养：一种或多种生物或细胞在可同化的碳源、氮源和矿物盐源存在下的有意生长。在一个示例中，此类生长可发生在固体或半固体营养培养基中，或发生在营养物所溶解或悬浮于的液体培养基中。在另一示例中，培养可以在表面上发生或通过深层培养发生。营养培养基可以由复合营养物组成，或可以是化学确定的。
[0056] 发酵：例如通过微生物细胞(诸如细菌和/或真菌)使复杂的有机化合物分解成更简单化合物的过程。发酵过程可以在好氧条件、厌氧条件或两者下发生(例如，在一些部分是好氧的而其他部分是厌氧的的大体积中)。在一些非限制性实施方案中，发酵包括对存在于水生动物或动物副产品(诸如几丁质)中的化合物的酶促和/或非酶促分解。
[0057] 分离的：“分离的”生物组分(诸如核酸、蛋白质或生物体)已基本上与其他生物组分(诸如其他细胞、细胞碎片或其他蛋白质或核酸)分离或纯化。已经“分离的”生物组分包括通过标准纯化方法纯化的那些组分。该术语还涵盖重组核酸、蛋白质或微生物，以及化学合成的核酸或肽。术语“分离的”(或“富集的”或“纯化的”)不需要绝对纯度，并且可包括至少50％分离的微生物或分子，诸如至少75％、80％、90％、95％、98％、99％或甚至100％分离的微生物或分子。
[0058] 液体肥料：含有可溶性氮的水溶液或悬浮液。在一些示例中，液体肥料中的可溶性氮包括有机氮源，诸如尿素，或衍生自无水氨的尿素(诸如尿素和硝酸铵的溶液(UAN))。也可以使用氨水(20-32％的无水氨)。在其他示例中，液体肥料中的可溶性氮包括含氮无机盐，诸如氢氧化铵、硝酸铵、硫酸铵、焦磷酸铵、硫代硫酸铵，或它们中的两种或更多种的组合。在一些实施方案中，液体肥料包括非天然存在的氮源(诸如焦磷酸铵或硫代硫酸铵)和/或其他非天然存在的组分。
[0059] 常见的液体非天然肥料共混物由其氮-磷-钾含量(NPK百分比)指定，并且包括其他组分的加入，诸如硫或锌。人造共混物的示例包括10-34-0、含2％硫和0.25％锌(螯合的)的10-30-0、11-37-0、含3％硫的12-30-0、2-4-12、2-6-12、4-10-10、3-18-6、7-22-5、8-25-3、15-15-3、含2％硫的17-17-0、18-18-0、含2％硫的18-18-0、28-0-0UAN、含2％硫和硫代硫酸钾的9-27-0。
[0060] 微生物(Microbe)：微生物(microorganism)，包括但不限于细菌、古细菌、真菌，以及藻类(诸如微藻)。在一些示例中，微生物是单细胞生物(例如，细菌、蓝细菌、一些真菌，或一些藻类)。在其他示例中，术语微生物包括多细胞生物，诸如某些真菌或藻类(例如，多细胞丝状真菌或多细胞藻类)。
[0061] 微生物组合物：组合物(其可以是固体、液体，或至少部分地两者)，所述组合物包含至少一种类型(或物种)的微生物的细胞(或至少一种类型的微生物的细胞群)。在一些示例中，微生物组合物包含液体培养基(诸如贮存、培养或发酵培养基)中的一种或多种类型(物种)的微生物(或一种或多种微生物群体)的细胞，例如，作为所述液体培养基中的悬浮液。在其他示例中，微生物组合物包含在固体或凝胶状培养基(包括但不限于培养板)或浆液或糊状物的表面上或嵌入其中的一种或多种类型(物种)的微生物(或一种或多种微生物群体)的细胞。
[0062] 微生物聚生体：在一些情况下彼此物理接触的两种或更多种微生物物种的细胞的混合物、缔合物或集合。聚生体中的微生物可通过直接物理接触、通过生物化学相互作用或两者而相互影响。例如，聚生体中的微生物可以彼此交换营养物、代谢物或气体。因此，在一些示例中，聚生体中的至少一些微生物是在代谢上相互依赖的。这种相互依赖的相互作用可能随着时间推移和随着培养条件的变化而在性质和程度上发生变化。
[0063] II.微生物组合物
[0064] 本文公开了包含一组确定的微生物或微生物物种的细胞的微生物组合物。在一些实施方案中，所公开的组合物包含如下所述的一组确定的微生物(例如，3种微生物物种、16种微生物物种、19种微生物物种、20种微生物物种、21种微生物物种，或22种微生物物种)的细胞。本文所公开的组合物中的任一种还可包含一种或多种非微生物组分，包括但不限于碳源、氮源、缓冲剂、激素、生长因子、蛋白酶抑制剂、蛋白质水解产物、剪切力保护剂、蛋白质、氨基酸、维生素、微量元素、无机盐、矿物质和/或脂质中的一者或多者。在一些示例中，还可以将一种或多种另外的微生物物种添加到所述组合物中，例如以提供或补充组合物的所需活性。
[0065] A.确定的微生物组合物
[0066] 本文公开了包含一组确定的微生物物种的细胞的组合物。例如，在一些实施方案中，所述组合物包含在单一组合物中组合并且在一些示例中共培养或共发酵的微生物分离株。
[0067] 在一个示例中，所述组合物包含包括以下各项或由以下各项组成的微生物物种的细胞：德氏乳杆菌、嗜盐枝芽孢杆菌、棕色固氮菌、巴氏梭菌、千叶类芽孢杆菌、灰色链霉菌、假单胞菌属(与嗜虫假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌密切相关；例如，具有与SEQ ID NO：17具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属(与科赫芽孢杆菌、抱川芽孢杆菌和芽孢杆菌属(菌株R-27341)密切相关；例如，具有与SEQ ID NO：15具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、解淀粉芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、灿烂类芽孢杆菌(例如，与灿烂类芽孢杆菌和类芽孢杆菌属(菌株Y412MC10)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：12具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、地衣芽孢杆菌、酒乳杆菌、库氏类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、布氏乳杆菌、巨大芽孢杆菌、巴氏醋杆菌、拜氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌、以及弯曲芽孢杆菌。在另一示例中，所述组合物包含包括以下各项或由以下各项组成的微生物物种的细胞：德氏乳杆菌、嗜盐枝芽孢杆菌、棕色固氮菌、巴氏梭菌、灰色链霉菌、假单胞菌属(与嗜虫假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌密切相关，例如，具有与SEQ ID NO：17具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属(与科赫芽孢杆菌、抱川芽孢杆菌和芽孢杆菌属(菌株R-27341)密切相关，例如，具有与SEQ ID NO：15具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、解淀粉芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酒乳杆菌、枯草芽孢杆菌、布氏乳杆菌、巨大芽孢杆菌、巴氏醋杆菌、拜氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌、以及弯曲芽孢杆菌。在另一示例中，所述组合物包含包括以下各项或由以下各项组成的微生物物种的细胞：德氏乳杆菌、嗜盐枝芽孢杆菌、棕色固氮菌、巴氏梭菌、千叶类芽孢杆菌、灰色链霉菌、假单胞菌属(与嗜虫假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌密切相关，例如，具有与SEQ ID NO：17具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属(与科赫芽孢杆菌、抱川芽孢杆菌和芽孢杆菌属(菌株R-27341)密切相关，例如，具有与SEQ ID NO：15具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、解淀粉芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、灿烂类芽孢杆菌(例如，与灿烂类芽孢杆菌和类芽孢杆菌属(菌株Y412MC10)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：12具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、地衣芽孢杆菌、酒乳杆菌、库氏类芽孢杆菌、布氏乳杆菌、巨大芽孢杆菌、巴氏醋杆菌、拜氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌、以及弯曲芽孢杆菌。在另一示例中，所述组合物包含包括以下项或由以下项组成的微生物物种的细胞：德氏乳杆菌、嗜盐枝芽孢杆菌、棕色固氮菌、巴氏梭菌、灰色链霉菌、假单胞菌属(与嗜虫假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌密切相关，例如，具有与SEQ ID NO：17具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属(与科赫芽孢杆菌、抱川芽孢杆菌和芽孢杆菌属(菌株R-27341)密切相关，例如，具有与SEQ ID NO：15具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、解淀粉芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酒乳杆菌、枯草芽孢杆菌、布氏乳杆菌、巨大芽孢杆菌、巴氏醋杆菌、拜氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌、以及弯曲芽孢杆菌。
[0068] 在其他示例中，所述组合物包含包括以下各项或由以下各项组成的微生物物种的细胞：德氏乳杆菌、嗜盐枝芽孢杆菌、棕色固氮菌、巴氏梭菌、千叶类芽孢杆菌、假单胞菌属(与嗜虫假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌密切相关，例如，具有与SEQ ID NO：17具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属(与科赫芽孢杆菌、抱川芽孢杆菌和芽孢杆菌属(菌株R-27341)密切相关，例如，具有与SEQ ID NO：15具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、解淀粉芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、灿烂类芽孢杆菌(例如，与灿烂类芽孢杆菌和类芽孢杆菌属(菌株Y412MC10)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：12具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、地衣芽孢杆菌、酒乳杆菌、库氏类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、布氏乳杆菌、巨大芽孢杆菌、巴氏醋杆菌，以及干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌。在其他示例中，所述组合物包含包括以下各项或由以下各项组成的微生物物种的细胞：德氏乳杆菌、嗜盐枝芽孢杆菌、棕色固氮菌、巴氏梭菌、假单胞菌属(与嗜虫假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌密切相关，例如，具有与SEQ ID NO：17具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属(与科赫芽孢杆菌、抱川芽孢杆菌和芽孢杆菌属(菌株R-27341)密切相关，例如，具有与SEQ ID NO：15具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、解淀粉芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酒乳杆菌、枯草芽孢杆菌、布氏乳杆菌、巨大芽孢杆菌、巴氏醋杆菌，以及干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌。
[0069] 在其他示例中，所述组合物包含包括以下各项或由以下各项组成的微生物物种的细胞：德氏乳杆菌、棕色固氮菌、巴氏梭菌、灰色链霉菌、假单胞菌属(与嗜虫假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌密切相关，例如，具有与SEQ ID NO：17具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、恶臭假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酒乳杆菌、枯草芽孢杆菌、布氏乳杆菌、巨大芽孢杆菌、巴氏醋杆菌、拜氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌，以及弯曲芽孢杆菌。
[0070] 在另一示例中，所述组合物包含包括以下各项或由以下各项组成的微生物物种的细胞：德氏乳杆菌、棕色固氮菌、巴氏梭菌、千叶类芽孢杆菌、灰色链霉菌、假单胞菌属(与嗜虫假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌密切相关，例如，具有与SEQ ID NO：17具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、恶臭假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、灿烂类芽孢杆菌(例如，与灿烂类芽孢杆菌和类芽孢杆菌属(菌株Y412MC10)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：12具有至少99％序列相同性的168rRNA序列的微生物物种)、地衣芽孢杆菌、酒乳杆菌、库氏类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、布氏乳杆菌、巨大芽孢杆菌、巴氏醋杆菌、拜氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌，以及弯曲芽孢杆菌。
[0071] 在另一示例中，所述组合物包含包括以下各项或由以下各项组成的微生物物种的细胞：拜氏梭菌、灰色链霉菌，以及弯曲芽孢杆菌。
[0072] 在具体示例中，这些组合物的组合用于产生本文所公开的组合物，例如通过混合和共发酵所述组合物中的两种。
[0073] 本领域的普通技术人员将认识到，微生物鉴定(特别是在物种或菌株水平上)并非总是可能的。如实施例1中所讨论的，通过以下方式来分析本文所述的组合物中的微生物：进行16S rDNA测序和全基因组测序，然后与公共数据库中的序列进行比较。然而，由于序列数据库中信息的限制(包括很少或没有关于一些物种或菌株的信息和/或命名法随时间推移而变化)，因此提供确定的物种或菌株鉴定可能是具有挑战性的。因此，在一些实施方案中，包含在所公开的组合物中的微生物物种通过它们与本文提供的16S rDNA序列(SEQ ID NO：3-24)的序列相同性来鉴定。
[0074] 在一些示例中，所述组合物包含包括以下项或由以下项组成的微生物物种的细胞：具有与SEQ ID NO：3-24中的每一者具有至少95％序列相同性(诸如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或甚至100％序列相同性)的16S rDNA序列的微生物。在另一示例中，所述组合物包含包括以下项或由以下项组成的微生物物种的细胞：具有与SEQ ID NO：3-8、10、11、13-18和20-24中的每一者具有至少95％序列相同性(诸如至少96％、至少
97％、至少98％、至少99％、或甚至100％序列相同性)的16S rDNA序列的微生物。在其他示例中，所述组合物包含包括以下项或由以下项组成的微生物物种的细胞：具有与SEQ ID NO：3-7和9-24中的每一者具有至少95％序列相同性(诸如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或甚至100％序列相同性)的16S rDNA序列的微生物，或者包含包括以下项或由以下项组成的微生物物种的细胞：具有与SEQ ID NO：3-7、10、11、13-18、以及20-24中的每一者具有至少95％序列相同性(诸如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或甚至
100％序列相同性)的16S rDNA序列的微生物的细胞。在其他示例中，所述组合物包含包括以下项或由以下项组成的微生物物种的细胞：具有与SEQ ID NO：3-8、10、11、14、16-18、20-
