技术领域
[0001] 本
发明属于
生物农药领域，具体涉及一种用于防治植物根结线虫的肠杆菌及应用。
背景技术
[0002] 植物寄生线虫在世界上许多国家和地区发生和为害，种类多种多样。在全球范围内，植物寄生线虫的发生与危害随着农林业的发展和耕作栽培制度的变化日益严重，据Esser统计，到1990年为止全世界已报道发现植物寄生线虫207属4832种。据估计，植物寄生线虫造成世界主要
农作物的年损失率为12.3％，超过1000亿美元，而实际的损失远远超过估计，理由是许多线虫造成的危害因没有田间可见症状或专化性特征而未引起注意，此外，世界范围内对线虫为害的新发现还在不断增加，而且一些更新的农业栽培体制使线虫问题更加突出，再者，线虫与其它生物相互作用而对植物产生的直接或间接影响还在急剧增加。从这种意义上说，线虫造成的危害较其它生物更加隐蔽！目前对植物有害的线虫约有3000多种，在我国主要有大豆胞囊线虫、根结线虫、松材线虫、甘薯茎线虫等。根结线虫(Meloidogyne)病是一类重要的植物寄生线虫病，一旦发生难以防除和根治，其寄主广泛，可寄生于110多个科的3000多种植物上从而常给农业生产带来严重的经济损失，世界上重要的经济作物每年因根结线虫病造成的损失高达数百亿美元，在我国尤其在保护地蔬菜栽培中，
温室一般发病达20％～30％，严重发病造成的损失可达60％～70％，甚至绝产绝收。
目前，植物寄生线虫的防治仍以
化学防治为主，但近年来，化学杀线剂的应用浪费大，污染环境，选择性差，灭生性强，破坏
土壤生物区系等弊端日益为人们所重视，21世纪称为环保世纪，一些有效的化学杀线剂的应用逐步受到限制，因此对植物寄生线虫的
生物防治研究自然成为热点问题。
发明内容
[0003] 为了弥补上述
现有技术的不足，本发明的目的是提出一种用于防治植物根结线虫的生防菌及应用，所述生防菌对植物根结线虫具有优异的防治作用，同时可以促进植物生长，提高植物对线虫的抗性，为开发新型
种子处理剂和诱导剂提供新的资源。
[0004] 本发明提供了一种用于防治植物根结线虫的肠杆菌，所述肠杆菌保藏单位为中国普通
微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.16336，保藏时间为2018年8月24日，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)。
[0005] 所述肠杆菌的菌学特征：在NA固体培养基上培养24h后，形成圆形，乳白色菌落，表面光滑；将菌落进行革兰氏
染色，菌落在
显微镜下观察为红色，菌株为革兰氏阴性菌；扫描电镜观察发现，菌体直杆状，两端钝圆，周生鞭毛(通常为4-6根)且具有运动性，菌株能分解
葡萄糖、甘露糖，MP-VP反应，赖
氨酸脱羧酶。
[0006] 本发明提供了一种肠杆菌菌剂的制备方法：其技术要点是，所述肠杆菌的液体
发酵培养基为YMB(Yeast Mannitol Broth)培养基，成分为(g/L)：
酵母提取物1.0；甘露醇10.0；
磷酸氢二
钾0.5；
硫酸镁0.2；
氯化钠0.1；
碳酸
钙1.0；pH 6.8-7.0；将所述肠杆菌的菌种接种到250mL三
角瓶(每瓶装150mL)上述液体发酵培养基中，发酵
温度为25-28℃，摇床转速150r·min-1、发酵时间2-3d后，将肠杆菌的浓度调至浓度为107-108CFU/mL，制得肠杆菌菌剂。
