免疫调节肽在制备免疫增强类药物上的应用
阅读：805发布：2020-05-11
专利汇可以提供免疫调节肽在制备免疫增强类药物上的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了免疫调节肽在制备免疫增强类药物上的应用，该类多肽发现于人 母乳 β- 酪蛋白 ，不超过21个 氨 基酸，能进入细胞并分布于 细胞质 和细胞核中。该类多肽对人单核细胞 细胞增殖 活 力 和细胞凋亡无显著影响，离体实验证明能显著促进人单核细胞的迁移，从而提高 机体 的免疫 应答机 制。该类多肽能促进人MCP-1、MCP-3及TNFα的表达，显著提高人p-IκBα的表达，可激活NF-κB 信号 通路。，下面是免疫调节肽在制备免疫增强类药物上的应用专利的具体信息内容。
1.免疫调节肽在制备免疫增强类药物上的应用。
2.免疫调节肽在制备免疫调节类药物上的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述免疫调节肽的通式如下：
R1-A-P-B-R2
其中， P为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
R1选自氨基、乙酰基的任意一种；
R2选自羟基、氨基的任意一种；
A为0 5个氨基酸组成的肽链；
~
B为0 5个氨基酸组成的肽链。
~
4.根据权利3所述的应用，其特征在于：所述免疫调节肽为SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. ~
5任意一个所示的氨基酸序列。
5.一种多肽组合物，其特征在于：包括两个或多个选自SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 5~
中不同的多肽。
免疫调节肽在制备免疫增强类药物上的应用
技术领域
背景技术
[0002] 抗生素的发现是现代医学最为伟大的成就之一，但是随着抗生素的广泛使用，许多微生物对常见的抗生素产生了耐药性，多重耐药菌引发的感染已经逐渐成为医疗领域长期面临的挑战，因此，新型抗菌制剂的研发迫在眉睫。近年来，多肽治疗被越来越多的应用于临床，具有抗微生物等多种生物学功能的抗菌肽也被研发，但是，针对杀伤病原菌的药物仍有产生耐药性的风险。先天性免疫应答是抵抗病原微生物的第一道防线。因此，调节先天性免疫系统功能这种抗感染治疗的新途径，逐渐受到人们的关注。调节免疫系统功能不仅具有与抗生素治疗类似的效果，还有更广泛的潜在应用价值，能够有效减少，甚至避免耐药性的问题。
[0003] 许多已知的具有免疫增强活性的多肽作为已建立的治疗模式的可行的佐剂的成功使用，为未来几十年里感染和其他恶性疾病的治疗提供了崭新的思路。自1974年，一种最小的细菌肽聚糖碎片胞壁酰二肽(Muramyl Dipeptide，MDP)被发现具有免疫刺激活性，研究者都在努力研发化学成分确定、低分子量的物质的免疫增强剂。因此，许多强有力的化合物逐渐被发掘，它们中的一些目前已进入临床试验阶段。新型的、化学成分明确，可用于临床的免疫调节剂，例如许多结构上与MDP相似的糖肽和脂肽已经被设计和合成。但是，它们大多数都包含微生物来源的成分，因此具有一定的毒副作用。
[0004] 母乳作为新生儿天然的营养来源，在体内蛋白酶的水解作用下会产生大量的内源性多肽，这些多肽不仅为新生儿提供氨基酸来源，还发挥着多种生物学功能，保护新生儿免受感染。我们借助超滤技术从人的母乳中分离出小于10kDa的多肽混合物，进一步借助串联质谱技术(LC-MS/MS)对多肽混合物的具体成分进行鉴定分析。结果发现，这些多肽主要是从人母乳β-酪蛋白(Homo sapiens β-casein，基因Bank号：NM_001891)中断裂下来的片段，天然存在于母乳中。经生物信息学分析，我们从鉴定的多肽片段中筛选出一条具有潜在免疫增强作用的多肽，并对其进行深入的研究。
发明内容
[0005] 发明目的：本发明的目的是提供了一类发现于人母乳β-酪蛋白的多肽的新应用，其可用于制备免疫增强类或免疫调节类药物；本发明还有一个目的是保护含有这一类多肽的组合物。
[0006] 技术方案：本发明所述的免疫调节肽的通式如下：
[0007] R1-A-P-B-R2
