一种拮抗霉菌的芽孢杆菌及其抗菌应用
阅读：484发布：2022-10-01
专利汇可以提供一种拮抗霉菌的芽孢杆菌及其抗菌应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种拮抗霉菌的芽孢杆菌及其抗菌应用，属于 微 生物 防治技术领域。本发明提供的拮抗霉菌的芽孢杆菌，是一株具有广谱抗菌能 力 的芽孢杆菌。保藏于中国典型培养物保藏中心，序列比对分析发现该菌株与已知的解 淀粉 芽孢杆菌Holycan 1(Bacillus amyloliquefaciens Holycan 1,KM54172)为100％，认定其属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。本发明提供的拮抗霉菌的芽孢杆菌，到达稳定期的时间非常短，有利于其快速定殖并占领生态位，与其他霉菌进行营养物质、 生存空间 的竞争。因此，本发明提供的青霉拮抗解淀粉芽孢杆菌，对常见 农作物 病害 真菌 具有很好抑制作用，表现出较广的抑菌谱，生防潜力较大，有良好的应用前景。，下面是一种拮抗霉菌的芽孢杆菌及其抗菌应用专利的具体信息内容。
1.一种拮抗霉菌的芽孢杆菌，其特征在于，该芽孢杆菌属于解淀粉芽孢杆菌种(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No.M
2017455。
2.根据权利要求1所述的拮抗霉菌的芽孢杆菌，其特征在于，所述拮抗霉菌的芽孢杆菌的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1所述的拮抗霉菌的芽孢杆菌，其特征在于，所述拮抗霉菌的芽孢杆菌生长速度快，且能够快速进入对数期和稳定期。
4.根据权利要求3所述的拮抗霉菌的芽孢杆菌，其特征在于，所述拮抗霉菌的芽孢杆菌生长1h到达对数期，6h到达稳定期。
5.根据权利要求1所述的拮抗霉菌的芽孢杆菌，其特征在于，所述拮抗霉菌的芽孢杆菌具有广谱拮抗性。
6.根据权利要求5所述的拮抗霉菌的芽孢杆菌，其特征在于，所述拮抗霉菌的芽孢杆菌能够抵抗青霉菌、香蕉炭疽菌、橡胶炭疽病菌、灰葡萄孢霉、山茱萸叶枯霉、黑曲霉、根霉菌、山叶枯萎病霉菌和大叶黄杨霉菌的生长。
7.权利要求1～6中任意一项所述的拮抗霉菌的芽孢杆菌在制备果蔬抗菌剂中的应用。
8.权利要求1～6中任意一项所述的拮抗霉菌的芽孢杆菌在制备生物农药中的应用。
9.权利要求1～6中任意一项所述的拮抗霉菌的芽孢杆菌在制备饲料及粮食保存防霉剂中的应用。
一种拮抗霉菌的芽孢杆菌及其抗菌应用
技术领域
背景技术
[0002] 霉菌无处不在，因形成孢子而具有很强的抗逆性。由于霉菌属于化能异养菌，可以借用有机质生活，因此凡是有有机物的地方，如果温湿度合适便可能会引发霉菌污染或感染，给人类社会带来很多麻烦。比如在果蔬和粮食饲料贮存中都很容易被霉菌污染，造成经济损失甚至人畜中毒；在禽畜舍中，由于禽畜粪便滋生霉菌，进而带给禽畜疾患；霉菌也会引起很多植物病害，影响植物的生长，造成减产等等。霉菌污染的预防和治理是我们由来已久且可能长期进行下去的一场持久战。
[0003] 芽孢杆菌是一类在自然界中广泛存在的好氧、产芽孢的革兰氏阳性菌，抗逆性强，易于培养。解淀粉芽孢杆菌为芽孢杆菌属的一个种，在自然界分布广泛且属于益生菌，有些菌株对细菌或真菌具有抑菌活性，有着良好的应用潜力(张娟等，解淀粉芽孢杆菌及其作为益生菌的应用[J].动物营养学报,2014,26(4):863-867)，因此该菌可成为理想的生物防治菌株(生防菌)的筛选对象。近些年很多研究者致力于生防菌株的筛选，但截止目前筛选到的广谱拮抗菌株并不多。
[0004] 果蔬作为生鲜食品，在采摘、运输和贮存过程中会发生程度不同的损伤进而招致霉菌污染而腐烂，即使在冷库中贮藏，也会由于湿度较高的原因而感染霉菌。果蔬病原菌由经伤口入侵果蔬，分解果蔬中的营养成分，使果蔬品质发生劣变，不仅造成巨大经济损失，也带来食品安全隐患，成为影响果蔬种植业的重要因素之一。对人畜无害的生防菌可“以菌防菌”，使得果蔬在采摘后的贮藏期减少腐烂(毕文慧等.微生物在果蔬贮藏保鲜中的应用研究进展[J].食品工业科技,2017,(20):347-351)。已有一些研究关注霉菌拮抗菌的筛选及其应用，如不属于芽孢杆菌属的类芽孢杆菌属菌株对青霉的拮抗和应用(郭娟华.柑橘采后青霉病拮抗菌的筛选及其应用[D].江西农业大学,2013)以及使用蜡样芽孢杆菌发酵液对苹果进行保鲜等(黄运红等.蜡样芽孢杆菌发酵液对苹果保鲜作用的初步研究[J].食品工业科技,2006,(11):516-519)。
