근면 미생물을 이용한 농약 제거 방법 및 그 미생물 {AGROCHEMICAL REMOVING METHOD USING ROOT SURFACE FIXING BACTERIA AND ITS BACTERIA}

본 발명은 근면 미생물을 이용한 농약 제거 방법 및 그 미생물에 관한 것으로, 상세하게는, 비점오염원의 하나인 농가 등의 하천에 오염된 농약을 근면 미생물이 흡착된 수생식물을 이용하여 제거하기 위한 근면 미생물을 이용한 농약 제거 방법 및 그 미생물에 관한 것이다.

현재 전 세계적으로 환경에 관한 문제들이 부각되면서 각종 환경오염에 관한 심각한 문제에 대하여 해결 방안을 마련하고 연구하고 있는 추세이다. 특히 수질오염에 대한 인식의 변화로 각종 수질 정화에 대한 관심과 각고의 노력으로 과거에 비하여 수질오염이 크게 개선되어 가고 있는 상황이다. 또 호소(湖沼) 등에서는 오염물을 정화하는 식물을 식재하여 키우고 있으나 겨울철의 경우 그 식물에 의해 유기오염원이 그대로 하천에 방치될 수 있는 기술을 적용시킨다는 문제점이 있다. 또한, 하천의 경우 하천변에 식물을 식재하여 하상 바닥 및 하부에 있는 다양한 오염 성분을 제거하고 있다.

특히, 최근에 점오염원보다 비점오염원에 대한 관심이 고조되고 있다. 즉, 점오염원은 오염물질의 유출경고가 명확하여 수집이 쉽고, 계절에 따른 영향이 상대적으로 적은 만큼 연중 발생량 예측이 가능하여 관거 및 처리장 등 처리시설의 설계, 유지 및 관리가 용이하다. 반면에, 비점오염원은 오염물질의 유출 및 경로가 명확하게 구분되지 않아 수집이 어렵고 발생량과 배출량이 강수량 등의 기상조건에 크게 좌우되기 때문에 처리시설의 설계, 유지 및 관리가 어렵다는 문제가 있다.

이러한 비점오염에는 농작물에 흡수되지 않고 농경지에 남아 있는 비료와 농약, 초지에 방목된 가축의 배설물, 가축 사육 농가에서 배출되는 미처리 축산폐수, 빗물에 섞인 대기오염물질, 도로 노면의 퇴적물, 합류식 하수관거에서 강수시 설계량을 초과하여 하천으로 흘러드는 오수, 하수 및 빗물의 혼합수 등이 그예이다.

이러한 비점오염원의 제거방법으로 현재까지 하천 근처나 하상에 식물을 식재한 인공적 호안이나 습지를 만들어 수질을 정화하는 방법이 최근 주목을 받고 있다. 예를 들어 인공습지 식물들을 식재하여 그 식물이 오염원 중의 어떤 성분을 흡수하여 정체된 수중에서 수질을 정화하는 것이다. 그리고 호안에 몇몇 식물을 식재함으로써 하천을 보호하고 수질의 오염도를 줄이기도 하는 실정에 있다.

특히, 비점오염원 중에서 지류 하천으로 유입되는 농약을 물리화학적 방법으로 처리하는 것이 아니라 친환경적으로 수생식물을 사용하여 이러한 농약 성분을 제거하는 것이 바람직할 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은, 보다 효율적이면서 오염된 농약을 친환경적으로 제거하기 위한 근면 미생물을 이용한 농약 제거 방법 및 그 미생물을 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은, 하천의 온도와 같은 저온에서 효율적으로 흡착이 가능한 근면 미생물을 이용한 농약 제거 방법 및 그 미생물을 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 근면 흡착 가능한 미생물 중에서도 농약 분해도가 양호한 미생물을 활용할 수 있는 근면 미생물을 이용한 하천의 농약 제거 방법 및 그 미생물을 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 수중 생태계를 개선시키며, 수생식물에 의한 자연경관의 심미적 효과를 높일 수 있으며, 그 식물을 이용한 퇴비화, 에너지화를 유도시킬 수 있는 근면 미생물을 이용한 하천의 농약 제거 방법 및 그 미생물을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적은 본 발명에 따라, (a) 수생식물의 뿌리에서 근면 미생물을 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 미생물을 배양하는 단계; (c) 배양된 미생물을 수생식물뿌리에 흡착하는 단계; (d) 미생물이 흡착된 수생식물 뿌리를 오염지에 식재하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 근면 미생물을 이용한 하천의 농약 제거방법에 의해 달성된다.