[0008] 其中，P为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
[0009] R1选自氨基、乙酰基的任意一种；
[0010] R2选自羟基、氨基的任意一种；
[0011] A为0～5个氨基酸组成的肽链；
[0012] B为0～5个氨基酸组成的肽链。
[0013] 本发明所述的免疫调节肽包括但不限于SEQ ID NO.1所示的序列，以前述序列作为共同的连续多肽链，同源性超过66.67％的多肽都具有一定的免疫增强或免疫调节用途，如以下几个氨基酸序列：
[0014] SEQ ID NO.2：VLKSPTIPFFDPQIPK
[0015] SEQ ID NO.3：MPVLKSPTIPFFDPQIP
[0016] SEQ ID NO.4：MPVLKSPTIPFFDPQIPK
[0017] SEQ ID NO.5：GRVMPVLKSPTIPFFDPQIP
[0018] 以上多肽都发现于人母乳β-酪蛋白第112-132位氨基酸，可以通过化学合成(液相法和固相法)、生物制备(原核表达系统和真核表达系统)等方法制备获得，并可通过将肽链氮端进行乙酰化，肽链碳端进行酰胺化修饰，以增强其稳定性。
[0019] 其中，SEQ ID NO.5所示的免疫调节肽相对于其余多肽具备更好的活性。该多肽分子量(Mw)为2238.2，等电点(pI)为8.8，脂肪指数为87.5，亲水性0.17，90％的氨基酸以无规卷曲，10％的氨基酸以延伸链的二级结构存在。
[0020] 本发明所述的免疫调节肽加入人单核细胞系THP-1中处理3小时后，将细胞用甩片机甩片后用4％多聚甲醛固定细胞，并滴加含有DAPI染料的抗淬灭剂，封片，采用共聚焦显微镜拍照。结果显示该多肽能够进入细胞并分布于细胞质和细胞核中。
[0021] 通过离体细胞增殖活力的测定，本发明所述的免疫调节肽对人单核细胞增殖活力无显著影响，经流式检测结果显示，多肽对人单核细胞细胞凋亡无显著影响。
[0022] 经Transwell体外细胞迁移实验发现，所述免疫调节肽可显著促进人单核细胞的迁移。
[0023] 实时荧光定量PCR结果显示，所述免疫调节肽能显著促进人单核细胞趋化因子MCP-1、MCP-3以及细胞因子TNFα的表达。众所周知，病原体感染的有效控制和清除取决于单核细胞向感染部位的迁移。这种迁移依赖于趋化因子的环境，包括单核细胞趋化蛋白1和3(MCP-1和MCP-3)。活性单核细胞产生的细胞因子，如TNFα可以对多种病原体产生有效的防御性炎症反应。
[0024] 本发明还通过蛋白免疫印迹试验，发现所述免疫调节肽能显著增加人单核细胞中磷酸化IκBα的表达，表明能够激活NF-κB信号通路。先天性免疫信号网络响应各种刺激而呈现出振荡动态。NF-κB信号通路是控制单核细胞趋化因子和炎性细胞因子表达的重要通路之一。
[0025] 传统抗生素以及抗菌肽是直接作用于菌体细胞DNA、RNA和蛋白质合成系统的特定环节实现杀菌作用，容易产生耐药性。与直接杀伤病原相比，通过主动调节免疫系统中免疫细胞的功能、增强其清除病原的能力，可以更加有效地避免耐药性的产生，因此具有更大的应用前景。先天性免疫是免疫系统的第一道防线，单核细胞是先天性免疫应答的关键效应细胞，更是先天性免疫和适应性免疫之间的重要纽带。因此，增强先天性免疫细胞单核细胞的功能将有助于病原的清除。现有的免疫增强活性的多肽如MDP其作用靶点多为抗原提呈细胞如树突状细胞，可通过TLR4/NFκB信号通路促进树突状细胞成熟，诱导树突状细胞产生细胞因子IL-12和TNFα，增强树突状细胞的抗原递呈能力。但是MDP包含微生物来源的成分，具有一定的毒副作用。
[0026] 本发明所述的多肽来源于人母乳的天然成分β-酪蛋白，多肽序列及理化性质与上述免疫增强多肽完全不同。本发明所述的多肽能够顺利进入人单核细胞中，并对人单核细胞的增殖活力和凋亡没有显著影响，但能够明显增强单核细胞的迁移能力，促进单核细胞趋化因子MCP-1、MCP-3和细胞因子TNFα的表达，并能够激活NFκB信号通路。因此，本发明所述的多肽具有良好的免疫增强效果，安全性优。
[0028] 图1是基于I-TASSER数据库预测本发明所述多肽的空间结构示意图；
[0029] 图2是试验例1多肽入胞的荧光显微镜拍照；
[0030] 图3是试验例2测定多肽对人单核细胞增殖活力影响的对照曲线图；
