一种解淀粉芽孢杆菌JSPB14及其应用
阅读：453发布：2021-07-13
专利汇可以提供一种解淀粉芽孢杆菌JSPB14及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于作物病害 生物 防治技术领域，特别涉及一种解 淀粉 芽孢杆菌JSPB14及其应用，所述解淀粉芽孢杆菌已于2017年11月20日保藏于中国 微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC No.14934；对采后杏鲍菇溃烂病菌、 水 稻细菌性条斑病菌和水稻白叶枯病菌均具有较高的拮抗活性，利用本发明菌株制备的生防菌剂对采后杏鲍菇溃烂病和水稻细菌性条斑病均表现较高的生防效果，可以避免或减少化学 农药 和农用抗生素的残留，提高食品和环境安全，具有较好的经济和社会效益。，下面是一种解淀粉芽孢杆菌JSPB14及其应用专利的具体信息内容。
1.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JSPB14，其特征在于，菌种保藏编号为CGMCC No.14934。
2.一种如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌JSPB14的发酵产物。
3.一种包含如权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌JSPB14和/或解淀粉芽孢杆菌JSPB14发酵产物的生防菌剂。
4.一种如权利要求3所述生防菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)活化培养：取本发明解淀粉芽孢杆菌菌株JSPB14的甘油菌种，划线接种至新鲜2YT固体平板上，在30℃条件下培养24h～36h；
(2)种子液制备：挑取一个单菌落接种2YT液体培养基中，30℃下振荡培养16h～36h，振荡频率为100r/min～200r/min；
(3)生防菌液的制备：将步骤(2)所得的种子液以1％～5％(v/v)的比列接种到Landy培养基中进行发酵，发酵温度为26℃～31℃，培养基的初始pH为6.5～7.2，以通气比0.5:1到
2.5:1之间进行发酵通气，搅拌速度为75r/min～200r/min，发酵时间为36h～48h；
(4)生防菌剂A的制备：将上述步骤(3)中发酵的生防菌液离心，取无菌上清，添加山梨酸钾，然后无菌灌装，室温保存。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，添加山梨酸钾的终浓度为1g/L。
6.一种如权利要求3所述生防菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)活化培养：取本发明解淀粉芽孢杆菌菌株JSPB14的甘油菌种，划线接种至新鲜2YT固体平板上，在30℃条件下培养24h～36h；
(2)种子液制备：挑取一个单菌落接种2YT液体培养基中，30℃下振荡培养16h～36h，振荡频率为100r/min～200r/min；
(3)生防菌液的制备：将步骤(2)所得的种子液以1％～5％(v/v)的比列接种到Landy培养基中进行发酵，发酵温度为26℃～31℃，培养基的初始pH为6.5～7.2，以通气比0.5:1到
2.5:1之间进行发酵通气，搅拌速度为75r/min～200r/min，发酵时间为36h～48h；
(4)生防菌剂B的制备：在上述步骤(3)中制备的发酵液中添加椰油基酯化复合物和苯甲酸钠，将pH值调整到4.5左右，然后无菌灌装，室温保存。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述椰油基酯化复合物的终浓度为8％(v/v)，苯甲酸钠的终浓度为1g/L。
8.如权利要求1-7任一项所述解淀粉芽孢杆菌JSPB14或其发酵产物或所述生防菌剂在防治采后杏鲍菇溃烂病和水稻细菌性条斑病中的应用。
9.如权利要求4或5所述生防菌剂A在防治采后杏鲍菇溃烂病中的应用方法，其特征在于，将生防菌剂A稀释1～5倍，利用浸泡方式处理采后杏鲍菇，晾干后按照采后货架条件进行放置。
10.如权利要求6或7所述生防菌剂B在防治水稻细菌性条斑病中的应用方法，其特征在于，将生防菌剂B稀释60～80倍，在水稻细菌病条斑病的发生初期进行均匀喷雾，间隔7～9d再喷施1次。