[0005] 除过影响果蔬贮藏外，霉菌污染也会引起禽畜舍环境卫生恶化，导致动物饲料的发霉变质，进而影响动物的健康，导致肉品质量下降(张闳媛等.浅谈霉菌及霉菌毒素对家禽生产的危害及防治措施[J].吉林畜牧兽医,2013,(06):55；张仁昆等.常见霉菌毒素对猪的危害及防治措施[J].现代农业科技,2017,(17):24-25)。除过禽畜舍卫生管理和霉菌预防外，目前，如何抑制饲料贮藏中霉菌的污染成为饲料行业的研究热点(房祥军等.饲料中霉菌毒素的危害及其降解方法研究进展[J].中国家禽,2016,38(5):34-37)。
[0006] 同样，霉菌也是造成粮食发热、霉变的主要原因。粮食被霉菌污染后，不仅会引起粮食的变质，更为严重的是对人带来的食品安全(严睿等.稻谷中霉菌及其毒素研究进展[J].湖南农业科学,2009,(11):85-87)。
[0007] 植物真菌病害是引起农业生产和食品安全的重要问题，病原微生物的侵害会造成植物生长缓慢、停滞、影响果实的外观和品质，甚至会引起作物毁灭性死亡，颗粒无收，造成巨大经济损失(谢晶.植物病原菌拮抗微生物的筛选、鉴定及拮抗机理研究[D]：四川大学,2004)。一直以来，植物病害的防治主要依赖于化学农药及肥料的使用，虽然效果显著，但却造成了土壤和地下水污染，这是更为严重的生态问题。生物农药是绿色环保的农药新类型，具有很大的优越性和应用潜力。有人已经从理论上阐明，将芽孢杆菌应用于植物真菌防治中是可行的(柯杨等.芽孢杆菌在植物真菌病害防治中的应用[J].保鲜与加工,2012,12(5):39-43,47)。
[0008] 芽孢杆菌拮抗霉菌的机理有多种，其中一种理论被称为“竞争机制”。其含义是，在同一环境中，芽孢杆菌与霉菌之间存在生态位点的竞争进而使营养物质(包括氧气)被竞争，如果芽孢杆菌生长速度大于霉菌，则芽孢杆菌会占上风，及早占据入侵的生态位点并对动植物形成保护，使得霉菌不得入侵(崔荣强等.芽孢杆菌的生物防治研究进展[J].山东化工,2015,(12):55-57)。研究发现，芽孢杆菌再生长中可在宿主表面形成一层生物薄膜，阻止其他病原菌的侵入(Niu DD et al.The plant growth-promoting rhizobacterium Bacillus cereus AR156 induces systemic resistance in Arabidopsis thaliana by simultaneously activating salicylate-and jasmonate/ethylene-dependent signaling pathways[J].Mol Plant Microbe Interact,2011,24(5):533-542)。
[0009] 芽孢杆菌已被证明是安全有益的微生物。对水产养殖动物的毒性试验研究表明，解淀粉芽孢杆菌微胶囊无毒无害(安健等.解淀粉芽孢杆菌的安全性分析[J].动物医学进展,2013,(01):16-19)。枯草芽孢杆菌活菌剂可以作为口服液应用于人类肠道疾病的治疗，作为保健品可改善动物肠道功能(惠明等.枯草芽孢杆菌的应用研究进展[J].安徽农业科学,2008,(27):11623-11624+11627)。地衣芽孢杆菌活菌制剂已作为婴幼儿急、慢性肠炎、腹泻的常用药。
发明内容
[0010] 本发明的目的在于提供一种拮抗霉菌的芽孢杆菌及其抗菌应用，该芽孢杆菌安全无毒害，可以广谱拮抗霉菌，能够有效应用于果蔬保鲜。
[0011] 本发明是通过以下技术方案来实现：
[0012] 本发明公开了一种拮抗霉菌的芽孢杆菌，该芽孢杆菌属于解淀粉芽孢杆菌种(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No.M 2017455。
[0013] 优选地，所述拮抗霉菌的芽孢杆菌的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0014] 优选地，所述拮抗霉菌的芽孢杆菌具有很快的生长速度，所述拮抗霉菌的芽孢杆菌生长1h到达对数期，6h到达稳定期。
[0015] 优选地，所述拮抗霉菌的芽孢杆菌具有广谱拮抗性。
[0017] 本发明还公开了上述的拮抗霉菌的芽孢杆菌在制备果蔬抗菌剂中的应用。
[0018] 本发明还公开了上述的拮抗霉菌的芽孢杆菌在制备生物农药中的应用。
[0019] 本发明还公开了上述的拮抗霉菌的芽孢杆菌在制备饲料及粮食保存防霉剂中的应用。
