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植烟 土壤微生态环境测定方法

阅读：946发布：2020-05-11

专利汇可以提供植烟土壤微生态环境测定方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种植烟土壤微生态环境测定方法，该测定方法包括以下步骤：1)功能生物有机肥的设置；2)田间对比试验性状调查；3)土壤生物理化性质测定；4)土壤微生物多样性测定。本发明涉及的功能生物有机肥可以有效地改善土壤机能；能完整全面，可以有效的评测土壤改善的结果。，下面是植烟土壤微生态环境测定方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种植烟土壤微生态环境测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)生物菌剂或生物有机肥的设置；2)田间对比试验性状调查；3)土壤生物理化性质测定；4)土壤微生物多样性测定。
2.根据权利要求1所述的植烟土壤微生态环境测定方法，其特征在于，所述的步骤1)生物菌剂的设置，具体为：
(1)进行4个试验设置处理：处理一：菌剂1，50倍液蘸根/灌根；处理二：菌剂2，50倍液蘸根/灌根；处理三：菌剂3，50倍液蘸根/灌根；对照：同期等量清水蘸根/灌根；
(2)施用次数：作物全生育期内使用1次：烤烟移栽时用该菌剂1︰50倍液蘸根，边蘸根边移栽，作物移栽当天内灌根，每株用量为400毫升；
(3)材料要求：微生物菌剂，执行GB20287-2006标准，液体或粉剂，常规使用；采用随机区组排列试验设计，设4个处理3次重复，常规单垄移栽，行距1.2m，株距0.6m，移栽后垄高
20cm，每小区种植30株。
3.根据权利要求1所述的植烟土壤微生态环境测定方法，其特征在于，所述的步骤1)功能生物有机肥的设置，具体为：
(1)进行6个试验设置处理：处理一：常规：习惯施肥；处理二：亩施活性功能生物有机肥(1)150千克+习惯施肥减量10％；处理三：功能生物有机肥(2)150千克+习惯施肥减量10％；
处理四：亩施活性功能生物有机肥(3)150千克+习惯施肥减量10％；处理五：亩施酵素炭肥
300千克+习惯施肥减量10％；处理六：空白对照(ck)，不施任何无机肥料和有机肥；作物全生育期内使用1次；常规单垄移栽，行距1.2m，株距0.6m，移栽后垄高20cm；每处理种植100株；
(2)基础土样的样品采集：选定试验地块后取试验地基础土样，若整地前取样，取0-
20cm耕层样品，若整地后移栽前取样，取垄体正中间10-30cm耕层样品。
4.根据权利要求1所述的植烟土壤微生态环境测定方法，其特征在于，所述的步骤2)田间对比试验性状调查，至少包括以下步骤：
(1)烟株农艺性状：分别于移栽后30天和打顶后采烤前，选定各处理代表性烟株3棵，测定不同处理烤烟株高、茎围、有效叶片数、叶面积指数的农艺性状指标；
(2)烤烟生物量：分别于移栽后30天和打顶后采烤前，选定各处理代表性烟株3棵，挖掘法测定烟株地上部：茎和叶、地下部：根的生物量鲜重和干重。
5.根据权利要求1所述的植烟土壤微生态环境测定方法，其特征在于，所述的步骤2)田间对比试验性状调查，至少包括以下步骤：
(3)病虫害调查：成熟期调查各处理田间主要土传病害：根结线虫病、黑胫病发病率和病情指数情况，每个处理重复调查3次；
发病率(％)＝发病株数/调查总数×100％
病情指数＝∑[(病级数×该病级株数)/(调查总数×最高级值)]×100
(4)烟叶产量质量：对各处理烟叶单采单编，称量不同等级烟叶质量；测定不同处理烤烟产量、均价、产值、上等烟比例、中等烟比例和下等烟比例。
6.根据权利要求1所述的植烟土壤微生态环境测定方法，其特征在于，所述的步骤3)土壤生物理化性质测定，具体为：
(1)土壤含水率测定
每份土壤称取10g，准确到0.1mg，平行三份；在120℃烘箱中烘10小时，冷却，称重；再放入120℃烘箱中烘2小时，冷却，称重，至相邻二次重量相差不高于0.2％，停止加热，计算含水率；
(2)土壤pH值测定
称取风干土壤10g于50mL高型烧杯中，加入25mL无二氧化碳的水；用玻璃棒剧烈搅动1-
2min，静止30min，此时避免空气中氨或挥发性酸的影响；用PHS-3C型精密酸度计直接测定土壤水溶液pH值；
(3)根际土壤酚酸测定。
7.根据权利要求6所述的植烟土壤微生态环境测定方法，其特征在于，所述根际土壤酚酸测定，具体为：
混合标准品溶液制备
分别精密称定标准品阔马酸0.0102g，对羟基苯甲酸0.0101g，香草酸0.0102g，丁香酸
0.0102g，4-香豆酸0.0102g，阿魏酸0.0102g，用99.9％的色谱级甲醇精确定容到100mL，配制为100ppm浓度的混合标液，4℃避光保存，待用；
土壤样品前处理
供试根际土壤风干，除去杂物，过40目筛，称取50g置于250ml具塞三角瓶中，加入
150ml2molL-1 NaOH，120rmin-1振荡提取3h，静置3h，用滤纸过滤；取上清液用5molL-l HCl调至pH为2.5；然后用乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，45℃蒸干，残渣用5ml色谱纯甲醇溶解，4℃避光保存；过0.22μm滤膜，待测；
高效液相色谱条件
流动相A：0.3％乙酸水溶液；流动相B：甲醇；流速为0.3ml/min；柱温35℃；进样量10μL；
线性关系：取混合标准品溶液过0.22μm滤膜，分别精密吸取0.5、1、3、5、8、10μL注入HPLC色谱仪；以对照品的含量为横坐标，以峰面积为纵坐标，制作标准曲线，R为0.999以上；
精密度及重复性试验：取同一供试对照品，连续5次进样，所得结果RSD值均小于1.8％，表明仪器精密度良好；
稳定性试验：取同一供试样品，分别于制样后0、4、8、12、16、24h后，按上述色谱条件进样10μL，对阔马酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸和阿魏酸含量的RSD值均小于
3％。
8.根据权利要求1所述的植烟土壤微生态环境测定方法，其特征在于，所述的步骤3)土壤生物理化性质测定，具体为：
(1)土壤含水率测定
每份土壤称取10g，准确到0.1mg，平行三份；在120℃烘箱中烘10小时，冷却，称重；再放入120℃烘箱中烘2小时，冷却，称重，至相邻二次重量相差不高于0.2％，停止加热，计算含水率；
(2)土壤pH值测定
称取风干土壤10g于50mL高型烧杯中，加入25mL无二氧化碳的水；用玻璃棒剧烈搅动1-
2min，静止30min，此时避免空气中氨或挥发性酸的影响；用PHS-3C型精密酸度计直接测定土壤水溶液pH值；
(3)根际土壤酚酸测定
样品处理
混合标准品溶液制备
分别精密称定标准品阔马酸0.0102g，对羟基苯甲酸0.0101g，香草酸0.0102g，丁香酸
0.0102g，4-香豆酸0.0102g，阿魏酸0.0102g，用99.9％的色谱级甲醇精确定容到100mL，配制为100ppm浓度的混合标液，4℃避光保存，待用；
土壤样品前处理
供试根际土壤风干，除去杂物，过40目筛，称取50g置于250ml具塞三角瓶中，加入-1 -1 -l
150ml2molL NaOH，120rmin 振荡提取3h，静置3h，用滤纸过滤；取上清液用5molL HCl调至pH为2.5；然后用乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，45℃蒸干，残渣用5ml色谱纯甲醇溶解，4℃避光保存；过0.22μm滤膜，待测；
高效液相色谱条件
流动相A：0.3％乙酸水溶液；流动相B：甲醇；流速为0.3ml/min；柱温35℃；进样量10μL；
线性关系：取混合标准品溶液过0.22μm滤膜，分别精密吸取0.5、1、3、5、8、10μL注入HPLC色谱仪；以对照品的含量为横坐标，以峰面积为纵坐标，制作标准曲线，R为0.999以上；
精密度及重复性试验：取同一供试对照品，连续5次进样，所得结果RSD值均小于1.8％，表明仪器精密度良好；
稳定性试验：取同一供试样品，分别于制样后0、4、8、12、16、24h后，按上述色谱条件进样10μL，对阔马酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸和阿魏酸含量的RSD值均小于
3％；
所述的步骤4)土壤微生物多样性测定，具体为：包括植烟土壤可培养微生物多样性研究：
①样品稀释液的制备准确称取待测样品l0g，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的
250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成10-1稀释液；再用1ml无菌吸管，吸取10-1稀释液lml，移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、
10-9一系列稀释菌液；用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定；样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低；
②培养基配制
细菌：采用牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g、蛋白胨5g、NaCl 5g、琼脂15-20g、水
1000ml、pH 7.0，平板稀释分离计数法，培养温度27～30℃；
真菌：采用孟加拉红培养基：葡萄糖1g、蛋白胨0.5g、KH2PO4·3H2O 0.1g、MgSO4·7H2O
0.05g、孟加拉红含量1mg/ml 0.33ml、琼脂1.5～2g、水100ml，平板稀释分离计数法，培养温度27～30℃；
放线菌：采用高氏一号培养基：可溶性淀粉20g﹑NaCl 0.5g﹑KNO3 1g、K2HPO4·3H2O
0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、琼脂15g﹑水1000ml、pH 7.4-7.6；在混合培养基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分；平板稀释分离计数法，培养温度27～30℃；
③平板接种培养先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上，每个编号设三个重复；再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌；在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲；将涂抹好的平板平放于桌上
20-30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌落后即可计数；
用移液枪从试管中吸取土壤悬浮液放入培养皿中，在无菌条件下把土壤悬浮液均匀涂开，然后在恒温箱中培养；
④菌落计数方法每毫升中菌数﹦平板上菌落数×稀释倍数/平板上加菌液的量。
9.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，所述的步骤4)土壤微生物多样性测定，具体为：包括植烟土壤微生物多样性分子测定研究：
基因组DNA的提取
采用天根磁珠法提取烤烟根际土壤与非植烟区对照土壤样本的基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的纯度和浓度；纯化后，取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1ng/μl；
PCR扩增
(1)模板：稀释后的基因组DNA；
(2)引物：使用带Barcode的特异引物341F-543R；
341F:CCTAYGGGRBGCASCAG，543R:ATTACCGCGGCTGCTGG；扩增16S V3区域；
(3)酶和缓冲液：使用New England Biolabs公司的 High-Fidelity PCR
Master Mix with GC Buffer；
PCR反应体系和程序(30μL)：
反应程序：98℃预变性1min；30个循环包括：98℃，10sec；50℃，30sec；72℃，30sec；72℃，5min
(4)纯度检测：PCR产物纯度使用2％(m/v)的琼脂糖凝胶电泳进行检测；
①PCR产物的混样和纯化
根据PCR产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后，使用1×TAE浓度2％(m/v)的琼脂糖胶电泳纯化PCR产物，选择主带大小在400-450bp之间的序列，割胶回收目标条带；产物纯化；
②文库构建和上机测序
使用建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit定量和文库检测，合格后，使用HiSeq进行上机测序；
根据所扩增的16SV3区域特点，基于测序平台，利用双末端测序的方法，构建小片段文库进行双末端测序；通过对Reads拼接过滤，OTUs聚类，并进行物种注释、丰度分析及与环境因子的相关性分析，获得连作烟草根际土壤中细菌多样性信息；
数据处理：SPSS16.0分析软件，进行描述性分析、正态分析和频率分析。
10.根据权利要求8所述的测定方法，其特征在于，所述的平板接种培养步骤中，涂平板时要等到琼胶平板表面的冷凝水消失后再划线。

