엑소톡신을 포함한 살충제 조성물{A PESTICIDAL COMPOSITION COMPRISING EXOTOXIN}

본 발명은 천연물질 즉, 토양미생물 유래의 물질을 유효성분으로 포함하는 살충제 조성물에 관한 것이다.

환경문제에 대한 전 세계적 차원의 인식이 고조되면서 수질 및 토양 오염의 주범으로 꼽히고 있는 합성화학농약을 대체할 수 있는 생물농약의 중요성이 크게 부각되고 있다. 특히, 1992년 UN의 리우 선언 이후 지구 환경 보호를 위한 노력이 본격화되면서, OECD 국가들은 2004년 화학농약 생산량을 1994년 총생산량의 절반 수준으로의 감축하기로 합의하였다. 또한, 1995년 WTO 출범 후, 환경과 무역을 연계시킨 국제 다자간 무역 협상, 즉 그린라운드가 본격적으로 진행됨에 농약의 사용량 제한 및 수출입 농산물에 대한 잔류허용량 검사가 강화됨에 따라 저독성, 저약량의 생물농약의 개발과 보급이 시급하게 되었다.

이러한 시대적 흐름에 발맞춰 우리나라에서도 1997년 농림부에서는 친환경농업육성법을 제정하고, 2004년부터 화학 비료 및 합성화학농약 사용량을 2013년까지 40% 감축하는 것을 목표로 '천적활용 해충방제사업'을 실시하고 있다. 하지만, 이러한 친환경농업정책의 추진에도 불구하고, 농약사용량은 1999년 대비 2002년에는 4.9% 증가하였으며, 2010년 현재에도 그 증가세가 멈추지 않고 있어 합성화학농약을 대체할 수 있는 생물농약, 즉 친환경형 병해충 방제제 개발을 통한 현실적이면서 실용적인 농약사용 감축대책 마련이 시급한 실정이다.

특히, 합성화학농약(synthetic chemical pesticide)은, 잔류독성에 의한 암 유발 및 치명적인 환경호르몬으로 작용으로 인한 기형발생 등의 심각한 부작용이 밝혀지면서 잔류성이나 내성발달의 문제가 거의 없는 생물농약(biopesticide)을 이용한 친환경 유기 농업에 대한 관심이 고조되고 있다.

이러한 환경친화형 생물농약의 개발은 범세계적인 추세에 힘입어, 1994년 미국 환경청(EPA)은 생물농약 및 오염방지분과를 신설하고, 생물농약 개발을 적극 장려하고 있으며, 국내에서도 2005년 '생물농약등록기준 및 시험방법'이 화학기준보다 대폭 완화되어 새로 설정, 고시됨에 따라 고효율 친환경 병해충 방제제 개발을 촉진하고 있다.

하지만 이러한 국제적 흐름에도 불구하고 국내에서 사용되고 있는 농약의 대부분은 유기합성 농약일 뿐만 아니라, 생물농약의 경우 선진국에서 개발된 것을 도입하거나 특허가 만료된 제품을 복제 또는 기술 제휴하여 만든 제품이 대부분이다.

그러나, 국외에서 도입되는 생물 또는 유전자변형생물체는 국내 환경생태계에 어떤 영향을 미치는지 검증되지 않아 2차 오염을 유발할 수 있는 문제점이 있다. 따라서, 이와 같은 문제점을 해결하기 위해 국내 토착 병해충에서 분리된 미생물 및 공생세균으로부터 다양한 생물농약 유전자 자원의 확보를 통한 새로운 친환경형 병해충 방제제 개발을 위한 기반 기술 개발 및 확보가 절실한 실정이다.

이와 관련하여, 미생물의 엑소톡신(exotoxic protein, exotoxin)은 여러 해충에 특이적으로 반응하며, 해충에 대한 높은 치사율을 가지고 있다. 또한, 단백질 제제이므로 환경에 잔류 가능성이 매우 낮고 단기간 내에 생분해가 가능하다는 장점으로 인해 세계적으로 환경친화형 병해충 방제제에 대한 연구로 Xenorhabdus nematophilus , Photorhabdus luminescens , Serratia entomophila 등의 미생물들이 가지고 있는 엑소톡신의 응용에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히, 곤충병원성 선충의 공생세균인 Xenorhabdus nematophilus 는 해충유충의 혈강에 침입하여 xptA1, xptA2, xptB1, xptC1이라는 toxin 단백질을 생산하여 다양한 해충을 방제하는데 우수한 효과를 가지고 있다고 알려져 있다.

그러나, 엑소톡신의 우수한 환경친화형 병해충 방제제로의 적용가능성에도 불구하고 세계적으로도 연구개발이 아직 기초적인 수준에 머물러 있으며, 살충 작용에 관여하는 새로운 엑소톡신 유전자들을 점차 규명해 가고 있는 단계이다.

이러한 측면에서, 신기술인 생물농약 분야에서의 선진국과의 격차를 줄이기 위해서는 친환경형 병해충 방제 후보물질 발굴을 위한 유전체학 및 단백체학과 같은 생물 유전정보 해석 기술을 이용한 고효율 대량 스크리닝을 통한 다양한 신규 엑소톡신 단백질 발굴 및 신규 유전자원 확보가 요구된다.

국내에서 사용되고 있는 생물농약의 대부분이 Bacillus thuringiensis 의 exotoxin인 Bt 독소를 직접 또는 변형 이용을 통한 특정 해충을 방제하는 연구가 대부분이기 때문에 연구 범위 및 제품 개발에 한계를 드러내고 있는 실정이다. 따라서, 제품의 다양성 및 저장안정성, 생물효과가 기대에 미치지 못하고 있으므로, 보다 폭 넓은 연구를 통해 국내 토착 병해충으로부터 분리된 미생물 및 공생세균으로부터의 새로운 친환경형 병해충 방제제 탐색 및 발굴에 대한 요구가 증가되고 있다.

본 발명은 국내 토양으로부터 분리된 미생물 유래 엑소톡신의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체로부터 발현된 재조합 엑소톡신을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 뉴클레오타이드 서열을 특정 벡터에 삽입시키고, 상기 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환체를 특정 조건에서 배양하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 엑소톡신 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 엑소톡신, 상기 재조합 엑소톡신, 상기 형질전환체, 이의 배양물, 이의 무세포 배양액, 상기 배양물의 농축액 및 상기 무세포 배양액의 농축액으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 활성성분으로 포함하는 살충제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 엑소톡신(EXOTOXIN)을 제공한다. 상기 엑소톡신은 바람직하게는 서열번호 1에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 아미노산 서열인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 엑소톡신을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 바람직하게는 상기 유전자서열은 서열번호 1에 기재된 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 엑소톡신을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 엑소톡신를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 형질전환체에서 발현시켜 제조한 재조합 엑소톡신 및 상기 재조합 엑소톡신를 생산하는 방법을 제공한다.