[0020] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0022] 2、本发明公开的拮抗霉菌的芽孢杆菌生长速度更快，占领生态位和利用营养物质更迅速，因此更具有竞争优势，拮抗效果更好。如与申请号为201710100745.9公开的解淀粉芽孢杆菌相比，该专利菌株进入对数期的时间为4h，到达稳定期为12h，而本发明提供的菌株1h到达对数期，6h到达稳定期。同时，为了验证生长占位竞争优势，对本发明公开的拮抗霉菌的芽孢杆菌的生长曲线和霉菌生长曲线进行了测定比较，实验选择青霉菌作为霉菌的代表，结果发现青霉菌的延迟期长达15-20h。可以预期，如果本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌和青霉菌共同存在的话，当本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌在6h到达稳定期时，青霉菌还未做好生长的准备。而那时候，本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌早已抢先耗尽了局部可能的营养物质并形成了保护菌膜，青霉菌将没有营养物质可以利用，没有机会再生长起来。可见，本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌具有很大的生物位点竞争能力，能够保护相关的对象不受霉菌的侵害。
[0023] 3、本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌菌液与生化防霉制剂合用，对抗霉效果具有正向协同效应。通过实验可以看出，能够使贮藏90天后冬枣的好果率和保绿效率比对照高，且没有发生任何霉变。该菌株对生化防霉制剂的正向协同作用尚未见报道。
[0024] 综上所述，本发明提供的拮抗霉菌的芽孢杆菌具有安全无毒害、可以广谱拮抗霉菌，可用于果蔬保鲜、禽畜舍环境治理、冷库和仓库霉菌的预防以及植物病原菌的防治。
[0025] 对本发明对所述的拮抗霉菌的芽孢杆菌进行了下述保藏：
[0027] 图1为本发明公开的拮抗霉菌的芽孢杆菌的菌苔形态；
[0028] 图2为本发明公开的拮抗霉菌的形态鉴定，其中，a为革兰氏染色阳性；b为芽孢染色；
[0030] 图4为本发明公开的拮抗霉菌的16S rDNA的PCR扩增产物(图中泳道M为分子量标准，泳道1为菌株16S rDNA PCR产物)；
[0031] 图5为本发明公开的拮抗霉菌的16S rDNA序列的聚类分析图。与为本发明公开的拮抗霉菌的聚成最小类的KM 454172为一株已知的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens Holycan 1)；
[0032] 图6为本发明公开的拮抗霉菌和青霉菌生长速度测定比较；
[0033] 图7为本发明公开的拮抗霉菌阻止青霉菌在罗甸脐橙表面定植扩散；
[0034] 图8为本发明公开的拮抗霉菌阻止青霉菌在达县脐橙表面定植扩散；
[0035] 图9为本发明公开的拮抗霉菌阻止青霉菌在湖北皇帝柑表面定植生长；
[0036] 图10为本发明公开的拮抗霉菌阻止青霉菌在汉中甜橙表面定植生长；
[0037] 图11为本发明公开的拮抗霉菌对香蕉炭疽霉的抑制效果；
[0038] 图12为本发明公开的拮抗霉菌对橡胶炭疽霉的抑制效果；
[0039] 图13为本发明公开的拮抗霉菌对灰葡萄孢霉的抑制效果；
[0040] 图14为本发明公开的拮抗霉菌对山茱萸叶枯霉的抑制效果；
[0041] 图15为本发明公开的拮抗霉菌对黑曲霉的抑制效果；
[0042] 图16为本发明公开的拮抗霉菌对根霉菌的抑制效果；
[0043] 图17为本发明公开的拮抗霉菌对山叶枯萎霉的抑制效果；
[0044] 图18为本发明公开的拮抗霉菌对大叶黄杨霉的抑制效果；
[0045] 图19为本发明公开的拮抗霉菌菌液侵浸法对冬枣的保鲜效果；对照为自来水侵浸；
[0046] 图20为本发明公开的拮抗霉菌菌液与双乙酸钠的协同保鲜效果；对照为双乙酸钠侵浸。
具体实施方式
[0047] 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0048] 以下对本发明的CCTCC M2017455菌株的筛选和鉴定过程作进一步详细描述：
[0049] 1、所用培养基
[0050] (1)LB培养基：根据常规配方配制，用于细菌培养。
[0051] (2)土豆培养基：根据常规配方配制，用于霉菌培养。
[0052] (3)淀粉水解培养基：根据常规配方配制，用于淀粉水解能力检验。
[0053] (4)共用培养基(m/v)：
[0054] 6.6％的土豆煮沸20分钟，纱布过滤取汁液。在土豆汁液中加入以下比例的物质：葡萄糖0.66％，蛋白胨1.25％，牛肉膏1.25％，氯化钠1.5％，自然pH。用于平板对峙法测定发明菌的抗菌谱以及发明菌和霉菌生长曲线的测定比较中。
[0055] 2、拮抗芽孢杆菌的筛选
[0056] 2.1源土样采集
[0057] 本发明随机采集68处有腐殖质的土样，待用。
[0058] 2.2指示菌悬液准备
[0059] 斜面划线法接种青霉菌于数支土豆斜面培养基上，28℃恒温培养7天。每管分3次加入无菌生理盐水共2mL，收集合并洗涤的孢子悬液，作为喷洒用的拮抗菌的指示菌悬液。
[0060] 2.3菌株筛选
