高效苹果基因转化方法
专利汇可以提供高效苹果基因转化方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 植物 基因工程领域的一种高效苹果基因转化方法。主要技术特征是取组织在MS培养基上进行初级培养、在扩繁培养基上进行再培养，取携带FRO2基因的农杆菌培养、分化培养和转接培养、伸长培养、生根培养、入土栽培。本发明科学合理，植株的再生率高，转化率高；通过本发明所生长的转基因苹果，含有抗缺 铁 基因，较大地提高了对铁的吸收 力 ，从根本上解决苹果的缺铁问题，对其他 水 果的基因转化具有很强的借鉴作用。，下面是高效苹果基因转化方法专利的具体信息内容。
1.一种高效苹果基因转化方法，其特征在于：
该转化方法的步骤为：
(1).取苹果树八棱海棠的茎尖组织在MS培养基上进行培养；
(2).培养后的茎尖组织在扩繁培养基上进行再培养，产生的无菌苗的外植体 待用；
(3).取携带FRO2基因的农杆菌的单菌落接种到YEB液体培养基上并在摇床 上培养；
(4).将无菌苗的外植体在培养好的农杆菌内浸泡，然后将该外植体接种到分 化培养基上进行分化培养和转接培养，产生再生转化芽；
(5).将该转化芽在伸长培养基内进行伸长培养；
(6).植入生根培养基进行生根培养；
(7).生根移栽；
(8).入土栽培。
2.根据权利要求1所述的高效苹果基因转化方法，其特征在于：所述的苹 果树八棱海棠的茎尖组织在MS培养基上进行培养前要采用含氯离子浓度为 2.8％的次氯酸钠溶液消毒10～15分钟，之后接种到MS培养基上进行培养，培 养的条件为：温度25～28℃，每天12小时左右光照，光强2500～5000LUX，培 养时间为1～2周；培养后用无菌水冲洗三次；
3.根据权利要求1所述的高效苹果基因转化方法，其特征在于：所述的扩 繁培养基为在MS培养基内还需添加2～4mg/L的6-BA生长激素和0.2～0.4mg/L 的NAA，扩繁条件为：温度为25～28℃，每天12小时左右光照，光强 2500～5000LUX，扩繁时间为4～6周。
4.根据权利要求1所述的高效苹果基因转化方法，其特征在于：将携带 FRO2基因的农杆菌的单菌落接种到YEB液体培养基上并在25～28℃温度条件下 放置在100转/min摇床上，摇摆48小时左右，该YEB液体培养基内需要添加 50mg/L的卡那霉素和100mg/L的庆大霉素。
5.根据权利要求1所述的高效苹果基因转化方法，其特征在于：将无菌苗的 外植体在25～28℃温度条件下在培养好的农杆菌内浸泡10分钟左右，然后首先 将该外植体接种到分化培养基上进行分化培养，该分化培养基由MS培养基、2～ 6mg/L的BA以及0.4～0.6mg/L的NAA组成；在该分化培养基上放一层滤纸，把该 外植体放置在滤纸上，在25～28℃温度下的密闭、暗条件下，培养48小时左右 取出，然后在一个添加5mg/L的除草剂和500mg/L的羧变青霉素的分化培养基所 构成的筛选培养基上将外植体所形成的转化芽放入，进行转化芽筛选，在25～ 28℃温度、昼夜光照、光强2500～5000LUX的条件下进行转接培养4周后，进行 再转接培养4～6周，产生再生转化芽；
6.根据权利要求1所述的高效苹果基因转化方法，其特征在于：所述的伸长 培养为：将再生转化芽在伸长培养基内进行伸长培养，该伸长培养基由MS培养 基、2mg/L的BA、0.5mg/L的NAA、5mg/L的除草剂和500mg/L的羧变青霉素组 成，在25～28℃温度条件下，光强2500～5000LUX的条件下光照每天12小时左 右。