一种解淀粉芽孢杆菌JSPB14及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 杏鲍菇(Pleurotus eryngii)属伞菌目(Aaricales)食用真菌，具有较高的营养和药用价值。目前，我国杏鲍菇的产量达50万吨/年以上，年产值45～60亿元。采后杏鲍菇溃烂病是由乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)侵染引起的细菌病害，一般发病率在15％～30％，严重时达50％以上，造成巨大经济损失。由于采后果蔬杀菌剂的应用标准较高，可以选用的杀菌剂种类和使用剂量受到严格限制，并且大多数国家禁止在采后果蔬上使用农用抗生素，导致可供选择的药剂种类很少，防治效果不理想。低温(1℃～5℃)是控制该病害的有效措施，但是，采后至餐桌的全程冷链控制需要先进的技术设备和昂贵的物流成本，大幅降低了杏鲍菇产业的经济效益。
[0003] 水稻细菌病害，主要包括水稻细菌性条斑病(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)和水稻白叶枯病(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)，是我国水稻生产上的重要病害，常年发生面积800～1500万亩，危害面积达300～500万亩，造成水稻产量损失5％～10％，严重时达50％以上，甚至绝产，成为我国稻米安全生产的重要隐患之一。目前，水稻细菌病害的防控主要依靠化学农药和农用抗生素。然而，化学农药和抗生素的长期不合理使用导致病原菌抗药性逐渐增强，施用剂量盲目增加，防治效果不理想，同时残留农药对食品安全和生态环境构成严重威胁。
[0004] 开发安全、高效、新型化学杀菌剂的成本高昂，投资风险巨大。基于微生物的生物防控技术被认为是未来控制作物细菌病害主要发展方向之一。芽孢杆菌(Bacillus spp.)属于革兰氏阳性细菌，广泛分布于土壤、植物表面、水体、农业废弃物等各种生境中，具有广谱的抗菌活性、较高的芽孢产率和较强的逆境适应性，被认为是最具有应用开发潜力的有益微生物之一。其中，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一种被科学家和消费者广泛认可的对人体安全的生防微生物，已经有多个菌株被用于防控植物病害。但是，不同来源解淀粉芽胞杆菌菌株的生物学特性、抗菌谱等存在明显差异，具有菌株特异性。
发明内容
[0005] 本发明解决现有技术中存在的上述技术问题，提供一种解淀粉芽孢杆菌JSPB14及其应用。
[0006] 为解决上述问题，本发明的技术方案如下：
[0007] 本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌JSPB14，已于2017年11月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为Bacillus amyloliquefaciens，菌种保藏编号为CGMCC No.14934。所述解淀粉芽孢杆菌菌株是从杏鲍菇的栽培基质中分离获得，采用菌落形态观察、菌体形态观察和gyrB基因序列测定相结合的方法，将该菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，并将其命名为JSPB14。
[0008] 解淀粉芽孢杆菌菌株JSPB14在2YT固体培养基平板上，30℃条件下培养48h后的菌落特征：单菌落为乳白色，扁平，圆形或近圆形，直径2.5mm～4.0mm，菌落表面皱缩，边缘锯齿状；其菌体形态为杆状，直径约0.5μm，长度约1μm～2μm，芽孢呈蚕茧状。所使用的2YT固体培养基成分为：胰蛋白胨17g，酵母浸膏10g，NaCl 5g，琼脂15g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，121℃条件下灭菌20min。
[0010] 本发明提供包含所述解淀粉芽孢杆菌JSPB14和/或解淀粉芽孢杆菌JSPB14发酵产物的生防菌剂。
[0011] 本发明提供包含所述解淀粉芽孢杆菌JSPB14和/或解淀粉芽孢杆菌JSPB14发酵产物的生防菌剂的制备方法：
[0012] 制备方法一
[0013] (1)活化培养：取本发明解淀粉芽孢杆菌菌株JSPB14的甘油菌种，划线接种至新鲜2YT固体平板上，在30℃条件下培养24h～36h；
[0015] (3)生防菌液的制备：将步骤(2)所得的种子液以1％～5％(v/v)的比列接种到Landy培养基中进行发酵，发酵温度为26℃～31℃，培养基的初始pH为6.5～7.2，以通气比0.5:1到2.5:1之间进行发酵通气，搅拌速度为75r/min～200r/min，发酵时间为36h～48h；