说明书全文

植烟土壤微生态环境测定方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种植烟土壤微生态环境测定方法，属于生态环境测定领域。

背景技术

[0002] 土壤在耕种一段时间之后，易出现土壤酸化、营养失衡、微生物失调、保水保肥能力下降、连作障碍土传病害严重等一系列问题。如何消除上述问题，保证土壤使用的稳定性和重复性是一个需要解决的技术问题。采用某种方法对土壤机能进行恢复时一般都有一些特定测定手段，但是目前的测定手段项目往往比较单一，很难从综合的方面进行测定。因此，在寻找到某种改良土壤机能途径的技术手段后，如何有效地评估、测定该方法的有效性成为一种需要解决的技术问题。

[0003] 烤烟长期种植后，植烟土壤各项性状发生较大变化，难以准确全面的进行检测，现有检测方法单一，检测指标不完善。

发明内容

[0004] 本发明提供了一种植烟土壤微生态环境测定方法，该方法用于解决现有土壤检测方法单一，检测指标不完善，无法全面反映土壤实际改变情况的技术问题。

[0005] 本发明的提供了一种植烟土壤微生态环境测定方法，包括以下步骤：

[0006] 1)生物菌剂或生物有机肥的设置；2)田间对比试验性状调查；3)土壤生物理化性质测定；4) 土壤微生物多样性测定。

[0007] 优选地，所述的步骤1)生物菌剂的设置，具体为：

[0008] (1)进行4个试验设置处理：处理一：菌剂1，50倍液蘸根/灌根；处理二：菌剂2，50 倍液蘸根/灌根；处理三：菌剂3，50倍液蘸根/灌根；对照：同期等量清水蘸根/灌根；

[0009] (2)施用次数：作物全生育期内使用1次：烤烟移栽时用该菌剂1︰50倍液蘸根，边蘸根边移栽，作物移栽当天内灌根，每株用量为400毫升；

[0010] (3)材料要求：微生物菌剂，执行GB20287-2006标准，液体或粉剂，常规使用；采用随机区组排列试验设计，设4个处理3次重复，常规单垄移栽，行距1.2m，株距0.6m，移栽后垄高20cm，每小区种植30株。

[0011] 优选地，所述的步骤1)功能生物有机肥的设置，具体为：

[0012] (1)进行6个试验设置处理：处理一：常规：习惯施肥；处理二：亩施活性功能生物有机肥(1)150千克+习惯施肥减量10％；处理三：功能生物有机肥(2)150千克+习惯施肥减量10％；处理四：亩施活性功能生物有机肥(3)150千克+习惯施肥减量10％；处理五：亩施酵素炭肥300 千克+习惯施肥减量10％；处理六：空白对照(ck)，不施任何无机肥料和有机肥；作物全生育期内使用1次；常规单垄移栽，行距1.2m，株距0.6m，移栽后垄高20cm；每处理种植
100株；

[0013] (2)基础土样的样品采集：选定试验地块后取试验地基础土样，若整地前取样，取0-20cm 耕层样品，若整地后移栽前取样，取垄体正中间10-30cm耕层样品。