[0007] 本发明提供了一种肠杆菌菌剂在防治植物根结线虫中的应用，具体使用方法为：在作物苗期采用灌根的方法，肠杆菌的浓度调至为107-108CFU/mL，发酵液处理量为100-
200mL/棵。
[0008] 进一步的，所述肠杆菌菌剂可与
杀线虫剂阿维菌素混合使用，混剂中所述肠杆菌菌剂的浓度为106-107CFU/mL，所述阿维菌素在肠杆菌菌剂中的含量为5-20μg/mL菌剂，混剂的使用量为100-200mL/棵。
[0009] 进一步的，所述肠杆菌菌剂可与杀线虫剂噻唑膦混合使用，混剂中所述肠杆菌菌剂的浓度为106-107CFU/mL，所述噻唑膦5-20μg/mL，混剂的使用量为100-200mL/棵。
[0010] 本发明提供了一种肠杆菌菌剂提高植物对线虫抗性和促进植物生长的应用方法，其技术要点是：将作物种子进行表面消毒，无菌
水冲洗干净，晾干后采用肠杆菌菌剂拌种，7 8
所述肠杆菌菌剂浓度为10-10CFU/mL,处理量为5-50μL/g种子。
[0011] 进一步的，所述肠杆菌菌剂提高番茄对线虫的抗性和促进其生长的应用方法为：将番茄种子进行表面消毒，无菌水冲洗干净，晾干后采用肠杆菌菌剂拌种，所述肠杆菌浓度为5×107-1×108CFU/mL,处理量为20μL/g种子。
[0012] 本发明的有益效果：本发明提出的肠杆菌菌剂对植物根结线虫具有优异的防治作用，同时可以促进植物生长，提高植物对线虫的抗性，为开发新型种子处理剂和诱导剂提供新的资源；肠杆菌菌剂与传统杀线虫剂混合使用对线虫具有优异的防效，可降低化学药剂的施用量，降低农药残留，具有环保意义。
具体实施方式
[0013] 为了更详细地进一步阐明而不是为了限制本发明，给出了下列
实施例。
[0014] 实施例1：
[0015] 制备肠杆菌(Enterobacter ludwigii)Sneb1987菌剂
[0016] 将肠杆菌(Enterobacter ludwigii)Sneb1987的菌株接种到试管培养基上，培养基配方为酵母甘露醇琼脂(YMA)，成分为(g/L)：酵母提取物1.0；甘露醇10.0；
磷酸氢二钾0.5；
硫酸镁0.2；氯化0.1；碳酸钙1.0；琼脂15g；pH 6.8，28℃培养3d，获得试管种。
[0017] 再将试管种接种到250mL三角瓶(每瓶装150mL)液体培养基中，培养基为YMB培养基，成分为(g/L)：酵母提取物1.0；甘露醇10.0；磷酸氢二钾0.5；硫酸镁0.2；氯化钠0.1；碳酸钙1.0；pH 6.8-7.0。发酵温度为25-28℃，摇床转速150r·min-1、发酵时间2-3d。
[0018] 将上述肠杆菌发酵液调整浓度为108CFU/mL，制成肠杆菌菌剂，用于处理番茄种子。
[0019] 试验地点：辽宁省
铁岭市蔡
牛乡营盘村。
[0020] 番茄品种为L-402，辽宁省农业科学院蔬菜研究所提供，种子市场也可购买，番茄种子先用
次氯酸钠溶液表面消毒，再用无菌水冲洗，采用上述肠杆菌发酵液处理番茄种子，Sneb1987发酵菌剂和种子采用一定比例(即每克种子与20μL肠杆菌发酵液一起处理)进行混匀，待植物长到两叶一心
时移栽。
[0021] 在番茄移栽45天后，将番茄苗连根拔出，保持根系的完整，查看根系的根结级数并计算根级指数，对结果进行统计分析，采用肖炎农分级标准(肖炎农，王明祖，付艳萍等.蔬菜根结线虫病情分级方法比较.华中农业大学学报，2000,19(4)：336-338)统计根级指数；根级指数＝∑[(级数×病株数)×100]/(调查总株数×病害最高级数)，∑是各级乘积数值的总和。