[0016] (4)生防菌剂A的制备：将上述步骤(3)中发酵的生防菌液离心，取无菌上清，添加山梨酸钾，然后无菌灌装，室温保存。
[0017] 优选地，所述步骤(4)中，添加山梨酸钾的终浓度为1g/L。
[0018] 制备方法二
[0019] (1)活化培养：取本发明解淀粉芽孢杆菌菌株JSPB14的甘油菌种，划线接种至新鲜2YT固体平板上，在30℃条件下培养24h～36h；
[0020] (2)种子液制备：挑取一个单菌落接种2YT液体培养基中，30℃下振荡培养16h～36h，振荡频率为100r/min～200r/min；
[0021] (3)生防菌液的制备：将步骤(2)所得的种子液以1％～5％(v/v)的比列接种到Landy培养基中进行发酵，发酵温度为26℃～31℃，培养基的初始pH为6.5～7.2，以通气比0.5:1到2.5:1之间进行发酵通气，搅拌速度为75r/min～200r/min，发酵时间为36h～48h；
[0022] (4)生防菌剂B的制备：在上述步骤(3)中制备的发酵液中添加椰油基酯化复合物和苯甲酸钠，将pH值调整到4.5左右，然后无菌灌装，室温保存。
[0023] 优选地，所述步骤(4)中所述椰油基酯化复合物的终浓度为8％(v/v)，苯甲酸钠的终浓度为1g/L。
[0024] 上述2YT培养基组分为：胰蛋白胨17g，酵母浸膏10g，NaCl 5g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，121℃条件下灭菌20min。
[0025] 上述2YT固体培养基组分为：胰蛋白胨17g，酵母浸膏10g，NaCl 5g，琼脂15g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，121℃条件下灭菌20min。
[0026] 上述Landy培养基组分为：L-谷氨酸5g/L、酵母浸膏1g/L、L-苯丙氨酸2mg/L、葡萄糖20g/L、KH2PO4 1g/L、KCI 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、FeSO4·7H2O 0.15g/L、CuSO4·5H2O 0.16mg/L、MnSO4 5mg/L，pH 6.8～7.2，121℃条件下灭菌20min。
[0027] 本发明提供所述解淀粉芽孢杆菌JSPB14或其发酵产物或所述生防菌剂在防治采后杏鲍菇溃烂病和水稻细菌性条斑病中的应用。
[0028] 所述生防菌剂A在防治采后杏鲍菇溃烂病中的应用方法：将生防菌剂A稀释1～5倍，利用浸泡方式处理采后杏鲍菇，晾干后按照采后货架条件进行放置。
[0029] 所述生防菌剂B在防治水稻细菌性条斑病中的应用方法：将生防菌剂B稀释60～80倍，在水稻细菌病条斑病的发生初期进行均匀喷雾，间隔7～9d再喷施1次。
[0030] 相对于现有技术，本发明的优点如下，
[0031] 本发明提供的解淀粉芽孢杆菌菌株JSPB14是一种新发现的芽孢杆菌生防资源，对采后杏鲍菇溃烂病菌、水稻细菌性条斑病菌和水稻白叶枯病菌均具有较高的拮抗活性，利用本发明菌株制备的生防菌剂对采后杏鲍菇溃烂病和水稻细菌性条斑病均表现较高的生防效果，可以避免或减少化学农药和农用抗生素的残留，提高食品和环境安全，具有较好的经济和社会效益。附图说明
[0032] 图1为4株初步鉴定的生防菌对杏鲍菇溃烂病菌的拮抗活性；
[0033] 图2为解淀粉芽胞杆菌JSPB14在2TY培养基上的菌落、菌体及芽胞形态；
[0034] 图3为基于解淀粉芽胞杆菌JSPB14的gyrB基因序列的进化树分析；
[0035] 图4为解淀粉芽胞杆菌JSPB14在Landy培养基中的生长及芽胞形成动态；
[0036] 图5为解淀粉芽胞杆菌JSPB14不同发酵时间次生代谢产物的抗菌活性；
[0037] 图6为解淀粉芽胞杆菌JSPB14的拮抗谱测定；
[0038] 图7为解淀粉芽胞杆菌JSPB14对不同病原细菌的拮抗活性；
[0039] 图8为解淀粉芽胞杆菌JSPB14生防菌剂对采后杏鲍溃烂病的防治；
[0040] 图9为解淀粉芽胞杆菌JSPB14生防菌剂对采后杏鲍溃烂病的防治效果。
具体实施方式
[0041] 本发明所涉及的解淀粉芽孢杆菌菌株JSPB14，已于2017年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为Bacillus amyloliquefaciens，菌种保藏编号为CGMCC No.14934。本发明所用的采后杏鲍菇溃烂病菌乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)是本研究室从采后发病杏鲍菇上分离、鉴定获得；水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)、水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)、胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种(Erwinia carotovora