[0031] 图4是试验例3测定多肽对人单核细胞凋亡影响的对照流式散点图；
[0032] 图5是试验例4中多肽促进人单核细胞迁移的显微镜下染色对照图以及计数统计结果的对照柱形图；
[0033] 图6是试验例5中多肽促进人单核细胞MCP-1、MCP-3、TNF-α表达的对照柱形图；
[0034] 图7是试验例6中五个多肽促进人外周血单核细胞MCP-1的表达的对照柱形图；
[0035] 图8是试验例7中多肽激活人单核细胞NFкB信号通路蛋白免疫印迹实验的对照图；
具体实施方式
[0036] 下面结合附图对本发明进行进一步说明。
[0037] 实施例1
[0038] 多肽SEQ ID NO.1，氨基酸序列为VLKSPTIPFFDPQIP，分子量(Mw)为1699.02，等电点(pI)为5.81，脂肪指数为97.33，亲水性0.253。
[0039] 实施例2
[0040] 多肽SEQ ID NO.2，氨基酸序列为VLKSPTIPFFDPQIPK，分子量(Mw)为1827.2，等电点(pI)为8.56，脂肪指数为91.25，亲水性-0.006。
[0041] 实施例3
[0042] 多肽SEQ ID NO.3，氨基酸序列为MPVLKSPTIPFFDPQIP，分子量(Mw)为1927.33，等电点(pI)为5.59，脂肪指数为85.88，亲水性0.241。
[0043] 实施例4
[0044] 多肽SEQ ID NO.4，氨基酸序列为MPVLKSPTIPFFDPQIPK，分子量(Mw)为2055.51，等电点(pI)为8.35，脂肪指数为81.11，亲水性0.011。
[0045] 实施例5
[0046] 多肽SEQ ID NO.5，氨基酸序列为GRVMPVLKSPTIPFFDPQIP，分子量(Mw)为2238.2，等电点(pI)为8.8，脂肪指数为87.5，亲水性0.17，90％的氨基酸以无规卷曲，10％的氨基酸以延伸链的二级结构存在。该多肽在I-TASSER数据库预测的空间结构如图1所示。从图1的多肽空间结构图可看出，该多肽浅色部分为无规卷曲，深色部分为延伸链结构。
[0047] 上述五个实施例对应的多肽均委托上海科肽生物科技有限公司，通过固相化学合成获得，并对肽链氮端进行了乙酰化，肽链碳端进行了酰胺化修饰(Ac-GRVMPVLKSPTIPFFDPQIP-NH2)。末端封闭使其与母本蛋白更为接近，以增强其稳定性及进入细胞的能力从而增强多肽的生物学活性。
[0048] 试验例1多肽的入胞性能
[0049] 将实施例1～5所述的多肽分别加入人单核细胞系THP-1中处理3小时后，将细胞用甩片机(Thermo，USA)甩片后用4％多聚甲醛(Biosharp，China)固定细胞15min，并滴加含有DAPI染料的抗淬灭剂(Life P36966，USA)，封片，采用共聚焦显微镜拍照，可观察到这些多肽都能够进入细胞并分布于细胞质和细胞核，说明这些多肽都能够进入细胞发挥功能。图2为实施例5所示的多肽荧光显微镜拍照图。
[0050] 试验例2多肽对人单核细胞增殖活力的影响
[0052] (1)THP-1细胞培养于含有10％FBS(Gibco，USA)的RPMI1640培养基(Gibco，USA)3
中。在96孔板中配制5×10/100μl/孔的细胞悬液，每组3个复孔。将培养板在37℃，5％CO2的培养箱里预培养24小时。
中。在96孔板中配制5×10/100μl/孔的细胞悬液，每组3个复孔。将培养板在37℃，5％CO2的培养箱里预培养24小时。
[0053] (2)向培养板中加入10μl含有如上述实施例所示的完全培养基，多肽的工作浓度为100μM。设置对照孔(含有细胞的培养基、CCK-8、不含该多肽)和空白孔(不含细胞和该多肽的培养基、CCK-8)。
[0054] (3)将培养板在37℃，5％CO2的培养箱中孵育6小时，24小时或48小时。
[0055] (4)更换100μl/孔的新鲜培养基，并向每孔加入10μl CCK-8溶液。
[0056] (5)将培养板在培养箱内孵育1小时。
[0057] (6)用酶标仪测定在450nm处的吸光度(OD450nm)。
[0058] (7)根据450nm处的吸光度以及相应公式(细胞存活率＝[(As-Ab]/(Ac-Ab)]×100％)测定该多肽对细胞增殖活力的影响。