상기 제조방법은 구체적으로 상기 서열번호 1에 기재된 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 특정 벡터에 삽입시켜 발현벡터를 제조하고, 상기 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환체를 특정 조건에서 배양하는 것을 특징으로 하는 상기 엑소톡신 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 엑소톡신, 상기 재조합 엑소톡신, 상기 형질전환체, 이의 배양물, 이의 무세포 배양액, 상기 배양물의 농축액 및 상기 무세포 배양액의 농축액으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 활성성분으로 포함하는 살충제를 제공한다.

본 발명에 있어서, 살충제(pesticidal, insecticide)는 사람이나 농작물에 해가 되는 곤충을 죽이는 효과를 지닌 약제를 의미하며, 곤충에 대한 효과와 관련하여, 접촉제, 소화중독제 및 가스제를 포함하는 개념이고, 바람직하게는 식물이나 미생물 등에서 얻은 유효성분을 가지는 천연 살충제 또는 생물농약일 수 있다.

본 발명에 있어서, 배추좀나방(diamondback moth)은 나비목 집나방과의 곤충으로, 성충은 몸길이 약 6 mm이며 날개길이가 12 mm 내지 16 mm인 작은 나방이며, 배추 또는 양배추 등의 겨자과 작물을 가해하는 해충이다. 알은 타원형으로 납작하고, 진주광택을 내며 그물 모양의 무늬가 있고 엷은 황록색이다. 유충은 원통형이고 앞뒤가 가늘며 몸은 대개 녹색이지만 담황색, 황적색 또는 회색 등 변이가 심하다. 상기 배추좀나방 유충은 잎맥을 따라 잎살만 먹으며, 자라면서 잎 뒷면에 기생하며, 겉껍질만 남기고 갉아먹는다. 주로 배추, 양배추 또는 무 등의 잎을 먹으며, 최근 국내에서는 특히 산간 지방을 중심으로 그 피해가 많이 나타나고 있다.

본 발명에 있어서, 외독소(EXOTOXIN)이란 세균이 균체 밖으로 분비하는 독소로 내독소에 대응하는 의미로 균체외독소라고도 한다. 주로, 디프테리아균, 파상풍균, 보툴리누스균 또는 가스괴저균군 등이 증식할 때 대사산물로서 생산된다. 포도상구균, 연쇄상구균, 이질균, 백일해균, 페스트균 등의 일부도 이와 유사한 독소를 생산하는 경우가 있다. 세균의 종류에 따라 독특한 독작용을 가지고 있고 그것에 의한 증세도 각각 다르다.

본 발명에 있어서, 배양물이란 세포, 바람직하게는 미생물, 더욱 바람직하게는 본 발명의 엑소톡신을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양한 배양배지를 의미하며, 상기 배양배지는 배양된 미생물을 포함하는 것이다.

본 발명에 있어서, 무세포(cell-free) 배양액이란 상기 형질전환체를 배양한 배양배지에서 배양된 미생물을 제거한 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 배양배지는 동물세포나 식물세포 또는 세균 등을 포함하는 미생물을 배양하는데 필요한 영양소가 포함되어 있는 고체 조성물 또는 액체 조성물을 의미하며, 바람직하게는 액체 조성물일 수 있다.

본 발명에 있어서 농축액이란, 상기 배양물 또는 무세포 배양액을 농축한 것을 의미한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자는 국내의 토양으로부터 분리된 엑소톡신을 이용한 생물학적 살충제에 대한 연구를 진행하던 중, 이차원 액상 크로마토그래피 기반의 프로테오믹스 기법은 종래의 접근 방법과 달리 세포로부터 분리된 단백질 용액을 이차원 액상 크로마토그래피를 이용하여 모든 범위의 pH에서, PI별로 분리 가능케 하고, 각각의 PI범위에서 분리된 샘플 fraction을 바로 동시에 이차원 액상 크로마토그래피를 통하여 분자량별로 순수 정제된 단일 단백질로 획득이 가능하기 때문에 엑소톡신 단백질 발굴 및 유전자 확보를 위한 프로테옴 분석에 바람직하다는 것을 확인하였다.

또한, 상기에서 확인 및 정제된 단백질은 간단한 전처리 후 바로 MALDI-TOF-MS 혹은 Nanospray ESI-MS/MS를 이용하여 손쉽게 동정이 가능하며, 무엇보다도 높은 loading capacity를 지니고 있고, 넓은 분자량 범위를 분석할 수 있어 기존의 방법과 비교 하였을 때, 엑소톡신 단백질 분리가 용이하며 희소성 단백질 및 낮거나 높은 분자량의 단백질 분리가 용이함으로 효과적으로 엑소톡신 단백질의 분리가 가능하다는 것을 확인하였다.

따라서, 상기 확인사실에 근거하여, 이차원 액상 크로마토그래피 기반의 프로테오믹스 기법과 MALDI-TOF-MS 기술을 이용하여 국내 토양으로부터 분리된 공생세균이 생산하는 엑소톡신을 분리하여 그 서열을 확인하였고, 상기 서열에 기반하여 재조합 엑소톡신을 생산한 후, 효율적인 생산방법과 함께 우수한 살충효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 공생세균이 생산하는 엑소톡신 또는 엑소톡신 단백질에 관한 발명이다.

상기 엑소톡신 단백질은 국내 토착 병해충의 공생미생물 중 하나인 곤충병원성 선충( Steinernema carpocapsa ) 내 신규 미생물인 Xenorhabdus sp - 7이 생산하는 엑소톡신으로, 362개의 아미노산을 갖는 단백질로, 이를 암호화하는 뉴클레오타이드는 1089개이다. 상기 엑소톡신은 바람직하게는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 가진 것일 수 있으며, 상기 효소의 활성을 유지하는 한, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 방법으로 아미노산을 결실, 치환 또는 삽입 등으로 변형한 것일 수 있다.

본 발명에 따른 엑소톡신를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 1에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것일 수 있으며, 상기 효소의 활성을 유지하는 한, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 방법으로 뉴클레오타이드를 결실, 치환 또는 삽입 등으로 변형한 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 효소 생촉매 개발을 위한 분리 및 정제 과정에 의한 비용의 증가 및 활성 손실 문제점을 해결하기 위하여, 상기 엑소톡신를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 재조합 엑소톡신를 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 벡터의 제조 및 형질전환체의 제조는 통상의 유전공학적 방법에 따라 제조된다.