22、以及24中的每一者具有至少95％序列相同性(诸如至少96％、至少97％、至少98％、至少
99％、或甚至100％序列相同性)的16S rDNA序列的微生物，或者包含包括以下项或由以下项组成的微生物物种的细胞：具有与SEQ ID NO：3-14、16-22、以及24中的每一者具有至少
95％序列相同性(诸如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或甚至100％序列相同性)的16S rDNA序列的微生物。
97％、至少98％、至少99％、或甚至100％序列相同性)的16S rDNA序列的微生物。在其他示例中，所述组合物包含包括以下项或由以下项组成的微生物物种的细胞：具有与SEQ ID NO：3-7和9-24中的每一者具有至少95％序列相同性(诸如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或甚至100％序列相同性)的16S rDNA序列的微生物，或者包含包括以下项或由以下项组成的微生物物种的细胞：具有与SEQ ID NO：3-7、10、11、13-18、以及20-24中的每一者具有至少95％序列相同性(诸如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或甚至
100％序列相同性)的16S rDNA序列的微生物的细胞。在其他示例中，所述组合物包含包括以下项或由以下项组成的微生物物种的细胞：具有与SEQ ID NO：3-8、10、11、14、16-18、20-
22、以及24中的每一者具有至少95％序列相同性(诸如至少96％、至少97％、至少98％、至少
99％、或甚至100％序列相同性)的16S rDNA序列的微生物，或者包含包括以下项或由以下项组成的微生物物种的细胞：具有与SEQ ID NO：3-14、16-22、以及24中的每一者具有至少
95％序列相同性(诸如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或甚至100％序列相同性)的16S rDNA序列的微生物。
[0075] 在一些实施方案中，所述组合物包含包括以下项或由以下项组成的微生物物种的细胞：在2016年7月1日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)并指定保藏号PTA-123288、PTA-123298、或PTA-123289的微生物集合。在一些示例中，所述组合物包含包括以下项或由以下项组成的微生物物种的细胞：所公开的ATCC保藏物中的两种或更多种的微生物物种，例如ATCC保藏号PTA-123288和PTA-123289的微生物物种，或者ATCC保藏号PTA-123298和PTA-123289的微生物物种。
[0076] 在另外的实施方案中，所述组合物包含提供所需代谢特征或活性(例如，可促进植物生长的一种或多种活性)的微生物物种的组合的细胞。因此，在一些示例中，所述组合物包含至少一种具有氮代谢活性(诸如脱氮、固氮和/或脲酶产生)的微生物物种的细胞、至少一种耐盐(例如，在含有1％、2.5％、5％、7.5％或10％盐的培养基中生长72小时)的微生物物种的细胞、至少一种具有磷酸盐和/或钙盐和/或锌盐增溶活性的微生物物种的细胞、至少一种具有纤维素分解和/或几丁质分解活性(诸如GlcNAc降解、几丁质降解和/或纤维二糖降解)的微生物物种的细胞、至少一种具有苹果酸代谢活性(诸如苹果酸同化)的微生物物种的细胞、至少一种具有植物激素(诸如吲哚(生长素))产生活性的微生物物种的细胞、至少一种具有铁代谢活性(诸如铁结合活性(铁载体))的微生物物种的细胞，和/或至少一种具有有机磷酸盐去磷酸化活性的微生物物种的细胞。
[0077] 所述组合物可包含具有一种或多种(诸如2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种或全部)上述特征或功能、以及其他所需的特征或功能的微生物物种的细胞。在具体示例中，所述微生物组合物包含三种或更多种微生物物种的细胞，其中每种微生物物种具有至少一种所公开的功能。在一些示例中，所述组合物包含至少一种具有氮代谢活性的微生物物种的细胞和至少一种具有耐盐性的微生物物种的细胞；或至少一种具有氮代谢活性的微生物物种的细胞、至少一种具有耐盐性的微生物物种的细胞、以及至少一种具有钙盐和/或磷酸盐增溶活性的微生物物种的细胞；或至少一种具有氮代谢活性的微生物物种的细胞、至少一种具有耐盐性的微生物物种的细胞、至少一种具有钙盐和/或磷酸盐和/或锌盐增溶活性的微生物物种的细胞、以及至少一种具有纤维素分解/几丁质分解活性的微生物物种的细胞；或至少一种具有氮代谢活性的微生物物种的细胞、至少一种具有耐盐性的微生物物种的细胞、至少一种具有钙盐和/或磷酸盐和/或锌盐增溶活性的微生物物种的细胞、至少一种具有纤维素分解/几丁质分解活性的微生物物种的细胞、以及至少一种具有苹果酸代谢活性的微生物物种的细胞；或者至少一种具有氮代谢活性的微生物物种的细胞、至少一种具有耐盐性的微生物物种的细胞、至少一种具有钙盐和/或磷酸盐和/或锌盐增溶活性的微生物物种的细胞、至少一种具有纤维素分解/几丁质分解活性的微生物物种的细胞、以及至少一种具有苹果酸代谢活性的微生物物种的细胞，以及至少一种具有植物激素产生活性的微生物物种的细胞；或者至少一种具有氮代谢活性的微生物物种的细胞、至少一种具有耐盐性的微生物物种的细胞、至少一种具有钙盐和/或磷酸盐和/或锌盐增溶活性的微生物物种的细胞、至少一种具有纤维素分解/几丁质分解活性的微生物物种的细胞、以及至少一种具有苹果酸代谢活性的微生物物种的细胞、以及至少一种具有植物激素产生活性的微生物物种的细胞，以及至少一种具有铁代谢活性的微生物物种的细胞；；或至少一种具有氮代谢活性的微生物物种的细胞、至少一种具有耐盐性的微生物物种的细胞、至少一种具有钙盐和/或磷酸盐和/或锌盐增溶活性的微生物物种的细胞、至少一种具有纤维素分解/几丁质分解活性的微生物物种的细胞、以及至少一种具有苹果酸代谢活性的微生物物种的细胞、以及至少一种具有植物激素产生活性的微生物物种的细胞、至少一种具有铁代谢活性的微生物物种的细胞、以及至少一种具有有机磷酸盐去磷酸化活性的微生物物种的细胞。具有指定活性的微生物物种的这些组合仅是示例，并且本文设想了所述活性的任何因子组合。如本文所讨论的，单一微生物物种可具有多于一种所列出活性，因此在一些示例中，包含具有给定数量的所列出活性的细胞的组合物将不一定具有该数量的不同微生物物种的细胞。
[0078] 用于确定微生物细胞的代谢特征或功能以及鉴定具有特定特征的微生物物种的示例性方法描述于实施例3中。本领域的普通技术人员将认识到，单一微生物物种可具有这些特征中的多于一种(例如，下表11)。在下面描述的示例中，微生物物种通过名称来标识；这些标识包括具有与本文公开为SEQ ID NO：3-24的这些命名物种中的每一者相关的序列具有至少95％(诸如至少96％、97％、98％、99％或甚至100％)的序列相同性的16S rDNA的微生物物种。
[0079] 因此，在一些实施方案中，所公开的组合物包含至少一种(诸如至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种或更多种)具有氮代谢活性的微生物物种的细胞，所述具有氮代谢活性的微生物物种为例如巴氏醋杆菌、棕色固氮菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌、嗜盐枝芽孢杆菌、拜氏梭菌、巴氏梭菌、库氏类芽孢杆菌、灿烂类芽孢杆菌(例如，与灿烂类芽孢杆菌和类芽孢杆菌属(菌株Y412MC10)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：12具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、假单胞菌属(与嗜虫假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌密切相关，例如具有与SEQ ID NO：17具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)和灰色链霉菌中的至少一者。在其他示例中，所公开的组合物包含至少一种(诸如至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种或更多种)的盐耐受5％NaCl的微生物物种的细胞，所述盐耐受5％NaCl的微生物物种为例如巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、芽孢杆菌属(与科赫芽孢杆菌、抱川芽孢杆菌和芽孢杆菌属(菌株R-27341)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：15具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、弯曲芽孢杆菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌、灿烂类芽孢杆菌(例如，与灿烂类芽孢杆菌和类芽孢杆菌属(菌株Y412MC10)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：12具有至少
99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、恶臭假单胞菌和假单胞菌属(与嗜虫假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌密切相关，例如具有与SEQ ID NO：17具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)。在其他示例中，所公开的组合物包含至少一种(诸如至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种或更多种)具有磷酸盐和/或钙盐和/或锌盐增溶活性的微生物物种的细胞，所述具有磷酸盐和/或钙盐和/或锌盐增溶活性的微生物物种为例如拜氏梭菌、巴氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌、布氏乳杆菌、酒乳杆菌、德氏乳杆菌和灿烂类芽孢杆菌(例如，与灿烂类芽孢杆菌和类芽孢杆菌属(菌株Y412MC10)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：12具有至少99％的序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)中的至少一者。在另外的示例中，所公开的组合物包含至少一种(诸如至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种或更多种)具有纤维素分解和/或几丁质分解活性的微生物物种的细胞，所述具有纤维素分解和/或几丁质分解活性的微生物物种为例如巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、芽孢杆菌属(与科赫芽孢杆菌、抱川芽孢杆菌和芽孢杆菌属(菌株R-27341)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：15具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、弯曲芽孢杆菌、拜氏梭菌、巴氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌、酒乳杆菌、灿烂类芽孢杆菌(例如，与灿烂类芽孢杆菌和类芽孢杆菌属(菌株Y412MC10)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：12具有至少99％的序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、千叶类芽孢杆菌和灰色链霉菌中的一者或多者。在其他示例中，所公开的组合物包含至少一种(诸如至少2种、至少3种、至少
4种、至少5种、至少6种或更多种)具有苹果酸代谢活性的微生物物种的细胞，所述具有苹果酸代谢活性的微生物物种为例如巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、芽孢杆菌属(与科赫芽孢杆菌、抱川芽孢杆菌和芽孢杆菌属(菌株R-27341)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：15具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、弯曲芽孢杆菌、库氏类芽孢杆菌、灿烂类芽孢杆菌(例如，与灿烂类芽孢杆菌和类芽孢杆菌属(菌株Y412MC10)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：12具有至少99％的序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、千叶类芽孢杆菌、恶臭假单胞菌、假单胞菌属(与嗜虫假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌密切相关，例如具有与SEQ ID NO：17具有至少99％序列相同性的
16S rRNA序列的微生物物种)和灰色链霉菌中的至少一者。在另外的示例中，所公开的组合物包含至少一种(诸如至少2种、至少3种或更多种)具有植物激素(例如，吲哚(生长素))产生活性的微生物物种的细胞，所述具有植物激素产生活性的微生物物种为例如巴氏梭菌、酒乳杆菌和布氏乳杆菌中的至少一者。在另外的示例中，所公开的组合物包含至少一种(例如至少2种，至少3种或更多种)具有铁代谢活性(例如，铁结合活性)的微生物物种的细胞，所述具有铁代谢活性的微生物物种为例如巴氏梭菌和拜氏梭菌中的至少一者。本文考虑了包含具有这些特征或活性的任何组合的微生物物种的细胞的组合物。
99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、恶臭假单胞菌和假单胞菌属(与嗜虫假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌密切相关，例如具有与SEQ ID NO：17具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)。在其他示例中，所公开的组合物包含至少一种(诸如至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种或更多种)具有磷酸盐和/或钙盐和/或锌盐增溶活性的微生物物种的细胞，所述具有磷酸盐和/或钙盐和/或锌盐增溶活性的微生物物种为例如拜氏梭菌、巴氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌、布氏乳杆菌、酒乳杆菌、德氏乳杆菌和灿烂类芽孢杆菌(例如，与灿烂类芽孢杆菌和类芽孢杆菌属(菌株Y412MC10)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：12具有至少99％的序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)中的至少一者。在另外的示例中，所公开的组合物包含至少一种(诸如至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种或更多种)具有纤维素分解和/或几丁质分解活性的微生物物种的细胞，所述具有纤维素分解和/或几丁质分解活性的微生物物种为例如巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、芽孢杆菌属(与科赫芽孢杆菌、抱川芽孢杆菌和芽孢杆菌属(菌株R-27341)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：15具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、弯曲芽孢杆菌、拜氏梭菌、巴氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌、酒乳杆菌、灿烂类芽孢杆菌(例如，与灿烂类芽孢杆菌和类芽孢杆菌属(菌株Y412MC10)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：12具有至少99％的序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、千叶类芽孢杆菌和灰色链霉菌中的一者或多者。在其他示例中，所公开的组合物包含至少一种(诸如至少2种、至少3种、至少