[0014] 优选地，所述的步骤2)田间对比试验性状调查，至少包括以下步骤：

[0015] (1)烟株农艺性状：分别于移栽后30天和打顶后采烤前，选定各处理代表性烟株3棵，测定不同处理烤烟株高、茎围、有效叶片数、叶面积指数的农艺性状指标；

[0016] (2)烤烟生物量：分别于移栽后30天和打顶后采烤前，选定各处理代表性烟株3棵，挖掘法测定烟株地上部：茎和叶、地下部：根的生物量鲜重和干重。

[0017] 优选地，所述的步骤2)田间对比试验性状调查，至少包括以下步骤：

[0018] (3)病虫害调查：成熟期调查各处理田间主要土传病害：根结线虫病、黑胫病发病率和病情指数情况，每个处理重复调查3次；

[0019] 发病率(％)＝发病株数/调查总数×100％

[0020] 病情指数＝∑[(病级数×该病级株数)/(调查总数×最高级值)]×100

[0021] (4)烟叶产量质量：对各处理烟叶单采单编，称量不同等级烟叶质量；测定不同处理烤烟产量、均价、产值、上等烟比例、中等烟比例和下等烟比例。

[0022] 优选地，所述的步骤3)土壤生物理化性质测定，具体为：

[0023] (1)土壤含水率测定

[0024] 每份土壤称取10g，准确到0.1mg，平行三份；在120℃烘箱中烘10小时，冷却，称重；再放入120℃烘箱中烘2小时，冷却，称重，至相邻二次重量相差不高于0.2％，停止加热，计算含水率；

[0025] (2)土壤pH值测定

[0026] 称取风干土壤10g于50mL高型烧杯中，加入25mL无二氧化碳的水；用玻璃棒剧烈搅动1- 2min，静止30min，此时避免空气中氨或挥发性酸的影响；用PHS-3C型精密酸度计直接测定土壤水溶液pH值；

[0027] (3)根际土壤酚酸测定。

[0028] 优选地，所述根际土壤酚酸测定，具体为：

[0029] 混合标准品溶液制备

[0030] 分别精密称定标准品阔马酸0.0102g，对羟基苯甲酸0.0101g，香草酸0.0102g，丁香酸0.0102g，4-香豆酸0.0102g，阿魏酸0.0102g，用99.9％的色谱级甲醇精确定容到100mL，配制为100ppm浓度的混合标液，4℃避光保存，待用；

[0031] 土壤样品前处理

[0032] 供试根际土壤风干，除去杂物，过40目筛，称取50g置于250ml具塞三角瓶中，加入150ml 2molL-1NaOH，120rmin-1振荡提取3h，静置3h，用滤纸过滤；取上清液用5molL-l HCl调至pH 为2.5；然后用乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，45℃蒸干，残渣用5ml色谱纯甲醇溶解，4℃避光保存；过0.22μm滤膜，待测；

[0033] 高效液相色谱条件

[0034] 流动相A：0.3％乙酸水溶液；流动相B：甲醇；流速为0.3ml/min；柱温35℃；进样量10μ L；

[0035] 线性关系：取混合标准品溶液过0.22μm滤膜，分别精密吸取0.5、1、3、5、8、10μL 注入HPLC色谱仪；以对照品的含量为横坐标，以峰面积为纵坐标，制作标准曲线，R为0.999 以上；

[0036] 精密度及重复性试验：取同一供试对照品，连续5次进样，所得结果RSD值均小于1.8％，表明仪器精密度良好；

[0037] 稳定性试验：取同一供试样品，分别于制样后0、4、8、12、16、24h后，按上述色谱条件进样10μL，对阔马酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸和阿魏酸含量的RSD 值均小于3％。

[0038] 优选地，所述的步骤3)土壤生物理化性质测定，具体为：

[0039] (1)土壤含水率测定

[0040] 每份土壤称取10g，准确到0.1mg，平行三份；在120℃烘箱中烘10小时，冷却，称重；再放入120℃烘箱中烘2小时，冷却，称重，至相邻二次重量相差不高于0.2％，停止加热，计算含水率；

[0041] (2)土壤pH值测定

[0042] 称取风干土壤10g于50mL高型烧杯中，加入25mL无二氧化碳的水；用玻璃棒剧烈搅动1- 2min，静止30min，此时避免空气中氨或挥发性酸的影响；用PHS-3C型精密酸度计直接测定土壤水溶液pH值；

[0043] (3)根际土壤酚酸测定

[0044] 样品处理

[0045] 混合标准品溶液制备

[0046] 分别精密称定标准品阔马酸0.0102g，对羟基苯甲酸0.0101g，香草酸0.0102g，丁香酸 0.0102g，4-香豆酸0.0102g，阿魏酸0.0102g，用99.9％的色谱级甲醇精确定容到100mL，配制为100ppm浓度的混合标液，4℃避光保存，待用；

[0047] 土壤样品前处理

[0048] 供试根际土壤风干，除去杂物，过40目筛，称取50g置于250ml具塞三角瓶中，加入150ml 2molL-1NaOH，120rmin-1振荡提取3h，静置3h，用滤纸过滤；取上清液用5molL-l HCl调至pH 为2.5；然后用乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，45℃蒸干，残渣用5ml色谱纯甲醇溶解，4℃避光保存；过0.22μm滤膜，待测；

[0049] 高效液相色谱条件

[0050] 流动相A：0.3％乙酸水溶液；流动相B：甲醇；流速为0.3ml/min；柱温35℃；进样量10μL；

[0051] 线性关系：取混合标准品溶液过0.22μm滤膜，分别精密吸取0.5、1、3、5、8、10μL 注入HPLC色谱仪；以对照品的含量为横坐标，以峰面积为纵坐标，制作标准曲线，R为0.999 以上；

[0052] 精密度及重复性试验：取同一供试对照品，连续5次进样，所得结果RSD值均小于1.8％，表明仪器精密度良好；

[0053] 稳定性试验：取同一供试样品，分别于制样后0、4、8、12、16、24h后，按上述色谱条件进样10μL，对阔马酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸和阿魏酸含量的RSD 值均小于3％。

[0054] 所述的步骤4)土壤微生物多样性测定，具体为：包括植烟土壤可培养微生物多样性研究：

[0055] ①样品稀释液的制备准确称取待测样品l0g，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成10-1稀释液；再用1ml无菌吸管，吸取10-1稀释液lml，移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、 10-9一系列稀释菌液；用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定；样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低；

[0056] ②培养基配制

[0057] 细菌：采用牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g、蛋白胨5g、NaCl 5g、琼脂15-20g、水 1000ml、pH 7.0，平板稀释分离计数法，培养温度27～30℃；

[0058] 真菌：采用孟加拉红培养基：葡萄糖1g、蛋白胨0.5g、KH2PO4·3H2O 0.1g、MgSO4·7H2O 0.05g、孟加拉红含量1mg/ml 0.33ml、琼脂1.5～2g、水100ml，平板稀释分离计数法，培养温度27～30℃；

[0059] 放线菌：采用高氏一号培养基：可溶性淀粉20g﹑NaCl 0.5g﹑KNO3 1g、K2HPO4·3H2O 0.5g、 MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、琼脂15g﹑水1000ml、pH 7.4-7.6；在混合培养基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分；平板稀释分离计数法，培养温度27～30℃；

[0060] ③平板接种培养先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上，每个编号设三个重复；再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌；在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲；将涂抹好的平板平放于桌上20-30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌落后即可计数；

[0061] 用移液枪从试管中吸取土壤悬浮液放入培养皿中，在无菌条件下把土壤悬浮液均匀涂开，然后在恒温箱中培养；

[0062] ④菌落计数方法每毫升中菌数﹦平板上菌落数×稀释倍数/平板上加菌液的量。

[0063] 优选地，所述的步骤4)土壤微生物多样性测定，具体为：包括植烟土壤微生物多样性分子测定研究：

[0064] 基因组DNA的提取

[0065] 采用天根磁珠法提取烤烟根际土壤与非植烟区对照土壤样本的基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的纯度和浓度；纯化后，取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1ng/μl；

[0066] PCR扩增

[0067] (1)模板：稀释后的基因组DNA；

[0068] (2)引物：使用带Barcode的特异引物341F-543R；

[0069] 341F:CCTAYGGGRBGCASCAG，543R:ATTACCGCGGCTGCTGG；扩增16S V3区域；

[0070] (3)酶和缓冲液：使用New England Biolabs公司的 High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer；