[0061] 将所采取的腐殖质土样加水溶解后煮沸5min杀灭微生物营养体。然后采用十倍稀释法进行稀释。吸取不同稀释度的土壤悬液100μL涂布于LB培养基上，并在平板上均匀喷洒指示菌悬液，待表面水分基本吸干后于28℃培养48h，观察拮抗效果，挑取具有最大菌落或抑菌圈的细菌，镜检，若为芽孢杆菌，保存菌株。共筛选到6株生长迅速的芽孢杆菌，最后经鉴定属于同一菌株。
[0062] 3拮抗菌株抗菌谱的测定
[0063] 采用平板对峙法，在共用培养基中心接种病原菌，当病原菌菌苔直径至5mm时，在距中心2.5cm的两个对称点处接种所筛选的拮抗菌，观察病原霉菌菌落的生长特点，判断是否具有拮抗效果。凡是霉菌菌落为圆形或能覆盖所筛选的拮抗菌，表示没有拮抗；若霉菌菌落变形，如方形、菱形、花瓣形等，则视为具有拮抗作用。
[0064] 4拮抗菌株的鉴定
[0065] 4.1菌苔形态观察
[0066] 在LB培养基上点种该芽孢杆菌菌株，37℃培养12-24h，待出现菌苔，参见图1，观察其特点为：菌苔颜色为乳白色；中央突起变厚，外缘稍薄；表面干燥；边缘不规整或有放射状生长；表面褶皱严重。符合芽孢杆菌生长特点。
[0067] 4.2革兰氏及芽孢染色
[0068] 按照常规实验方法进行，参见图2，其中，a，革兰氏染色阳性；b，芽孢染色，可以看出，染色结果符合芽孢杆菌属特点。
[0069] 4.3淀粉水解实验
[0070] 按照常规淀粉水解鉴定方法，在淀粉培养基上点种该芽孢杆菌菌株，证明其具有解淀粉的能力。参见图3，说明本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌具有解淀粉芽孢杆菌特点。
[0071] 4.4生理生化鉴定
[0072] 经第三方协助对该芽孢杆菌进行生理生化鉴定。经鉴定，本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌符合解淀粉芽孢杆菌特点。具体结果如下表1所示：
[0073] 表1拮抗霉菌的芽孢杆菌生理生化鉴定
[0074]
[0075] 注：+，阳性；－，阴性
[0076] 4.5 16S rDNA序列相似性分析
[0077] 以该芽孢杆菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增，如图4所示，该芽孢杆菌的测序结果如SEQ ID NO：1所示(1415bp)，依此构建聚类树状图如图5所示。将测序结果在NCBI GeneBank上进行序列比对发现其与已知的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens Holycan 1，KM454172)16S rDNA序列的相似性为99％，判断该芽孢杆菌极有可能为解淀粉芽孢杆菌。
[0078] 该芽孢杆菌已于2017年8月28日保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏号为CCTCCM 2017455。
[0079] 本发明的芽孢杆菌具有以下特点：
[0080] 1、发明菌菌苔颜色为乳白色；中央突起变厚，外缘稍薄；表面干燥；边缘不规整或有放射状生长；表面褶皱严重；
[0081] 2、发明菌呈短杆状，革兰氏阳性，中生芽孢；
[0082] 3、发明菌可以外泌淀粉酶，形成淀粉圈，具有解淀粉能力；
[0083] 4、经第三方协助进行生理生化鉴定，发明菌符合解淀粉芽孢杆菌特点；
[0084] 5、对发明菌的16S rDNA序列进行扩增和比对发现该菌株与已知的解淀粉芽孢杆菌KM454172的相应序列的相似性为99.0％，判断该菌种极有可能属于解淀粉芽孢杆菌种；
[0085] 6、发明菌生长速度很快(是目前能检索到的资料中最快的)。进入对数期和稳定期间的时间非常短，有利于其及早占据生态位点。利用营养物质的速度也更为迅速，并对生长点形成保护，阻止霉菌的侵入；
[0086] 7、采用平板对峙法，对发明菌的抑菌谱进行测定，证明其对香蕉炭疽菌、橡胶炭疽病霉菌、灰葡萄孢霉、山茱萸叶枯霉、黑曲霉、根霉菌、山叶枯萎病霉菌、大叶黄杨霉菌病原菌的抑制效果很明显；
[0087] 8、发明菌与生化防霉制剂合用，对抗霉效果具有正向协同效应。
[0088] 下面结合具体的试验内容对本发明的效果进一步详细说明：
[0089] 实施例1本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌与青霉菌生长速度的测定比较[0090] 分别接种本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌与青霉菌于共用培养液中，测定二者的生长曲线。
[0091] 采用分光光度法测定本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌的生长曲线如图6中A线所示。可以看出，本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌到达对数期和稳定期的时间短，分别为1h和6h。