4种、至少5种、至少6种或更多种)具有苹果酸代谢活性的微生物物种的细胞，所述具有苹果酸代谢活性的微生物物种为例如巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、芽孢杆菌属(与科赫芽孢杆菌、抱川芽孢杆菌和芽孢杆菌属(菌株R-27341)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：15具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、弯曲芽孢杆菌、库氏类芽孢杆菌、灿烂类芽孢杆菌(例如，与灿烂类芽孢杆菌和类芽孢杆菌属(菌株Y412MC10)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：12具有至少99％的序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、千叶类芽孢杆菌、恶臭假单胞菌、假单胞菌属(与嗜虫假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌密切相关，例如具有与SEQ ID NO：17具有至少99％序列相同性的
16S rRNA序列的微生物物种)和灰色链霉菌中的至少一者。在另外的示例中，所公开的组合物包含至少一种(诸如至少2种、至少3种或更多种)具有植物激素(例如，吲哚(生长素))产生活性的微生物物种的细胞，所述具有植物激素产生活性的微生物物种为例如巴氏梭菌、酒乳杆菌和布氏乳杆菌中的至少一者。在另外的示例中，所公开的组合物包含至少一种(例如至少2种，至少3种或更多种)具有铁代谢活性(例如，铁结合活性)的微生物物种的细胞，所述具有铁代谢活性的微生物物种为例如巴氏梭菌和拜氏梭菌中的至少一者。本文考虑了包含具有这些特征或活性的任何组合的微生物物种的细胞的组合物。
[0080] 在另外的实施方案中，本文所公开的任一微生物组合物能进一步包括以下项中的一者或多者(诸如2者或更多者、3者或更多者、4者或更多者或全部)的细胞：南半球脱硫弯曲孢菌(Desulfosporosinus meridiei)、亚硝化侏儒菌属(Nitrosopumilus sp.)、苔藓虫海杆菌(Marinobacter bryozoorum)、固氮氧化亚铁钩端螺旋菌(Leptospirillum ferrodiazotrophum)，以及嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。
[0081] 除微生物外，所公开的组合物可包含一种或多种进一步的组分，包括但不限于盐、金属离子和/或缓冲剂(例如，KH2PO4、K2HPO4、CaCl2、MgSO4、FeCl3、NaMoO4和/或Na2MoO4中的一者或多者)、微量元素(诸如硫、硫酸根、亚硫酸根、铜或硒)、微量营养素(诸如硼(B)、锌(Zn)、锰(Mn)、铁(Fe)、铜(Cu)、钼(Mo)、氯(Cl))、维生素(诸如B族维生素或维生素K)、糖类(诸如蔗糖、葡萄糖或果糖)、几丁质、脱乙酰几丁质、葡糖胺、蛋白质，和/或一种或多种氨基酸。所述组合物中还可包含的另外组分包括HYT B、HYT C和/或HYT D、一种或多种肥料(例如，液体肥料)、一种或多种农药、一种或多种杀真菌剂、一种或多种除草剂、一种或更多种杀虫剂、一种或多种植物激素、一种或多种植物激卫素(plant elicitor)，或这些组分中的两种或更多种的组合。
[0082] 在一些实施方案中，所公开的组合物是在液体培养基(诸如培养或发酵培养基或储存培养基)或接种物中。在其他实施方案中，所述组合物存在于含有或支持微生物的固体或凝胶状培养基(诸如培养板)上。在其他示例中，所公开的组合物被冻干，并且能通过添加液体(诸如培养基)并在液体培养基中生长或通过在固体培养基上划线来重构。
[0083] 在其他实施方案中，本文所述的组合物以干制剂(诸如干粉、丸剂或颗粒)存在。干制剂能通过将渗透保护剂(诸如糖，例如海藻糖和/或麦芽糖糊精)以所需比率加入到溶液中的微生物组合物中来制备。将该溶液与干载体或吸收剂(诸如木粉或粘土)以所需的微生物组合物浓度(诸如2-30％，例如2.5-10％、5-15％、7.5-20％、或15-30％)组合。颗粒能通过掺入粘土或聚合物粘合剂来产生，所述粘土或聚合物粘合剂用于将颗粒保持在一起或提供特定的物理或降解性质。形成颗粒的示例性方法包括旋转造粒、混合器造粒或挤出。在其他示例中，通过以下方式来制备干制剂：将本文所述的液体微生物组合物喷雾到固体载体(诸如膨润土)上/或浸泡在所述固体载体中，或将液体微生物组合物直接涂覆到肥料颗粒上。在其他示例中，干制剂包含这样的组合物，所述组合物包含已冻干(冷冻干燥)的本文所公开的微生物物种中的一者或多者(或其任何组合)的细胞。用于制备包含一种或多种微生物物种的干制剂的其他方法是本领域的普通技术人员已知的，例如如在Formulation of Microbial Biopesticides：Beneficial Microorganisms，Nematodes and Seed Treatments，Burges编辑，Springer Science，1998中所描述的。
[0084] 在一些示例中，将组合物维持在支持微生物生长的温度下，例如约25-45℃(诸如约30-35℃、约30-40℃、或约35-40℃)下。在其他示例中，将所述组合物储存在微生物不生长或无活性的温度下，诸如低于25℃(例如，20℃、15℃、10℃、4℃、-20℃)、-40℃、-70℃或更低)下。本领域的技术人员能配制用于冷藏的组合物，例如通过包含稳定剂(诸如甘油)。在其他示例中，将所述组合物储存在环境温度下，诸如约0-35℃(例如，约10-30℃或约15-
25℃)下。
25℃)下。
[0085] B.产生确定的组合物的方法
[0086] 在一些实施方案中，通过以下方式来产生所公开的组合物：共培养或共培育所公开的微生物物种中的两种或更多种(诸如2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种、15种或更多种、16种或更多种、17种或更多种、18种或更多种、19种或更多种、20种或更多种、21种或更多种、或22种或更多种微生物物种)的细胞。在共培养组合物中的少于全部微生物物种的示例中，通过以下方式来产生组合物：组合所述组合物中的微生物物种中的两种或更多种共培养子集(子组合物)。在产生微生物物种的混合物(全集或子集)的过程中可以存在另外的组分(例如，非微生物组分)，或者可以在产生组合物中的微生物物种的混合物之后加入另外的组分。
[0087] 在一些示例中，通过共培养所述组合物中的所有微生物物种来产生所公开的组合物。因此，在一个示例中，通过共培养以下各者的细胞来产生所公开的组合物：德氏乳杆菌、嗜盐枝芽孢杆菌、棕色固氮菌、巴氏梭菌、千叶类芽孢杆菌、灰色链霉菌、假单胞菌属(与嗜虫假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌密切相关，例如具有与SEQ ID NO：17具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属(与科赫芽孢杆菌、抱川芽孢杆菌和芽孢杆菌属(菌株R-27341)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：15具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、解淀粉芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、灿烂类芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酒乳杆菌、库氏类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、布氏乳杆菌、巨大芽孢杆菌、巴氏醋杆菌、拜氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌，以及弯曲芽孢杆菌。
在另一示例中，通过共培养以下各者的细胞来产生所公开的组合物：德氏乳杆菌、嗜盐枝芽孢杆菌、棕色固氮菌、巴氏梭菌、灰色链霉菌、假单胞菌属(与嗜虫假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌密切相关，例如具有与SEQ ID NO：17具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属(与科赫芽孢杆菌、抱川芽孢杆菌和芽孢杆菌属(菌株R-27341)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：15具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、解淀粉芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酒乳杆菌、枯草芽孢杆菌、布氏乳杆菌、巨大芽孢杆菌、巴氏醋杆菌、拜氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌，以及弯曲芽孢杆菌。在另外的示例中，通过共培养以下各者的细胞来产生所公开的组合物：德氏乳杆菌、嗜盐枝芽孢杆菌、棕色固氮菌、巴氏梭菌、千叶类芽孢杆菌、灰色链霉菌、假单胞菌属(与嗜虫假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌密切相关，例如具有与SEQ ID NO：17具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属(与科赫芽孢杆菌、抱川芽孢杆菌和芽孢杆菌属(菌株R-27341)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：15具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、解淀粉芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、灿烂类芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酒乳杆菌、库氏类芽孢杆菌、布氏乳杆菌、巨大芽孢杆菌、巴氏醋杆菌、拜氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌，以及弯曲芽孢杆菌。在另一示例中，通过共培养以下各者的细胞来产生所公开的组合物：德氏乳杆菌、嗜盐枝芽孢杆菌、棕色固氮菌、巴氏梭菌、灰色链霉菌、假单胞菌属(与嗜虫假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌密切相关，例如具有与SEQ ID NO：17具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属(与科赫芽孢杆菌、抱川芽孢杆菌和芽孢杆菌属(菌株R-27341)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：15具有至少99％序列相同性的
16S rRNA序列的微生物物种)、解淀粉芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酒乳杆菌、布氏乳杆菌、巨大芽孢杆菌、巴氏醋杆菌、拜氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌，以及弯曲芽孢杆菌。
在另一示例中，通过共培养以下各者的细胞来产生所公开的组合物：德氏乳杆菌、嗜盐枝芽孢杆菌、棕色固氮菌、巴氏梭菌、灰色链霉菌、假单胞菌属(与嗜虫假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌密切相关，例如具有与SEQ ID NO：17具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属(与科赫芽孢杆菌、抱川芽孢杆菌和芽孢杆菌属(菌株R-27341)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：15具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、解淀粉芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酒乳杆菌、枯草芽孢杆菌、布氏乳杆菌、巨大芽孢杆菌、巴氏醋杆菌、拜氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌，以及弯曲芽孢杆菌。在另外的示例中，通过共培养以下各者的细胞来产生所公开的组合物：德氏乳杆菌、嗜盐枝芽孢杆菌、棕色固氮菌、巴氏梭菌、千叶类芽孢杆菌、灰色链霉菌、假单胞菌属(与嗜虫假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌密切相关，例如具有与SEQ ID NO：17具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属(与科赫芽孢杆菌、抱川芽孢杆菌和芽孢杆菌属(菌株R-27341)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：15具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、解淀粉芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、灿烂类芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酒乳杆菌、库氏类芽孢杆菌、布氏乳杆菌、巨大芽孢杆菌、巴氏醋杆菌、拜氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌，以及弯曲芽孢杆菌。在另一示例中，通过共培养以下各者的细胞来产生所公开的组合物：德氏乳杆菌、嗜盐枝芽孢杆菌、棕色固氮菌、巴氏梭菌、灰色链霉菌、假单胞菌属(与嗜虫假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌密切相关，例如具有与SEQ ID NO：17具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属(与科赫芽孢杆菌、抱川芽孢杆菌和芽孢杆菌属(菌株R-27341)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：15具有至少99％序列相同性的
16S rRNA序列的微生物物种)、解淀粉芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酒乳杆菌、布氏乳杆菌、巨大芽孢杆菌、巴氏醋杆菌、拜氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌，以及弯曲芽孢杆菌。
[0088] 在另一示例中，通过共培养以下各者的细胞来产生所公开的组合物：德氏乳杆菌、棕色固氮菌、巴氏梭菌、灰色链霉菌、假单胞菌属、恶臭假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酒乳杆菌、枯草芽孢杆菌、布氏乳杆菌、巨大芽孢杆菌、巴氏醋杆菌、拜氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌，以及弯曲芽孢杆菌。在其他示例中，通过共培养以下各者的细胞来产生所公开的组合物：德氏乳杆菌、棕色固氮菌、巴氏梭菌、千叶类芽孢杆菌、灰色链霉菌、假单胞菌属、恶臭假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、灿烂类芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酒乳杆菌、库氏类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、布氏乳杆菌、巨大芽孢杆菌、巴氏醋杆菌、拜氏梭菌、干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌，以及弯曲芽孢杆菌。
[0089] 能用于通过共培养来产生这些组合物的培养基描述于实施例2中，并且包括但不限于包含2％糖蜜(w/v)、1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)、0.1％乳清蛋白(w/v)和0.25％Ferti-Nitro Plus(w/v)的培养基。在其他示例中，用于共培养微生物细胞的培养基包含磷酸盐缓冲盐水(1x)、黑糖蜜(2-10％w/v)、乳清蛋白(0.1-0.5％w/v)、Ferti-Nitro Plus Plant N(0.25-1.25％w/v)，含有或不含昆布提取物(0.0067％)、酵母粉(0.0033％w/v)和/或螺旋藻(0.0067％w/v)。