subsp.carotovora)、茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)均为本研究室保存菌株，其他单位或个人可以向本研究室索取以上7种病原细菌。
subsp.carotovora)、茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)均为本研究室保存菌株，其他单位或个人可以向本研究室索取以上7种病原细菌。
[0043] 以下所述的2YT培养基组分为：胰蛋白胨17g，酵母浸膏10g，NaCl 5g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，121℃条件下灭菌20min。2YT固体培养基添加琼脂15g/L。
[0044] 以下所述的Landy培养基组分为：L-谷氨酸5g/L、酵母浸膏1g/L、L-苯丙氨酸2mg/L、葡萄糖20g/L、KH2PO4 1g/L、KCI 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、FeSO4·7H2O 0.15g/L、CuSO4·5H2O 0.16mg/L、MnSO4 5mg/L，pH 6.8～7.2，121℃条件下灭菌20min。
[0045] 以下所述的MRS培养基组分为：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、柠檬酸二铵2g/L、葡萄糖20g/L、牛肉浸膏10g/L、MgSO4.7H2O 0.58g/L、MnSO4.4H2O 0.25g/L、K2HPO4 2g/L、乙酸钠2g/L、吐温80 1mL/L，pH 6.8，121℃条件下灭菌20min。MRS固体培养基添加琼脂15g/L。
[0046] 以下所述的“椰油基酯化复合物”的商品名称“SF-98B”，从常州润源泥炭制品有限公司购买)。
[0047] 实施例1：
[0048] 解淀粉芽胞杆菌菌株JSPB14的分离与鉴定
[0049] (1)待筛选菌种资源的分离：从采后杏鲍菇溃烂病发病率较高的栽培基质中随机取样50g，共取5份基质样品，混合均匀，取10g基质放入含有20粒细玻璃珠和100mL灭菌去离子水的250mL锥形瓶中，置于摇床上150r/min、30℃条件下震荡培养6h。静置10min，取上清1mL，利用灭菌去离子水10倍梯度稀释，吸取100μL每个浓度梯度稀释液凃布2YT固体平板，
30℃条件下静置培养36h。利用接种环挑取单菌落在2YT固体培养基上划线纯化2次，将纯化的不同形态单菌落转接到2YT固体平板上，30℃条件下静置培养36h，保存于4℃备用。
30℃条件下静置培养36h。利用接种环挑取单菌落在2YT固体培养基上划线纯化2次，将纯化的不同形态单菌落转接到2YT固体平板上，30℃条件下静置培养36h，保存于4℃备用。
[0050] (2)生防菌株的平板拮抗筛选：将保存于2YT固体平板上纯化的各菌株在2YT液体培养基中培养，培养条件为150r/min、30℃、36h，作为种子液备用；另外，将乳酸乳球菌乳酸亚种菌株SLPE1-3的甘油菌种划线接种到MRS固体平板上，30℃条件下培养36h，然后挑取单菌落接种到含有50mL MRS液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃条件下静置培养12h，将培养液(OD600≈1.0)添加到液态的低温2YT琼脂培养基中，迅速混匀，制备2YT固体营养平板；将待测菌株种子液2μL点到制备的2YT固体营养平板上，每个平板点4个待测菌株；每个菌株3个重复；将处理好的拮抗平板放置在30℃条件下培养48h，通过拮抗圈的直径评估待测定菌株对乳酸乳球菌乳酸亚种的拮抗活性。结果发现，在测定的367个菌株中，编号为JSPB3、JSPB14、JSPB106和JSPB247产生的拮抗圈直径大于10mm，其中JSPB14的拮抗圈直径达到13.0mm，如图1所示。
[0051] (3)生防菌株JSPB14的形态观察：将JSPB14在2YT固体平板上稀释涂板培养，培养条件为30℃、48h，单菌落为乳白色，扁平，圆形或近圆形，直径2.5mm～4.0mm，菌落表面干燥皱缩，边缘锯齿状，如图2A所示；扫描电镜下观察，其菌体形态为杆状，直径约0.5μm，长度约1μm～2μm，芽孢呈蚕茧状，如图2B和2C所示。