[0092] 采用菌体干重法测定青霉菌生长曲线如图6中B线，发现其到达对数期和稳定期的时间很长，分别为20h和60h，是本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌的10倍时长之久。
[0093] 比较说明，本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌的生长速度很快，可以快速定殖并占领生态位，快速消耗营养物质，可对动植物形成保护，阻止病原菌的侵入。
[0094] 实施例2用本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌抑制罗甸脐橙青霉菌的定植生长[0095] 本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌菌悬液的制备：在LB培养液中接入本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌，37℃振荡培养8-15h，获取本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌菌悬液。
[0096] 青霉孢子菌悬液的制备：斜面划线法接种青霉菌于数支土豆斜面培养基上，28℃恒温培养7天。每管分3次加入无菌生理盐水共2mL，收集合并洗涤的孢子悬液，获得青霉孢子菌悬液。
[0097] 用无菌剪刀在市售罗甸脐橙腰部表面刺伤一个大约边长4mm，深度3mm正方形伤口，将伤口在发明菌菌悬液中侵浸一下，进行预防接种，待菌液干燥后，再在青霉孢子悬液中侵浸一下，进行感染接种。对照组是将伤口首先在无菌水中侵浸一下，待水分干燥后，再在青霉孢子悬液中侵浸一下，进行感染接种。保持相对湿度在95％左右，28℃贮藏两周，观察霉菌侵染情况。
[0098] 观察结果如图7所示。左为未喷洒本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌液时水果大面积腐软，右图预先在伤口喷洒了本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌液则水果伤口完好，说明本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌液对罗甸脐橙青霉菌有良好的拮抗作用。
[0099] 实施例3用本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌抑制达县脐橙青霉菌的定植生长[0100] 本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌菌悬液的制备：在LB培养液中接入本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌，37℃振荡培养8-15h，获取本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌菌悬液。
[0101] 青霉孢子菌悬液的制备：斜面划线法接种青霉菌于数支土豆斜面培养基上，28℃恒温培养7天。每管分3次加入无菌生理盐水共2mL，收集合并洗涤的孢子悬液，获得青霉孢子菌悬液。
[0102] 用无菌剪刀在市售达县脐橙腰部表面刺伤一个大约边长4mm，深度3mm正方形伤口，将伤口在发明菌菌悬液中侵浸一下，进行预防接种，待菌液干燥后，再在青霉孢子悬液中侵浸一下，进行感染接种。对照组是将伤口首先在无菌水中侵浸一下，待水分干燥后，再在青霉孢子悬液中侵浸一下，进行感染接种。保持相对湿度在95％左右，28℃贮藏两周，观察霉菌侵染情况。
[0103] 观察结果如图8所示。左为未喷洒本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌液时水果果皮腐软皱缩，右图预先在伤口喷洒了本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌液则水果伤口完好，说明本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌液对达县脐橙青霉菌有良好的拮抗作用。
[0104] 实施例4用本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌抑制湖北皇帝柑青霉菌的定植生长[0105] 本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌菌悬液的制备：在LB培养液中接入本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌，37℃振荡培养8-15h，获取本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌菌悬液。