[0090] 在其他示例中，通过以下方式来产生所公开的组合物：共培养至少两种微生物物种子集的细胞，并然后将两种共培养物组合以产生所述组合物。在一个示例中，通过以下方式来产生所述组合物：共培养以下项的细胞：德氏乳杆菌、嗜盐枝芽孢杆菌、棕色固氮菌、巴氏梭菌、千叶类芽孢杆菌、假单胞菌属(与嗜虫假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌密切相关，例如具有与SEQ ID NO：17具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属(与科赫芽孢杆菌、抱川芽孢杆菌和芽孢杆菌属(菌株R-27341)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：15具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、解淀粉芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、灿烂类芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酒乳杆菌、库氏类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、布氏乳杆菌、巨大芽孢杆菌、巴氏醋杆菌和干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌(19种微生物种的组)；以及单独共培养拜氏梭菌、灰色链霉菌和弯曲芽孢杆菌(3种微生物种的组)。
[0091] 在另一示例中，通过以下方式来产生所述组合物：共培养以下项：德氏乳杆菌、嗜盐枝芽孢杆菌、棕色固氮菌、巴氏梭菌、假单胞菌属(与嗜虫假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌密切相关，例如具有与SEQ ID NO：17具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属(与科赫芽孢杆菌、抱川芽孢杆菌和芽孢杆菌属(菌株R-27341)密切相关，例如具有与SEQ ID NO：15具有至少99％序列相同性的16S rRNA序列的微生物物种)、解淀粉芽孢杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酒乳杆菌、枯草芽孢杆菌、布氏乳杆菌、巨大芽孢杆菌、巴氏醋杆菌和干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌(16种微生物物种的组)；以及单独共培养拜氏梭菌、灰色链霉菌和弯曲芽孢杆菌。在足以使微生物生长的条件(诸如实施例2中描述的那些条件)下单独共培养两种混合物后，将单独的共培养物混合以产生所述组合物。
[0092] 在一些示例中，用于共培养19种微生物物种的组或16种微生物物种的组的培养基包含10％糖蜜(w/v)、1X PBS、0.5％乳清蛋白(w/v)和1.25％Ferti-Nitro Plus(w/v)。在一些示例中，用于共培养3种微生物物种的组的培养基包含2％糖蜜(w/v)、1X PBS、0.1％乳清蛋白(w/v)和0.25％Ferti-Nitro Plus。然而，本领域的普通技术人员能辨识适合于共培养微生物的其他培养基，包括多种量的所列成分，如实施例2中所述。在足以使微生物生长的条件(诸如实施例2中描述的那些条件)下单独共培养两种混合物之后，将单独的共培养物(诸如19种微生物的组和3种微生物的组，或16种微生物的组和3种微生物的组)混合以产生所述组合物。在一些示例中，将两种共培养物以10∶1至1∶0.5(诸如8∶1至1∶1、5∶1至2∶1、3∶1至1∶0.5)的大组(19种微生物物种的组或16种微生物物种的组)：小组(3种微生物物种的组)的比率混合。在一些示例中，所述共培养物的比率为约10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1，或1∶0.5。在特定实施方案中，所述共培养物的比率为约6.5∶1、1∶1、2∶1，或
1∶0.5。类似的共培养培养基和混合物能与共培养物一起利用，所述共培养物与上面列出的那些共培养物相同，但不包括枯草芽孢杆菌。
1∶0.5。类似的共培养培养基和混合物能与共培养物一起利用，所述共培养物与上面列出的那些共培养物相同，但不包括枯草芽孢杆菌。
[0093] 在其他示例中，通过以下方式来产生所述组合物：单独培养ATCC保藏号PTA-123288和PTA-123289中的微生物，以及混合单独培养物以产生所述组合物。在其他示例中，通过以下方式来产生所述组合物：单独培养ATCC保藏号PTA-123298和PTA-123289中的微生物，以及混合单独培养物以产生所述组合物。
[0094] III.生物降解过程
[0095] 能使用所公开的组合物来降解生物材料，诸如富含几丁质的材料，例如水生动物或水生动物副产品、昆虫或真菌。因此，在一些实施方案中，本文公开了方法，所述方法包括将所公开的微生物组合物中的一种或多种与含几丁质的生物材料混合以形成混合物，以及发酵所述混合物。在一些实施方案中，所述方法还包括将所述混合物分离成固体级分、含水级分和任选的脂质级分(图1)。
[0096] 在一些实施方案中，本文所公开的生物降解过程包括将本文公开的微生物组合物与一种或多种含几丁质的生物材料混合。含几丁质的生物材料包括但不限于水生动物或水生动物副产品、昆虫和真菌。在一些示例中，所述含几丁质的生物材料是水生动物，诸如水生节肢动物(例如，软甲纲的成员)。用于所公开方法的水生节肢动物包括虾、蟹类、龙虾、小龙虾和磷虾。在一些示例中，在本文所公开的生物降解方法中使用完整的水生动物(诸如水生节肢动物)或水生动物副产品。水生动物副产品包括水生动物的任何部分，诸如通过加工水生动物产生的任何部分。在一些示例中，水生动物副产品是水生动物外骨骼(诸如虾壳、蟹壳、小龙虾壳，或龙虾壳)的全部或一部分。在其他示例中，水生动物副产品是水生动物的一部分，例如虾头胸部。
[0097] 在其他示例中，所述含有几丁质的生物材料包括真菌，诸如来自接合菌门、担子菌门、子囊菌门或不完全菌门的真菌。具体的示例性真菌包括曲霉属(Aspergillus spp.)、青霉属(Penicillium spp.)、木霉属(Trichoderma spp.)、酵母属(Saccharomyces spp.)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces spp.)。因此，烘焙废弃物流、啤酒制造废弃物流和蒸馏酒废弃物流能提供含几丁质的生物材料的来源。在其他示例中，所述含几丁质的生物材料包括在外骨骼中含有几丁质的昆虫，诸如蚱蜢、蟋蟀、甲虫，以及其他昆虫。加工这些昆虫的副产品也被认为是几丁质的来源。
[0098] 将所述含几丁质的生物材料与上述第1I部分中所述的组合物混合，以形成基本上均匀的混合物。在一些示例中，将所述含几丁质的生物材料在与本文所述的微生物组合物混合之前进行研磨、压碎、切碎、碾磨，或以其他方式分散。在具体示例中，所述混合物在接种物中含有约10-50％(诸如约10-20％、约20-30％、约30-40％、约25-40％，例如约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％)的含几丁质的材料(诸如虾头)(w/v)，所述接种物含有约0.1-5％(诸如约0.1-1％、约0.5-2％、约1-2％、约2-3％、约0.1％、约0.2％、约
0.3％、约0.5％、约0.8％、约1％、约1.25％、约1.5％、约1.75％、约2％、约2.5％、约3％、约
4％、或约5％)的微生物组合物(v/v)。
0.3％、约0.5％、约0.8％、约1％、约1.25％、约1.5％、约1.75％、约2％、约2.5％、约3％、约
4％、或约5％)的微生物组合物(v/v)。
[0099] 在一些示例中，将所述接种物、含几丁质的生物材料和糖(或其他碳源)混合在一起，例如通过搅拌或搅动。在其他示例中，在将微生物组合物与所述含几丁质的生物材料混合和进行发酵之前，任选地活化所述微生物组合物中的一种或多种微生物。本文所公开的方法不需要活化。本领域的技术人员能根据微生物在发酵前是否被活化来调节发酵的时间和/或温度。所述微生物的活化能通过以下方式来实现：在一定温度下将所述微生物组合物的接种物与碳源(诸如糖，例如葡萄糖、蔗糖、果糖或其他糖)一起孵育足够的时间段以使微生物生长。在一些示例中，所述微生物的接种物(诸如本文所述的微生物组合物)在液体培养基中的浓度为约0.05-5％v/v(例如，约0.5-5％、约0.5-2％、约1-2％、或约2-3％)。将所述接种物在含有约0.1-1％(例如，约0.1-0.5％、约0.1-0.3％、约0.2-0.6％、或约0.5-1％，诸如约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％或约1％)糖的溶液中稀释并在环境温度例如约20-40℃(诸如约20℃、约25℃、约30℃、约35℃或约40℃)下孵育约1-5天(诸如约24小时、约48小时、约72小时、约96小时、或约120小时)。在其他示例中，所述微生物的活化能通过以下方式来活化：在一定温度下将所述微生物组合物的接种物孵育足够的时间段以使微生物生长，例如在约20-40℃(诸如约25-35℃)下孵育12小时至5天(诸如1-4天或2-3天)。在一些非限制性示例中，当培养物达到在600nm处＞
0.005的光密度时，认为所述微生物被活化。
0.005的光密度时，认为所述微生物被活化。
[0100] 在将所述含几丁质的生物材料与微生物组合物(其为任选经活化的)混合后，将所述混合物进行发酵。在一些示例中，在发酵之前测量混合物的pH。如果需要的话，在发酵之前将pH调节至选定的范围(例如，约3至约4或约3.5至4的pH)。将所述混合物在约20-40℃(例如，约30℃-36℃，诸如约30℃、约31℃℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃或约40℃)的温度下孵育约1-30天(诸如约3-28天、约7-21天、约3、5、7、10、14、16、20、24、28或30天)。定期搅动(例如，非连续搅动)所述混合物。在一些示例中，每
1-7天，例如每1、2、3、4、5、6或7天将所述混合物搅动一段时间。在一些非限制性示例中，进行所述发酵直至可滴定酸度(TTA)为约3-5％且所述pH为约4-5。
1-7天，例如每1、2、3、4、5、6或7天将所述混合物搅动一段时间。在一些非限制性示例中，进行所述发酵直至可滴定酸度(TTA)为约3-5％且所述pH为约4-5。
[0101] 发酵后，将所得发酵混合物分离成至少固体级分和液体级分。在一些示例中，所述固体级分被称为“HYT C”，并且在一些示例中，所述液体级分被称为“HYT B”。在一些示例中，将所述发酵物从罐传递到沉降设备。随后将所述液体倾析并离心。在一个非限制性示例中，将所述发酵混合物在约5℃下以1250rpm(930×g)离心15分钟以获得液体级分和脂质(例如，色素)级分。从生物降解过程获得的液体(或含水)级分能在环境温度下储存。在一些非限制性示例中，将糖加入所述液体级分中，例如以1-10％v/v加入。
[0102] 所述液体级分可包括诸如蛋白质、氨基酸、葡糖胺、微量元素(诸如钙、镁、锌、铜、铁和/或锰)和/或酶(诸如乳酸酶、蛋白酶、脂肪酶、和/或几丁质酶)之类的组分。在一些非限制性示例中，所述液体级分含有(w/v)约1-5％的总氨基酸、约3-7％的蛋白质、约0.1-2％的氮、少于约0.2％的磷、约0.5-1％的钾、约4-8％的碳、约0.2-1％的钙、少于约0.2％的镁、少于约0.2％的钠，和/或约0.1-0.4％的硫。在另外的非限制性示例中，所述液体级分包含约0.01-0.2％(例如，约0.1％或更少)的葡糖胺。所述液体级分还可含有一种或多种微生物(例如，来自用于起始发酵过程的接种物)和/或微量的脱乙酰几丁质或几丁质。所述液体级分在一些示例中在本文中被称为“HYT B”。
[0103] 从所述生物降解过程获得的所述固体级分含有几丁质(例如，约50-70％或约50-60％的几丁质)。所述固体级分还可含有一种或多种微量元素(诸如钙、镁、锌、铜、铁和/或锰)、蛋白质或氨基酸，和/或来自用于起始所述发酵过程的接种物的一种或多种微生物。所述固体级分在一些示例中在本文中被称为“HYT C”。任选地将HYT C微粉化以形成微粉化的几丁质和残留的几丁质。在一些非限制性示例中，所述固体级分含有(w/v)约9-35％的总氨基酸、约30-50％的粗蛋白、约5-10％的氮、约0.3-1％的磷、少于约0.3％钾、约35-55％的碳、约0.5-2％的钙、少于约0.1％的镁、约0.1-0.4％的钠，和/或约0.2-0.5％的硫。
[0104] 在一些示例中，还将脂质级分与所述固体和液体级分分离。所述脂质级分是所述液体级分的上部相。所述脂质级分含有化合物，诸如甾醇、维生素A和/或维生素E、脂肪酸(诸如DHA和/或EHA)，并且在一些示例中含有类胡萝卜素色素(例如，虾青素)。所述脂质级分可用于多种目的，包括但不限于化妆品或营养产品的生产。
[0105] 在另外的实施方案中，使用所公开的微生物组合物来发酵几丁质。在一些示例中，将几丁质(诸如HYT C，或如上所述产生的微粉化和/或残留的几丁质)与含有本文所述微生物和蛋白质水解物(例如，HYT B)的微生物聚生体或组合物混合，以及进行发酵以形成发酵混合物。由于发酵，起始混合物中至少一部分几丁质被消化。在一些示例中，将所述混合物在约20-40℃(例如，约30℃-35℃，诸如约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃或约40℃)的温度下孵育约l天至30天(诸如约2-28天、约4-24天、约16-30天、约10-20天，或约12-24天)。在一些示例中，定期搅动(例如，非连续搅动)所述混合物。在其他示例中，连续搅动所述混合物。在一个非限制性示例中，每天搅动所述混合物约1-12小时(诸如约2-8小时或约4-10小时)。可以定期监测所述发酵混合物的pH。在一些示例中，所述pH任选地保持在约4-5。在一些示例中，进行所述发酵直至总可滴定酸度(TTA)为至少约1-10％(诸如约2-8％、约4-8％或约5-10％)。
[0106] 发酵后，将所得发酵混合物分离成至少固体和液体级分，例如通过倾析、过滤和/或离心。在一些示例中，由HYT B和几丁质与所述微生物组合物发酵得到的所述液体级分被称为“HYT D”。在一些非限制性示例中，所述液体级分含有(w/v)约0.5-2％的总氨基酸、约3-7％的蛋白质、约0.5-1％的氮、少于约0.1％的磷、约0.4-1％的钾、约3-7％的碳、少于约
0.5％的钙、少于约0.1％的镁、少于约0.3％的钠，和/或约少于约0.3％的硫。此外，HYT D含有少于约50％的几丁质(诸如少于约45％、少于约40％、少于约35％、或少于约30％的几丁质)和少于2％的葡糖胺(诸如少于约1.5％或少于约1％的葡糖胺)。在其他示例中，HYT D含有约25-50％的几丁质和约0.5-2％的葡糖胺。
0.5％的钙、少于约0.1％的镁、少于约0.3％的钠，和/或约少于约0.3％的硫。此外，HYT D含有少于约50％的几丁质(诸如少于约45％、少于约40％、少于约35％、或少于约30％的几丁质)和少于2％的葡糖胺(诸如少于约1.5％或少于约1％的葡糖胺)。在其他示例中，HYT D含有约25-50％的几丁质和约0.5-2％的葡糖胺。
[0107] IV.用于处理土壤、植物和/或种子的过程
[0108] 所公开的微生物组合物，单独或与本文所公开的产品(诸如HYT B、HYT C和/或HYT D)组合，能用于处理土壤、植物或植物部分(诸如根、茎、叶子、种子或幼苗)。产生HYT B、HYT C和HYT D的方法描述于第III部分(上文)中并且还描述于美国专利No.8,748,124和国际专利申请公开No.WO 2012/175738中，这两篇专利均全文以引用方式并入本文。
[0109] 在一些示例中，用所公开的组合物处理改善了植物生长，改善了胁迫耐受性和/或增加了作物产量。在一些实施方案中，所述方法包括使土壤、植物(诸如植物叶子、茎、根、幼苗或其他植物部分)或种子与本文所公开的微生物或组合物接触。所述方法还可包括使经处理的植物、植物部分或种子生长和/或在经处理的土壤中培育植物、植物部分或种子。
[0110] 微生物是任选地在施用前活化的组合物。在一些示例中，所述微生物的活化如上文第1II部分中所述。在其他示例中，通过以下方式来活化微生物：将100份水和1份微生物组合物混合，以及在约15-40℃(诸如约20-40℃、约15-30℃、或约25-35℃)孵育约12小时至14天(诸如约1-14天、3-10天、3-5天，或5-7天)。如果所述微生物组合物与HYT B组合施用，则活化混合物任选地还能包含1份HYT B。
[0111] 在其他实施方案中，所述方法包括使土壤、植物、植物部分或种子与所公开的组合物以及HYT B、HYT C和HYT D中的一者或多者(诸如HYT B、HYT C和HYT D中的一者、两者或全部)接触。HYT B、HYT C和/或HYT D可以单独地施用于土壤、植物(或植物部分)和/或种子，例如与所公开的微生物组合物顺序地、同时或基本上同时地施用。
[0112] 在一些示例中，所述方法包括使土壤、植物(或植物部分)或种子与所公开的微生物组合物和一种或多种另外的组分接触，所述另外的组分包括但不限于几丁质、脱乙酰几丁质、葡糖胺、蛋白质、氨基酸、液体肥料、一种或多种农药、一种或多种杀真菌剂、一种或多种除草剂、一种或多种杀虫剂、一种或多种植物激素、一种或多种植物激卫素、或它们中的两者或更多者的组合。另外的组分可以包含在包含本文所公开的微生物的组合物中，或者可以单独地施用于土壤、植物(或植物部分)和/或种子，例如与所公开的组合物顺序地、同时或基本上同时地施用。