상기 발현벡터는 사용하는 숙주에 따라 적절히 선택할 수 있고, 형질전환체에서 단백질을 발현시킬 수 있는 통상의 발현벡터가 모두 적용 가능하며, 일 예로 상기 형질전환체에 의해 발현된 단백질을 정제할 수 있는 융합 파트너(fusion-tag)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터일 수 있다. 구체적으로는, 대장균의 경우에는 도입된 외래 유전자를 형질전환체에서 수용성 형태로 고효율로 발현시킬 수 있는 pET 21a(Novagen Co., Germany), pGEX 4T-1(GE Healthcare, USA) 또는 pHCE 19(BioLeaders Co., 대한민국)일 수 있고, 바람직하게는 pGEX 4T-1 또는 pHCE 19일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 pHCE 19일 수 있고, 효모의 경우에는 갈락토스를 암호화하는 유전자인 GAL1의 프로모터를 외래 유전자의 발현에 이용할 수 있는 pYES2(Invitrogen Co., USA) 등을 사용할 수 있다.

상기 형질전환체는 상기 발현벡터를 이용하여 제조한 것으로 상기 형질전환체의 제조에 사용되는 숙주는 대장균, 바실러스 속( Bacillus sp.) 균주 및 슈도모나스 속( Pseudomonas sp.) 균주와 같은 원핵세포 또는 효모, 곰팡이 등의 진핵세포 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는 상기 발현벡터는 pHCE 19 벡터에 서열번호 1의 엑소톡신를 암호화하는 유전자 서열을 가진 폴리뉴클레오타이드를 삽입시킨 것이고, 상기 숙주는 바람직하게는 대장균일 수 있으며, 일 예로 E. coli BL21(DE3)일 수 있다.

상기 형질전환체를 이용하여 엑소톡신를 생산하는 방법은 상기 형질전환체를 배양배지를 이용하여 배양하고, 상기 배양배지에 포함된 엑소톡신 또는 상기 형질전환체 내에 존재하는 엑소톡신을 수득하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 배양배지, 배양조건 및 배양방법은 형질전환체의 종류에 따라 적절하게 선택될 수 있으며, 일 예로 상기 서열번호 1의 엑소톡신를 암호화하는 유전자 서열을 가진 폴리뉴클레오타이드를 삽입시킨 pHCE 19 벡터를 도입시켜 제조한 형질전환체를 배양배지에서 배양한 후에, IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside)를 첨가하고 배양하여 제조할 수 있다. 상기 형질전환체에 의해 발현되는 방법으로 제조된 재조합 엑소톡신는 종래 알려진 통상의 방법으로 정제할 수 있지만, 정제하지 않고 전세포 또는 이의 배양물이나 이의 무세포 배양액 형태로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환체에서 발현시켜 제조한 재조합 엑소톡신에 관한 발명이다.

상기 형질전환체는 바람직하게는 대장균일 수 있고, 일 예로 E. coli BL21(DE3)일 수 있다. 상기 발현벡터는 pGEX 4T-1 벡터 또는 pHCE 19 벡터일 수 있으며, 바람직하게는 pHCE 19 일 수 있다. 일 예로, 상기 서열번호 1의 엑소톡신을 암호화하는 유전자 서열을 가진 폴리뉴클레오타이드를 삽입시킨 pHCE 19 벡터를 도입시켜 제조한 형질전환체에 의해 제조된 재조합 엑소톡신는 pHCE 19 벡터가 가지는 GST-Tag을 포함한 융합 단백질일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 엑소톡신, 상기 재조합 엑소톡신, 형질전환체, 상기 형질전환체의 배양물, 상기 형질전환체의 무세포 배양액, 상기 배양물의 농축액 및 상기 무세포 배양액의 농축액으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 살충제에 관한 것이다.

상기 살충제는 다양한 해충에 대한 살충제로 사용될 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니나, 유해 절지동물류 (예 : 유해 곤충 및 유해 진드기) 및 유해 선충류를 포함한 해충들에 대한 방제 효력을 나타낼 수 있으며, 일 예로 배추좀나방(diamondback moth) 또는 배추좀나방의 유충에 대한 살충효과 또는 방제효과를 가질 수 있다.

또한 본 발명의 살충제는 종래 살충제에 대한 저항성이 향상된 해충을 효과적으로 방제하는데 사용될 수 있다.

상기 엑소톡신은 상기 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있고, 바람직하게는 상기 서열번호 1에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명의 구체적 실시예에서, 배추좀나방의 유충에 본 발명의 엑소톡신 또는 재조합 엑소톡신 등을 포함하는 살충제를 사용하였을 때 농도 의존적 및 시간 의존적으로 지속적인 살충효과가 있음이 확인되었다.

본 발명의 살충제는 상기 유효성분 외에 통상 고체 담체, 액체 담체, 기체 담체 또는 유인물(bait)과 혼합하거나, 염기성 물질, 예로 다공질 세라믹 플레이트 또는 부직포에 흡수시킨 후, 계면활성제 및 필요한 경우, 기타 보조제들을 첨가하여, 이를 각종 형태들, 예로 오일 스프레이, 유화 가능한 농축물, 습윤성 분말, 유동물, 과립, 더스트, 에어로졸, 훈연제 (예 : 포깅), 증기화 가능한 제형물, 스모킹 제형물, 독성 유인물, 진드기방지용 시이트 또는 수지 제형물로 제형할 수 있다.

상기 각 제형물들은 통상 유효 성분으로서 상기 엑소톡신, 상기 재조합 엑소톡신, 형질전환체, 상기 형질전환체의 배양물, 상기 형질전환체의 무세포 배양액, 상기 배양물의 농축액 및 상기 무세포 배양액의 농축액으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 0.01 내지 95 중량 % 함유할 수 있다.

제형물에 사용될 수 있는 고체 담체에는, 카올린 점토, 규조토, 합성 수화된 산화규소, 벤토나이트, 푸바사미 점토 및 산점토 등의 점토 물질의 미세 분말 또는 과립; 각종 탈크, 세라믹 및 기타 무기 물질, 예로 견운모, 석영, 황, 활성탄, 탄산칼슘 및 수화된 실리카; 및 화학적 비료, 예로 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아 및 염화암모늄이 포함될 수 있다.

액체 담체에는, 물; 알콜, 예로 메탄올 및 에탄올; 케톤, 예로 아세톤 및 메틸 에틸 케톤; 방향족 탄화수소, 예로 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 에틸벤젠 및 메틸나프탈렌; 지방족 탄화수소, 예로 헥산, 시클로헥산, 케로신 및 라이트 오일; 에스테르, 예로 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트; 니트릴, 예로 아세토니트릴 및 이소부티르니트릴; 에테르, 예로 디이소프로필에테르 및 디옥산; 산 아미드, 예로 N,N-디메틸포름아미드 및 N,N-디메틸아세트아미드; 할로겐화 탄화수소, 예로 디클로로메탄, 트리클로로에탄 및 사염화탄소; 디메틸 술폭시드; 및 식물성 오일, 예로 대두유 및 면실유가 포함될 수 있다.

