技术领域
[0001] 本
发明涉及
食品安全领域，具体涉及一种亲水性广谱固相萃取柱的制备及应用，该亲水性广谱固相萃取柱主要用在检测动物源性食品中磺胺类兽药、雌
激素、磺酰脲类
除草剂和
氨基
甲酸酯类
农药四种农兽药残留的富集和分离上。
背景技术
[0002] 食品中存在的磺胺类兽药、雌激素、磺酰脲类除草剂及氨基甲酸酯类农药均是造成食品安全问题的重要因素。磺胺类兽药以其广谱、高效、用量少的优势已经成为目前使用量最大的抗菌药之一。由于不合理的用药，磺胺类药物在动物源性食品中的残留很严重。通过各种途径摄入的磺胺类药物均会在人体内造成蓄积，从而对人体健康造成危害。其对人体的危害主要包括过敏反应、泌尿系统的危害、抑制白细胞的生成等。雌激素是一类类固醇类内分泌干扰物，其可以通过
蛋白质的同化作用，通过食物链影响人体内的矿物质、脂肪、糖类和蛋白质的新陈代谢。同时可以促进动物生长、增加蛋白质沉积和增强
饲料的转化率。雌激素作为内分泌干扰物之一，在较低的浓度下也可以表现出较强的内分泌干扰作用，造成
肿瘤，例如
乳腺癌、
前列腺癌等。并且目前有研究指出过量的雌激素残留与儿童的性早熟有关。欧盟及包括中国在内的许多国家都已经颁布法律禁止己烯雌酚或者其作为饲料的添加剂在
畜牧业中使用。与磺胺类药物和雌激素不同，磺酰脲类除草剂和氨基甲酸酯类农药
杀虫剂主要应用于大豆田、玉米田和水稻田中
杂草的防治。由于这两种农药的高效、广谱和方便性，其得到了广泛的应用。这些污染物的残留与急性、慢性中毒，甚至是急性和癌症的发病有关。基于上述原因，为了保护食品安全和人类的健康，建立一种能同时检测多种农兽药残留的方法是十分有必要的。
[0003] 但是由于这几类物质在食品中的残留量是痕量的，再加之食品基质的复杂性，给痕量污染物的检测带来了一定的困难。所以在检测之前，样品的前处理、
净化是必不可少的一步。由于操作简单、所需的
溶剂少、时间短、效率高的优点，固相萃取技术打破传统液-液萃取法的弊端，成为目前应用的最多的样品前处理方法。但是目前所应用的固相萃取柱在水相中的
吸附力较差，限制了固相萃取柱的应用范围。本发明公开了一种可以用于完全水相且对磺胺类药物、雌激素、磺酰脲类除草剂、氨基甲酸酯类农药均具有吸附力的广谱性固相萃取柱。
[0004] 目前还未发现有与本研究相似的发明，还未见有关亲水性广谱固相萃取柱的制备。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于克服传统固相萃取过程中使用大量
有机溶剂、分离富集效果差等缺点，提供了一种亲水性广谱固相萃取柱的制备方法。该方法所制备的固相萃取柱对动物源性食品中磺胺类兽药、磺酰脲类除草剂、雌激素和氨基甲酸酯类农药四种农兽药均具有较强的分离、富集功能，并且该固相萃取柱可以适用于富集完全水相中上述四种农兽药的残留。
[0006] 本发明的另一目的在于克服了传统固相萃取柱只能用于富集某一类物质的缺点，而提供了一种具有亲水性并且可以同时检测磺胺类药物、雌激素、磺酰脲类除草剂、氨基甲酸酯类农药的广谱性固相萃取柱。该固相萃取柱能够快速、高效、简单的用于猪肉中磺胺类药物、磺酰脲类除草剂、雌激素和氨基甲酸酯类杀虫剂四种农兽药的富集和分离。
[0007] 本发明通过以下方案实现的：
[0008] 一种亲水性广谱固相萃取柱的制备方法，包括如下步骤：
[0009] （1）亲水性
聚合物制备：将功能
单体甲基
丙烯酸（MAA）溶解在致孔剂中，加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）和亲水性功能单体甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA），并加入引发剂偶氮二异丁腈（AIBN），在氮气流的作用下密封，60℃条件下热引发聚合24h，得到
块状聚合物；将块状聚合物进行
研磨后过筛,分筛得到30-60μm之间的粒径，将不合格的颗粒除去，称取一定
质量的过筛聚合物用高氯酸进行磁力搅拌，用水和氢
氧化钠洗涤至中性，75℃干燥至恒重，获得亲水性聚合物；
[0010] （2）固相萃取柱填充：将亲水性聚合物填充到5mL聚丙烯固相萃取柱中，即得。
[0011] 上述的亲水性广谱固相萃取柱的制备方法中，所述致孔剂为乙腈和
甲苯的
混合液，两者体积比为1:1。
[0012] 上述的亲水性广谱固相萃取柱的制备方法中，所述高氯酸的浓度为质量分数30%，加入高氯酸的量与过筛聚合物体积质量比为30ml：1g，磁力搅拌的时间为5h。