[0106] 青霉孢子菌悬液的制备：斜面划线法接种青霉菌于数支土豆斜面培养基上，28℃恒温培养7天。每管分3次加入无菌生理盐水共2mL，收集合并洗涤的孢子悬液，获得青霉孢子菌悬液。
[0107] 用无菌剪刀在市售湖北皇帝柑腰部表面刺伤一个大约边长4mm，深度3mm正方形伤口，将伤口在发明菌菌悬液中侵浸一下，进行预防接种，待菌液干燥后，再在青霉孢子悬液中侵浸一下，进行感染接种。对照组是将伤口首先在无菌水中侵浸一下，待水分干燥后，再在青霉孢子悬液中侵浸一下，进行感染接种。保持相对湿度在95％左右，28℃贮藏两周，观察霉菌侵染情况。
[0108] 观察结果如图9所示。上排未喷洒本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌液情况下喷洒了青霉菌孢子悬液导致水果有的腐软有的长了大量霉菌孢子，下排预先在伤口喷洒了本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌液，即便再喷洒青霉菌孢子悬液，水果也完好无霉，说明本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌液对湖北皇帝柑青霉菌有良好的拮抗作用。
[0109] 实施例5用本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌抑制汉中甜橙青霉菌的定植生长[0110] 本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌菌悬液的制备：在LB培养液中接入本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌，37℃振荡培养8-15h，获取本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌菌悬液。
[0111] 青霉孢子菌悬液的制备：斜面划线法接种青霉菌于数支土豆斜面培养基上，28℃恒温培养7天。每管分3次加入无菌生理盐水共2mL，收集合并洗涤的孢子悬液，获得青霉孢子菌悬液。
[0112] 用无菌剪刀在市售汉中甜橙腰部表面刺伤一个大约边长4mm，深度3mm正方形伤口，将伤口在发明菌菌悬液中侵浸一下，进行预防接种，待菌液干燥后，再在青霉孢子悬液中侵浸一下，进行感染接种。对照组是将伤口首先在无菌水中侵浸一下，待水分干燥后，再在青霉孢子悬液中侵浸一下，进行感染接种。保持相对湿度在95％左右，28℃贮藏两周，观察霉菌侵染情况。
[0113] 观察结果如图10所示。从左到右在伤口喷洒青霉菌孢子滴度依次提高；上排未喷洒本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌液导致水果有的腐软有的长了大量霉菌孢子，下排预先在伤口喷洒了本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌液，水果完好无霉；说明本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌液对汉中甜橙青霉菌有良好的拮抗作用。
[0114] 实施例6本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌拮抗香蕉炭疽霉的实验测试[0115] 选取香蕉炭疽霉，采用平板对峙法对本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌的抑菌能力进行了测定。结果如图11，霉菌菌苔不能呈现圆形生长或覆盖本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌生长，表明本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌对香蕉炭疽霉有拮抗能力。
[0116] 实施例7本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌拮抗橡胶炭疽病霉菌的实验测试[0117] 选取橡胶炭疽霉，采用平板对峙法对本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌的抑菌能力进行了测定。结果如图12，霉菌菌苔不能呈现圆形生长或覆盖本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌生长，表明本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌对橡胶炭疽霉有拮抗能力。