기체 담체 또는 추진제 (propellant)에는, 프레온 가스,부탄 가스, LPG (액화 석유 가스), 디메틸 에테르 및 이산화탄소가 포함될 수 있다.

안정화제에는, PAT (이소프로필 산 포스페이트), BHT (2,6-디-tert-부틸-4-메틸페놀), BHA (2-tert-부틸-4-메톡시페놀 및3-tert-부틸-4-메톡시페놀의 혼합물), 식물성 오일, 미네랄 오일, 계면활성제, 지방산 및 그것의 에스테르가 포함될 수있다.

본 발명의 유효성분인 상기 엑소톡신, 상기 재조합 엑소톡신, 형질전환체, 상기 형질전환체의 배양물, 상기 형질전환체의 무세포 배양액, 상기 배양물의 농축액 및 상기 무세포 배양액의 농축액으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상이 농업용 살 곤충제, 살 진드기제 또는 살 선충제 등으로 사용될 경우, 그것들의 적용량은 통상 10 에이커 당, 0.00001 내지 10,000 g 일 수 있다. 물로 희석한 후 사용되는 유화 가능한 농축물, 습윤성 분말, 유동물 및 기타 유사 제형물들로 사용될 수 있고, 과립, 더스트 또는 기타 유사 제형물의 적용은, 희석하지 않은 제형물로서 수행될 수 있다.

상기 엑소톡신, 상기 재조합 엑소톡신, 형질전환체, 상기 형질전환체의 배양물, 상기 형질전환체의 무세포 배양액, 상기 배양물의 농축액 및 상기 무세포 배양액의 농축액으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 유행병 예방을 위한 살 곤충제, 살 진드기제 또는 살 선충제 등으로서 사용할 경우, 그것들은 유화 가능한 농축물, 습윤성 분말, 유동물 또는 기타 유사 제형물의 경우, 물로 희석하여 사용할 수 있고, 그것들을 오일 스프레이, 에어로졸, 훈연제, 독성 유인물, 진드기방지용 시이트 또는 기타 유사 제형물의 경우에는, 그대로 적용된다. 이 적용 양 및 농도는, 제형물의 형태, 적용 시기, 장소 및 방법, 해충의 종류, 손해 정도 및 기타 요인들에 따라 다를 수 있으므로, 상기 범위에 한정되지 않고, 증감 가능하다.

본 조성물을 소 및 돼지 등의 가축, 또는 고양이 및 개 등의 애완동물의 기생충 방제를 위한 살 곤충제 또는 살 진드기제로 사용할 경우, 그 조성물 또는 이의 염을 공지된 수의학적 방법들, 예로 계통적 방제를 위한 정제, 캡슐, 침액용 용액, 볼리 (boli), 먹이 혼입, 좌약 또는 주사제; 또는 유성 또는 수성 용액의 분무, 주입 (붓기 또는 점적) 처리로써, 또는 비계통적 방제를 위해 칼라 및 귀 태크 (꼬리표)와 같은 적절한 모양으로 만든 성형품을 이용하여 적용할 수 있다. 이 경우, 본 상기 엑소톡신, 상기 재조합 엑소톡신, 형질전환체, 상기 형질전환체의 배양물, 상기 형질전환체의 무세포 배양액, 상기 배양물의 농축액 및 상기 무세포 배양액의 농축액으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상은 통상 숙주 체중을 고려하여 적용할 수 있다.

상기 엑소톡신, 상기 재조합 엑소톡신, 형질전환체, 상기 형질전환체의 배양물, 상기 형질전환체의 무세포 배양액, 상기 배양물의 농축액 및 상기 무세포 배양액의 농축액으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상은, 다른 살 곤충제, 살 선충제, 살 진드기제, 살 세균제, 살 진균제, 제초제, 식물 성장 조절제, 시너지스트, 비료,토양 컨디셔너 및/또는 동물 사료와 함께, 혹은 그것들과 별도로 하되 동시에 사용될 수 있다.

국내에서 사용되고 있는 생물농약은 주로 선진국에서 개발된 것을 도입한 것으로, 국내 토양 미생물로부터 분리하여 제조된 본 발명의 엑소톡신 등을 포함한 살충제는 현재 대부분을 수입에 의존하고 있는 생물농약에 대한 막대한 수입대체 효과를 거둘 수 있을 것이며, 생물농약 작용기작 규명을 통한 새로운 생물농약으로 그동안 합성화학농약이 일으켰던 환경호르몬 작용으로 인한 생식독성, 생태계 잔류에 의한 생물 농축성, 내성 돌연변이 생물체의 출연으로 인한 생태계 파괴 문제를 해결할 수 있을 것으로 예상될 뿐만 아니라, 합성화학농약의 사용으로 인한 막대한 환경비용 절감 효과를 기대할 수 있다.

국내 토착 병해충에서 분리된 미생물 및 공생세균으로부터의 다양한 생물농약 유전자자원 확보를 통해 개발된 새로운 친환경형 병해충 방제제는 국외에서 도입되는 생물 또는 유전자 변형 생물체와는 달리 국내 생태 환경에 알맞은 생물농약으로 환경 생태계를 변화 시키지 않으면서 국내 해충에 더욱 특이적으로 작용할 것으로 예상된다.