[0013] 上述的亲水性广谱固相萃取柱的制备方法中，所述固相萃取柱填充步骤中要在固相萃取柱的顶端和底端分别装上聚乙烯筛板。
[0014] 上述的亲水性广谱固相萃取柱的制备方法中，所述聚乙烯筛板的孔径为20μm。
[0015] 上述的亲水性广谱固相萃取柱的制备方法中，所述亲水性聚合物的制备过程如下：
[0016] （1）将1mmol的功能单体甲基丙烯酸溶解在致孔剂—2.5mL乙腈和2.5mL甲苯中，超声15min后在
振荡器上以160转/min的转速振荡3h，形成预聚合溶液；
[0017] （2）向步骤（1）形成的预聚合溶液中加入1mmol亲水性功能单体甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA），继续振荡1h，再加入5mmol的交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA），振荡1h后加入引发剂偶氮二异丁腈（AIBN）25mg，振荡0.5h，通入氮气除氧5min并且在氮气的保护下密封；
[0018] （3）在60℃条件下水浴24h，热引发步骤（2）所形成的聚合体系，得到吸附性聚合物；
[0019] （4）称取步骤（3）所得到的聚合物1g于50mL的圆底烧瓶中，加入30mL质量分数为30%的高氯酸，磁力搅拌5h后，用水和氢氧化钠洗涤至中性，75℃烘干至恒重，得到亲水性聚合物。
[0020] 上述方法制备的亲水性广谱固相萃取柱在萃取猪肉中农兽药残留的方法，包括如下步骤：
[0021] （1）样品的制备：取市售的猪肉样品，切碎，均质后置于-20℃的
冰箱中贮存，得目标分析物；
[0022] （2）样品的前处理及目标分析物的提取：准确称取步骤（1）中样品1g于100 mL的烧杯中，加入甲醇溶液作为提取剂，超声15 min提取目标分析物，将此步骤重复三次，收集提取的上清液，3000 r/min离心15 min，弃去沉淀，将将上清液经过0.22μm
纤维素
膜过滤到50mL的容量瓶中，用pH=3.28的双蒸水定容至刻度，待净化；
[0023] （3）对固相萃取柱进行活化和平衡，加入50 mL的待净化液，对样品进行富集和净化。
[0024] 上述的亲水性广谱固相萃取柱的制备方法中，所述对固相萃取柱的活化和平衡是指，在上样前，先用3mL的甲醇和3mL的蒸馏水对固相萃取柱进行活化和平衡。
[0025] 上述方法制备的亲水性广谱固相萃取柱的使用方法，步骤如下：
[0026] 1)去本发明方法制备的固相萃取柱，首先用3mL的甲醇和3mL的水活化和平衡；
[0027] 2)在抽
真空条件下加入样品50mL；
[0028] 3)用3mL蒸馏水淋洗固相萃取柱，除去未被吸附的目标物和其它杂质；
[0029] 4)用1mL的二氯甲烷-甲醇（1:1，v/v），1mL的丙
酮-甲醇（1:1，v/v），1mL的
氨水-甲醇（1:1，v/v）混合液洗脱固相萃取柱，收集洗脱液，待检测。
[0030] 5）洗脱完成后，用3 mL甲醇对固相萃取柱进行再生，以备下次使用。
[0031] 本发明的有益效果在于：
[0032] （1） 本发明提供了一种新的亲水性广谱固相萃取柱的制备方法。
[0033] （2）本发明方法所制备的固相萃取柱不仅可以同时用于四类农兽药痕量残留的检测，而且检测的灵敏度高，样品的前处理简单。同时具有一定的经济效益和社会效益。
附图说明
[0034] 图1：亲水性聚合物和传统聚合物的合成路径。
具体实施方式
[0035] 下面结合具体
实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。
[0036] 实施例1 亲水性广谱固相萃取柱的制备
[0037] （1）亲水性广谱聚合物的制备
[0038] 首先将1mmol的功能单体甲基丙烯酸（MAA）溶解在体积比为1:1的乙腈甲苯混合液中，超声15min。并在振荡器上以160转/min的转速振荡3h，形成预聚合溶液。随后，在上述形成的预聚合溶液中加入1mmol的亲水性功能单体GMA，继续振荡1h；然后加入5mmol的交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA），振荡1h后，加入25mg的引发剂偶氮二异丁腈（AIBN），振荡0.5h。通入氮气5min后密封。在水浴60℃条件下通