[0052] (4)生防菌株JSPB14的分子鉴定：利用灭菌牙签挑取JSPB14单菌落于含有50mL 2YT液体培养基的250mL锥形瓶中，150r/min、30℃条件下培养36h，利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取JSPB14的总基因组DNA。利用细菌gyrB基因的通用引物UP-1(5’-
GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3’)和UP-2r(5’-
AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3’)PCR扩增DNA片段；利用测序引物UP-1S(5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3’)和UP-2Sr(5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3’)对PCR产物进行测序。基于获得的gyrB基因序列和GenBank数据库，利用ClustalX 1.83软件和MEGA 5.05软件对JSPB14进行进化树分析，确定该菌株属于解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，如图3所示。
GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3’)和UP-2r(5’-
AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3’)PCR扩增DNA片段；利用测序引物UP-1S(5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3’)和UP-2Sr(5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3’)对PCR产物进行测序。基于获得的gyrB基因序列和GenBank数据库，利用ClustalX 1.83软件和MEGA 5.05软件对JSPB14进行进化树分析，确定该菌株属于解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，如图3所示。
[0053] 实施例2：
[0054] JSPB14在Landy培养基中的生长动态及次生代谢产物的抗菌活性
[0055] 从-70℃超低温冰箱取出甘油保存的JSPB14菌株，划线接种到2YT固体平板上，30℃条件下培养36h；利用灭菌牙签挑取JSPB14单菌落接种到含有50mL 2YT液体培养基的250mL锥形瓶中，150r/min、30℃条件下培养36h，作为种子液；将种子液按照5％(v/v)的比例接种到含有50mL Landy液体培养基的250mL锥形瓶中，75r/min、30℃条件下培养60h。分别于接种后0h、4h、8h、12h、18h、24h、36h、48h、60h调查菌体群体密度，具体方法：分别在上述时间点取样，利用灭菌水进行10倍梯度稀释，吸取100μL每个浓度梯度稀释液涂布2YT固体平板，30℃条件下培养48h进行菌落计数。分别于接种后0h、4h、8h、12h、18h、24h、36h、
48h、60h调查芽胞形成密度，具体方法：分别于上述时间点取样，80℃热水浴30min，然后利用灭菌水进行10倍梯度稀释，吸取100μL每个浓度梯度稀释液涂布2YT固体平板，30℃条件下培养48h进行菌落计数。结果发现，接种后12h时菌体密度达到3.87×108CFU/mL，48h时菌体密度最达9.13×108CFU/mL，如图4所示；接种后12h开始大量形成芽胞，24h时芽胞密度达到8.07×107CFU/mL，48h时芽胞密度达到最高1.47×108CFU/mL，如图4所示。每个处理三个重复。
48h、60h调查芽胞形成密度，具体方法：分别于上述时间点取样，80℃热水浴30min，然后利用灭菌水进行10倍梯度稀释，吸取100μL每个浓度梯度稀释液涂布2YT固体平板，30℃条件下培养48h进行菌落计数。结果发现，接种后12h时菌体密度达到3.87×108CFU/mL，48h时菌体密度最达9.13×108CFU/mL，如图4所示；接种后12h开始大量形成芽胞，24h时芽胞密度达到8.07×107CFU/mL，48h时芽胞密度达到最高1.47×108CFU/mL，如图4所示。每个处理三个重复。