[0071] PCR反应体系和程序(30μL)：

[0072]

[0073]

[0074] 反应程序：98℃预变性1min；30个循环包括：98℃，10sec；50℃，30sec；72℃，30sec；72℃， 5min

[0075] (4)纯度检测：PCR产物纯度使用2％(m/v)的琼脂糖凝胶电泳进行检测；

[0076] ①PCR产物的混样和纯化

[0077] 根据PCR产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后，使用1×TAE浓度2％(m/v)的琼脂糖胶电泳纯化PCR产物，选择主带大小在400-450bp之间的序列，割胶回收目标条带；产物纯化；

[0078] ②文库构建和上机测序

[0079] 使用建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit定量和文库检测，合格后，使用 HiSeq进行上机测序；

[0080] 根据所扩增的16SV3区域特点，基于测序平台，利用双末端测序的方法，构建小片段文库进行双末端测序；通过对Reads拼接过滤，OTUs聚类，并进行物种注释、丰度分析及与环境因子的相关性分析，获得连作烟草根际土壤中细菌多样性信息；

[0081] 数据处理：SPSS16.0分析软件，进行描述性分析、正态分析和频率分析。

[0082] 优选地，所述的平板接种培养步骤中，涂平板时要等到琼胶平板表面的冷凝水消失后再划线。

[0083] 本发明能产生的有益效果包括：

[0084] 1)本发明所提供的植烟土壤微生态环境测定方法，该方法能对使用生物菌剂或生物有机肥的土壤进行全面评测，不止涉及土壤各项生化指标，同时还对植株生长情况，土壤微生物分布、数量、种类进行测定，便于全面了解所用生物菌剂或生物有机肥的效果。

[0085] 2)本发明所提供的植烟土壤微生态环境测定方法，完整全面，可以有效的评测土壤改善的结果。本发明的测定方法完整全面，可以有效的评测土壤改善的结果。

[0086] 生物保藏说明：

[0087] 生物材料：菌株KMXU1，建议分类命名为：解淀粉芽胞杆菌(拉丁名：Bacillus amyloliquefaciens)，于2012年09月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.6598。

[0088] 生物材料：菌株KMXU22，建议分类命名为：荧光假单胞菌(拉丁名：Pseudomonas fluorescens)，于2012年09月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.6597。

[0089] 生物材料：菌株KMXU56，建议分类命名为：短小芽孢杆菌(拉丁名：Bacillus pumilus)，于2012年09月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.6595。

具体实施方式

[0090] 下面结合实施例详述本发明，但本发明并不局限于这些实施例。

[0091] 实施例

[0092] 以下实施例中所用物料如非特殊说明，均为通过商业途径获取。

[0093] 以下实施例中所用菌株筛选、分离步骤如下：

[0094] 菌株KMXU1：从云南省曲靖市富源县蓝莓种植区蓝莓根际土壤中分离得到KMXU1，对其鉴定结果表明该细菌属于解淀粉芽孢杆菌，该菌株名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)KMXU1。

[0095] 该菌株已经保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国.北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2012年9月21；保藏号：CGMCC NO.6598。

[0096] 平板拮抗试验筛选：按照方中达所著《植病研究方法》中的平板对持培养试验方法，对 KMXU1菌对真菌性的抑制效果进行评价，灭菌蒸馏水对照处理组病菌菌丝长满平板时统计结果如下，KMXU1对植物病原真菌(如：烟草镰刀型枯萎病菌)生长抑制率为86.67～90.00％，说明KMXU1菌株对植物病原真菌具有显著的抑制作用。

[0097] 本发明的菌体特征及菌落特征：菌体呈短杆状，染色均匀，具运动性，兼性厌氧，可形成内生芽孢，芽孢囊膨大，呈椭圆形，游离芽孢表面着色弱，革兰氏染色阳性。在LB培养基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，菌落边缘不规则，在多种培养基上均不产色素。

[0098] 菌株KMXU22：从健康魔芋植株中分离得到了一株具有防治细菌性病害的菌株KMXU22，对其鉴定结果表明该细菌属于荧光假单孢菌，该菌株命名为荧光假单孢菌(Psdeuomnoda fluorescens)KMXU22。

[0099] 该菌株已经保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国.北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2012年9月21日；保藏号为CGMCC NO.6597。

[0100] 平板拮抗试验筛选：采用打孔法对细菌性病原菌的抑制效果进行评价。将细菌性植物病原菌悬液均匀涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上(牛肉膏3.0g，NaCl 5.0g，蛋白胨10.0g，水1000ml，琼脂10.0g，pH7.0，下同)，用无菌打孔器均匀打4个6mm孔，向孔内加入50μl的KMXU22 发酵液。32℃培养一天后，抑菌圈直径平均达到30.2mm。说明KMXU22菌株对细菌性植物病原菌具有显著的抑制作用。

[0101] CGMCC NO.6597菌株的菌体特征及菌落特征：菌株为杆状，大小为0.4μm～0.7μm×1.0μm ～1.2μm，革兰氏染色阴性，无芽孢，单极生鞭毛，能运动。在KB培养基上培养24h后形成1.2mm 菌落，菌落产生橙色或褐黄色素，圆形，表面凸起，光滑，较粘稠，易挑起，边缘整齐；LB 培养基配方为：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠 (NaCl)5g/L，pH7.0，琼脂17g/L。

[0102] 菌株KMXU56：菌株KMXU56是从采自昆明神瑞农业有限公司堆肥发酵车间腐熟的水葫芦堆肥样品中分离筛选得到的一株具有较好的分解纤维素能力，能够在中高温范围 (40℃～70℃)条件下生存的短小芽孢杆菌菌株。

[0103] 该菌株已于2012年9月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，保藏号CGMCC No.6595。

[0104] 短小芽孢杆菌KMXU56的分离与纯化筛选：称取堆肥发酵车间的水葫芦渣堆肥腐熟的样品有机肥0.5g,加入20mL无菌水,混匀，使样品悬浮,取悬浮液1mL接种到含100mL 液体种子培养基的250mL摇瓶中,45℃、180r/min培养5d。取1mL培养液梯度稀释至 102、104、106、108涂布于固体培养基上47℃培养2d。挑取平板上菌落饱满、透明圈明显的单个菌落接种于液体培养基中,47℃、180r/min再培养2d。重复液体培养和固体平板分离 3次)，挑取生长旺盛的单菌落，在细菌培养基上，反复划线分离纯化3次，再将形态一致的菌落制片，进行简单染色，在油镜下观察菌体形态，多视野下观察菌体细胞形态，确认菌体形态一致后，接种至细菌斜面培养至丰厚，在4℃下保存，备用。

[0105] 将初筛得到的单菌株进行纤维素分解鉴定和不同温度活性实验，最终筛选出一株在 40℃～70℃生存生长，并有效分解纤维素的菌株KMXU56。

[0106] 菌株KMXU56的鉴定筛选：生理生化特征:菌株的生理和生化特征实验测定方法及鉴定，革兰氏染色结果表明,菌株KMXU56为革兰氏阳性。菌株KMXU56知接触酶、葡萄糖产酸、淀粉水解试验、丙二酸盐利用、硝酸盐还原、柠檬酸盐利用均为阳性；葡萄糖产气、甲基红实验、V-P测定、吲哚反应、H2S实验均为阴性；根据《伯杰细菌鉴定手册》,其特征与短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)特性相吻合。菌株KMXU56的16S rRNA基因序列分析采用 PCR技术,成功扩增出菌株KMXU56的16SrRNA基因,然后克隆和测序。测定的序列长度为1458bp，获得的16S rRNA基因序列通过GENBANK数据库 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)进行比对，结果显示相似性在99％以上的菌株均为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的菌株，把该菌株编号命名为KMXU56，并于2012年9月21 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus，保藏号CGMCC No.6595。