过热引发聚合，水浴时间为24h。反应结束后得到块状聚合物。将所得到的块状聚合物研磨后，准确称取1g的聚合物微粒于50mL的圆底烧瓶中，加入30mL质量分数为30%的高氯酸，磁力搅拌5h后，用水和氢氧化钠洗涤至中性，75℃烘干至恒重，得到亲水性聚合物微粒。
[0039] 上述的合成步骤中加入了亲水性功能单体GMA，由于高氯酸的强酸作用，使合成过程中GMA引入的环氧基发生开环作用，形成羟基，从而使聚合物微粒具有较强大的亲水性能。而传统的吸附聚合物由于没有羟基的引入所以不具备亲水性。两者的具体流程见图1。
[0040] （2）亲水性聚合物填充到5mL聚丙烯固相萃取小柱中，固相萃取柱的顶端和底端分别装上聚乙烯筛板，所述聚乙烯筛板所述聚乙烯筛板的孔径为20μm，即得本发明的亲水性广谱固相萃取柱。
[0041] 实施例2：亲水性广谱固相萃取柱的性能评价
[0042] 1) 活化和平衡。固相萃取柱装填好后，在上样前，先用3mL的甲醇和3mL的双蒸水活化和平衡固相萃取柱。在活化和平衡的过程中，要保持固相萃取柱湿润，不能使溶液流干。
[0043] 2) 上样。取50mL的溶液上样。上样溶液含有不同浓度（1 μg/L,2 μg/L,5 μg/L,15 μg/L, 20 μg/L）的十种磺胺药物、雌激素、磺酰脲类除草剂和氨基甲酸酯类杀虫剂混合液（具体物质见表1）。样品流速为1mL/min。上样过程中同样要保持固相萃取柱湿润，不能使溶液流干。
[0044] 3)淋洗。上样完毕后，用3mL的双蒸水洗涤固相萃取柱，除去杂质和部分没有吸附的目标溶液。
[0045] 4)洗脱。分别用1mL的二氯甲烷-甲醇（1:1，v/v），1mL的丙酮-甲醇（1:1，v/v），1mL的氨水-甲醇（1:1，v/v）依次洗脱目标物，收集洗脱液，氮气流吹干后用1mL的甲醇复溶，待HPLC检测。
[0046] 十种物质的的线性方程图见表1。
[0047] 由表1可知，该固相萃取柱富集净化的样品的相关系数均可以达到0.99以上，呈现显著相关水平，说明该固相萃取柱可以用于磺胺类药物、雌激素、磺酰脲类除草剂和氨基甲酸酯类杀虫剂的痕量残留检测。
[0048]
[0049] 实施例3：试验例1制备的亲水性广谱固相萃取柱的应用
[0050] 1)猪肉中磺胺类药物、雌激素、磺酰脲类除草剂和氨基甲酸酯类杀虫剂的提取[0051] 将市售的猪肉样品用均质机均质，使用前样品贮藏在-20℃的冰箱中。准确称取1g的均质猪肉于100mL的烧杯中，加标3个不同浓度（0.02mg/L,0.15mg/L,0.01mg/L）的磺胺类药物、雌激素、磺酰脲类除草剂、氨基甲酸酯类杀虫剂的混合溶液。在加标样品中加入
3mL的甲醇，超声15min提取目标物。将此步骤重复3次。收集提取的上清液，3000r/min离心15min。弃去沉淀，将上清液经过0.22μm
纤维素膜过滤到50mL的容量瓶中，用pH=3.28的双蒸水定容至刻度。待净化。
[0052] 2)样品的净化
[0053] 将已制备好的固相萃取柱先用3mL的甲醇和3mL的双蒸水活化和平衡，然后将步骤1）中待净化的样品上样，流速为1mL/min。上样完成后用3mL的双蒸水淋洗固相萃取柱，除去杂质和没有吸附的目标溶液。用1mL的二氯甲烷-甲醇（1:1，v/v），1mL的丙酮-甲醇（1:1，v/v），1mL的氨水-甲醇（1:1，v/v）作为洗脱液，对目标分析物进行洗脱。收集洗脱液，用氮气流吹干后用1mL的甲醇复溶，待HPLC检测。
[0054] 3)高效液相色谱法测定四类物质的回收率
[0055] 标准曲线的制作：分别取0.25mg/L，0.5mg/L，1mg/L，2mg/L，5mg/L的十种物质的混合溶液作为标准工作溶液，取20μL的溶液直接进样，以工作溶液的浓度为横坐标，其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
[0056] 色谱条件：色谱柱ThermoC18柱(5um,4.6mm×250mm)流动相A：甲醇流动相B：0.1%的水溶液，梯度洗脱条件见表2。检测
波长：磺胺类药物为270nm，雌激素和磺酰脲类除草剂为230nm，氨基甲酸酯类杀虫剂为210nm。
[0057]
[0058] 经测定，在猪肉中磺胺类药物、雌激素、磺酰脲类除草剂和氨基甲酸酯类杀虫剂的回收率在48.02%-111.9%。结果见表3。
[0059] 结果表明，该法合成的吸附材料具有可以同时检测磺胺类药物、雌激素、磺酰脲类除草剂和氨基甲酸酯类杀虫剂的能力。
[0060]