[0056] 按照上述方法在Landy培养基中发酵培养JSPB14，分别于接种后24h、36h、48h调查发酵次生代谢产物的抗菌活性，具体方法：分别于上述时间点每瓶取样2mL，15,000g离心10min，利用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，无菌滤液保存于-70℃备用。将乳酸乳球菌乳酸亚种菌株SLPE1-3培养液(OD600≈1.0)按照1％(v/v)的比例添加到液态的低温2YT琼脂培养基中，迅速混匀，制备2YT固体营养平板；待平板凝固后，在平板上利用灭菌打孔器均匀打5个孔，每个孔分别添加灭菌水40μL(处理编号为CK，下同)、100μg/mL氨苄青霉素40μL(Amp100)、24h无菌发酵液40μL(24h)、36h无菌发酵液40μL(36h)、48h无菌发酵液40μL(48h)，将平板放置在30℃条件下培养36h，调查拮抗圈直径。结果发现，随着发酵时间的增加，无菌发酵上清的抗菌活性增强，48h无菌发酵上清对乳酸乳球菌乳酸亚种的抑菌圈直径达到21.8mm，显著大于36h时的拮抗活性(20.1mm)，与对照药剂100μg/mL氨苄青霉的抗菌活性(21.5mm)没有显著差异，见图5所示。
[0057] 实施例3：
[0058] 生防菌株JSPB14的抗细菌谱测定
[0059] 为了评估解淀粉芽胞杆菌菌株JSPB14次生抗菌物质的抗细菌谱，选择了6种主要的作物病原细菌和1种人体机会主义病原细菌进行了平板拮抗实验，包括乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)、水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)、水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)、胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种(Erwinia carotovora subsp.carotovora)、茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。具体方法：从-70℃超低温冰箱取出上述除乳酸乳球菌乳酸亚种之外的6种病原细菌的甘油菌种，分别在2YT固体培养基上划线，30℃培养36h，分别挑取单菌落于2YT液体培养基中，30℃、150r/min条件下培养至OD600≈0.5，备用；从-70℃超低温冰箱取出乳酸乳球菌乳酸亚种的甘油菌种，在MRS固体培养基上划线，30℃条件下培养36h，挑取单菌落接种到MRS液体培养基中，在30℃条件下静置培养至OD600≈0.5，备用；将上述培养的病原菌种子液，按照1％(v/v)的比例分别添加到液态的低温2YT琼脂培养基中，迅速混匀，制备2YT固体营养平板；待平板凝固后，在平板上利用灭菌打孔器均匀打3个孔，备用。
[0060] 按照实施例2中的描述制备JSPB14的36h和48h无菌发酵上清液，分别将40μL灭菌水(清水对照CK)、40μL 48h无菌发酵上清液(处理1)、40μL 36h无菌发酵上清液(处理2)滴到制备的含有病原细菌的2YT固体平板孔里，将平板放置在30℃条件下培养36h，调查拮抗圈直径，计算拮抗圈半径(减去孔的半径3mm)。结果发现，JSPB14次生抗菌物物质不仅对采后杏鲍菇溃烂病原细菌乳酸乳球菌乳酸亚种表现出较强的拮抗活性，对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和野油菜黄单胞菌野油菜致病变种也表现出较强的拮抗活性，特别是对水稻细菌性条斑病菌的抑菌圈半径高达17.1mm(36h)和18.4mm(48h)，如图6和图7所示。
[0061] 实施例4：
[0062] JSPB14生防制剂A的制备及其对采后杏鲍溃烂病的防治
[0063] 取本发明解淀粉芽孢杆菌菌株JSPB14的甘油菌种，划线接种到2YT固体平板上，30℃条件下培养24h；利用灭菌牙签挑取JSPB14单菌落接种到含有50mL 2YT液体培养基的250mL锥形瓶中，100r/min、30℃条件下培养36h，作为种子液；将种子液以1％(v/v)的比列接种于Landy培养基中进行发酵，发酵温度为26℃，培养基的初始pH为6.5，以通气比0.5:1进行发酵通气，其中通气比：指每分钟通过发酵液的空气体积与发酵液体积之比；搅拌速度为75r/min，发酵时间为48h。将发酵液6,000r/min条件下离心20min，取无菌上清，添加终浓度为1g/L的山梨酸钾，即为JSPB14生防菌剂A，然后无菌灌装，室温保存。