[0107] 短小芽孢杆菌KMXU56分解纤维素活性测定筛选：将实菌株短小芽孢杆菌KMXU56 菌株在无菌环境中接种至LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母萃取物5g/L，NaCl 10g/L,pH7.0)上，在37℃下培活化养3天，然后在无菌环境中，用接种针挑取一环KMXU56，接种至装有600ml 已灭菌的LB培养基中，在180rpm，37℃下振荡培养3天，得发酵液。发酵液经4000r/min 离心10min,上清液作为粗酶液。用0.5mL适当稀释的酶液于70℃恒温水浴预热2min 后,加入1.5mL用醋酸缓冲液pH 4.8配制的1％羧甲基纤维素钠溶液,70℃恒温水浴酶解30 min,加入1mL浓度为1mol/L的氢氧化钠摇匀以终止反应。然后加入2mL的DNS于沸水浴中
5min,用流动的冷水终止反应,冷却后在540nm下测定其吸光值,并对照标准曲线后测算酶活力。结果显示产酶的菌株KMXU56所产生的纤维素酶40℃～70℃下,相对酶活力较高,达到
95％～89％。在此温度范围之外,相对酶活力较低。

[0108] 菌株KMXU56具有如下特性：KMXU56菌株菌体呈杆状，圆末端，单个或呈短链排列， 1.2～1.5×2.0～4.0微米。能运动，革兰氏阳性，芽孢1.0～1.2×1.5～2.0微米，椭圆形，中生或次端生。该菌能水解淀粉，降解甘露聚糖、木聚糖、纤维素。

[0109] 实施例1生物菌剂提升植烟土壤微生态环境测定

[0110] 一、土壤

[0111] 在云南省临沧市耿马县县勐撒镇云烟87烤烟的植烟区(99°23'22”E,23°33'40”N)，选取两块2017年连作障碍的烟田。基础土样：选定试验地块后取试验地基础土样，若整地前取样，应取0-20cm耕层样品，若整地后移栽前取样，应取垄体正中间10-30cm耕层样品。“S”型取样，土壤样品标签注明试验地点、试验名称、取样时间、取样人姓名等信息。与此同时，采集植烟区附近未植烟的土壤，作为对照土壤。完成土壤采集后，送回昆明学院/云南省都市特色农业工程技术研究中心实验室，一部分-20℃保存，用于土壤理化性质和酚酸含量的测定，另一部分-80℃保存，用于土壤微生物多样性分析。

[0112] 二、生物菌剂

[0113] 解淀粉芽胞杆菌、荧光假单胞菌、短小芽孢杆菌的菌株分别按以下步骤制得生防菌剂：

[0114] a.将菌株移植到含有LB培养基的试管进行一环活化，32℃培养48小时；

[0115] LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)5g/L，pH7.0；

[0116] b.取一环活化后的菌苔移入用1000ml锥形瓶装的600ml所述LB培养液中，在120转/min、 32℃下培养72小时，获得发酵菌液；

[0117] c.将发酵菌液按接种量1：200倍的比例接种于所述LB培养液中，并在种子罐中进行发酵培养，种子罐的温度为32℃，发酵18小时后获得发酵种子菌种；

[0118] d.将发酵种子菌种按接种量1：20倍的比例接种于所述LB培养液中，在发酵罐中32℃下进行发酵培养，接种发酵菌液菌体5小时后，每隔2小时对发酵罐进行发酵质量检测，观10 11
察含菌量、测定发酵液的酸碱度，发酵72小时，当菌含量大于1×10 ～1×10 CFU/ml以上，酸碱度为7.0 或7.6时，储存作为生防菌剂。

[0119] 将各菌株的生防菌剂按表1所列组成，执行GB20287-2006标准制成液体或粉剂的混合菌剂，得到生物菌剂1～3。

[0120] 表1

[0121]

[0122] (1)进行4个试验设置处理：菌剂1(50倍液蘸根/灌根)；菌剂2(50倍液蘸根/灌根)；菌剂3(50倍液蘸根/灌根)；对照(同期等量清水蘸根/灌根)。

[0123] (2)施用次数：作物全生育期内使用1次：烤烟移栽时用该菌剂1︰50倍液蘸根，边蘸根边移栽，作物移栽当天内灌根，每株用量为400毫升；

[0124] (3)材料要求：生物菌剂，执行GB20287-2006标准，液体或粉剂，常规使用。在常规栽培管理措施如耕作、排灌、密度、防治病虫害等一致的前提下，采用随机区组排列试验设计，设4个处理3次重复，常规单垄移栽，行距1.2m，株距0.6m，移栽后垄高20cm，每小区种植30 株。

[0125] 三、田间对比试验性状调查方法

[0126] ①烟株农艺性状：分别于移栽后30天和打顶后采烤前，选定各处理代表性烟株3棵，测定不同处理烤烟株高、茎围、有效叶片数、叶面积指数等农艺性状指标。

[0127] ②烤烟生物量：分别于移栽后30天和打顶后采烤前，选定各处理代表性烟株3棵，挖掘法测定烟株地上部(茎、叶)、地下部(根)生物量鲜重和干重。

[0128] ③病虫害调查：成熟期调查各处理田间主要土传病害(青枯病、黑胫病、根结线虫病) 发病率和病情指数情况，每个处理重复调查3次。

[0129] 发病率(％)＝发病株数/调查总数×100％

[0130] 病情指数＝∑[(病级数×该病级株数)/(调查总数×最高级值)]×100

[0131] ④烟叶产量质量：对各处理烟叶单采单编，称量不同等级烟叶质量。测定不同处理烤烟产量、均价、产值、上等烟比例、中等烟比例和下等烟比例。

[0132] 烟叶样品：按照烤烟国家标准(GB2635-92)挑选X2F、C3F、B2F各2kg烟叶样品用于烤烟外观质量检测、化学成分检测，统一按要求填写样品识别卡，将识别卡置于样品袋内。

[0133] 四、土壤生物及理化性质测定方法

[0134] (1)土壤含水率测定

[0135] 每份土壤称取10g，准确到0.1mg，平行三份。在120℃烘箱中烘10小时，冷却，称重；再放入120℃烘箱中烘2小时，冷却，称重，至相邻二次重量相差不高于0.2％，停止加热，计算含水率。

[0136] (2)土壤pH值测定

[0137] 称取风干土壤10g于50mL高型烧杯中，加入25mL无二氧化碳的水。用玻璃棒剧烈搅动1- 2min，静止30min，此时应避免空气中氨或挥发性酸的影响。用PHS-3C型精密酸度计直接测定土壤水溶液pH值。

[0138] (3)根际土壤酚酸测定

[0139] 3.1样品处理

[0140] 3.1.1混合标准品溶液制备

[0141] 分别精密称定标准品阔马酸0.0102g，对羟基苯甲酸0.0101g，香草酸0.0102g，丁香酸0.0102g， 4-香豆酸0.0102g，阿魏酸0.0102g，用99.9％的色谱级甲醇精确定容到100mL，配制为100ppm 浓度的混合标液，4℃避光保存，待用。

[0142] 3.1.2土壤样品前处理

[0143] 供试根际土壤风干，除去须根等杂物，过40目筛，称取50g置于250ml具塞三角瓶中，加入150ml2molL-1NaOH，120rmin-1振荡提取3h，静置3h，用滤纸过滤。取上清液用5molL-lHCl调至pH为2.5。然后用乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，45℃蒸干，残渣用5ml色谱纯甲醇溶解，4℃避光保存。过0.22μm滤膜，待测。

[0144] 3.2高效液相色谱条件

[0145] 色谱柱：ACQUITYUPLCBEHC18(2.1mm×50mm,1.7μm,美国WATERS公司)；流动相A： 0.3％乙酸水溶液；流动相B：甲醇；流速为0.3ml/min；柱温35℃；进样量10μL。UPLC梯度洗脱程序如表2所示。