[0113] 在特定实施方案中，将所述微生物组合物与液体肥料(例如含有可溶性氮的水溶液或悬浮液)组合。在一些示例中，所述液体肥料包含有机氮源，诸如尿素；或含氮无机盐，诸如氢氧化铵、硝酸铵、硫酸铵、焦磷酸铵、硫代硫酸铵，或它们的组合。氨水(20-24.6％的无水氨)也能用作可溶性氮。在一些示例中，将所述微生物聚生体或组合物在临用前或在使用前短时间(例如在使用前10分钟至24小时内，例如，使用前约30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时或24小时)内与所述液体肥料组合(例如，与所述液体肥料混合)。在其他示例中，将所述微生物聚生体或组合物在使用前至少24小时(诸如使用前24小时至6个月，例如至少36小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时、至少一周、至少两周、至少四周、至少八周或至少12周)与所述液体肥料组合(例如与所述液体肥料混合)。
[0114] 在一些示例中，计算待施用的所述组合物的量(例如，每英亩或公顷)，并将所述组合物在水(或在一些示例中，液体肥料)中稀释至足以喷洒或灌溉待处理区域的量(如果所述组合物是液体的话)。所述组合物能在下种时以0.5-2升/英亩(诸如0.5L/英亩、1L/英亩、1.5L/英亩或2L/英亩)的比率施用。所述微生物组合物也能在生长期间一次或多次以相同或不同的量施用于土壤(例如，植物根部附近)或植物。在其他示例中，所述组合物能与稀释的除草剂、杀虫剂、农药或植物生长调节化学品混合。如果待施用的组合物是固体(例如干制剂)，则所述固体能直接施用于土壤、植物或植物部分，或者能在使用前悬浮或溶解于水(或其他液体)中。
[0115] 取决于种植情况和农业实践，所公开的微生物组合物(单独或与本文所公开的其他组分组合)能在植物的不同发育阶段以多种方式递送。在一些示例中，将所公开的微生物组合物与液体肥料混合，并在下种时以0.5-2升/英亩(诸如0.5L/英亩、1L/英亩、1.5L/英亩、或2L/英亩)的比率施用，或者替代地单独施用。所述微生物组合物和液体肥料也能在生长期间一次或多次以相同或不同的量施用于土壤(例如，植物根部附近)或植物。在其他示例中，将所公开的微生物组合物与HYT B混合并稀释，并在下种时以0.5-2升/英亩(诸如0.5L/英亩、1L/英亩、1.5L/英亩、或2L/英亩)的比率施用，或者替代地单独施用。所述微生物组合物和HYT B也能在生长期间一次或多次以相同或不同的量施用于土壤(例如，植物根部附近)或植物。
[0116] 在其他示例中，将所公开的微生物组合物和另外的组分(诸如液体肥料、HYT B或其他组分)稀释，并当幼苗或移植苗正在生根时通过低浓度滴灌一起递送，以淹灌递送，或者作为稀释混合物与营养物一起以喷灌或滴灌在温室中分配到幼苗或已生根的植株，或者替代地单独施用。在另外的示例中，将所公开的微生物组合物加入到田间的其他土壤处理中，诸如加入到杀虫剂处理中，以使得能够易于使用。在其他示例中，诸如在温室中，将所公开的微生物组合物和HYT B单独地或一起使用，与液体肥料(诸如鱼肥)和其他营养物组合并在植物生长的过程中注入顶部水喷灌系统或滴灌管线中。在一个温室示例中，将所公开的微生物组合物和HYT B一起使用，例如稀释并在喷灌或加肥灌溉期间以0.25至1升的比率在幼苗萌发时施用，之后以加肥灌溉进行0.25至1升的中期生长循环，以及最后进行0.25至1升加肥灌溉5-10天以结束生长循环。
[0117] 在一些实施方案中，将所公开的微生物组合物和HYT B一起或单独地施用(例如顺序地施用)以促进作物的产量、活力、分型(typeness)、品质、根发育或胁迫耐受性。
[0118] 在所有作物中，HYT C可以在作物生根或种植时以约0.5-2kg/英亩(诸如约0.5kg/英亩、约1kg/英亩、约1.5kg/英亩、或约2kg/英亩)的比率加入到土壤中，例如与所公开的微生物组合物组合。在其他示例中，将HYT C加入到所公开的微生物组合物的滴灌溶液中，并将HYT B加入到含有所公开的微生物组合物和温室中(诸如上述示例中)的HYT B的施肥应用中。
[0119] 在另外的实施方案中，将HYT D(单独地或与本文所公开的微生物组合物或其他组分组合)以约1-20L/公顷(诸如约1-15L/公顷、约3-10L/公顷、或约3-5L/公顷)使用。在其他示例中，将HYT D(单独地或与本文所公开的微生物组合物或其他组分组合)用作种子处理以提高作物产量和性能(例如，约1-10L/kg种子，诸如约1-3L/kg、约3-5L/kg、或约5-10L/kg)。或者，HYT D能在土壤中(单独或与本文所公开的微生物组合物或其他组分组合)以约1-3L/公顷使用以增强植物生长，例如以帮助植物在胁迫条件下保持生产力。
[0120] 在一些示例中，用所公开的组合物处理土壤、种子、植物或植物部分使植物生长(诸如总植物大小、叶子数量、根数目、根直径、根长度、分蘖产生、果实产生、花粉产生和/或种子产生)增强至少约5％(例如，至少约10％、至少约30％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约2倍、至少约3倍、至少约5倍、至少约10倍或更多)。在其他示例中，与未处理的作物相比，所公开的方法导致作物产量增加约10-75％(诸如约20-60％或约30-50％)。其他作物性能的量度包括果实品质、产量、淀粉或固体含量、糖含量或白利糖度、果实或可收获产品的储存寿命、可销售产量或目标大小的产生、果实或产品的品质、草皮的分蘖量和抗脚踩性(resistance to foot traffic)、授粉和坐果、开花、开花数、花寿命、开花品质、生根和根质量、作物抗倒伏性、非生物热胁迫耐受性、非生物干旱胁迫耐受性、非生物寒冷胁迫耐受性和胁迫后的恢复、对贫瘠土壤的适应性、光合作用和绿变水平，以及植物健康。为了确定产品的功效，对照包括相同的农艺措施但不加入微生物，并行进行。
[0121] 所公开的方法和组合物能与任何作物结合使用(例如，用于直接作物处理或用于种植前或种植后的土壤处理)。典型的作物包括但不限于苜蓿、扁桃、香蕉、大麦、花椰菜、卷心菜、油菜、胡萝卜、柑橘果园果树(citrus and orchard tree crop)、玉米、棉花、黄瓜、花卉和观赏植物、大蒜、葡萄、啤酒花、园艺植物、韭菜、瓜、油棕、洋葱、花生和豆类、菠萝、杨树、松树和木材树木、土豆、覆盆子、稻、芝麻、高粱、大豆、南瓜、草莓、甘蔗、向日葵、番茄、草皮草和牧草、西瓜、小麦和桉树。V.实施例
[0122] 提供以下实施例以说明某些具体特征和/或实施方案。这些实施例不应被解释为将本公开限制于所描述的特定特征或实施方案。
[0123] 实施例1
[0124] 微生物的分离和鉴定
[0125] 该实施例描述了微生物的分离、鉴定和表征。
[0126] 微生物的分离：将HYT A(Agrinos AS；50mL至5L)的样品在室温下避光储存。在从选定的HYT A批次取样之前，将相应的容器剧烈混合以确保内容物均匀分布，因为沉降通常随时间推移发生。通常，保留1-10mL等分试样以用于微生物分离目的。在固氮菌的情况下，从土壤样品(在N 38°32′49.55″，W 121°44′13.54″处获得)进行分离。
[0127] 通过涂布平板进行分离：从保留的HYTA等分试样无菌地收集0.1mL并在培养管中与9.9mL无菌水或蛋白胨水混合((10-2稀释)。然后将管涡旋振荡(例如，以2,000rpm进行60秒)，并在水或蛋白胨水中制备10倍连续稀释液(至多1∶109稀释度)。随后使用无菌L形涂布器将一百微升的每种稀释液涂布在100mm Petri平皿中的半固体培养基上。使用含有标准方法琼脂(SMA；BD#247940)、营养琼脂(NA；BD#213000)或其他选择生长培养基(表1)的平板。然后将接种的平板在温控室中于22℃至35℃下孵育。为了分离厌氧微生物，首先将板置TM于厌氧箱(例如，BD GasPak EZ容器系统，BD Diagnostics)中，然后在所需温度下孵育。
[0128] 表1.用于从HYTA中分离微生物的半固体培养基
[0129]
[0130] *NA：营养琼脂(BD#213000)；SMA：标准方法琼脂(BD#247940)；YPD：酵母蛋白胨葡萄糖(BD#242720)；AMA：固氮菌培养基琼脂(HIMEDIA#M372)；AMAG：补充有10g/L葡萄糖的固氮菌培养基琼脂(HIMEDIA#M371)；RCM：加强梭菌培养基(BD#218081)；RMA：根瘤菌培养基琼脂(HIMEDIA#M408)；PA：Pikovskaya培养基(HIMEDIA#M520)；MRS：乳杆菌MRS(BD#288210)。
[0131] 从土壤样品中分离微生物：向30-50克土壤中加入1％w/w甘露醇或蔗糖，然后每10g土壤加入2mL无菌水。在无菌研钵中，将所得泥浆捏合以产生均匀的糊状物。随后将糊状物转移到Petri培养皿中并在27-30℃下在加湿室中孵育长达1周。随后将形成在土壤糊状物表面上的粘性物质样品转移到新鲜且无菌的半固体无氮培养基中(关于培养基组成参见实施例3)。如下所述，通过传代培养使所得微生物生长变成生物纯的。
[0132] 生物纯的微生物分离株的制备：孵育后，分析平板的微生物生长。基于在半固体培养基上生长的菌落的传统宏观和微观特征来选择微生物菌株用于进一步研究(Bergey’s Manual of Systematics of Archaea and Bacteria；William B.Whitman编辑)。考虑了诸如菌落颜色、密度或形态(例如，形式、高度和边缘)的标准。为了在固体培养基上获得良好分离的菌落，使用“划线”技术。简言之，将所选择的微生物菌落在新鲜的新固体培养基上划线并使其生长直至出现良好分化的菌落。如果需要的话，进行多次传代培养直至获得生物纯的微生物菌落；这些微生物菌落被称为“分离株”。然后对所述分离株进行另外的测试以研究细菌的细胞形态。还使用鉴别革兰氏染色来开始将分离株分类成适当的最可能的属。
[0133] 微生物基因组DNA提取：从优化的液体肉汤和培养条件中生长和收获不同物种的细菌细胞。使用PowerSoil DNA分离试剂盒(MoBio，产品目录号12888)进行小规模的基因组DNA制备。对于大规模基因组DNA提取，使用GenElute Bacterial Genomic DNA试剂盒(Sigma，产品目录号NA2110)或Qiagen Genomic DNA Buffer Set和Genomic-tip 500/G(Qiagen，产品目录号19060和10262)，按照由制造商推荐的方法来制备细胞裂解物。然后将基因组DNA用等体积的异丙醇沉淀，用70％的乙醇洗涤，风干并重悬于TE缓冲液中。
[0134] 对16S进行扩增和测序以进行分类确认：直接地使用基因组DNA和/或菌落作为PCR模板从不同细菌物种扩增全长16S基因。按照略有修改的Singer等人(2016)的方法设计正向引物(27F，5’-AGRGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；SEQ ID NO：1)和反向引物(1492R，5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；SEQ ID NO：2)。使用所述正向和反向PCR引物直接对PCR产物进行测序。对NCBI核苷酸集合(nr/nt)数据库进行BLAST搜索以得到高质量序列轨迹，以进行分类学确认。获得的全长16S rDNA序列在本文中提供为SEQ ID NO：3-24。
[0135] 全基因组测序(WGS)：使用PacBio RSII系统(Pacific Biosciences Menlo Park，CA USA)按照制造商推荐的序列文库制备和测序方法来对生物纯的分离株进行全基因组测序。从微生物分离株平均产生73,000个平均长度为24kb的读段。使用Hierarchical Genome Assembly Process(HGAP，Pacific Biosciences，Menlo Park，CA USA)进行从头基因组装配。
[0136] 全基因组比对：具有完全测序的基因组的命名细菌物种的数量在过去几年中迅速增长，但与16S rRNA序列的数量相比仍然很少。然而，当参照基因组可用时，进行全基因组比对是确认物种，或甚至是菌株水平匹配的最明确方法之一。为此，从RefSeq下载高品质的微生物基因组，并使用MUMmer与分离株的全基因组序列进行比对(Delcher等人，Nucl.Acids Res.30：2478-2483，2002；Kurtz等人，Genome Biol.5：R12，2004)，MUMmer鉴别非常长的序列之间的最大唯一匹配(MUM)。
[0137] 16S rRNA基因和保守系统发生标记基因(pMGS)的鉴定和分类：使用Barrnap程序(Seemann，2014)在从头基因组装配中鉴定核糖体RNA (rRNA)基因，Barrnap程序是与HMMer 3.1一起包含的用于NHMMer工具的包装器(Wheeler和Eddy，2013)。然后使用核糖体数据库项目(RDP)朴素贝叶斯分类器对16S rRNA序列进行分类，以及使用BLASTn进行双序列比对(Camacho等人，BMC Bioinformatics 10：421，2009；Cole等人，Nucleic Acids Research
42(D1)：633-642，2014)。
42(D1)：633-642，2014)。
[0138] 随着具有测序基因组的生物数量的增长，利用这些数据进行更特定的系统分类已经变得越来越普遍。specI数据库含有40个保守系统发生标记基因(pMG)的序列，所述pMG选自COG(保守的直系同源组)数据库(Tatsuov等人，Science 278：631-637，1997)。它们中大多数与遗传信息加工有关。在specI数据库中存在数千细菌物种的序列(Mende等人，Nature Methods 10：881-884，2013)。因此，使用Prodigal(v2.6.2)在所装配的每个微生物分离株的基因组序列内鉴定蛋白质编码基因(Hyatt等人，BMC Bioinformatics 11：119，2010)，Prodigal利用与美国能源部联合基因组研究所(JGI)的基因组审编专家合作开发的启发性阈值。通过与specI(v1.0)一起包括的FetchMG程序来注释通过Prodigal鉴定的翻译编码序列，FetchMG程序使用一组经验确定的截止值来鉴定给定蛋白质组中属于每个pMG COG的序列。然后，使用BLASTn将翻译序列通过FetchMG鉴定为属于40种specI pMG中的一者的编码基因与来自specI数据库中的未翻译参照pMG进行比对。
[0139] 微生物分离株的系统分类：传统上，鉴定物种水平的微生物通常是基于单一通用标记基因(16S rRNA基因)来决定的(参见例如Stackebrandt等人，Int.J.Syst.Bacteriol.44：846-849，1994；Janda等人，J.Clin.Microbiol.45：2761-2764，
2007)。然而，微生物学界已经注意到，全基因组信息已经变得可用的微生物的身份并不总是与通过在下一代高通量测序出现之前常用的方法确定的身份相关。此外，全基因组信息不适用于每种微生物，并且大量捕获微生物遗传全景(genetic landscape)的数据库未经验证/存储。因此，将物种/菌株分配给新的微生物分离株是一项挑战。
2007)。然而，微生物学界已经注意到，全基因组信息已经变得可用的微生物的身份并不总是与通过在下一代高通量测序出现之前常用的方法确定的身份相关。此外，全基因组信息不适用于每种微生物，并且大量捕获微生物遗传全景(genetic landscape)的数据库未经验证/存储。因此，将物种/菌株分配给新的微生物分离株是一项挑战。
[0140] 考虑到上述分类鉴定限制，本文描述的每种微生物分离株的物种分配所采用的方法是多管齐下的方法。产生每种分离株的遗传信息(诸如全基因组测序)、40种保守系统发生标记基因的分析和16S rRNA基因分析。提供分类鉴定服务的两个第三方实验室是独立签约的，以根据它们专有的数据库和算法来提供属和物种鉴定。此外，在以下三个独立的数据库中进行每种微生物的全长16S rRNA基因的序列同源性搜索：Greengenes数据库(DeSantis等人，Appl.Environ.Microbiol.72：5069-5072，2006)、EZTaxon数据库(Kim等人，Int.J.Syst.Evol.Microbiol.62：716-721，2012)和国家生物技术信息中心数据库(U.S.National Library of Medicine，Bethesda，MD)。
[0141] 如果至少三个或更多个数据库搜索(包括上面列出的第三方专有数据库和公共数据库)和鉴定服务返回相同的物种分配，则为每种分离株分配物种。对于至少三种分离株，数据库搜索在至少三个数据库中没有返回相同的物种分配。在这些情况下，根据最佳判断进行分配(芽孢杆菌属、假单胞菌属和灿烂类芽孢杆菌)。
[0142] 基于上述，微生物鉴定进行如下：
[0143] ·德氏乳杆菌。所有分析的结果强烈支持将该分离株鉴定为德氏乳杆菌亚种保加利亚乳杆菌ND02.