[0064] 生防菌剂A在防治采后杏鲍菇溃烂病中的应用方法：将生防菌剂A稀释1～5倍，利用浸泡方式处理采后杏鲍菇，晾干后按照采后货架条件进行放置，可取得良好的防治效果。
[0065] 应用案例：
[0066] 挑取乳酸乳球菌乳酸亚种菌株SLPE1-3单菌落于含有50mL MRS液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃条件下静置培养16h，作为病原菌接种体备用。选用大小均一的杏鲍菇，利用灭菌手术刀，在杏鲍菇菇柄中下部划十字伤口，伤口大小为约2cm×2cm，伤口深度约1mm。共计3个处理：(1)生防处理，将制备的乳酸乳球菌乳酸亚种接种体20μL接种到杏鲍菇伤口上，室温静置30min，然后分别在上述方法制备的生防菌剂2倍稀释液中浸泡30s，处理编号为JSPB14-S+SLPE1-3；(2)清水对照处理，在伤口滴加20μL灭菌水，无菌水浸泡30s，处理编号为CK；(3)单独接种病原菌SLPE1-3的对照处理，将制备的乳酸乳球菌乳酸亚种接种体20μL接种到伤口上，无菌水浸泡30s，处理编号为SLPE1-3。将各浸泡处理的杏鲍菇捞出晾干，然后放置在塑料保鲜箱内，接种伤口向上。将保鲜箱密封好，放置在15℃恒温培养箱内孵育4d，然后将恒温培养箱的温度调高至20℃，继续孵育，分别于处理后第8d和12d调查杏鲍菇的发病率。结果如图8和图9所示，仅接种病原菌的对照处理杏鲍菇的发病率高达
88.9％(第8d)和97.2％(第12d)；生防制剂处理的杏鲍菇发病率分别为0(第8d)和5.6％(第
12d)，防治效果优异。
88.9％(第8d)和97.2％(第12d)；生防制剂处理的杏鲍菇发病率分别为0(第8d)和5.6％(第
12d)，防治效果优异。
[0067] 实施例5：
[0068] JSPB14生防菌剂B的制备及其对水稻细菌性条斑病的防治
[0069] 取本发明解淀粉芽孢杆菌菌株JSPB14的甘油菌种，划线接种到2YT固体平板上，30℃条件下培养36h；利用灭菌牙签挑取JSPB14单菌落接种到含有200mL 2YT液体培养基的1,000mL锥形瓶中，200r/min、30℃条件下培养16h，作为种子液；将种子液以5％(v/v)的比列接种到Landy培养基中进行发酵，发酵温度为31℃，培养基的初始pH为7.2，以通气比2.5:1进行发酵通气，搅拌速度为200r/min，发酵时间为36h。在发酵液中添加终浓度为8％(v/v)的椰油基酯化复合物和终浓度为1g/L的苯甲酸钠，利用稀盐酸将pH值调整到4.5左右，即为JSPB14生防菌剂B，然后无菌灌装，室温保存。
[0070] 生防菌剂B在防治水稻细菌性条斑病中的应用方法：将生防菌剂B稀释60～80倍，在水稻细菌病条斑病的发生初期进行均匀喷雾，间隔7～9d再喷施1次，均可取得良好的防治效果。
[0071] 应用案例：
[0072] 于2017年，利用JSPB14生防菌剂B进行田间防治水稻细菌性条斑病小区试验，考察其试验剂量下对水稻细菌性条斑病防治效果，试验设置4个处理：清水对照、JSPB14生防菌剂B 750mL/亩、JSPB14生防菌剂B 1000mL/亩、20％噻唑锌悬浮剂100mL/亩，每亩用水60kg，均匀喷雾。水稻品种为Y两优900，于8月13日(水稻抽穗扬花期)调查见病。于8月15日第一次施药，8月22日第二次施药，分别于第二次用药后第8d和15d调查病情指数。结果如表1所示，第二次用药后第8d，JSPB14生防菌剂B 750mL/亩剂量的防效达到75.9％，JSPB14生防菌剂B 1000mL/亩剂量的防效达到79.1％，与化学药剂20％噻唑锌悬浮剂的防效相近(82.6％)；第二次用药后第15d调查，JSPB14生防菌剂B 750mL/亩剂量的防效略有下降(72.3％)，但JSPB14生防菌剂B 1000mL/亩剂量的防效达到80.1％，与20％噻唑锌悬浮剂防效(79.8％)基本相同。
[0073] 表1 JSPB14生防菌剂B防控水稻细菌性条斑病田间试验结果
[0074]
[0075] 上述实施例说明本发明涉及的解淀粉芽孢杆菌菌株JSPB14对包括采后杏鲍菇溃烂病菌、水稻细菌性条斑病菌等多种植物病原细菌具有较强的拮抗活性，对采后杏鲍菇溃烂病和水稻细菌性条斑病具有较好的防控效果，可以降低或避免化学农药和农用抗生素的残留，提高食品和环境安全，具有良好的市场开发前景。
[0076] 需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。
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