[0146] 表2.UPLC梯度洗脱程序

[0147]时间(min) A(％) B(％)
0 95 5
1 80 20
5 70 30
7.5 20 80
10 95 5

[0148] 3.3线性关系考察

[0149] 取“1.3.1”中的混合对照品溶液过0.22μm滤膜，分别精密吸取0.5、1、3、5、8、10μL注入HPLC 色谱仪。以对照品的含量(μg)为横坐标，以峰面积为纵坐标，制作标准曲线，R为0.999以上。

[0150] 表3酚酸类对照品的线性关系

[0151]

[0152] 3.4精密度及重复性试验

[0153] 取同一供试对照品，连续5次进样，所得结果RSD值均小于1.8％，表明仪器精密度良好。

[0154] 3.5稳定性试验

[0155] 取同一供试样品，分别于制样后0、4、8、12、16、24h后，按上述色谱条件进样10μL，对阔马酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸和阿魏酸含量的RSD值均小于3％。

[0156] 1.1.5土壤微生物多样性测定方法

[0157] 烤烟根际土壤微生物活性及区系变化研究：分别于移栽后30天和打顶后采烤前，选定各处理代表性烟株3棵，测定烤烟根际土样微生物多样性及区系变化指标。

[0158] 植烟土壤可培养微生物多样性测定方法：

[0159] ⑤样品稀释液的制备准确称取待测样品l0g，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的 250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成-1 -110 稀释液；再用1ml无菌吸管，吸取10 稀释液lml，移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、
10-7、10-8、 10-9等一系列稀释菌液。用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。

[0160] ⑥培养基配制

[0161] 细菌：采用牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3g、蛋白胨5g、NaCl5g、琼脂15-20g、水1000ml、 pH7.0)平板稀释分离计数法，培养温度27～30℃。

[0162] 真菌：采用孟加拉红培养基(葡萄糖1g、蛋白胨0.5g、KH2PO4·3H2O0.1g、MgSO4·7H2O0.05g、孟加拉红含量1mg/ml0.33ml、琼脂1.5～2g、水100ml)，平板稀释分离计数法，培养温度27～ 30℃。

[0163] 放线菌：采用高氏一号培养基(可溶性淀粉20g﹑NaCl0.5g﹑KNO31g、K2HPO4·3H2O0.5g、 MgSO4·7H2O0.5g、FeSO4·7H2O0.01g、琼脂15g﹑水1000ml、pH7.4-7.6。在混合培养基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分。注：对于FeSO4·7H2O这样的微量成分，则可预先配成高浓度的贮备液，在配制培养基时按需要加入一定的量。加重铬酸钾3％1ml抑制细菌和霉菌的生长)平板稀释分离计数法，培养温度27～30℃。

[0164] ⑦平板接种培养先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上(每个编号设三个重复)。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20-30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌落后即可计数。

[0165] 用移液枪从试管中吸取100ul土壤悬浮液放入培养皿中，在无菌条件下把土壤悬浮液均匀涂开，然后在恒温箱中培养。(注：涂平板时要等到琼胶平板表面的冷凝水消失后才能划线，否则细菌将在冷凝水中流动而影响形成整片的菌落而无法统计其个数和划分种类。)

[0166] ⑧菌落计数方法每毫升中菌数﹦平板上菌落数×稀释倍数/平板上加菌液的量(ml)

[0167] A.植烟土壤微生物多样性分子测定研究

[0168] ①基因组DNA的提取

[0169] 采用天根磁珠法提取烤烟根际土壤与非植烟区对照土壤样本的基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的纯度和浓度。纯化后，取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1ng/μl。

[0170] ②PCR扩增(Bio-radT100梯度PCR仪)

[0171] (1)模板：稀释后的基因组DNA；

[0172] (2)引物：使用带Barcode的特异引物341F-543R(扩增16SV3区域)。

[0173] 341F:CCTAYGGGRBGCASCAG，543R:ATTACCGCGGCTGCTGG

[0174] (4)酶和缓冲液：使用NewEnglandBiolabs公司的 High- FidelityPCRMasterMixwithGCBuffer。

[0175] PCR反应体系和程序(30μL)：

[0176] pHusionMasterMix(2×)15μL

[0177] Primer(2μM)3μL

[0178] gDNA(1ng/μL)10μL(5～10ng)

[0179] H2O 2μL

[0180] 反应程序：98℃预变性1min；30个循环包括(98℃，10sec；50℃，30sec；72℃，30sec)； 72℃，5min

[0181] (5)纯度检测：PCR产物纯度使用2％(m/v)的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

[0182] ③PCR产物的混样和纯化

[0183] 根据PCR产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后，使用1×TAE浓度2％(m/v)的琼脂糖胶电泳纯化PCR产物，选择主带大小在400-450bp之间的序列，割胶回收目标条带。产物纯化试剂盒使用的是ThermoScientific公司GeneJET胶回收试剂盒。

[0184] ④文库构建和上机测序

[0185] 使用New England Biolabs公司的 UltraTMDNALibraryPrepKitforIllumina建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit定量和文库检测，合格后，使用HiSeq进行上机测序。高通量测序工作由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

[0186] 根据所扩增的16SV3区域特点，基于IlluminaHiSeq测序平台，利用双末端测序(Paired-End) 的方法，构建小片段文库进行双末端测序。通过对Reads拼接过滤， OTUs(OperationalTaxonomicUnits)聚类，并进行物种注释、丰度分析及与环境因子的相关性分析，获得连作烟草根际土壤中细菌多样性信息。

[0187] 数据处理

[0188] 用SPSS16.0等相关分析软件，进行描述性分析、正态分析和频率分析等。

[0189] 2、结果与分析

[0190] 2.1试验设置

[0191] 2.1.1基础土样采集

[0192] 2018年5月在云南省临沧市耿马县县勐撒镇云烟87烤烟的植烟区(99°23'22”E,23°33'40”N)，选取连作障碍的烟田，根结线虫病发病严重(前作为玉米)。选定试验地块后取试验地基础土样：整地后取样。完成土壤采集后，送回昆明学院/云南省都市特色农业工程技术研究中心实验室，一部分-20℃保存，用于土壤理化性质和酚酸含量的测定，另一部分-80℃保存，用于土壤微生物多样性分析。试验区植烟土壤类型为红壤，土壤质地为轻粘土，试验地土壤pH值为 4.69，有机质含量为29.13g/kg，水解性氮含量为155.28mg/kg，铵态氮含量为2.48mg/kg，有效磷含量为8.84mg/kg，速效钾含量为145.97mg/kg。

[0193] 表4移栽前土壤养分检测结果

[0194]

[0195] 2.1.2试验处理设置

[0196] 进行4个试验设置处理：菌剂1(50倍液蘸根/灌根)；菌剂2(50倍液蘸根/灌根)；菌剂3(50倍液蘸根/灌根)；对照(同期等量清水蘸根/灌根)。移栽当天内灌根，每株用量为400毫升；在常规栽培管理措施如耕作、排灌、密度、防治病虫害等一致的前提下，采用随机区组排列试验设计，设每处理3次重复，常规单垄移栽，行距1.2m，株距0.6m，移栽后垄高20cm，每处理种植100株。

[0197] 2.2试验处理烟株农艺性状测定结果及分析

[0198] 2.2.1不同处理旺长期农艺性状测定结果及分析

[0199] 表5.移栽后20d各处理农艺性状测定

[0200]

[0201]

[0202] 注：不同字母表示差异显著(P<0.05)

[0203] 由表5知，施用生物菌剂在移栽后20d时与对照相比烟株的生长无明显作用，烟株的株高、有效叶片数、叶长、茎围、鲜重和干重，均与对照间无显著差异，且部分指标低于对照，这可能是由于施用后，生物菌剂在土壤中定殖并产生作用需要一定的时间过程。