[0144] ·嗜盐枝芽孢杆菌。16S BLASTn的结果表明，该分离株可能是嗜盐枝芽孢杆菌的菌株，虽然这由于缺乏合适的参考序列而不能通过任何其他方法确认。该16S BLASTn结果与根据朴素贝叶斯分类器(NBC)的属水平分配一致，但不足以单独确认物种水平的分类。
[0145] ·棕色固氮菌。该分离株似乎是棕色固氮菌的新型菌株。这得到了16S rRNA和其他系统发生标记基因的分析，以及两个最接近的候选菌株的全基因组比对的支持。在全基因组比对中观察到的大量的小差异和大差异，以及16S与编码序列之间的大量小差异，表明这可能是一种新型菌株，甚至可能是一种新型物种，但是这种分离株与棕色固氮菌的关系明显比与任何所述数据库中所包含的任何其他物种的关系更密切。
[0146] ·巴氏梭菌。16S分析和全基因组比对支持将该分离株鉴定为巴氏梭菌的新型菌株。specI数据库不含有巴氏梭菌的任何参考序列，但是specI结果确实提供了对属水平的进一步支持。
[0147] ·千叶类芽孢杆菌。该分离株的阳性鉴定最有力的证据是来自RDP NBC的属水平分类，所述属水平分类将该分离株分配为概率为1.0的类芽孢杆菌。16S和specI BLASTn结果都支持此分配。在RefSeq中找不到密切匹配的参照基因组，但是在类芽孢杆菌属Y412MC10的基因组装配与参考序列之间观察到了持续的同线性。可用数据库中的全长16S rRNA基因序列比对目前表明该分离株属于千叶类芽孢杆菌。
[0148] ·灰色链霉菌。该分离株明显是与NBRC 13350极其密切相关的灰色链霉菌的菌株。这得到了16S rRNA和其他系统发生标记基因的分析，以及两个最接近的候选菌株的全基因组比对的支持。然而，全基因组比对确实揭示了分散在整个基因组中的许多差异，表明该分离株应分类为单独的菌株。
[0149] ·假单胞菌属。很明显的是，这种分离株属于假单胞菌属，并且它与嗜虫假单胞菌非常密切相关，但它与菌株L48不完全匹配，菌株L48是唯一具有可用参照基因组的嗜虫假单胞菌菌株。该分离株也与恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌密切相关。
[0150] ·恶臭假单胞菌。一些分析的结果支持将该分离株鉴定为恶臭假单胞菌。虽然该分离株似乎与菌株恶臭假单胞菌NBRC 14164(最佳可用参照物)极其密切相关，但全基因组分析显示整个基因组中存在许多小差异，表明该分离株应分类为单独的菌株。
[0151] ·小鳟鱼大洋芽孢杆菌。16S分析和全基因组比对支持将该分离株鉴定为小鳟鱼大洋芽孢杆菌的新型菌株。specI数据库不含有小鳟鱼大洋芽孢杆菌的任何参考序列，但是specI结果确实提供了对属水平的进一步支持。
[0152] ·灿烂类芽孢杆菌。所有分析的结果强烈支持将该分离株鉴定为与良好表征的sp.Y412MC10密切相关但不完全相同的类芽孢杆菌菌株。考虑到沿着与sp.Y412MC10的完整全基因组比对的小差异的高密度，在sp.Y412MC10标记基因的双序列比对中观察到的许多小差异，以及观察到与来自sp.HGF5的序列的类似良好比对，以及类芽孢杆菌属Y412MC10尚未正式命名的事实。可用数据库中的全长16S rRNA基因序列比对目前表明该分离株属于灿烂类芽孢杆菌物种。
[0153] ·地衣芽孢杆菌。所有分析的结果强烈支持将该分离株鉴定为地衣芽孢杆菌DSM13＝ATCC 14580，可能一直下降到菌株水平。然而，这种分离株可能是基于相当大的重排和由全基因组比对揭示的其他小差异，以及在16S和specI结果中观察到的点突变的独特的菌株，但是很少观察到两个基因组之间的这种高度序列相同性，甚至是来自同一物种时也如此。
[0154] ·酒乳杆菌。Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology不包含关于运动乳杆菌(Lactobacillus mobilis)，或潜在相反特异(contra specific)和同样不良表征的酒乳杆菌的任何进一步的信息(Passoth等人，Microbiology 73：4354-4356，2007)。相对于唯一可用的酒乳杆菌参考基因的全基因组比对显示了大量同源区域，但是参考序列的极度片段化使得难以评估它们中的任一者与该分离株之间的关系。可用数据库中的全长16S rRNA基因序列比对目前表明该分离株属于酒乳杆菌物种。
[0155] ·库氏类芽孢杆菌。该分离株的阳性鉴定最有力的证据是来自RDP NBC的属水平分类，所述属水平分类将该分离株分配为概率为1.0的类芽孢杆菌。16S和specI BLASTn结果都支持此分配。在RefSeq中找不到密切匹配的参照基因组，但是在类芽孢杆菌属Y412MC10的分离株装配与参考序列之间观察到了持续的同线性。可用数据库中的全长16S rRNA基因序列比对目前表明该分离株属于库氏类芽孢杆菌物种。
[0156] ·布氏乳杆菌。所有分析的结果强烈支持将该分离株鉴定为布氏乳杆菌，但是specI结果不支持16S分析和全基因组比对，大概是因为数据库缺乏必要的参考序列。虽然该样品似乎与菌株布氏乳杆菌CD034(最佳可用参考)极其密切相关，但是全基因组分析仍显示包括两个大缺失在内的数十个差异，表明该分离株应分类为单独的菌株。
[0157] ·巨大芽孢杆菌。所有分析的结果强烈支持将该分离株鉴定为巨大芽孢杆菌。虽然该分离株似乎与菌株巨大芽孢杆菌DSM319(最佳可用参照物)极其密切相关，但全基因组分析显示整个基因组中存在许多小差异，表明该分离株应分类为单独的菌株。
[0158] ·巴氏醋杆菌。所有分析的结果强烈支持将该分离株鉴定为巴氏醋杆菌。虽然该分离株似乎与菌株巴氏醋杆菌IFO 3283菌株(最佳可用参照物)极其密切相关，但全基因组分析显示整个基因组中存在许多小差异，甚至对于最密切的匹配也如此，表明该分离株应分类为单独的菌株。
[0159] ·拜氏梭菌。所有分析的结果强烈支持将该分离株鉴定为拜氏梭菌。虽然它似乎与菌株拜氏梭菌NCIMB 8052(最佳可用参照物)极其密切相关，但全基因组分析显示整个基因组中存在许多小差异，表明该分离株应分类为单独的菌株。
[0160] ·干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌。所有分析的结果强烈支持将该分离株鉴定为干酪乳杆菌或副干酪乳杆菌。虽然来自所有分析的最佳匹配一致地来自这两个重叠物种的成员，但所有分析都揭示了跨越基因组整个长度的许多小差异，表明该分离株应分类为单独的菌株。
[0161] ·弯曲芽孢杆菌。该分离株的阳性鉴定最有力的证据是来自RDP NBC的属水平分类，所述属水平分类将该分离株分配为概率为1.0的芽孢杆菌。16S和specI BLASTn结果以及MUMmer全基因组比对均支持将该分配下降至属水平。可用数据库中的全长16S rRNA基因序列比对目前表明该分离株属于弯曲芽孢杆菌物种。
[0162] ·芽孢杆菌属。16S分析强烈支持将该分离株鉴定为芽孢杆菌菌株，但所述分析中没有一项分析能够将其肯定地分配给命名物种。16S BLASTn结果表明它可能是科赫芽孢杆菌，但可用数据库中缺乏全基因组序列阻止了这一点的确认。
[0163] ·枯草芽孢杆菌。所有分析的结果强烈支持将该分离株鉴定为枯草芽孢杆菌。该属和物种的分类和命名法非常复杂，但是所有分析的结果压倒性地由已经正式分类为枯草芽孢杆菌的菌株所主导。尽管有大量的序列数据和许多与单个基因的完全匹配，但是无法鉴定出完全的全基因组匹配，强烈表明该分离株是枯草芽孢杆菌的新型菌株。
[0164] ·解淀粉芽孢杆菌。所有分析的结果强烈支持鉴定为解淀粉芽孢杆菌亚种植物乳杆菌(plantarum)，但是这一物种的分类目前相当复杂。解淀粉芽孢杆菌亚种植物乳杆菌最近被重命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)(Dunlap等人，Iut.J.System.Evol.Microbiol.65：2104-2109，2015；Dunlap等人，
Iut.J.System.Evol.Microbiol.66：1212-1217，2015)。这些变化导致了RefSeq中的部分重新分类和重新分组，但是在specI和RDP数据库中的序列标识符仍然指代解淀粉芽孢杆菌亚种植物乳杆菌。
Iut.J.System.Evol.Microbiol.66：1212-1217，2015)。这些变化导致了RefSeq中的部分重新分类和重新分组，但是在specI和RDP数据库中的序列标识符仍然指代解淀粉芽孢杆菌亚种植物乳杆菌。
[0165] 实施例2
[0166] 微生物的单独生长和共培养
[0167] 生长培养基制备：使用现成的盐和试剂制备所测试的生长培养基。将液体培养基通过在121℃、15psi高压灭菌至少30分钟或通过滤过0.45μm滤膜来灭菌。
[0168] 对单一培养物中的单独菌株生长动态的研究：分析了每种生物纯的微生物分离株的生长速率。从主平板开始，制备每种分离株的至多3mL液体培养物。每种分离株在30℃下生长1-3天，以获得在对数状态下具有足够密度的培养物。然后将每种分离株以～0.05的光密度(OD600)传代培养到含有1mL生长培养基(参见下文)的24孔微量滴定板中。使用Cytation 5成像读数器(BioTek，Winooski，VT USA)，在30℃的好氧条件下实时(每30秒)记录每种分离株的生长曲线达1周的时段。使用无菌培养基作为阴性对照。
[0169] 在发酵实验中共培养微生物
[0170] 连续搅拌的生物反应器：在具有1.5升工作体积的2升DASGIP生物反应器(EppendorfNorth America Hauppauge，NY)中进行发酵。通过在121℃、15psi下高压灭菌一小时来对容器进行灭菌。将除PBS之外的生长培养基与容器一起灭菌，将PBS单独灭菌并在接种前无菌地加入生物反应器中。使用聚丙二醇2000作为泡沫控制剂。将所述泡沫控制剂在接种前以0.07v/v％的浓度无菌地加入到生物反应器中。将容器直接从解冻的工作细胞库小瓶以0.1-0.4v/v％的接种体积接种。将发酵温度控制在30℃。取决于发酵而有时控制溶氧浓度，有时不控制溶氧浓度。当控制时，溶氧设定点在空气饱和度的1-25％的范围内。
使用级联搅动来实现溶氧控制，然后使空气流动以维持设定点。当不使用溶氧控制时，将搅动固定于在200与800rpm之间的值，并将空气流速固定于在0.1与0.5vvm之间的值。类似地，有时控制发酵液的pH，有时不控制发酵液的pH。当控制时，pH设定点在6.3至6.9的范围内。
pH滴定剂为20w/w％的KOH和13.8w/w％的H3PO4。每天用离线pH计检查发酵液的pH，以校正生物反应器pH探针中的任何漂变。
使用级联搅动来实现溶氧控制，然后使空气流动以维持设定点。当不使用溶氧控制时，将搅动固定于在200与800rpm之间的值，并将空气流速固定于在0.1与0.5vvm之间的值。类似地，有时控制发酵液的pH，有时不控制发酵液的pH。当控制时，pH设定点在6.3至6.9的范围内。
pH滴定剂为20w/w％的KOH和13.8w/w％的H3PO4。每天用离线pH计检查发酵液的pH，以校正生物反应器pH探针中的任何漂变。
[0171] 旋转瓶生物反应器：将微生物接种物与含有水中的5.5％w/w乳清蛋白和1.2％w/w酸乳的悬浮液(“C vat”)和含有水中的0.1％w/w螺旋藻和0.1％w/w昆布提取物的悬浮液(“A vat”)混合。将A vat悬浮液和C vat悬浮液各自在与种菌培养物混合之前3天单独制备，并在环境温度下孵育。将种菌培养物、C vat和A vat以约81∶9∶9的比例混合。混合后，将含有约70％v/v糖蜜、0.5％v/v HYT B、0.003％w/v阿拉伯胶和0.02％w/v啤酒酵母(酿酒酵母)的另外的组分的悬浮液与种菌培养物、C vat和Avat的混合物，以及另外的水以约16∶34∶50的比率混合。将混合物在环境温度(约19-35℃)下发酵约7天。7天后，每隔一天将烧瓶(1.7L)充气30分钟。加入另外的水(另外约10％v/v)，并在相同条件下继续发酵另外约10天。加入另外的水(另外约4％v/v)，并继续发酵另外约7天，此时收集样品进行分析。
[0172] 微生物种群分析-液滴数字PCR：液滴数字PCR(ddPCR)系统提供对靶生物存在的检测和绝对定量(Dreo等人，Anal.Bioanal.Chem.406：6513-6528，2014；Yin等人，Journal ofMicrobiological Methods 65：21-31，2006)。使用来自16S基因的独特序列和/或从WGS基因组装配鉴定的独特编码基因序列来设计在实施例1中鉴定的22种细菌物种的特异性引物(表2和表3)。根据制造商推荐的QX200液滴数字PCR系统(BioRAD，Hercules CA USA)使用EvaGreen Supermix或Supermix For探针(BioRAD，Hercules CA USA)进行ddPCR，并然后在QuantaSoft(BioRAD，Hercules CA USA)中分析ddPCR数据。
[0173] 表2.用于ddPCR EvaGreen Supermix方法的正向引物和反向引物
[0174]
[0175]
[0176] 表3用于探针方法的ddPCR Supermix的寡核苷酸
[0177]
[0178]
[0179] 单一培养物的培养基开发：所述微生物中的每种微生物在各种培养基上分离。我们分析了一种培养基配方是否足以用于所有22种分离株的生长。
[0180] 首先在单独的糖蜜上测试所有22种分离株的生长。我们发现22种菌株中有5种菌株表现出可检测的生长。然后优化培养基的配方以包括必需元素，诸如磷酸盐、钠、钾和氯化物(以市售磷酸盐缓冲盐水的形式)。这导致另外6种分离株的生长。然后加入酶法产生的食品级乳清粉和非转基因(non-GMO)大豆提取物(Ferti-Nitro Plus Plant N；Ferti-Organic，Brownsville，TXUSA)形式的氨基酸、氮和肽/蛋白质的来源。除芽孢杆菌属外，单独的乳清没有显著改善大多数分离株的生长性能。单独的Ferti-Nitro Plus Plant N似乎刺激了大量微生物的生长。乳清蛋白和Ferti-Nitro Plus Plant N一起似乎有适度的协同效应，进一步刺激了巴氏醋杆菌、小鳟鱼大洋芽孢杆菌、巴氏梭菌、德氏乳杆菌和嗜盐枝芽孢杆菌的生长。结果汇总在表4中。
[0181] 表4.对PBS/糖蜜培养基中的单个微生物的生长性能评估
[0182]
[0183] (-)：没有检测到生长；(+)：低生长；(++)：适度生长；(+++)：稳健生长。
[0184] (*)在厌氧条件下生长的分离株。
[0185] 在其他实验中，探索了支持两种分离株(巴氏梭菌和棕色固氮菌)的生长的培养基。此外，这旨在开发这样的培养基，所述培养基改善一些分离株(诸如小鳟鱼大洋芽孢杆菌和嗜盐枝芽孢杆菌、德氏乳杆菌和酒乳杆菌)的生长，这些分离株在上述培养基中没有显示出稳健的生长。
[0186] 使用关于每种分离株的最佳生长条件的信息(Bergey′s Manual of Systematics of Archaea and Bacteria；William B.Whitman编辑)、上述数据、关于细菌元素组成的公开可用信息(Rittmann和McCarty；Environmental Biotechnology：Principles and Applications；2001 ISBN 0072345535)、以及推荐的固氮菌生长培养基(1713改良的固氮菌培养基I；ATCC)，在单一培养中测试多种培养基配方的22种微生物分离株生长。结果汇总在表5中。