[0022] 试验调查：
[0023] 表1肠杆菌菌剂对番茄根结线虫的防治作用
[0024]
[0025] 实施例2：
[0026] 制备肠杆菌(Enterobacter ludwigii)Sneb1987菌剂
[0027] 将肠杆菌(Enterobacter ludwigii)Sneb1987的菌株接种到试管培养基上，培养基配方为为酵母甘露醇琼脂(YMA)，成分为(g/L)：酵母提取物1.0；甘露醇[0028] 10.0；磷酸氢二钾0.5；硫酸镁0.2；氯化0.1；碳酸钙1.0；琼脂15g；pH6.8。28℃培养3d，获得试管种。
[0029] 再将试管中菌种接到摇瓶中进行发酵，250mL三角瓶(每瓶装150mL)液体培养基中，培养基为YMB培养基，成分为(g/L)：酵母提取物1.0；甘露醇
[0030] 10.0；磷酸氢二钾0.5；硫酸镁0.2；氯化钠0.1；碳酸钙1.0；pH 7.0。发酵温度为28℃，摇床转速150r·min-1、发酵时间2-3d，调整菌液浓度为107CFU/mL，制成肠杆菌菌剂。
[0031] 防治南方根结线虫田间试验：本试验分别在辽宁省铁岭市铁岭县蔡牛乡东贝河
温室大棚进行田间效果试验。番茄品种为L-402，辽宁省农业科学院蔬菜研究所提供，也可以在种子市场购买到。
[0032] 试验药剂：肠杆菌菌剂，肠杆菌浓度为107CFU/mL；
[0033] 肠杆菌菌剂+1.8％阿维菌素
乳油混剂，在肠杆菌菌剂中加入阿维菌素；1.8％阿维菌素乳油稀释1000倍，即999ml肠杆菌菌剂中加入1ml浓度为1.8％阿维菌素乳油，肠杆菌在混剂中的浓度为107CFU/mL；
[0034] 肠杆菌菌剂+10％噻唑膦颗粒剂混剂，在肠杆菌菌剂中加入噻唑膦；10％噻唑膦颗粒剂使用剂量为200μg/mL药剂，肠杆菌在混剂中的浓度为107CFU/mL。
[0035] 试验方法：
[0036] 番茄育苗在温室大棚进行，待番茄植株生长至四叶期时移栽到试验大棚中，完全随机种植。试验处理植株每株根灌注200mL菌株发酵液、肠杆菌菌剂+1.8％阿维菌素乳油混剂、肠杆菌菌剂+10％噻唑膦颗粒剂混剂，番茄根灌注未接菌株的YMB
营养液和清水为对照，在移栽后45d进行调查，将番茄植株连根挖出，保持根系完整，调查番茄根系根结指数。
[0037] 试验结果：
[0038] 使用肠杆菌菌剂和两个混剂处理的番茄，根结指数明显低于对照，在铁岭蔡牛乡的防效分别为57.14％和50％，肠杆菌与阿维菌素的混剂在两地的防效分别为66.67％和59.09％，肠杆菌与噻唑膦的混剂在两地的防效分别为84.38％和63.64％，均大于肠杆菌菌剂的防效。
[0039] 表2Sneb35菌剂处理番茄
幼苗在辽宁铁岭的田间防效
[0040]
[0041] 注：45d后的调查后的结果
[0042] 实施例3：肠杆菌(Enterobacter ludwigii)Sneb1987菌剂防治南方根结线虫盆栽效果试验
[0043] 为了验证其诱抗的
稳定性，特此进行了盆栽的防治效果研究。本试验在沈阳农业大学温室大棚进行盆栽效果试验，以未经过包衣的番茄种子和YMB液体培养液包衣的番茄种子为对照，试验重复两次。
[0044] 肠杆菌菌剂制备方法同实施例1；
[0045] 试验番茄品种同实施例1；
[0046] 种子处理方法同实施例1；