[0204] 2.2.2采烤前农艺性状测定结果及分析

[0205] 表6.采烤前各处理农艺性状测定(2018年7月)

[0206]

[0207] 注：不同字母表示差异显著(P<0.05)

[0208] 由表6可知，与对照相比，施用生物菌剂后在采烤前已明显影响烟株的生长，各生物菌剂处理烟株的株高、有效叶片数、叶长、茎围、鲜重和干重等参数值都较对照(即不施用生物菌剂)均有一定程度的提高，尤其是株高、有效叶片数、叶长、单株鲜重与干重，均与对照间达到显著差异。上述结果初步表明：施用生物菌剂在土壤中定制并产生作用需要一定的时间过程，可以在烟株的后期生长中产生作用，一定程度上促进烟株的生长。

[0209] 2.3试验处理可培养微生物数量结果及分析

[0210] 土壤微生物的数量、活性和群落结构及其变化，直接影响到植物吸收水分、养分，也影响植物对恶劣环境的抵抗能力。细菌是土壤微生物中数量最多的一个微生物类群，占土壤微生物总数的70％-90％，参与有机质的分解，氨化作用等，是土壤有机物质和养分分解转化的主要参与者；真菌参与土壤中有机质的分解、腐殖质的形成、土壤中的氨化作用以及团聚体的形成，在土壤碳素和能源循环过程中起着巨大作用，但真菌是许多作物病害的病原菌，与作物土传病害的发生直接相关；放线菌具有较强分解复杂有机化合物的能力，与土壤腐殖质含量有关，它能同化无机氮，分解碳水化合物及脂类、单宁等难分解的物质，在土壤中对物质转化也起一定作用，另外，多种放线菌还能产生抗生素物质，因此，放线菌与土壤肥力以及有机质转化和植物病害防治有着密切关系。具体如下：

[0211] 2.3.1不同处理旺长期土壤微生物数量测定结果与分析

[0212] 表7.各生物菌剂处理旺长期微生物数量比较

[0213] 处理设置细菌(cfu/g) 真菌(cfu/g) 放线菌(cfu/g) 真菌/细菌处理一(菌剂1) 1.31*107 1.80*105 1.60*105 0.0137
处理二(菌剂2) 2.84*107 1.53*105 0.50*105 0.0054
7 5 5
处理三(菌剂3) 2.20*10 2.33*10 0.40*10 0.0106
CK 1.29*107 1.10*105 0.50*105 0.0085

[0214] 生物菌剂处理对植烟土壤微生物有一定影响(表7，在刚处理20天后，各生物菌剂处理后土壤微生物数量均高于对照(清水处理)，有利于土壤有机质的分解和腐殖质的形成。真菌/ 细菌比是评价土壤肥力和健康程度的重要指标之一，土壤真菌/细菌比越高代表土壤肥力越高、土壤生态系统稳定程度也越高，在处理20天后，菌剂1和菌剂3处理后土壤的真菌/细菌比明显高于对照，说明生物菌剂对土壤肥力及活性有一定的影响。

[0215] 在旺长期，不同处理对土壤微生物数量有一定影响，细菌表现为处理二＞处理三＞处理一＞CK，其中处理二的细菌数量最多；真菌表现为处理三＞处理一＞处理二＞CK，其中处理三的真菌数量最多；放线菌表现为处理一＞处理二＝CK＞处理三，其中处理一的放线菌数量最多，但其余三个处理间无显著性差异。

[0216] 2.3.2不同处理采烤前土壤微生物数量测定结果与分析

[0217] 表8.各生物菌剂处理采烤前微生物数量比较

[0218]处理设置细菌(cfu/g) 真菌(cfu/g) 放线菌(cfu/g) 真菌/细菌
处理一(菌剂1) 7.19*107 1.26*105 1.23*105 0.0018
处理二(菌剂2) 7.29*107 1.63*105 3.00*105 0.0022
处理三(菌剂3) 11.51*107 1.25*105 2.55*105 0.0011
CK 7.27*107 1.38*105 2.26*105 0.0019

[0219] 随着生长时期增加，植物生长迅速，土壤微生物也较活跃，与移栽20天相比，土壤微生物细菌和放线菌数量呈显著增长趋势。其中部分处理细菌数量变化较大，与其它试验处理呈显著差异。

[0220] 在采烤前期不同处理对土壤微生物数量有影响不同，细菌表现为处理三＞处理二＞CK＞处理一，其中处理三的细菌数量最多，呈显著性差异；真菌表现为处理二＞CK＞处理一＞处理三，但四个处理间无显著性差异；放线菌表现为处理二＞处理三＞CK＞处理一，其中处理二的放线菌数量最多，但其余三个处理间无显著性差异。

[0221] 2.3.3不同处理采烤后土壤微生物数量测定结果与分析

[0222] 表9各生物菌剂处理采烤后微生物数量比较

[0223]处理设置细菌(cfu/g) 真菌(cfu/g) 放线菌(cfu/g) 真菌/细菌
处理一(菌剂1) 2.19*107 4.18*105 0.73*105 0.019
处理二(菌剂2) 2.71*107 2.42*105 1.20*105 0.009
处理三(菌剂3) 3.61*107 3.00*105 1.27*105 0.008
7 5 5
CK 1.87*10 1.33*10 1.35*10 0.007

[0224] 2.3.4试验处理不同时期微生物数量变化分析

[0225] 根据以上表格中数据，采用EXCEL绘制折线图。根据所得折线图分析数据变化情况。

[0226] 2.4试验处理土壤生物及理化性质测定

[0227] 不同处理及在烤烟生长的旺长期、采烤前期、采烤后期三个时期植烟土壤的pH、电导率、硝态氮、铵态氮、有效磷、速效钾、有机质、全氮(％)等数据已完成检测。结果表明各菌剂处理可在一定程度上有效提高植烟土壤肥力和活性，缓解土壤酸化指标，详见表10[0228] 表10同生物菌剂处理对土壤养分的影响

[0229]

[0230]

[0231] 2.5试验处理测定结果如下：

[0232] 不同处理在烤烟生长的旺长期、采烤前期时期植烟土壤的酚酸类物质测定。结果表明各有生物菌剂处理与常规对照相比可在一定程度降低酚酸类物质含量，提高土壤活性，详见表11。

[0233] 表11.不同生物菌剂处理对土壤酚酸类物质的影响

[0234]

[0235] 2.6试验处理经济性状调查结果

[0236] 通过不同土壤调控措施处理，进行经济性状调查结果表明，菌剂处理比常规处理在产量、产值上等烟比、中等烟比等方面比较一致，无显著性差异。

[0237] 表12不同生物菌剂处理经济性状调查结果

[0238] 处理产量(kg/亩) 产值(元/亩) 上等烟比(％) 中等烟比(％) 下等烟比(％) 均价(元/kg) 对照 124.20 3457.73 69.08 23.83 6.73 27.84菌剂1 121.10 3348.42 67.40 24.79 7.09 27.65
菌剂2 123.70 3440.10 68.65 24.06 6.76 27.81
菌剂3 121.80 3365.33 67.55 24.50 7.22 27.63

[0239] 实施例2生物有机肥提升植烟土壤微生态环境水平的测定方法

[0240] 一、土壤

[0241] 同实施例1。

[0242] 二、生物有机肥

[0243] 按以下步骤制备得到生物有机肥1～4，

[0244] 1)粉碎甘蔗渣至细度100～150目，将甘蔗渣粉：草炭：腐植酸：磷矿粉混合后，进行堆肥自然发酵，其间当温度升至62℃时进行翻堆以充分发酵，翻堆后继续发酵，直至物料均为灰黑褐色时，物料发酵成熟，得生物磷肥基质；其中所用磷矿粉中磷元素的质量百分数为15～20％，其余成分为SiO2。