[0118] 实施例8本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌拮抗灰葡萄孢霉的实验测试[0119] 选取灰葡萄孢霉，采用平板对峙法对本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌的抑菌能力进行了测定。结果如图13，霉菌菌苔不能呈现圆形生长或覆盖本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌生长，表明本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌对灰葡萄孢霉有拮抗能力。
[0120] 实施例9本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌拮抗山茱萸叶枯霉的实验测试[0121] 选取山茱萸叶枯霉，采用平板对峙法对本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌的抑菌能力进行了测定。结果如图14，霉菌菌苔不能呈现圆形生长或覆盖本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌生长，表明本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌对山茱萸叶枯霉有拮抗能力。
[0122] 实施例10本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌拮抗黑曲霉的实验测试
[0123] 选取黑曲霉，采用平板对峙法对本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌的抑菌能力进行了测定。结果如图15，霉菌菌苔不能呈现圆形生长或覆盖本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌生长，表明本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌对黑曲霉有拮抗能力。
[0124] 实施例11本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌拮抗根霉菌的实验测试
[0125] 选取根霉菌，采用平板对峙法对本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌的抑菌能力进行了测定。结果如图16，霉菌菌苔不能呈现圆形生长或覆盖本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌生长，表明本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌对根霉菌有拮抗能力。
[0126] 实施例12本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌拮抗山叶枯萎病霉菌的实验测试[0127] 选取山叶枯萎病霉菌，采用平板对峙法对本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌的抑菌能力进行了测定。结果如图17，霉菌菌苔不能呈现圆形生长或覆盖本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌生长，表明本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌对山叶枯萎病霉菌有拮抗能力。
[0128] 实施例13本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌拮抗大叶黄杨霉菌的实验测试[0129] 选取大叶黄杨霉菌，采用平板对峙法对本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌的抑菌能力进行了测定。结果如图18，霉菌菌苔不能呈现圆形生长或覆盖本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌生长，表明本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌对大叶黄杨霉菌有拮抗能力。
[0130] 实施例14本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌用于冬枣的鲜果保鲜