[0047] 供试线虫：采自辽宁省铁岭市李千户镇营盘村大棚发病严重的番茄根系，经鉴定为南方根结线虫(Meloidogyne incognita)，用
镊子挑取饱满成熟的
卵囊，放入盛有无菌水的灭菌培养皿中，然后用0.5％NaClO消毒3min，并无菌水冲洗3次，从中挑取完整且饱满的卵囊，置入盛有适量无菌水的灭菌培养皿中，将其放入28℃的恒温箱中培养，3d后将孵化出的二龄幼虫J2接种到温室内易感病的番茄根部进行扩繁。将扩繁获得的卵囊采用浅盘法孵化出J2，制备成线虫悬浮液200条/mL。
[0048] 处理方法：将包衣后晾干的番茄种子
播种到育苗钵中，待番茄植株长到四叶期时进行移栽，移栽到12×12cm的钵中，定植3天后，每盆接种2000条根结线虫。以未经过包衣的番茄种子和YMB液体培养液包衣的番茄种子为对照，在移栽后45d进行调查，测量番茄株高、根长、根鲜重和根结数。
[0049] 试验结果：使用肠杆菌Sneb1987菌剂处理的番茄，根结数明显低于对照，番茄株高、根长、根鲜重与未处理的番茄存在明显差异，盆栽防效为50.49％。
[0050] 表3肠杆菌Sneb1987菌剂包衣处理番茄种子盆栽防效
[0051]处理 株高(cm) 株鲜重(g) 根结数(个) 盆栽防效
Sneb1987 34.17±5.51a 7.37±2.79a 40.6±21.69b 50.49％
YMB 30.56±5.17b 5.45±1.46b 72.00±20.88ab ——
CK 28.89±5.36b 4.95±1.96b 82.00±34.06a ——
[0052] 实施例4：肠杆菌(Enterobacter ludwigii)Sneb1987发酵产品对二龄幼虫/卵的作用
[0053] 为了验证其对根结线虫二龄幼虫(J2)以及卵的作用效果，特此进行了。本试验在沈阳农业大学北方线虫研究所室内进行，以无菌水为对照，贝氏小皿法将发酵液直接处理根结线虫二龄幼虫以及卵粒，24h统计线虫死亡率，3d后统计卵囊孵化抑制率，试验重复两次。
[0054] 二龄幼虫J2获得方法同实施例2；
[0055] 肠杆菌菌剂制备方法同实施例2，获得发酵液后1000r·min-1离心10min,弃沉淀，保留上清液用于后续试验。
[0056] 根结线虫卵粒获得采用
蔗糖离心分离法，用将含有根结线虫卵囊的根剪成5cm左右小段，放在
豆浆机中，配成0.5％NaClO搅碎，分别过40-100-400目筛子，收集400目筛子的卵囊，用喷头轻轻淋洗套筛，然后翻转400目网筛，从网筛背面细水流小心淋洗，将残余物
洗入烧杯中。将烧杯中的混合物倒入离心管，低速离心机，2000rpm/min离心4min。弃去离心管中上清液，注入比重1.18的蔗糖溶液(673g蔗糖溶于1000mL水)，用玻璃棒搅匀后，2000rpm/min离心1min。将上层蔗糖悬液缓慢倾入500目(孔径25μm)网筛中，用细水流淋洗线虫卵粒样品到烧杯中，进行后续试验。
[0057] 所述肠杆菌菌剂防治根结线虫二龄幼虫的菌剂浓度与所述肠杆菌抑制根结线虫卵孵化的处理浓度均为107CFU/mL。大约100个二龄幼虫以及400粒卵粒置于菌发酵液中。分别24h统计线虫死亡率，3d后统计卵囊孵化抑制率。
[0058] 试验结果：使用Sneb1987发酵产品处理二龄幼虫和卵粒，线虫死亡率显著高于对照，相对致死率提高了10.56倍，线虫孵化率也受到明显抑制，相对抑制达到4.723倍。
[0059] 表4肠杆菌菌剂对线虫J2死亡，卵孵化影响
[0060]