따라서, 본 발명은 농산물 생산 현장에서의 최적화된 생물농약을 사용함으로써 효과적인 병해충 방제와 생태계 보전이라는 두 가지 요소를 모두 획득할 수 있을 것으로 예상되므로, 그 산업적 효과가 매우 크다 할 것이다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 엑소톡신의 단백질 서열 및 폴리뉴클레오타이드 서열이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 분리된 공생미생물의 16S rRNA 기반 계통도이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 각 미생물의 엑소톡신 활성을 측정한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 Xenorhabdus sp.-7의 배양시간에 따른 엑소톡신 활성을 측정한 그래프로, 도 4a는 순수배양액이고, 도 4b는 상기 균주를 접종한 것을 나타낸다.
도 5 및 도 6은 이차원 액상 크로마토그래피를 이용한 Xenorhabdus sp.-7의 엑소톡신 활성에 따른 비교프로테옴 프로파일링 결과로, 도 6은 시간 경과에 따른 단백질 양을 비교하여 엑소톡신 대상 물질로 분석된 결과를 나타낸 것이다.
도 7 내지 도 10은 재조합 엑소톡신을 생산하는 내용으로, 도 7은 Exotoxin-2 유전자 클로닝을 위한 insert 및 vector의 digestion 결과로, M : DNA size marker, 1 : Exotoxin-2 F, R primer; EcoR I/ Xho I, 2 : Exotoxin-2 F, stop R primer; EcoR I/ Hind III, 3 : Exotoxin-2 F, R primer; EcoR I/ Xho I, 4 : pET 21a; EcoR I/ Xho I, 5 : pHCE 19; EcoR I/ Hind III, 6 : pGET4T-1; EcoR I/ Xho I을 의미한다. 도 8은 Digestion을 통한 Exotoxin-2 protein 유전자의 클로닝 성공 유무 확인 결과로, M : DNA size marker, 1 : pET 21a vector cloning EcoR I/ Xho I digestion, 2 : pHCE 19 vector cloning, EcoR I/ Hind III digestion, 3 : pGEX4T-1 vector cloning EcoR I/ Hind III digestion을 나타낸다. 도 9는 pGEX4T-1 벡터를 이용한 재조합 exotoxin-2 protein의 과발현 유도 결과로, M : Protein size marker 1 : pGEX4T-1_활성형 단백질 (Soluble) 2 : pGEX4T-1_불활성형 단백질 (Insoluble) 3 : pGEX4T-1 ;; exotoxin-2_활성형 단백질 (Soluble) 4 : pGEX4T-1 ;; exotoxin-2_불활성형 단백질 (Insoluble)을 의미한다. 도 10은 pHCE 19 벡터를 이용한 재조합 exotoxin-2 protein의 과발현 유도 결과로, M : Protein size marker 1 : pHCE19_활성형 단백질 (Soluble) 2 : pHCE19_불활성형 단백질 (Insoluble) 3 : pHCE19 ;; exotoxin-2_활성형 단백질 (Soluble) 4 : pHCE19 ;; exotoxin-2_불활성형 단백질 (Insoluble)을 의미한다.
도 11은 본 발명의 실시예에 따른 엑소톡신-2의 함량에 따른 방제효과를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 하기 실시 예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1. 국내 토착 병해충으로부터 exotoxin activity 를 지닌 신규 공생미생물의 분리

본 연구에서 사용된 곤충병원성 선충인 Steinernema carpocapsae 종을 YS 배지(0.2% Yeast extract, 1% Soluble starch, 0.3% Malt extract)가 첨가된 튜브에 담아 5분간 vortexing하여 선충을 파괴 시킨 후, 28℃의 조건으로 shaking incubator에서 48시간 배양한 후, 채취된 배양액을 nutrient agar bromothymol blue triphenyltetrazolium chloride(NBTA, 0.3% Beef extract, 0.5% Peptone, 1.5% Agar, 0.004%, Triphenyltetrazolium chloride, 0.0025% Bromothymol blue)에 plate out하여 콜로니(single colony)를 분리하였다.

또한, 상기 Steinernema carpocapsae 선충을 배추 좀 나방 유충에 접종하여 48시간 28℃의 조건으로 NBTA의 조성(0.3% Beef extract, 0.5% Peptone, 1.5% Agar, 0.004% Triphenyltetrazolium chloride, 0.0025% Bromothymol blue)에서 보관 후 유충 사체를 무균적으로 해부하여 사체 내부액을 plate out하여 콜로니(single colony)를 분리하였다.

상기 분리과정에서 5종의 미생물을 분리하였다.

실시예 2. 분리된 공생미생물의 16S rRNA 서열분 석

상기 분리된 5종의 미생물을 동정하기 위하여, 16S rRNA 기반 동정과정을 I애하였다.

보다 구체적으로, 분리된 공생미생물에 대한 균주 동정을 위하여, 순수 배양된 각 분리균주에 대한 16S rRNA 서열분석을 실시하였다. 일반적인 박테리아 16S rRNA 특이적 프라이머로 알려진 Bac27F 프라이머(5'-AGAGTTTGGATCMTGGCTCAG-3')와 Bac1492R 프라이머(5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3')를 이용하여 16S rRNA 증폭을 위한 PCR을 수행하였다.

상기 PCR은 94℃에서 60초간 변성 후, 66℃에서 60초간 아닐링(annealing)하고, 72℃에서 1분 동안 신장(extention)을 실시하고 이 과정을 30회 반복하는 방법으로 수행하였다.

상기 각 균주별 증폭된 16S rRNA 유전자는 PCR product purification을 통하여 정제되었으며 정제를 마친 각 균주의 16S rRNA 유전자는 sequencing되었다.

Sequencing 결과 확인된 각 균주별 16S rRNA 서열을 이용하여 NCBI에 등록되어 있는 유사서열을 찾고 이를 이용하여 계통분류학적 서열분석을 실시하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 이와 같은 서열분석 과정을 통하여 분리된 공생미생물간의 서열 유사도 및 계통분류학적 위치를 파악하여 배추 좀 나방 선충인 Steinernema carpocapsae 내 신규 공생미생물을 동정되었다.

실시예 3. 분리된 공생미생물인 Xenorhabdus sp .의 배양 시간별 exotoxin activity 측정

상기 실시예 2에서 분리된 공생미생물을 대상으로 프로테옴 기법을 활용한 신규 exotoxin 단백질 유전자 발굴을 위해 Xenorhabdus sp.의 배양과정에서 최초 살충효능이 나타나는 시기 및 살충효율이 극대화되는 시기를 파악하고자하였다.

배양시간에 따른 Xenorhabdus sp.의 exotoxin 생산량을 조사하기 위해 0.5g/LK ₂ HPO ₄ , 0.5g/L NH ₄ H ₂ PO ₄ , 0.2g/L MgSO _{4 ?} H ₂ O, 5g/L NaCl, 5g/L glucose, 50g/L yeast extract를 첨가한 배지에서 Xenorhabdus sp.을 배양하였다.

배양은 500mL flask에서 working volume 200mL(OD ₆₀₀ 값이 0.5가 되도록 균주 접종)로 28℃ 및 200rpm 하에서 약 60시간 동안 진탕 배양하면서 매 12시간 마다 (0, 12, 24, 36, 48 , 60 시간) 배양액을 채취하여 배추 좀 나방 유충((주)이코바이오, 대한민국)을 대상으로 살충활성(exotoxin activity)을 측정하였다.

상기 살충활성의 측정 방법은 상기 Xenorhabdus sp. 배양액을 10,000rpm에서 15분간 원심분리한 후 상등액을 회수한 후, 회수된 배양 상등액을 microsyringe를 이용하여 Steinernema carpocapsae 에 5 ㎕씩 접종한 후, 접종된 Steinernema carpocapsae 은 25℃ 조건의 incubator에서 보관하면서 사멸시간을 조사하였다.