[0131] 本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌菌悬液的制备：在LB培养基中接入本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌，37℃振荡培养8-15h，获取本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌菌悬液。
[0132] 将大枣在本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌菌悬液侵浸一下进行保鲜接种，在无菌水中侵浸一下作为对照。
[0133] 每组各处理10个冬枣，待冬枣自然晾干后装入打孔的塑料袋中，在相对湿度为95％左右，4℃冰柜贮藏，分别在45天和90天观察冬枣状态。利用以下公式计算冬枣的好果率，保绿效率及防霉效率。
[0134]
[0135]
[0136]
[0137] 结果如图19所示，对照组(无菌水组)贮藏90天后，冬枣的好果率仅为20％，保绿效率为20％，防霉效率为50％；若将本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌菌悬液粘附在冬枣表面，贮藏90天后，冬枣的好果率为70％，比对照提高了40％；保绿效率为50％，比对照提高了30％；防霉效率为100％，比对照组提高了50％。说明该本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌菌液对冬枣不仅具有防霉作用，还具有保绿保鲜作用。
[0138] 实施例15本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌菌液与双乙酸钠的协同保鲜测试[0139] 本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌菌悬液的制备：在LB培养基中接入本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌，37℃振荡培养8-15h，获取本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌菌悬液。
[0140] 化学防霉保鲜液制备：配制0.04g/ml双乙酸钠溶液作为化学保鲜液。
[0141] 生化复配防霉保鲜液制备：在本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌菌悬液中加入双乙酸钠，使其浓度为0.04g/ml，作为复配保鲜液。
[0142] 实验组将冬枣在生化复配防霉保鲜液中侵浸一下，对照组将冬枣在化学防霉保鲜液中侵浸一下。每组各处理10个果实，待冬枣自然晾干后装入打孔的塑料袋中，在相对湿度为95％左右，4℃冰柜贮藏，分别在45天和90天观察冬枣状态。利用以下公式计算冬枣的好果率，保绿效率及防霉效率。
[0143]
[0144]
[0145]
[0146] 结果如图20所示，使用化学防霉保鲜液侵浸的冬枣，贮藏90天后，冬枣的好果率为50％，保绿效率为20％，防霉效率为80％；使用复配防霉保鲜液侵浸的冬枣，贮藏90天后，冬枣的好果率为80％，比单化学组保护提高了30％，比单菌液保护提高了10％；保绿效率为
70％，比单化学组保护提高了50％，比单菌液保护提高了20％；防霉效率为100％，比单化学组保护提高了20％，与单菌液抗霉效果一致。说明本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌菌液与化学防霉制剂(双乙酸钠)合用，具有正向协同保绿保硬保鲜效果。
70％，比单化学组保护提高了50％，比单菌液保护提高了20％；防霉效率为100％，比单化学组保护提高了20％，与单菌液抗霉效果一致。说明本发明的拮抗霉菌的芽孢杆菌菌液与化学防霉制剂(双乙酸钠)合用，具有正向协同保绿保硬保鲜效果。
[0147] 综上所述，本发明公开了一株可以拮抗霉菌的芽孢杆菌及其应用。所述拮抗霉菌的芽孢杆菌株属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏于中国典型培养物保藏中心的(CCTCC)，保藏号为：CCTCC M 2017455，保藏日期为2017年8月28日。
[0148] 所述拮抗霉菌的芽孢杆菌可以抵抗青霉菌、香蕉炭疽菌、橡胶炭疽病菌、灰葡萄孢霉、山茱萸叶枯霉、黑曲霉、根霉菌、山叶枯萎病霉菌和大叶黄杨霉菌的生长，对植物病原霉菌具有广谱拮抗性。
[0149] 所述拮抗霉菌的芽孢杆菌属于益生菌，对人和动物是安全的。
[0150] 所述拮抗霉菌的芽孢杆菌能用于果蔬保鲜和冷库防霉，防止果蔬霉变；能用于禽畜舍卫生管理，预防禽畜疾病发生；能预防饲料及粮食霉菌，保障饲料粮食安全；可作为生物农药用于植物霉菌疾病的预防。可见该拮抗霉菌的芽孢杆菌的生物防治潜力较大，具有良好的应用前景。
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