7.根据权利要求1所述的高效苹果基因转化方法，其特征在于：所述的生根 移栽为：待再生转化芽生长到2～3cm长度时切下，植入生根培养基进行培养， 该生根培养基为MS培养基、0.2～0.4mg/L的NAA、5mg/L的除草剂和500mg/L的 羧变青霉素组成，在25～28℃温度条件下，光强2500～5000LUX的条件下光照每 天12小时左右，促其生根。
8.根据权利要求1所述的高效苹果基因转化方法，其特征在于：所述的入土 栽培为：将生根的转化苗取出，冲洗掉其根部的培养基，将其栽到蛭石培养基 内，浇MS培养液，保持每天3～4小时直射光照，在25～28℃温度条件下自然生 长，当生长3～4个叶片时，入土栽培。
9.根据权利要求1或5所述的高效苹果基因转化方法，其特征在于：所述的 无菌苗的外植体为无菌苗的叶柄、去掉生长点的茎尖、节尖、叶片之一。
所属领域
本发明属于农业生物技术领域或植物基因工程领域，尤其是一种高效苹果 基因转化方法。
背景技术
苹果是1989年英国East Malling园艺研究所的James等首先报道转化成功的， 此外还有绿袖(Green sleeves)、元帅(Delicious)、皇家嘎拉(Royal Gala)、新乔纳 金和营养系砧木M26等转基因的报道；转化的基因除报告基因外还有胭脂碱合 成酶基因、杀虫结晶蛋白及豇豆胰蛋白酶抑制基因和MADbox基因等。
总之，苹果、香蕉、猕猴桃、枳壳、杏、枇杷、龙眼、樱桃、李、木瓜、 悬钩子、葡萄、胡桃、树莓、甜橙等都有转基因报道，绝大多数建立了转基因 受体系统，不少还建立了再生系统，有的已成功导入外源优良基因，并且已得 到转基因植株。因此，采用生物技术手段将这些基因导入植株来解决因缺铁引 起的果树营养不平衡问题，补充及扩展常规育种、并进而获得果树铁高效基因 型或新品种将成为可能。
然而对苹果来讲，其杂交比较困难。原因是杂交选育时间比较长，常规育 种不可行，另外，抗缺铁基因很少，目前主要采用基因枪和砧木来解决这个问 题。但采用基因枪不好打；采用砧木也不很理想，抗缺铁能力较低，存在一定 的排斥作用，仍然表现出缺铁生长。此外，基因转化到苹果外植体中，难度较 大，外植体再生很难，发芽率很低，再生植株容易受到污染。
把抗缺铁基因转化到拟南芥上已经成功。依据这个原理，天津农学院已经 成功地采用RT-PCR技术从拟南芥植株克隆全长FRO2基因，为采用农杆菌导入 法获得抗缺铁苹果的再生转化株打下了基础。
发明内容
本发明的目的是这样实现的：
高效苹果基因转化方法，其转化方法的步骤为：
(1).取苹果树八棱海棠的茎尖组织在MS培养基上进行培养；
(2).培养后的茎尖组织在扩繁培养基上进行再培养，产生的无菌苗的外植体 待用；
(3).取携带FRO2基因的农杆菌的单菌落接种到YEB液体培养基上并在摇床上 培养；
(4).将无菌苗的外植体在培养好的农杆菌内浸泡，然后将该外植体接种到分 化培养基上进行分化培养和转接培养，产生再生转化芽；
(5).将该转化芽在伸长培养基内进行伸长培养；
(6).植入生根培养基进行生根培养；
(7).生根移栽；
(8).入土栽培。
而且，所述的苹果树八棱海棠的茎尖组织在MS培养基上进行培养前要采用 含氯离子浓度为2.8％的次氯酸钠溶液消毒10～15分钟，之后接种到MS培养基 上进行培养，培养的条件为：温度25～28℃，每天12小时左右光照，光强 2500～5000LUX，培养时间为1～2周；培养后用无菌水冲洗三次；