또한, 상기 (a) 단계는, 하천변의 수생식물뿌리를 깨끗이 세척하여 오염물질을 제거하고 뿌리를 절단하여 멸균수에 넣어 와동(vortexing) 하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 (a) 단계는, 와동한 액을 10 ³ , 10 ⁴ , 10 ⁵ 으로 희석하고 샘플 100ul 씩을 옥수수가루 배지(CMA : Corn Meal Agar)에 도말하여 유기물을 잘 분해하는 근면미생물을 선발하기 위하여 배양하는 것을 더 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 평판배지에 20~30℃, 3~5일간 전배양하는 것을 더 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 (c) 단계는, (c-1) 근면 미생물을 액체 배지에 접종하여 진탕배양기(shaking incubator)에서 3~5일간 배양하고 배양된 현탁액을 원심 분리하여 멸균수로 세척하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 (c)단계는, (c-2) 멸균수로 세척한 다음 미생물을 증류수에 현탁하여 OD ₆₆₀ 수치가 0.3~1.0 이 되게 마련하는 것을 더 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 (c)단계는, (c-3) 수생식물을 세척하여 오염물질을 제거하고 수생식물의 뿌리를 살균하며, 살균된 수생식물 뿌리를 멸균시키는 것이 바람직하다.

또한, 상기 (c-3)단계의 수생식물 뿌리를 상기 (c-2)단계의 현탁액에 넣어 배양하여 근면 미생물을 수생식물 뿌리에 흡착하는 것을 더 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 수생식물은 부들(Typha arientalis), 갈대(Phragmites australis), 애기부들(Typha angustifolia), 달뿌리풀(Phragmites japonica), 줄(Zizania latifolia)을 포함하는 것이 바람직하다.

한편, 본 발명의 목적은, 배양된 미생물은 국립농업과학원 농업유전자원센터에 수탁한 수탁번호 제KACC91556P호의 'Rhizobium sp. DH-2', 수탁번호 제KACC91557P호의 'Pseudomonas sp. DH-3' 및 수탁번호 제KACC91558P호의 'Microbacterium testaceum DH-4' 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 근면 미생물에 의해서도 달성될 수 있다.

본 발명에 따르면, 비교적 효율적이면서 친환경적으로 농가 하천에 오염된 농약을 제거할 수 있다.

또한, 하천의 온도와 같거나 유사한 저온에서 효율적으로 흡착이 가능하다.

또한, 근면 흡착 가능한 미생물 중에서도 농약 분해도가 양호한 미생물을 활용할 수 있다.

또한, 수중 생태계를 개선시키며, 수생식물에 의한 자연경관의 심미적 효과를 높일 수 있으며, 그 식물을 이용한 퇴비화, 에너지화를 유도시킬 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 근면 미생물의 PCR 결과 스펙트럼 사진,
도 2a 및 도 2b는 각각 6번 미생물의 배양 사진,
도 3a 및 도 3b는 각각 8번 미생물의 배양 사진,
도 4a 및 도 4b는 각각 9번 미생물의 배양 사진,
도 5는 부들에 미생물을 흡착시키는 상태를 나타낸 사진,
도 6은 본 발명에 따른 과정을 설명하기 위한 흐름도이다.

본 발명에 따른 근면 미생물을 이용한 농약 제거 방법에 대하여 도 1 내지 도 6을 참조하여 설명하면 다음과 같다.

미생물 분리 단계(S110)에서는 하천변에 자생하는 수생식물을 채집하고 미생물을 배양하여 분리하는 과정이다.

먼저, 하천변에 자생하는 수생식물들 채집한다. 수생식물의 종류는 다양할 수 있으며, 부들을 포함한다. 채집된 수생식물의 뿌리를 세척하여 토양, 낙엽 등의 오염물질을 제거한다. 그런 다음, 수생식물의 뿌리를 예를 들면, 1cm 크기로 잘라 멸균수 10ml에 넣어 5분간 와동(vortexing)을 시킨다.