회수된 각각의 배양 상등액 5 ㎕를 microsyringe를 이용하여 100 마리의 Steinernema carpocapsae 에 접종한 후, 25 incubator에서 보관 24시간 후 생존한 개체수를 조사하여 exotoxin activity을 측정하였다.

상기 균주가 생산하는 엑소톡신의 명칭 및 측정결과를 하기 표 1 및 도 3에 나타내었다.

상기 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 5종의 strains 중, Novel exotoxin bactria-4( Xenorhabdus sp.-7)의 exotoxin 활성이 가장 좋은 것으로 확인되었다.

따라서 이후 실험에서 상기 Xenorhabdus sp.-7을 이용하여, 배양시간대 별 배양상등액을 이용한 exotoxin 활성 측정을 통해 Xenorhabdus sp.의 배양과정에서 최초 살충효능이 나타나는 시기 및 살충효율이 극대화되는 시기를 파악하였다. 상기 결과를 도 4에 나타내었다.

상기 도 4에 나타낸 바와 같이, exotoxin 활성을 보이는 초기의 시점인 배양 후 12시간이고, 최대 exotoxin activity를 지닌 배양 후 48시간이었다.

실시예 4. 이차원 액상 크로마토그래피기반 프로테오믹스 기법을 이용한 Xenorhabdus sp .의 프로테옴 정밀분석

Exotoxin activity를 지닌 배추 좀 나방 선충의 공생미생물인 Xenorhabdus sp.-7의 exotoxin 단백질 프로테옴 정보 구축을 위하여 본 연구과제의 핵심인 이차원 액상 크로마토그래피를 이용한 프로테옴 정밀분석을 실시하였다.

exotoxin 활성을 보이는 초기의 시점인 배양 후 12시간과 최대 exotoxin activity를 지닌 배양 후 48시간의 단백질의 프로테옴 비교를 위한 compatative proteome 분석을 실시하였다.

Xenorhabdus sp.-7은 최적배지(0.5g/L K2HPO4, 0.5g/L NH4H2PO4, 0.2g/L MgSO4?H2O, 5g/L NaCl, 5g/L glucose, 50g/L yeast extract)에서 배양되었으며 배양 후 12시간 및 48시간 후에 sampling된 배양액으로부터 원심분리(4℃, 250 rpm, 10 min)하여 균체를 회수하였다. 상기회수된 균체는 TE buffer룰 이용하여 2번 세척 후, 회수된 균체를 다시 TE buffer에 재현탁하였으며, sonicator를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 그 후 파쇄 현탁된 균체를 13000 rpm의 조건으로 15분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다.

회수된 상등액은 buffer change를 위하여 start buffer (pH 8.5)로 equilibration 되어 있는 PD-10 컬럼(Amersham Biosciences, 일본)에 loading 한 후, 10분 동안 방치함. PD-10 컬럼에 loading 된 단백질을 회수하기 위하여 start buffer 2 ml을 재 loading 하였으며, 회수된 단백질은 Bradford 기법을 이용하여 단백질 정량하였다.

이차원 액상 크로마토그래피에 injection할 단백질은 1.5 mg/ml의 농도로 준비하였으며, 샘플 injection 전 일차컬럼은 컬럼 volume 30배의 start buffer로 equilibration 시켜 컬럼 내부의 pH가 8.3-8.5가 되도록 만들어줌. pH에 따른 단백질의 분리를 위하여 1.5 mg/ml로 정량된 Xenorhabdus sp. 단백질을 loop에 injection 하였다.

샘플 injection 후, 10분 동안은 start buffer가 loop를 흐를 수 있도록 하였으며, 20분 후에 elution buffer (pH 4.0)가 loop로 바뀌도록 프로그래밍하였다.

상기 사용된 기기는 ProteomeLab PF2D system(Beckman Coulter)에서 구입하였고, 상기 사용된 버퍼의 조성은 다음과 같다.

Start buffer : (6M urea, 25mM Bis-Tris), pH 8.5 with iminodiacetic acid

Elution buffer : (6M urea, 10% v/v polybuffer 74 (GE Healthcare)), 0.15% Triton X-100, pH 4.0 with iminodiacetic acid

단백질은 isoelectric point (pI)에 따라 elution되며, pH에 따른 단백질 회수가 끝나면 컬럼 volume 10배의 1M NaCl solution을 이용하여 컬럼을 세척하였으며, 단백질 샘플은 pH 0.3의 간격으로 회수하였다.

분리 정제된 단백질은 0.2 ml 씩 이차원 크로마토그래피 컬럼에 injection하였다. 상기 이차원 크로마토그래피( ProteomeLab PF2D system (Beckman Coulter))의 buffer의 조성은 0.1% TFA in water (solvent A) 및 0.08% TFA in acetonitrile (solvent B)이다.

상기 이차원 크로마토그래피를 통한 원활한 단백질 회수를 위하여 컬럼은 50로 유지하였으며, flow rate는 0.75 ml/min으로 유지하였다. 단백질의 크기에 따른 분리를 위하여 DW에 0.1% (v/v) TFA를 첨가한 Solvent A와 acetonitrile에 0.08% (v/v) TFA를 첨가한 Solvent B를 준비하였다.

단백질은 Solvent B를 0-100%의 농도로 gradient를 주어 회수 하였음. 각 fraction은 30초에서 시작하여 24.3초 사이에 회수되었다. 일차원 크로마토그래피는 UV 214 nm에서 검출되었으며, 이차원 크로마토그래피는 UV 280 nm에서 검출되었음. 이와 같은 과정을 통하여 exotoxin 활성을 보이는 초기의 시점인 배양 후 12시간 sample과 최대 exotoxin activity를 지닌 배양 후 48시간 sample에 대한 이차원 액상 크로마토피기반의 compatative proteome 결과를 도출하였다. 이차원 액상 크로마토그래피를 통하여 검출된 단백질 pick는 proteovue program을 이용하여 이미지화 시킨 후 분석하였다.

상기 분석결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.

상기 분석결과 4종의 단백질이 분석대상으로 검토되었다.

실시예 5. MALDI - TOF mass spectrometer ( AXIMA - CFR plus )을 이용한 단백질 동정

프로테옴분석을 통해 exotoxin 후보단백질을 선정하고, 이차원 reverse phase column에 의하여 fraction 되어 있는 각 exotoxin 후보단백질은 수용상태에서 직접 1 ㎕의 trypsin(100 ng/㎕) 첨가 후 60℃에 한시간 보관하여 digestion 하였으며, 이를 통해 peptide화된 각각의 단백질 시료는 MALDI-TOF/TOF MS/MS 기법을 이용하여 단백질 동정에 이용되었다.