而且，所述的扩繁培养基为在MS培养基内还需添加2～4mg/L的6-BA生长 激素和0.2～0.4mg/L的NAA，扩繁条件为：温度为25～28℃，每天12小时左右 光照，光强2500～5000LUX，扩繁时间为4～6周。
而且，将携带FRO2基因的农杆菌的单菌落接种到YEB液体培养基上并在 25～28℃温度条件下放置在100转/min摇床上，摇摆48小时左右，该YEB液体 培养基内需要添加50mg/L的卡那霉素和100mg/L的庆大霉素。
而且，将无菌苗的外植体在25～28℃温度条件下在培养好的农杆菌内浸泡 10分钟左右，然后首先将该外植体接种到分化培养基上进行分化培养，该分化 培养基由MS培养基、2-6mg/L的BA以及0.4-0.6mg/L的NAA组成；在该分化培 养基上放一层滤纸，把该外植体放置在滤纸上，在25～28℃温度下的密闭、暗 条件下，培养48小时左右取出，然后在一个添加5mg/L的除草剂和500mg/L的羧 变青霉素的分化培养基所构成的筛选培养基上将外植体所形成的转化芽放入， 进行转化芽筛选，在25～28℃温度、昼夜光照、光强2500～5000LUX的条件下进 行转接培养4周后，进行再转接培养4～6周，产生再生转化芽；
而且，所述的伸长培养为：将再生转化芽在伸长培养基内进行伸长培养， 该伸长培养基由MS培养基、2mg/L的BA、0.5mg/L的NAA、5mg/L的除草剂和 500mg/L的羧变青霉素组成，在25～28℃温度条件下，光强2500～5000LUX的条 件下光照每天12小时左右。
而且，所述的生根移栽为：待再生转化芽生长到2～3cm长度时切下，植入 生根培养基进行培养，该生根培养基为MS培养基、0.2～0.4mg/L的NAA、5mg/L 的除草剂和500mg/L的羧变青霉素组成，在25～28℃温度条件下，光强2500～ 5000LUX的条件下光照每天12小时左右，促其生根。
而且，所述的入土栽培为：将生根的转化苗取出，冲洗掉其根部的培养 基，将其栽到蛭石培养基内，浇MS培养液，保持每天3～4小时直射光照，在25 ～28℃温度条件下自然生长，当生长3～4个叶片时，入土栽培。
而且，所述的无菌苗的外植体为无菌苗的叶柄、去掉生长点的茎尖、节 尖、叶片之一。
本发明的优点和积极效果是：
据资料报道，在世界上，有10亿多人由于缺铁而引起缺铁性贫血，尤其在青 年妇女和青少年中特别严重。据估计，在发展中国家，有50％的孕妇和40％的 非孕妇妇女患有缺铁性贫血。在我国召开的第三界国际妇幼营养会议上报道， 我国约有1亿儿童患营养性贫血。若膳食中长期供铁不足，就会影响人体的免 疫力。这是由于缺铁时，与杀菌有关的许多含铁酶或依赖铁的酶活性明显下 降，嗜中性白细胞内过氧化物酶活性降低，并且可以直接影响淋巴组织的发 育。另外，缺铁性贫血还可影响儿童的生长发育、智能发育，体力活动下降， 引起行为改变，主要表现为注意力分散、对周围不感兴趣、易烦躁、表情淡漠 等。
我国大部分果园存在果树缺铁黄化问题，大量的柑桔、落叶果树等都不同 程度失绿。我国北方干旱、半干旱地区的果园土壤多为碱土和盐碱土，果树黄 化症发病率高达30％～60％，丁绍夫在山东、河北、山西、河南、江苏、北京 等五省一市考察表明，苹果树缺铁黄化发生普遍，所到单位罹病园发病株率多 在50％以上，病株上的病梢率多在70％以上。转基因抗缺铁黄化品种的培育是 一条根本途径。
本发明的产生是首次在国际上将影响植株铁素吸收和代谢的关键性限速酶 基因Fe3+-螯合物还原酶基因--FRO2导入苹果，首次建立了苹果的高效农杆菌 介导的转化体系。本发明所述的转化方法，科学合理，植株的再生率高，转化 率高；通过本发明所生长的转基因苹果，含有抗缺铁基因，较大地提高了对铁 的吸收力，从根本上解决苹果的缺铁问题，对其他水果的基因转化具有很强的 借鉴作用。