이하에서 수생식물은 일예로 부들(Typha arientalis)을 예로 들었으나, 갈대(Phragmites australis), 애기부들(Typha angustifolia), 달뿌리풀(Phragmites japonica), 줄(Zizania latifolia) 등을 포함할 수 있다.

와동된 샘플을 각각 10 ¹ , 10 ² , 10 ³ , 10 ⁴ , 10 ⁵ 으로 희석하고 희석된 샘플에서 10 ³ , 10 ⁴ , 10 ⁵ 샘플 100~200ul 씩을 옥수수가루 배지(CMA : Corn Meal Agar)에 도말하여, 하천의 온도와 유사한 온도에서 배양한다. 즉, 15 ~ 25℃에서 3 내지 5일간 인큐베이터에서 배양하는 것이 바람직하다. 배양된 colony들을 각 single colony별로 배양하여 순수 분리한다.

분리된 미생물을 배양하는 단계(S120)는, 미생물 분리 단계(S110)를 거친 미생물을 배양한다. 그리고, 이 단계에서 배양된 근면 미생물의 동정을 확인한다.

먼저 분리된 미생물을 평판배지(LB agar)에서 일정 온도 및 기간 동안 배양한다. 배양하는 기간을 단축하기 위해 온도를 25~30℃로 유지하고 3 내지 5일간 전 배양시킨다. 전 배양된 근면흡착미생물 single colony를 이용하여 콜로니 중합효소연쇄반응(colony PCR : colony Polymerase Chain Reaction)을 수행하였다. 이 때 시발체(Primer)로는 P16s F : GCCTTGTACACACCGC 와 P23s R : CTTAGATGTTTCAGTTC를 사용하였다(논문출처 : Scientific Reports of the Faculty of Agriculture Okayama University Vol. 95, 7-11, 2006).

중합효소 연쇄반응의 조건을 간략하게 살펴보면 다음과 같다.

94℃ 4min

94℃ 1min, 58℃ 1min, 72℃ 2min, (35 cycle )

72℃ 10min

4℃ ∞

상기 조건에 따른 반응을 거친 PCR의 결과에 대한 사진은 도 1에 도시되어 있다.

이렇게 증폭된 rDNA를 분석기(ABI 3730xl DNA Analyzer)를 이용하여 염기서열 분석을 하였다.

분석된 DNA 염기서열을 미국 국립생물정보센터에서 상동성 검색을 수행하였으며, 그 중에서 대표적인 미생물을 도 1에 도시된 바와 같이 실험번호 6번 미생물, 8번 미생물, 9번 미생물이라 칭한다. 이러한 세 개의 미생물인 6번, 8번, 9번 미생물의 배지 상태는 각각 도 2 내지 도 4에 도시되어 있다.

여기서, 6번 미생물은 2010년 5월 국립농업과학원 농업유전자원센터에 수탁한 수탁번호 제KACC91556P호의 'Rhizobium sp. DH-2'에 해당하고, 6번 미생물은 2010년 5월 국립농업과학원 농업유전자원센터에 수탁한 수탁번호 제KACC91557P호의 'Pseudomonas sp. DH-3'에 해당하고, 9번 미생물은 2010년 5월 국립농업과학원 농업유전자원센터에 수탁한 수탁번호 제KACC91558P호의 'Microbacterium testaceum DH-4'에 해당한다.

상기 세 개의 근면 미생물(6번, 8번 및 9번)에 대해 농약 제거에 대한 테스트를 시행하는 방법과 그 결과를 살펴보면 다음과 같다.

먼저, AB액체배지(minimum medium : K2HPO4 3g, NaH2PO4 1g, MgSO4?7H2O 0.3g, KCl 0.15g, CaCl2 0.01g, FeSO4?7H2O 0.0025g)에 10ppm 농도의 농약 원제를 첨가하여 미생물 최소배지를 제조한다(1 liter 기준).

세 가지 근면흡착미생물(실험번호 : 6번, 8번, 9번)을 각각의 농약원제가 첨가된 AB배지 10ml에 single colony로 접종하여 15~25℃, 200rpm으로 48시간 배양한다. 배양된 샘플들을 GC 분석법(Agilent 6890N Series with Auto sampler)으로 분석하여 농약 분해효율을 측정한다.

이렇게 측정한 데이터를 정리한 것이 아래의 <표 1>이다.