[0245] 2)将生防菌种子液1与所得生物磷肥基质混匀后，制成生物有机肥；

[0246] 所得生物有机肥中：含有1×1010个/g以上的拮抗微生物数量(菌株KMXU1)、全氮含量为5～6％，总氮磷钾养分为6～8％、有机质含量为40％。

[0247] 生物有机肥1～4的制备条件及其中各物质含量如下表所列。

[0248] 表13

[0249]

[0250] 处理设置：

[0251] 处理一：常规(习惯施肥)；

[0252] 处理二：亩施活性功能生物有机肥(1)150千克+习惯施肥减量10％；

[0253] 处理三：功能生物有机肥(2)150千克+习惯施肥减量10％；

[0254] 处理四：亩施活性功能生物有机肥(3)150千克+习惯施肥减量10％；

[0255] 处理五：亩施酵素炭肥300千克+习惯施肥减量10％；

[0256] 处理六：空白对照(ck)，不施任何无机肥料和有机肥。肥料按习惯施肥进行塘施。

[0257] 在常规栽培管理措施如耕作、排灌、密度、防治病虫害等一致的前提下，采用随机区组排列试验设计，设6个处理3次重复，常规单垄移栽，行距1.2m，株距0.6m，移栽后垄高20cm；每处理种植100株。供试品种：云烟87。

[0258] 2、试验处理烟株农艺性状测定结果及分析

[0259] 2.1不同处理旺长期农艺性状测定结果及分析

[0260] 农艺性状测定方法与实施例1相同。结果如表14示。

[0261] 表14移栽后20d各处理农艺性状测定

[0262]

[0263] 注：不同字母表示差异显著(P<0.05)

[0264] 由表13知，不同处理在移栽后20d时与对照(CK，常规处理)相比各农艺性状存在显著差异，其中不同有机肥(处理二、处理三、处理四、处理五)及酵素炭肥(处理六)烟株的株高、有效叶片数、叶长、茎围、鲜重和干重均有一定程度增高，且部分指标差异显著。

[0265] 2.2.2采烤前农艺性状测定结果及分析

[0266] 表15采烤前各处理农艺性状测定(2018年7月)

[0267]

[0268]

[0269] 注：不同字母表示差异显著(P<0.05)

[0270] 由表15知，与对照相比，施用不同有机肥料后在采烤前已明显影响烟株的生长，各施肥处理烟株的株高、有效叶片数、叶长、茎围、鲜重和干重等参数值都较对照(CK及常规施肥) 均有一定提高，尤其是株高、鲜干重均与对照达到显著差异。

[0271] 2.3试验处理可培养微生物数量结果及分析

[0272] 2.3.1不同处理旺长期土壤微生物数量测定结果与分析

[0273] 表16各处理旺长期微生物数量比较

[0274] 处理设置细菌(cfu/g) 真菌(cfu/g) 放线菌(cfu/g) 真菌/细菌处理一(常规) 2.65*107 0.90*105 0.60*105 0.0034
处理二(有机肥1) 1.57*107 1.00*105 1.47*105 0.0064
处理三(有机肥2) 4.08*107 1.40*105 0.40*105 0.0034
处理四(有机肥3) 1.71*107 0.40*105 1.07*105 0.0023
处理五(有机肥4) 3.15*107 1.67*105 1.90*105 0.0053
处理六(酵素生物炭肥) 1.64*107 1.87*105 0.67*105 0.0114

[0275] 在旺长期，不同处理对土壤微生物数量有一定影响(表16，细菌表现为处理三＞处理五＞处理一＞处理四＞处理六＞处理二，其中处理三的细菌数量最多；真菌表现为处理六＞处理五＞处理三＞处理二＞处理一＞处理四，其中处理六的真菌数量最多；放线菌表现为处理五＞处理二＞处理四＞处理一＞处理三，其中处理五及处理二的放线菌数量较多，但其余四个处理间无显著性差异。

[0276] 2.3.2不同处理采烤前土壤微生物数量测定结果与分析

[0277] 表17.各处理采烤前微生物数量比较

[0278]

[0279]

[0280] 在采烤前期不同处理对土壤微生物数量影响不同(表17，细菌表现为处理三＞处理二＞处理五＞处理一＞处理四＞处理六，其中处理三、处理二、处理五细菌数量较多；真菌数量六个处理中无显著性差异；放线菌的数量反应与各处理土壤pH变化趋于一致，酵素生物炭肥(处理六)处理后，烟株根际土壤pH值有一定提高，提供了有利于放线菌的生长环境。

[0281] 2.3.3不同处理采烤后土壤微生物数量测定结果与分析

[0282] 表18各有机肥处理采烤后微生物数量比较

[0283] 处理设置细菌(cfu/g) 真菌(cfu/g) 放线菌(cfu/g) 真菌/细菌处理一(常规) 1.81*107 1.47*105 1.30*105 0.0081
处理二(有机肥1) 2.19*107 4.18*105 0.73*105 0.0191
处理三(有机肥2) 2.71*107 2.42*105 1.20*105 0.0089
处理四(有机肥3) 3.61*107 3.00*105 1.27*105 0.0083
处理五(有机肥4) 2.90*107 3.23*105 2.55*105 0.0111
处理六(酵素生物炭肥) 1.02*107 1.46*105 3.48*105 0.0143

[0284] 2.3.4试验处理不同时期微生物数量变化分析

[0285] 根据以上数据采用EXCEL绘制折线图，获取数据变化趋势，并分析折线图。

[0286] 2.4试验处理土壤生物及理化性质测定

[0287] 不同处理：处理一(常规)、处理二(有机肥1)、处理三(有机肥2)、处理四(有机肥3)、处理五(有机肥4)、处理六(酵素生物炭肥)及在烤烟生长的旺长期、采烤前期、采烤后期三个时期植烟土壤的pH、电导率、硝态氮、铵态氮、有效磷、速效钾、有机质、全氮(％)等数据检测，结果表明各有机肥处理及酵素生物炭肥可有效提高植烟土壤pH值，缓解土壤酸化指标，与常规对照相比酵素生物炭肥较为明显(pH6.32)，详见表19。

[0288] 表19同有机肥处理对土壤养分的影响

[0289]

[0290]

[0291]

[0292] 2.5试验处理土壤酚酸类物质的影响

[0293] 不同处理：处理一(常规)、处理二(有机肥1)、处理三(有机肥2)、处理四(有机肥3)、处理五(有机肥4)、处理六(酵素生物炭肥)及在烤烟生长的旺长期、采烤前期时期植烟土壤的酚酸类物质测定。结果表明各有机肥处理及酵素生物炭肥与常规对照相比可降低酚酸类物质含量，缓解土壤酸化指标，详见表20。

[0294] 表20.不同有机肥处理对土壤酚酸类物质的影响

[0295]

[0296]

[0297] 2.6试验处理经济性状调查

[0298] 通过不同土壤调控措施处理，进行经济性状调查结果表明，有机肥处理比常规处理在产量、产值上等烟比、中等烟比等方面均有一定程度的提高，其中处理有机肥2和处理有机肥3效果较为明显。

[0299] 表21.不同有机肥处理经济性状调查结果

[0300]

[0301] 在本说明书中所谈到的“一个实施例”、“另一个实施例”、“实施例”、“优选实施例”等，指的是结合该实施例描述的具体特征、结构或者特点包括在本发明概括性描述的至少一个实施例中。在说明书中多个地方出现同种表述不是一定指的是同一个实施例。进一步来说，结合任一实施例描述一个具体特征、结构或者特点时，所要主张的是结合其他实施例来实现这种特征、结构或者特点也落在本发明的范围内。

[0302] 尽管这里参照本发明的多个解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本发明公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本发明公开和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变形和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。

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