具体实施方式
本发明所述的转化方法由以下步骤构成：
1.取苹果树八棱海棠的茎尖组织在MS培养基上进行培养
取苹果树八棱海棠的茎尖组织，首先采用含氯离子浓度为2.8％的次氯酸钠 溶液消毒10～15分钟，之后接种到MS培养基上进行培养，培养时间为1～2周， 培养的环境条件是：温度为25～28℃，光照每天12小时左右，光强 2500～5000LUX，然后用无菌水冲洗三次。
2.培养后的茎尖组织在扩繁培养基上进行再培养
将培养后的茎尖组织接种到扩繁培养基内扩繁4～6周，该扩繁培养基由 MS培养基添加2～4mg/L的6-BA生长激素和0.2～0.4mg/L的NAA(奈乙酸)构 成，条件为：温度为25～28℃，光照每天12小时，光强2500～5000LUX，可获 得10倍左右的增殖率；取扩繁后所产生的无菌苗的外植体(无菌苗的叶柄、 去掉生长点的茎尖、节尖、叶片之一)进行下一步的外植体转化，以下以无菌 苗的叶柄为例。
3.取携带FRO2基因的农杆菌的单菌落接种到YEB液体培养基上并在摇床上 培养
取携带FRO2基因的农杆菌的单菌落接种到YEB液体培养基上，并放置在摇 床上，在25～28℃温度条件下，以100转/min摇摆48小时，该液体培养基内需 要添加50mg/L的卡那霉素和100mg/L的庆大霉素。
4.将无菌苗的外植体在培养好的农杆菌内浸泡，然后将该外植体接种到分 化培养基上进行分化培养和转接培养，产生再生转化芽。
取叶柄，用培养好的农杆菌在25～28℃温度条件下浸泡10分钟，之后取 出，然后用无菌滤纸吸干，将叶柄接种到分化培养基上进行培养，该分化培养 基由MS培养基、2～6mg/L的BA、0.4～0.6mg/L的NAA等构成。在该分化培养基 上放一层滤纸，把该叶柄放置在滤纸上，25～28℃温度下的密闭、暗条件下培 养48小时取出，然后在一个添加5mg/L的除草剂和500mg/L的羧变青霉素的分化 培养基所构成的筛选培养基上将外植体所形成的转化芽放入，进行转化芽筛 选。在此过程中，叶柄的创口要充分接触培养基，在25～28℃温度条件下，光 强2500～5000LUX的条件下，昼夜光照，培养四周；四周以后，再转接一次。 目的是除草剂在长时间条件下有效性会有降低，营养性降低，每4周转接一 次，共培养8～10周后，产生再生转化芽。
5.将该转化芽在伸长培养基内进行伸长培养
把该转化芽切下，在伸长培养基内进行长大培养，在25～28℃温度条件 下，光强2500～5000LUX的条件下光照每天12小时左右。该伸长培养基由MS培 养基、2mg/L的BA、0.5mg/L的NAA、5mg/L的除草剂和500mg/L的羧变青霉素 构成。
6.植入生根培养基进行生根培养
待再生转化芽生长到2～3cm长度时切下，在25～28℃温度条件下，光强2500 ～5000LUX的条件下光照每天12小时左右，植入生根培养基进行培养，促其生 根，形成再生苗。该生根培养基为MS培养基、0.2～0.4mg/L的NAA、5mg/L的 除草剂和500mg/L的羧变青霉素构成。
7.生根移栽
生根后，取出再生苗，冲洗掉再生苗根部的培养基，将其栽到蛭石培养基 内，浇MS培养液，保持每天3～4小时直射光照，在25～28℃温度条件下，当生 长3～4个叶片时，入土栽培。
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