<표 1> 실험번호 6번, 8번 및 9번 근면 미생물의 농약 분해효율 비교

상기의 표를 정리하면, 농약의 카보퓨란(Carbofuran)를 감소시키는 비율은 9번 미생물이 36.4%로 가장 높음을 알 수 있다. 또한, 농약의 뷰타클로르(Butachlor)를 감소시키는 비율은 6번 미생물이 33.57%로 가장 높음을 알 수 있다. 또한, 농약의 만코제브(Mancozeb)를 감소시키는 비율은 9번 미생물이 40.51%로 가장 높음을 알 수 있다. 그리고, 농약의 아이비(IBP, Kitazin)를 감소시키는 비율은 세 개 미생물이 상당히 높으나, 그 중 9번 미생물이 52.58%로 가장 높음을 알 수 있다. 또한, 농약의 프로피네브(Propineb)를 감소시키는 비율은 세 개 미생물이 매우 높으나, 그 중 9번 미생물이 80.93%로 가장 높음을 알 수 있다.

다음, 근면 미생물을 수생식물 뿌리에 흡착하는 단계(S130)는, 수생식물 뿌리에 근면 미생물을 흡착시키는 과정이다.

먼저, 근면흡착미생물을 액체(LB broth) 배지에 접종하여 20~25℃, 200rpm 으로 진탕배양기(shaking incubator)에서 3 내지 5일간 배양한다. 배양된 현탁액을 원심분리하고 멸균수로 2회 씻어준다. 다음, 멸균수로 씻은 미생물을 멸균수에 현탁하여 OD ₆₆₀ 값이 0.3~1.0이 되게 준비한다.

반면, 수생식물의 하나인 부들을 수돗물로 깨끗이 씻어 뿌리의 오염물질들을 제거 한다. 부들의 뿌리를 70% 에틸 알콜(ET-OH)에 10~50초간 넣어 살균한다. 이렇게 살균된 부들뿌리를 멸균수로 3회 세척하여 뿌리에 남아있는 알코올을 제거하여 준다.

이런 살균 과정을 거친 부들뿌리를 3번 현탁액에 넣어 20~30℃, 6시간이상 배양하여 근면 미생물을 흡착시킨다. 수생식물에 근면 미생물을 흡착시키는 상태를 보여주는 사진이 도 5이다.

그리고, 근면 미생물이 흡착된 수생식물 뿌리를 오염원인 하천 등에 식재하는 단계(S140)는, 수생식물 뿌리에 흡착된 근면 미생물을 비점오염원들에서 발생하는 오염물질 등이 모이는 곳에 식재한다. 예를 들면 지류 하천 등에 적절한 배열, 깊이, 수량 등으로 뿌리에 흡착된 근면 미생물을 갖는 부들을 식재할 수 있다.

전술한 예에서 알 수 있듯이 생화학적 처리 등에 의하지 않고 수생식물과 수생식물에 흡착된 근면 미생물을 이용하여 비교적 효율적이면서 친환경적으로 농가 하천에 오염된 농약을 제거할 수 있다. 또한, 하천의 온도와 같거나 유사한 저온에서 효율적으로 흡착이 가능하다. 또한, 근면 흡착 가능한 미생물 중에서도 농약 분해도가 양호한 미생물만을 선택하여 이를 활용할 수 있다. 그리고, 또한, 수중 생태계를 개선시키며, 수생식물에 의한 자연경관의 심미적 효과를 높일 수 있으며, 그 식물을 이용한 퇴비화, 에너지화를 유도할 수 있다.

여기서, 본 발명의 여러 실시 예를 도시하여 설명하였지만, 본 발명의 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 당업자라면 본 발명의 원칙이나 정신에서 벗어나지 않으면서 본 실시 예를 변형할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 발명의 범위는 첨부된 청구항과 그 균등물에 의해 정해질 것이다.