보다 구체적으로, 이차원 액상 크로마토그래피 기반의 비교프로테옴 분석결과 exotoxin 최대 활성을 지닌 배양 후 48시간 시료의 프로테옴 결과에서 발현량의 증가를 보이는 단일단백질을 회수하였다. 분리 및 회수된 단일 단백질 수용액을 sequencing grade modified trypsin (Promega, Madison, WI, USA) 처리하여 peptide화 하고, Trypsin으로 digestion된 peptide 조각들은 4700 proteomics analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용한 MALDI-TOF-TOF 분석에 이용하였다.

MALDI-TOF-TOF 분석을 위해 0.5% TFA 용액에 녹인 peptide 조각들은 ZipTipC18 (Millerpore, Bedford, MA)에 의하여 염과 그 밖의 불순물을 제거하였다. 50% ACN/0.1 TFA에 녹인 a-Cyano-4-hydroxycin namic acid matrix와 조각난 peptide 즉 시료용액을 혼합하여 target well에 올린 후, 공기 중에서 용매와 물이 증발되고 결정화가 이루어질 때까지 방치하였다. 충분히 결정이 만들어진 후에 시료가 올린 평판을 레이저 빔 소스가 있는 이온화실로 옮기고 펄스 빔을 주사하여 이온화 시킨 후, 질량값을 얻었다. 정확한 질량 스펙트럼을 얻기 위한 교정법으로 질량 값이 알려져 있는 standard peptide 혼합물 (des-Arg Bradykinin, Angiotensin I, Glu-Fibrino-peptid B, Adrenocortico-tropic hormone (ACTH) clip 1-17, ACTH clip 18-39, ACTH clip 7-38)을 위와 같은 방법으로 처리한 후 실험적인 질량 스펙트럼 값을 얻고 이론적인 값과 비교하여 정확하게 교정하였다. 또한 peptide 단위로의 절단에 사용된 trypsin의 peptide peak ([M+H]+=842.5099, 2211.1046) 값도 standard로 이용하였다.

MALDI-TOF-TOF에서 얻어진 target peptide의 MS/MS값은 Mascot peptide mass fingerprint software (www.matrixscience.com)를 사용하여 MSDB, NCBI에 존재하는 peptide 서열정보와 비교하여 동정하였다.

상기 동정된 결과를 도 1에 나타내었다.

실시예 6. 유전자 클로닝을 통한 재조합 신규 exotoxin -2 단백질 발현 벡터 제작

클로닝 실험에 사용된 벡터는 pHCE 19(bioleaders, 대한민국), pET 21a(Novagen, 독일), pGEX 4T-1(GE Healthcare, 노르웨이)이며, 발굴된 신규 exotoxin-2 단백질 유전자의 클로닝을 위한 일차적인 단계로 신규 exotoxin 단백질 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제작하기 위하여 제한 효소 자리를 포함한 DNA 프라이머를 하기 표 2와 같이 제작하였다.

상기 제한 효소 자리를 첨가하여 제작한 프라이머를 이용한 PCR 방법을 통하여 신규 발굴된 exotoxin-2 단백질 유전자를 증폭하였다.

상기 벡터와 관련된 정보는 하기와 같다. 상기 제한효소 부위는 pET 21a의 경우, EcoR I/Xho I이고, pGEX 4T-1의 경우, EcoR I/Xho I이며, pHCE 19의 경우 EcoR I/Hind III이고, 상기 제한효소의 ligation 조건은 다음과 같다.

상기 형질전환은 BTX electroporation system을 이용한 전기천공법으로 수행하였고, set voltage: 1.8kV, set resistance: 200 ohms으로수행하였다.

상기 형질전환된 균주는 Luria-Bertani broth(1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) containing 50 ㎕/mL ampicillin, induced at an OD(600 nm) of 0.6 with 1mM IPTG and grown for 4 hours and then harvested이었다.

상기 exotoxin-2 단백질 유전자의 PCR 조건은 변성(denaturation): 94, 60초, 어닐링(annealing): 66, 60초, 신장(extention): 72, 1분을 진행하였으며, 동일한 과정을 30회 반복하였다.

상기 PCR를 마친 각 exotoxin 단백질 유전자와 벡터를 동일한 제한효소를 이용하여 자른 후 라이게이션(ligarion)하여 재조합 벡터를 제조하였다. 상기 제작된 재조합 벡터는 전기천공법(electrophoration)을 이용하여 E. coli BL21(DE3)로 형질전환 되었으며, 각 벡터의 특이적 항생제 내성을 이용하여 암피실린(amphicillin) 저항성 콜로니를 선별하였다.

실시예 7. 고효율 재조합 exotoxin -2 단백질 발현시스템 개발

제작된 재조합 exotoxin 단백질 발현 벡터를 숙주세포내로 도입하여 대장균 형질 전환체를 확보하고자 함. 제작된 발현 벡터는 전기천공법(electrophoration)을 이용하여 E. coli BL21(DE3)로 형질전환 하였으며, 각 벡터의 특이적 항생제 내성을 이용하여 암피실린(amphicillin) 저항성 콜로니를 선별하였다. 확보된 각 재조합 exotoxin 단백질 생산 균주를 LB(0.5% yeast extract, 1% peptone, 0.5% NaCl) 배지에 종균 배양하였다.

배양된 종균 배양액의 일부를 본 배양배지(LB배지 + 50mg/L 암피실린)에 접종 (1%)한 다음 37에서 200 rpm으로 배양하여 각 재조합 exotoxin 단백질의 발현 및 세포의 성장을 유도하였음. 유전자의 발현은 배양액의 OD600이 0.4에 이르렀 때에 isopropylthio-β-D-galactoside(IPTG) 1mM을 첨가하여 유도하였음. IPTG 첨가 후 동일한 조건으로 3-4시간 더 배양을 한 세포 배양액은 원심분리(13,000 rpm, 4, 10분)하여 균체만을 따로 분리하였다. 원심분리를 통하여 회수된 균체는 10 mM Tris-HCl을 이용하여 재현탁하고, sonicator를 이용하여 균체를 파쇄 하였다. 획득한 배양액은 원심분리(13,000 rpm, 4, 10분)를 통하여 활성형 단백질과 비 활성형 단백질로 분리 하였다.

각 재조합 exotoxin 단백질 발현 클론으로부터 분리 및 확보된 활성형 재조합 exotoxin 단백질과 비활성형 exotoxin 단백질은 SDS-PAGE (12% 및 15%)분석을 통하여 신규 재조합 exotoxin 단백질의 발현 정도, 재조합 exotoxin 단백질 내 활성형 단백질 및 비활성형 단백질의 구성정도를 측정하였고, 그 결과를 도 7 내지 도 10에 나타내었다.