[0187] 在这些实验中，将磷酸钾作为元素磷和元素钾的来源与不同浓度的氯化钠(以满足嗜盐微生物如小鳟鱼大洋芽孢杆菌和嗜盐枝芽孢杆菌的要求)以及对作为(但不限于)氨基酸和氮的来源的乳清和Ferti-Nitro plus Plant N的需要一起进行测试。如下所述，除糖蜜外，还在设计的盐混合物中补充微量元素。
[0188] 表5.对AAM01/糖蜜培养基中单个微生物的生长性能评价
[0189]
[0190]
[0191] (**)AAM01(Agrinos固氮菌培养基01)由硫酸亚铁(0.12g/L)；硫酸镁(0.3g/L)；氯化钙(0.1g/L)；氯化锰(0.001g/L)、钼酸钠(0.001 g/L)；柠檬酸硫酸钾(0.12g/L)组成。
[0192] (*)在厌氧条件下生长的分离株。
[0193] (-)：没有检测到生长；(+)：低生长；(++)：适度生长；(+++)：稳健生长
[0194] 在这些实验中，棕色固氮菌和巴氏梭菌表现良好。许多其他分离株也成功生长，然而与先前的配方(例如，PBS/糖蜜)不同，并非所有菌株在一种培养基中一致地生长。
[0195] 在其他实验中，在包含酵母粉(0.021g/L；YP)、阿拉伯胶(0.028g/L；AG)、黑糖蜜、乳清粉(1.56g/L；WP)、螺旋藻(0.029g/L，SP)、昆布提取物(0.029g/L；KE)和0.8％w/v NaCl(因为有证据表明分离株如小鳟鱼大洋芽孢杆菌和嗜盐枝芽孢杆菌等在这种盐的存在下生长得更好)的培养基中评估单个微生物分离株的生长。该培养基在本文中称为“提取”培养基。如上所述，使用ddPCR随时间监测微生物组合物。将检测到的微生物评分为(+)。低于ddPCR方法的检测限(BDL)的微生物被如此评分。该实验的结果汇总在表6中。
[0196] 表6.对提取培养基中单个微生物的生长性能评价
[0197]
[0198]
[0199] *在厌氧条件下生长
[0200] 用两种培养基配方研究了小规模生物反应器中的发酵性能。第一种培养基由糖蜜、PBS、乳清蛋白和Ferti-Nitro Plus Plant N组成(表4)。与基于固氮菌的实验室规模发酵中使用的化学品的培养基(诸如AAM01)不同，不存在具有潜在安全性问题的盐。用于微生物生长的最佳培养基的许多研究级配方推荐使用微量金属，诸如硒和钼(其是有效的酶辅助因子，尤其是对于固氮酶)。由糖蜜和其他天然提取物组成的提取物培养基(表6)与目前使用的培养基高度相似。
[0201] 小规模发酵实验中的共培养：为了评估支持所有22种微生物菌株的共培养的发酵条件，使用实验室规模的发酵罐。在接种后4-28天，分析所得发酵产物中每种微生物的存在和丰度。使用两种类型的发酵生物反应器构造。
[0202] 连续搅拌釜式反应器：第一种生物反应器构造是连续搅拌釜式反应器(CSTR)。向含有1.5L培养基的两升DASGIP生物反应器中接种22OD的微生物(每种单个菌株1 OD)。这些实验中使用的培养基是基于来自表3的结果，并且含有以下成分：磷酸盐缓冲盐水(1x)、黑糖蜜(2-10％w/v)、乳清蛋白(0.1-0.5％w/v)、Ferti-Nitro Plus Plant N(0.25-1.25％w/v)，含有或不含昆布提取物(0.0067％)、酵母粉(0.0033％w/v)和螺旋藻(0.0067％w/v)。在这些实验中，气体组成(5％至21％的O2；95％至79％的N2)、气体流速(5至45标准升/小时)、pH(6.3至6.7)、搅动(200-1100rpm)、和溶氧(无控制到25％)是变化的。将温度保持恒定在30℃。如上所述，使用ddPCR以及菌株特异性探针确定发酵运行结束时微生物组合物的定量和分析。将检测到的微生物评分为(+)。低于ddPCR方法的检测限(BDL)的微生物被如此评分，结果的示例示于表7中。
[0203] 表7.在使用1.5L CSTR的共培养发酵中的总体微生物特征。
[0204]
[0205] (*)BDL：低于检测限
[0206] 在其他实验中，测试在包含所有22种菌株(参见上文)的共培养实验中未检测到的微生物以确定它们是否能一起生长。为此，测试了所述微生物的接种的顺序(全部一起相对于首先厌氧菌相对于首先好氧菌)以及接种时和发酵过程中的溶氧水平以及培养基组成的影响。通过使用流量和/或搅动速率使气体质量传递发生变化来控制溶氧水平。表8汇总了拜氏梭菌(严格厌氧菌)、灰色链霉菌和弯曲芽孢杆菌(严格好氧菌)的共培养的结果。如在先前的实验中，通过ddPCR进行微生物生长的检测和评估。
[0207] 表8.对拜氏梭菌、灰色链霉菌和弯曲芽孢杆菌共培养实验中的实验设计和微生物特征的概述
[0208]
[0209] 旋转瓶生物反应器：将含有所有22种微生物的接种物在提取培养基中稀释，并如上所述在旋转瓶中进行糖蜜发酵。使用ddPCR随时间监测微生物组合物。将检测到的微生物评分为(+)。低于ddPCR方法的检测限(BDL)的微生物被如此评分。该实验的结果汇总在表9中。
[0210] 表9.对在28天时段的旋转烧瓶中22种微生物的共培养实验中的微生物特征的概述
[0211]
[0212]
[0213] 商业规模发酵罐中的共培养：基于最佳共培养的细菌需求和所需的最终微生物聚生体品质(通过ddPCR评估)，将来自上述组的好氧细菌和/或厌氧细菌接种到高达300L规模的发酵罐中。每种菌株的最终接种OD600经计算在6.67E-05至6.67E-04之间。发酵培养基包含糖蜜、乳清蛋白、昆布提取物、酵母粉、螺旋藻、阿拉伯胶和氯化钠。分别使用氢氧化铵和磷酸作为碱溶液和酸溶液以将pH保持在pH 5.2与7.2之间。将温度控制在28℃与35℃之间，并且使溶氧在发酵时长(长达3天)期间保持在0％与25％之间。发酵产物中的平均微生物组成汇总在表10中。
[0214] 表10：发酵产物中的平均微生物组成
[0215]
[0216]
[0217] n＝16，厌氧；n＝10，好氧
[0218] BDL-低于检测限
[0219] 通过在好氧和厌氧条件下涂布平板来分析可行的微生物负载。使用涂布平板方法进行微生物计数分析以确定样品中的菌落形成单位(CFU)。所有样品在室温下储存于避光且气密的容器中。在剧烈混合样品以确保内容物均匀分散后，保留1mL。从该等分试样无菌地收集0.1mL，并在培养管中与9.9mL无菌水混合(10-2稀释)。然后将管涡旋振荡(例如，以2000rpm进行60秒)，并在水中制备10倍连续稀释液(至多1∶109稀释)。随后使用无菌L形涂布器将一百微升的每种稀释液涂布在100mm Petri平板中的半固体培养基上。使用含有工业标准培养基诸如标准方法琼脂(SMA；BD#247940)、营养琼脂(NA；BD#213000)的平板。然后将接种的平板在温控室中于22℃至35℃下孵育。为了评估厌氧微生物计数，首先将板置于厌氧箱(例如，BD GasPakTM EZ容器系统，BD Diagnostics)中，然后在所需温度下孵育。在一些情况下，在进行如上所述的连续稀释和平板涂布之前，首先将待测试的等分试样在无菌蛋白胨水中在高达35℃的温度下孵育长达3天的时段。孵育后，使用菌落计数器(诸如暗视野菌落计数器(Reichert))以CFU/mL计算所选平板上的所有菌落。在好氧和
厌氧条件下，平板涂布显示为高达1.1E+09 CFU/mL。
厌氧条件下，平板涂布显示为高达1.1E+09 CFU/mL。
[0220] 实施例3
[0221] 微生物代谢活性潜力的鉴定
[0222] 耐盐性测定：微生物聚生体中的所有菌株在实验室级酵母蛋白胨葡萄糖培养基(YPD，Difco 242820)中表现出可接受的生长。因此，使用该培养基，用至多5％w/v的可变量的氯化钠(耐盐性测试的标准品)来确定每种分离株的耐盐性。将每种分离株在2ml培养基中于以下理想生长条件下培养：对于需氧菌在30℃下进行搅动(125-175rpm)，而对于厌氧菌在厌氧室(BD diagnostics)中于35℃下不进行搅动。在24、48和72小时处，基于与MacFarland标准的一般等同性，记录每种培养物的生长(可在万维网上的pro-lab.com/inserts/McFarland.pdf处获得)。将在72小时处显示出在5％NaCl下生长的任何分离株记录为具有≥5％的NaCl耐受性，在2.5％NaCl下生长的任何分离株记录为具有≥2.5％的NaCl耐受性，等等。
[0223] 氮(N)固定测试：制备含有5.0g/L的蔗糖、0.2g/L的MgSO4；0.8g/L的KH2PO4；0.04g/L的FeSO4；0.005g/L的Na2MoO4；2g/L的CaCO3和15g/L的琼脂的无氮半固体培养基，并通过高压灭菌进行灭菌。从主培养平板中将每种分离株的单个菌落无菌地转移至无N平板。使用划线方法，将菌落涂布到新鲜的无N平板上。生长条件基于分离株而变化：厌氧/微需氧细菌在35℃下在厌氧室中孵育，而需氧细菌在30℃下孵育。在进行生长评分之前，将孵育时间延长至1周。仅强氮固定菌(例如，稳健生长)被评定为阳性。
[0224] 钙盐增溶测定：制备含有0.3/L的MgSO4；01.g/L的CaCl2；0.12g/L的FeSO4；1g/L的K2SO4；20g/L的蔗糖；0.01g/L的Na2MoO4；0.01g/L的MnCl2；5g/L的酵母提取物；10g/L的蛋白胨；2g/L的CaCO3；15g/L的琼脂的碳酸钙半固体培养基，并通过高压灭菌进行灭菌。从主培养平板中将每种分离株的单个菌落无菌地转移至碳酸盐平板。在平板的中间划下单个划线。生长条件基于分离株而变化：厌氧/微需氧细菌在35℃下在厌氧室中孵育，而需氧细菌在30℃下孵育。在对细菌附近的清除区域进行评分之前，将孵育时间延长至1周。只有明显的CaCO3沉淀物清除才被评分为阳性。
[0225] 磷酸盐增溶测定：制备含有0.3g/L的MgSO4；01.g/L的CaCl2；0.12g/L的FeSO4；1g/L的K2SO4；20g/L的蔗糖；0.01g/L的Na2MoO4；0.01g/L的MnCl2；5g/L的酵母提取物；10g/L的蛋白胨；5g/L的Ca3(PO4)2；15g/L的琼脂的磷酸钙半固体培养基，并通过高压灭菌进行灭菌。从主培养平板中将每种分离株的单个菌落无菌地转移至碳酸盐平板。在平板的中间划下单个划线。生长条件基于分离株而变化：厌氧/微需氧细菌在35℃下在厌氧室中孵育，而需氧细菌在30℃下孵育。在对细菌附近的清除区域进行评分之前，将孵育时间延长至1周。只有明显的磷酸钙沉淀物清除才被评分为阳性。
[0226] 锌盐增溶测定：为了测试菌株使锌增溶的能力，在测定中使用以下四种类型的锌：Zn5(CO3)2(OH)6(碳酸锌氢氧化物)、Zn3(PO4)2(磷酸锌)、ZnO(氧化锌)和ZnSO4(硫酸锌)。然后将每种类型的锌以0.2％(w/v)加入脑心浸液(BHI)或YPD琼脂培养基中。然后针对每种菌株，选择单个菌落并划线到Petri培养皿中的两种半固体培养基上。将需氧菌在30℃下孵育，并将厌氧菌在35℃下在静态培养箱中孵育3天。在24、48和72小时后检查平板的培养基中的清除迹象，这被解释为锌增溶的阳性指标。
[0227] 铁动员分析：许多土壤微生物在具有低浓度的必需微量营养素铁的环境中产生所谓的铁载体。这些化合物与Fe3+形成水溶性复合物，Fe3+能在缺铁的情况下释放。两种细菌铁载体都作为铁的局部来源而有益于植物和微生物两者。对22种分离株中的每一种进行全基因组序列分析，重点是检测编码铁载体、铁载体生物合成途径以及铁载体受体和转运体的基因，所述铁载体、铁载体生物合成途径以及铁载体受体和转运体为诸如Yus、Yfh、Yfi、Asb、Fur、TonB、ExbB、ExbD、柠檬酸盐、去铁铵(Desferrioxamine)、去铁胺(Deferoxamine)、高铁色素(Ferrichrome)、镰孢氨酸(Fusarinine)、鸟氨酸菌素(Ornibactin)、菊菌素(Chrysobactin)、弧菌素(Vibriobactin)、分枝杆菌素(Mycobactin)、绿脓荧光素(Pyoverdin)、绿脓杆菌螯铁蛋白(Pyochelin)、耶尔森杆菌素(Yersiniabactin)、肠杆菌素(Enterobactin)、无色菌素(Achromobactin)、不动菌素(Acinetobactin)、固氮菌素(Azotobactin)、嗜铁素(Bacillibactin)和蛇肌动蛋白(Anguibactin)。这使得能够确定给定的微生物是否具有代谢装备库(arsenal)以进行铁动员化合物的产生和/或运输。
[0228] 对微生物的有机物去磷酸化潜力的分析：细菌能释放出一系列微生物酶，所述一系列微生物酶通过作用于有机物而能产生植物可利用的磷酸盐形式。这些酶包括使有机物质中的磷酸酯和/或磷酸酐键去磷酸化的非特异性磷酸酶，从植酸释放磷的植酸酶和膦酸酯酶，以及在有机膦酸酯中解离C-P键的C-P裂解酶。对22种分离株中的每一种进行全基因组序列分析，重点是检测编码这些酶中功能性代谢途径的基因。这使得能够确定给定的微生物是否具有酶降解装备库以进行土壤中的有机物质的去磷酸化。
[0229] 几丁质酶测定：基本上如Hsu和Lockwood(Applied Microbiology，29：422-426，1975)所述地进行胶体几丁质平板测定。将从主平板上挑取的细菌菌落(1-3日龄)在胶体几丁质平板(5g/L的半干几丁质；0.7g/L的K2HPO4；0.3g/L的KH2PO4；0.5g/L的MgSO4.5H2O；
0.01g/L的FeSO4.7H2O；0.001g/L的ZnSO4；0.001g/L的MnCl2和15g/L的琼脂)上划线。对于需氧菌将平板在30℃下孵育长达1周，或者对于厌氧菌将平板在厌氧条件下在35℃下孵育长达1周。通过培养基中的清除和/或显著的微生物生长来鉴定几丁质酶阳性分离株。
0.01g/L的FeSO4.7H2O；0.001g/L的ZnSO4；0.001g/L的MnCl2和15g/L的琼脂)上划线。对于需氧菌将平板在30℃下孵育长达1周，或者对于厌氧菌将平板在厌氧条件下在35℃下孵育长达1周。通过培养基中的清除和/或显著的微生物生长来鉴定几丁质酶阳性分离株。
[0230] 纤维素酶测定：脱氧甲基纤维素平板测定(Deoxymethyl Cellulose Plate Assay)改编自Alves等人(The Open Microbiology Journal，8：25-31，2014)。简言之，将从主平板上挑取的细菌菌落(1-3日龄)在半固体培养基(0.5％w/v的脱氧甲基纤维素；1.5％w/v的琼脂糖；50mM pH 6.8的Tris-HCl；1 mM的CaCl2)上划线。随后对于需氧菌将细菌分离株在30℃下孵育长达1周，对于厌氧菌将细菌分离株在厌氧条件下在35℃下孵育长达1周。
随后用刚果红溶液(0.25％w/v，在0.1M Tris-HCl pH 8.0中)处理各平板，并用在0.1M Tris-HCl，pH 8.0中的0.5％w/v NaCl溶液进行脱色。通过培养基中的清除和/或显著的微生物生长来鉴定纤维素酶阳性分离株。
随后用刚果红溶液(0.25％w/v，在0.1M Tris-HCl pH 8.0中)处理各平板，并用在0.1M Tris-HCl，pH 8.0中的0.5％w/v NaCl溶液进行脱色。通过培养基中的清除和/或显著的微生物生长来鉴定纤维素酶阳性分离株。
[0231] 吲哚-3-乙酸(IAA)产生测定：对在补充有1-5mg/mL色氨酸的液体培养基中生长的每种微生物分离株进行IAA测定。在接种后七至十四天，如Glickmann等人(Applied and Environmental Microbiology，1995年2月，第793-796页)所述，使用Salkowski试剂测试培养物的IAA产生。简而言之，将来自每个培养物的经澄清的用过的培养基与Salkwoski试剂以1∶1的比率混合。孵育30分钟后，测量540nm处的吸光度。使用先前预先制备的标准曲线，使用纯化的IAA(Alfa-Aesar，Tewksbury，MA USA)进行IAA产生的评估。此外，对22种分离株中的每一种进行全基因组序列分析，重点是检测生长素生物合成途径。