국립농업과학원 농업유전자원센터

KACC91556

20100511

국립농업과학원 농업유전자원센터

KACC91557

20100511

국립농업과학원 농업유전자원센터

KACC91558

20100511

<110> KIM SANG JIN;DOOHAP CLEANTECH CO.,LTD <120> AGROCHEMICAL REMOVING METHOD USING ROOT SURFACE FIXING BACTERIA AND ITS BACTERIA <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 949 <212> DNA <213> Rhizobium sp. <400> 1 cgcaagggga gtggcagacg ggtgagtaac gcgtgggaat ctaccgtgcc ctgcggaata 60 gctccgggaa actggaatta ataccgcata cgccctacgg gggaaagatt tatcggggta 120 tgatgagccc gcgttggatt agctagttgg tggggtaaag gcctaccaag gcgacgatcc 180 atagctggtc tgagaggatg atcagccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac 240 gggaggcagc agtggggaat attggacaat gggcgcaagc ctgatccagc catgccgcgt 300 gagtgatgaa ggccttaggg ttgtaaagct ctttcaccgg agaagataat gacggtatcc 360 ggagaagaag ccccggctaa cttcgtgcca gcagccgcgg taatacgaag ggggctagcg 420 ttgttcggaa ttactgggcg taaagcgcac gtaggcggat atttaagtca ggggtgaaat 480 cccagagctc aactctggaa ctgcctttga tactgggtat cttgagtatg gaagaggtaa 540 gtggaattcc gagtgtagag gtgaaattcg tagatattcg gaggaacacc agtggcgaag 600 gcggcttact ggtccattac tgacgctgag gtgcgaaagc gtggggagca aacaggatta 660 gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gaatgttagc cgtcgggcag tatactgttc 720 ggtggcgcag ctaacgcatt aaacattccg cctggggagt acggtcgcaa gattaaaact 780 caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg 840 cgcagaacct ta ccagctct tgacattcgg ggtttgggca gtggagacat tgtccttcag 900 ttaggctggc cccanaacnn tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcg 949 <210> 2 <211> 868 <212> DNA <213> Pseudomonas sp. <400> 2 gacgggagct tgctccttga ttcagcggcg gacgggtgag taatgcctag gaatctgcct 60 ggtagtgggg gacaacgttt cgaaaggaac gctaataccg catacgtcct acgggagaaa 120 gcaggggacc ttcgggcctt gcgctatcag atgagcctag gtcggattag ctagttggtg 180 gggtaatggc tcaccaaggc gacgatccgt aactggtctg agaggatgat cagtcacact 240 ggaactgaga cacggtccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tggacaatgg 300 gcgaaagcct gatccagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg tcttcggatt gtaaagcact 360 ttaagttggg aggaagggca gtaagctaat accttgctgt tttgacgtta ccgacagaat 420 aagcaccggc taactctgtg ccagcagccg cggtaataca gagggtgcaa gcgttaatcg 480 gaattactgg gcgtaaagcg cgcgtaggtg gtttgttaag ttggatgtga aagccccggg 540 ctcaacctgg gaactgcatc caaaactggc aagctagagt acggtagagg gtggtggaat 600 ttcctgtgta gcggtgaaat gcgtagatat aggaaggaac accagtggcg aaggcgacca 660 cctggactga tactgacact gaggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc 720 tggtagtcca cgccgtaaac gatgtcaact agccgttgga atccttgaga ttttagtggc 780 gcagctaacg cattaagttg accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa aactcaatga 840 attgacgggg gc ccgcacaa gcggtgga 868 <210> 3 <211> 706 <212> DNA <213> Microbacterium testaceum <400> 3 cacgtgagca acctgccctg gactctggga taagcgctgg aaacggcgtc taatactgga 60 tatgagcccc tatcgcatgg tgggggttgg aaagattttt tggtctggga tgggctcgcg 120 gcctatcagc ttgttggtga ggtaatggct caccaaggcg tcgacgggta gccggcctga 180 gagggtgacc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt 240 ggggaatatt gcacaatggg cgaaagcctg atgcagcaac gccgcgtgag ggatgacggc 300 cttcgggttg taaacctctt ttagcaggga agaagcgaaa gtgacggtac ctgcagaaaa 360 agcgccggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggcgcaag cgttatccgg 420 aattattggg cgtaaagagc tcgtaggcgg tttgtcgcgt ctgctgtgaa atcccgaggc 480 tcaacctcgg gcctgcagtg ggtacgggca gactagagtg cggtagggga gattggaatt 540 cctggtgtag cggtggaatg cgcagatatc aggaggaaca ccgatggcga aggcagatct 600 ctgggccgta actgacgctg aggagcgaaa gggtggggag caaacaggct tagataccct 660 ggtagtccac cccgtaaacg ttgggaacta gttgtgggga ccattc 706