실시예 8. 분리 정제된 재조합 exotoxin -2 단백질의 정량적 in vivo 살충성 테스트

재조합 exotoxin 단백질의 정제를 위하여 His 융합 파트너(pET-21a vector)를 가지는 exotoxin 단백질의 경우는 Ni-NTA agarose resin을 이용하며, GST를 융합 파트너(pGEX 4T-1, pHCE)로 가지는 exotoxin 단백질의 경우는 glutathione agarose를 이용하여 정제함. 이를 통해 확보된 재조합 exotoxin 단백질의 접종량에 따른 배추 좀 나방 유충의 사멸시간 및 치사율등의 종합분석을 통해 방제 효능 평가를 실시하였다.

Exotoxin-2 protein의 경우 역시 약 70% 이상의 재조합 활성형 exotoxin-2 protein을 발현 시키는 pHCE 19 벡터를 이용한 재조합 균주로부터 순수 분리?정제되었다.

준비된 exotoxin-2 단백질은 배추 좀 나방 유충을 대상으로한 in vivo 살충성 테스트를 위해 microsyringe를 이용하여 1, 10, 20, 100, 200, 1000 ng의 농도로 Steinernema carpocapsae에 접종하였다. 접종된 배추좀나방 유충을 25 incubator에서 보관하면서 보관 시간별 배추좀나방 유충의 mortality(%)를 측정하였으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다.

<110> ECOBIO INC <120> A PESTICIDAL COMPOSITION COMPRISING EXOTOXIN <130> KP20100274 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1089 <212> DNA <213> exotoxin-2 DNA <400> 1 atggttatta aacccggacc aactccgagt gtaatacaat caacgcctga tgatagaagt 60 gaatatcaac ccgttgaaaa gcaaatagcg ggagatataa tacgtgtact agaattcaag 120 caaacaaatg aaagtcatac aggattgtat ggaattgcat atcgagctaa gaaagtaata 180 atagcatatg ctttagcggt aagtggtatt cataatgtct ctcaacttcc agaagactat 240 tataaaaata aggataacac aggtagaatt tatcaagaat acatgtctaa tctttcatct 300 gcactattgg gtgagaatgg tgatcaaatt tctaaagata tggcaaatga ttttacccag 360 aacgaactgg agtttggagg tcaacgtctt aaaaatacct gggatattcc tgatcttgag 420 aataaactat tggaagatta ttcagatgaa gataaattat tagcactata tttctttgct 480 tcacaagaac ttccaatgga ggcaaatcaa caatcaaatg cagcaaattt ttttaaagta 540 attgattttt tacttatctt atctgctgta acatcactgg gaaaaaggat tttttcaaaa 600 aatttttaca atggtctaga aactaaatca ttagagaatt atattcagag aaaagcactt 660 tctaaacctt tctttcgacc accgcagaag ttacctgatg gcagaacagg cta cttggcc 720 ggtccaacaa aagcgcctaa attgccaaca acgtcttcta cagcaacaac gtctacagca 780 gcttcatcta attggagagt tagtttgcaa aaacttagag ataacccatc cagaaataca 840 tttatgaaaa tggatgatgc tgcaaaacga aaatatagtt catttataaa agaggtacaa 900 aagggtaatg atccacgtgc agcagcaaca agtattggta caaaaagcgg cagtaacttc 960 gaaaaactgc aaggtagaga tttatatagt ataagactaa gccaagaaca cagggtaaca 1020 ttctccataa ataataatga cgaattaacg gagatccaaa gtgttggaac tcattaccaa 1080 aatatataa 1089 <210> 2 <211> 362 <212> PRT <213> EXOTOXIN-2 Protein <400> 2 Met Val Ile Lys Pro Pro Glu Thr Pro Ser Val Ile Gln Leu Thr Arg 1 5 10 15 Ile Ala Glu Gly Glu Ala Glu Lys Ile Glu Lys Gln Ile Ala Gly His 20 25 30 Tyr Ala Arg Val Leu Glu Phe Lys Gln Thr Asn Glu Ser His Thr Gly 35 40 45 Leu Tyr Gly Ile Ala Tyr Arg Ala Lys Lys Val Ile Ile Ala Tyr Ala 50 55 60 Leu Ala Val Ser Gly Ile His Asn Val Ser Gln Leu Pro Glu Asp Tyr 65 70 75 80 Tyr Lys Asn Lys Asp Asn Thr Gly Arg Ile Tyr Gln Glu Tyr Met Ser 85 90 95 Asn Leu Ser Ser Ala Leu Leu Gly Glu Asn Gly Asp Gln Ile Ser Lys 100 105 110 Asp Met Ala Asn Asp Phe Thr Gln Asn Glu Leu Glu Phe Gly Gly Gln 115 120 125 Arg Leu Lys Asn Thr Trp Asp Ile Pro Asp Leu Glu Asn Lys Leu Leu 130 135 140 Glu Asp Tyr Ser Asp Glu Asp Lys Leu Leu Ala Leu Tyr Phe Phe Ala 145 150 155 160 Ser Gln Glu Leu Pro Met Glu Ala Asn Gln Gln Ser Asn Ala Ala Asn 165 170 175 Phe Phe Lys Val Ile Asp Phe Leu Leu Ile Leu Ser Ala Val Thr Ser 180 185 190 Leu Gly Lys Arg Ile Phe Ser Lys Asn Phe Tyr Asn Gly Leu Glu Thr 195 200 205 Lys Ser Leu Glu Asn Tyr Ile Glu Arg Lys Lys Leu Ser Lys Pro Phe 210 215 220 Phe Arg Pro Pro Gln Lys Leu Pro Asp Gly Arg Thr Gly Tyr Leu Ala 225 230 235 240 Gly Pro Thr Lys Ala Pro Lys Leu Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ala Thr 245 250 255 Thr Ser Thr Ala Ala Ser Lys Gly Trp Arg Val Ser Leu Gln Lys Leu 260 265 270 Arg Asp Asn Pro Ser Arg Asn Thr Phe Met Lys Met Asp Asp Ala Ala 275 280 285 Lys Arg Lys Tyr Ser Ser Phe Ile Lys Glu Val Gln Lys Gly Asn Asp 290 295 300 Pro Arg Ala Ala Ala Thr Ser Ile Gly Thr Lys Ser Gly Ser Asn Phe 305 310 315 320 Glu Lys Leu Gln Gly Arg Asp Leu Tyr Ser Ile Arg Leu Ser Gln Glu 325 330 335 His Arg Val Thr Phe Ser Ile Asn Asn His Glu Gly Arg Met Glu Ile 340 345 350 Gln Ser Val Gly Thr His Tyr Gln Asn Ile 355 360