[0232] 其他代谢测定：对于包括脱氮测定、脲酶产生和苹果酸同化在内的另外的代谢活动，根据制造商的建议使用bioMérieux的 鉴定产品(bioMérieux，Inc.，Durham，NC USA)。
[0233] 关键代谢活动概况分析的结果如表11所示。
[0234] 表11.微生物分离株的代谢活性
[0235]
[0236]
[0237] 实施例4
[0238] 对植物生长促进活性的评估
[0239] 将从The Seed Kingdom购买的黄瓜种子在22-24℃下在温度和湿度受控的生长室(Sheldon Manufacturing，Inc.Cornelius，OR)中预萌发4天。在用液体肥料(50ppm的20-20-20 NPK(Grow More，Gardena，CA)的水溶液)与Agrinos微生物聚生体(AMC)产品的1∶1,
000到1∶2,000范围的稀释混合物浸渍的铺开育苗纸(Anchor Paper，Saint Paul，MN)中进行预发芽。AMC产品是通过使用实施例2中描述的商业规模共培养对表10中列出的22种微生物进行共培养获得的液体产物。
000到1∶2,000范围的稀释混合物浸渍的铺开育苗纸(Anchor Paper，Saint Paul，MN)中进行预发芽。AMC产品是通过使用实施例2中描述的商业规模共培养对表10中列出的22种微生物进行共培养获得的液体产物。
[0240] 然后将分期和同步的小植株移植到用肥料和微生物预处理而制备的盆栽土生长培养基(Sunshine Mix)中。盆栽土的预处理由液体肥料(50ppm NPK)与AMC产品的1∶1000至1∶2000范围的稀释混合物组成。对于每种处理，使用17-18株植物。将地块随机分配到以下确定的生长条件下的平地中：16-24℃和12小时光周期。每周使用50ppm NPK浇灌平地2至3次。33天后，测量每株植物的末端真叶的叶面积指数(LAI)(图2)。通过单因素ANOVA(方差分析)对数据进行分析以比较实验内的样品。
[0241] 实施例5
[0242] 作物活性评估
[0243] 该实施例描述了用于评定所公开组合物在作物如玉米、番茄和卷心菜中的活性的具体方法。然而，本领域的技术人员将理解，偏离这些具体方法的方法也能用于评定组合物的活性。
[0244] 玉米测定(生长室)：将玉米种子(Alberta Lea Seeds，Albert Lea，MN)在室温下在水中浸泡4小时，然后在用肥料和AMC产品预处理过的盆栽土或无土生长培养基(Sunshine Mix)中种植，所述肥料和AMC产品如下：改良的Hoagland溶液(30.97ppm的P；
39.1ppm的K；40.0ppm的Ca；14.59ppm的Mg；20.143ppm的S；1.010ppm的Fe；0.019ppm的Cu；
0.012ppm的Co；2.44ppm的B；0.494ppm的Mn；0.001 ppm的Mo，以及0.056ppm的Zn)和1∶1,000稀释的AMC产物。在下种时，将100mg缓释尿素制剂加入土壤中。将具有8至9个地块的托盘在
25℃下在温度和湿度受控的生长室(Sheldon Manufacturing，Inc.Cornelius，OR)中在黑暗中孵育3天。然后使植物在以下生长室条件下生长13至16天：16-24℃和12小时光周期。每周用改良的Hoagland溶液浇灌2至3次。随后在75℃下干燥4天后测定干枝重量(图3)。通过单因素ANOVA(方差分析)来分析数据。
39.1ppm的K；40.0ppm的Ca；14.59ppm的Mg；20.143ppm的S；1.010ppm的Fe；0.019ppm的Cu；
0.012ppm的Co；2.44ppm的B；0.494ppm的Mn；0.001 ppm的Mo，以及0.056ppm的Zn)和1∶1,000稀释的AMC产物。在下种时，将100mg缓释尿素制剂加入土壤中。将具有8至9个地块的托盘在
25℃下在温度和湿度受控的生长室(Sheldon Manufacturing，Inc.Cornelius，OR)中在黑暗中孵育3天。然后使植物在以下生长室条件下生长13至16天：16-24℃和12小时光周期。每周用改良的Hoagland溶液浇灌2至3次。随后在75℃下干燥4天后测定干枝重量(图3)。通过单因素ANOVA(方差分析)来分析数据。
[0245] 田间番茄试验：将番茄品种Sun 6366移植到6m×1.8m大小的苗床地块(bedded plot)中，并在移植时加入另外的水。在移植前用201kg N/ha和224kg P2O5和K2O/ha对田地施肥。将AMC分两次施用施加于每个地块中的番茄。第一次施加是在移植到田地后发生的。将AMC通过滴灌(TTAPE，排出器之间间隔20cm)以1L/英亩的速率施用。AMC的第二次施用是直接注射，并且是在移植后36天与UAN 28形式的N肥一起以38L/英亩的速率施加的。除了在培育过程中没有使用AMC外，对照地块与实验地块完全相同地进行处理。
[0246] 管理番茄林以具有等量的植物群体。在最后一次AMC施用后2个月时，手工收获番茄。在地块中心3.35m2的区域收获了总共6株植物。记录番茄产量和品质(绿色相对于红色)。使用XCELSTAT2016.4(Addinsoft Inc.)记录和分析重量(图4)。
[0247] 田间玉米试验：将玉米品种Mycogen 2H723(Mycogen Seeds，Indianapolis，IN)种植成4行构造，其中行间间隔75em并且行长6.1m。在移植前用201kg N/ha和224kg P2O5和K2O/ha对田地施肥。将AMC分两次施用施加于每个地块中。第一次施加是在种植到田地后发生的。使用背负式喷雾器以1 L/英亩的速率施加AMC，并使用滴灌(TTape，20cm发射器)将水施加到土壤中。在这项研究中，将灌溉水限制为正常水平的75％。施加限水5周，直至完全开花。AMC的第二次施用是直接注射，并且是在种植后35天施用的。对照玉米地块在注射时以38L/英亩的比率＝33kg N/ha的比率接受UAN 28形式的另外的N肥，在研究过程中总共接受
234kg N/ha。AMC地块未接受另外的N，并且最终达到201kg N/ha。土壤pH在田地区域中较高，并且平均为8.1。
234kg N/ha。AMC地块未接受另外的N，并且最终达到201kg N/ha。土壤pH在田地区域中较高，并且平均为8.1。
[0248] 将玉米林疏苗到34,000株植物的植物种群，以确保等量的植物群体。种植后5个月时用玉米收割机收获玉米。只有中心2行是从代表地块中心的9.3m2区域的4行地块收获的，这提供了收获区域周围的大量边界植物。将玉米粒在数天内干燥至15％水分，称重。使用XCELSTAT2016.4(Addinsoft Inc)记录和分析玉米粒重量(图5)。
[0249] 田间卷心菜试验：将卷心菜品种Golden Acres作为种子种植到12英尺长乘11英尺宽的4行苗床地块中。在种植之前，用20加仑/英亩的25-7-0-3 S在与苗床中心隔开16英寸的双行中进行田地施肥。使用UAN(32％N)以10加仑/英亩来施加另外的肥料以作为侧施应用，10加仑/英亩产生90lb N、15lbs P、0lbs K和6.5lbs S/英亩的比率。在种植时在犁沟中以1L/英亩的比率施加AMC产品，并且在处理2的情况下，在种植后42天施加AMC的第二次施用(1L/英亩的比率)。将田地沟灌4次，其中灌溉范围为6.3至8.9英亩英寸水/灌溉，总共为29.7英亩英寸。在作物的生命周期中，降雨供应了另外10.7英寸。在作物上喷洒多种杀虫剂、除草剂和杀菌剂，以保护卷心菜免受生物胁迫。土壤pH值为8.0
[0250] 卷心菜具有相同的林分计数群体，并在播种后95天收获一次。从220ft2的有效收获地块中收获所述地块中间两行的所有植物。然后将卷心菜球分级成大小24和18类，并称重。使用XCELSTAT2016.4(Addinsoft Inc.)分析分级重量和总重量(图6)。
[0251] 实施例6
[0252] 根测定
[0253] 将商品作物种子(诸如但不限于玉米和番茄)在22-24℃下在温度和湿度受控的生长室(Sheldon Manufacturing，Inc.Cornelius，OR)中预萌发3天。在用液体肥料(25-100ppm的20-20-20 NPK(Grow More，Gardena，CA)的水溶液)和AMC产品的1∶1000至1∶5000的稀释混合物浸渍的铺开育苗纸(Anchor Paper，Saint Paul，MN)中进行预萌发。将分期和同步的小植株移植到预处理的无土培养基中，所述预处理的无土培养基为诸如沙子、岩棉、蛭石或其他惰性基质。生长培养基的预处理由水培营养液如Hoagland完全营养液
(Hoaglund和Arnon，The Water-Culture Method for Growing Plants Without Soil，
1938)与AMC产品的1∶1000至1∶5000范围的稀释混合物组成。将每种处理的至少12株植物(包括对照植物在内)随机分配在支撑托盘中。使植物在标准温室条件下生长长达45天。在完成实验后分析根部解剖结构和形态。
(Hoaglund和Arnon，The Water-Culture Method for Growing Plants Without Soil，
1938)与AMC产品的1∶1000至1∶5000范围的稀释混合物组成。将每种处理的至少12株植物(包括对照植物在内)随机分配在支撑托盘中。使植物在标准温室条件下生长长达45天。在完成实验后分析根部解剖结构和形态。
[0254] 实施例7
[0255] 冻干微生物的存活力
[0256] 冻干：将在最佳培养基(表12)中单独培养或共培养的微生物进行冻干以评估存活力。简而言之，对于单一培养，在厌氧或好氧条件下，使微生物在30-35℃下在恒温搅动(200rpm)下在温度受控的培养箱中的5mL培养体积中生长24小时。对于共培养实验，使用含2％w/v糖蜜、0.1％w/v乳清粉、0.25％w/v Ferti-Nitro Plus Plant N(Ferti-Organic，Brownsville，TX USA)、0-4％w/v NaCl、0.02％KCl、0.115％w/v Na2HPO4和0.02％KH2PO4；
pH 5.7-7.0，温度为30-35℃的培养基，使微生物在2L的DASGIP生物反应器(Eppendorf North America Hauppauge，NY)中生长。厌氧组在没有氧的情况下生长。
pH 5.7-7.0，温度为30-35℃的培养基，使微生物在2L的DASGIP生物反应器(Eppendorf North America Hauppauge，NY)中生长。厌氧组在没有氧的情况下生长。
[0257] 确定每种培养物在600nm处的光密度。随后根据制造商的推荐将每种培养物与甘露醇/冻干保护剂溶液(OPS Diagnostics Lebanon，NJ，USA)混合，并将微生物悬浮液等分到冻干小瓶(OPS Diagnestics，Lebanon，NJ，USA)中，所述冻干小瓶填充1/3-1/5的体积并且然后装上分开的塞子。在-80℃下60分钟后，将小瓶置于FreeZone 6冻干系统(Labconco，Kansas City，MO)中，施加真空，并使样品中的水升华过夜(0.04mBa，-50℃)。冻干后，将分开的塞子放入小瓶中，并进一步在适当位置用铝带压接紧固。将样品储存在4℃直至需要时。
[0258] 表12：用于个体微生物生长的培养基。
[0259]微生物 生长培养基
巴氏醋杆菌 YPD、MP、M-HYTA
棕色固氮菌 RhX、MP、M-HYTA
解淀粉芽孢杆菌 YPD、MP、YPDS、M-HYTA
弯曲芽孢杆菌 BHI、MP、M-HYTA、NA、YPD
地衣芽孢杆菌 BHI、MP、M-HYTA
巨大芽孢杆菌 YPD、MP、YPDS、M-HYTA
芽孢杆菌属 BHI、MP、M-HYTA、YPD
枯草芽孢杆菌 BHI、MP、M-HYTA、YPD
拜氏梭菌 RCM、MP、M-HYTA
巴氏梭菌 RCM、MP、M-HYTA
布氏乳杆菌 RCM、MRS、MP、M-HYTA
干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌 RCM、MRS、MP、M-HYTA
德氏乳杆菌 RCM、MRS、MP、M-HYTA
酒乳杆菌 RCM、MRS、MP、M-HYTA
小鳟鱼大洋芽孢杆菌 BHI、MP、BHIS、M-HYTA
千叶类芽孢杆菌 BHI、MP、M-HYTA，
库氏类芽孢杆菌 BHI、MP、M-HYTA
灿烂类芽孢杆菌 BHI、MP、M-HYTA
恶臭假单胞菌 YPD、MP、YPDS、M-HYTA
假单胞菌属 YPD、MP、YPDS、M-HYTA
灰色链霉菌 YPD、MP、YPDS、M-HYTA
嗜盐枝芽孢杆菌 BHI、MP、BHIS、M-HYTA、YPD
巴氏醋杆菌 YPD、MP、M-HYTA
棕色固氮菌 RhX、MP、M-HYTA
解淀粉芽孢杆菌 YPD、MP、YPDS、M-HYTA
弯曲芽孢杆菌 BHI、MP、M-HYTA、NA、YPD
地衣芽孢杆菌 BHI、MP、M-HYTA
巨大芽孢杆菌 YPD、MP、YPDS、M-HYTA
芽孢杆菌属 BHI、MP、M-HYTA、YPD
枯草芽孢杆菌 BHI、MP、M-HYTA、YPD
拜氏梭菌 RCM、MP、M-HYTA
巴氏梭菌 RCM、MP、M-HYTA
布氏乳杆菌 RCM、MRS、MP、M-HYTA
干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌 RCM、MRS、MP、M-HYTA
德氏乳杆菌 RCM、MRS、MP、M-HYTA
酒乳杆菌 RCM、MRS、MP、M-HYTA
小鳟鱼大洋芽孢杆菌 BHI、MP、BHIS、M-HYTA
千叶类芽孢杆菌 BHI、MP、M-HYTA，
库氏类芽孢杆菌 BHI、MP、M-HYTA
灿烂类芽孢杆菌 BHI、MP、M-HYTA
恶臭假单胞菌 YPD、MP、YPDS、M-HYTA
假单胞菌属 YPD、MP、YPDS、M-HYTA
灰色链霉菌 YPD、MP、YPDS、M-HYTA
嗜盐枝芽孢杆菌 BHI、MP、BHIS、M-HYTA、YPD
[0260] YPD：酵母蛋白胨葡萄糖(BD#242720)，YPDS：YPD+8g/L NaCl，RCM：增强梭菌培养基(BD#218081)，BHI：脑心浸液肉汤(HiMedia，#LQ077)，BHIS：BHI+45g/L NaCl，RhX：ATCC培养基：111根瘤菌X培养基，MRS：乳杆菌MRS(BD#288210)；M-HYTA：糖蜜、乳清蛋白、昆布提取物、酵母粉、螺旋藻和NaCl
[0261] 为了评估存活力，将每种冻干的培养物再水化并确定生长潜力。用OD600为0.1的再水化培养物接种新鲜培养基。监测3天时段内的生长。作为对照，使用非冻干培养物。结果汇总在表13中。
[0262] 表13.冻干和再水化后的微生物生长
[0263]
[0264] a(+)表示冻干后的生长。
[0265] *厌氧地生长。
[0266] 鉴于可以应用本公开的原理的许多可能的实施方案，应该认识到，所示实施方案仅是示例，并且不应被视为限制本发明的范围。相反，本发明的范围由以下权利要求限定。因此，我们要求这些权利要求的范围和精神之内的所有权利。
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