[0059] 试验结果表明，这一类多肽对人单核细胞细胞的增殖活力均无显著影响。如图3展示了基于实施例5的多肽测定多肽对人单核细胞增殖活力影响的对照曲线图。
[0060] 试验例3多肽对人单核细胞凋亡的影响
[0061] 采用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(BD 556547，USA)，具体步骤如下：
[0062] (1)收集100μM如上述实施例所示的多肽处理24小时的THP-1细胞及对照细胞，300g，4℃离心5min。
[0063] (2)用预冷的PBS洗涤细胞2次，每次均需300g，4℃离心5min。
[0064] (3)吸弃PBS，加入100μ1 1×Binding Buffer重悬细胞。
[0065] (4)加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI Staining Solution，轻轻混匀。
[0066] (5)避光、室温反应10-15min。
[0067] (6)加入400μl 1×Binding Buffer，混匀后放置于冰上，样品在1小时内用流式细胞仪检测。
[0068] 试验结果表明，本发明的这一类多肽对人单核细胞细胞凋亡同样无显著影响。如图4展示了基于实施例5的多肽测定多肽对人单核细胞凋亡影响的对照曲线图。
[0069] 综合试验例2和试验例3的结果，表明了该类多肽对人单核细胞的细胞增殖活力和凋亡均无明显影响，无细胞毒副作用。
[0070] 试验例4多肽对人单核细胞迁移的影响
[0071] 采用Transwell迁移小室实验检测，具体步骤如下：
[0072] 采用100μM上述实施例多肽处理的人单核细胞THP-1细胞24h后收集培养上清，4度1000g离心15min后取上清立即用于实验。迁移小室下室加入100μM实施例1所述的多肽处理
4
THP-1细胞24h后的培养上清600μl，将正常培养的THP-1细胞按照5×10 悬于100μl含有
0.5％BSA(Solarbio，A8020-5g，USA)的无血清RPMI1640培养基中小心加入上室，避免产生气泡。对照组下室加入无多肽处理的THP-1细胞培养24h后的上清600μl。培养24h后弃掉培养基，用1×PBS(Gibco，USA)漂洗后加入4％多聚甲醛固定20min，1×PBS漂洗后加入1％结晶紫(Solarbio，G1062-10ml，USA)染色20min，清水漂洗去多余颜色，用棉签擦净小室上表面细胞，自然风干后显微镜下观察、拍照。
4
THP-1细胞24h后的培养上清600μl，将正常培养的THP-1细胞按照5×10 悬于100μl含有
0.5％BSA(Solarbio，A8020-5g，USA)的无血清RPMI1640培养基中小心加入上室，避免产生气泡。对照组下室加入无多肽处理的THP-1细胞培养24h后的上清600μl。培养24h后弃掉培养基，用1×PBS(Gibco，USA)漂洗后加入4％多聚甲醛固定20min，1×PBS漂洗后加入1％结晶紫(Solarbio，G1062-10ml，USA)染色20min，清水漂洗去多余颜色，用棉签擦净小室上表面细胞，自然风干后显微镜下观察、拍照。
[0073] 试验结果表明，该类多肽处理组培养的上清能够明显促进人单核细胞的迁移。图5展示了基于实施例5的多肽Transwell迁移实验显微镜下染色下的细胞迁移结果，柱形图对照表情多肽组具有显著意义。
[0074] 试验例5多肽对人单核细胞趋化因子及细胞因子表达的影响
[0075] 采用100μM上述实施例的多肽处理人单核细胞THP-1细胞，6h后1000rpm离心5min后弃上清，1×PBS洗一遍，收集细胞，采用RNA抽提试剂盒(OMEGA R6834-01，USA)提取总RNA。步骤如下：
[0076] 1.使用前每1ml TRK裂解缓冲液加入20μl的β-巯基乙醇。收集细胞(≤1，500rpm or 400*g)*5min，弃上清，加入TRK)裂解液，漩涡振荡混匀。在离心管中用TRK裂解缓冲液裂解细胞，使细胞团松散，轻弹EP管或者用枪头吹旋，再用漩涡振荡混匀。
[0077] 2.像裂解产物加入等体积的70％乙醇，混匀。
[0078] 3.将HiBind RNA Mini柱子放在一个2ml收集管中，将上述样品全部加入HiBind RNA Mini柱子上，室温10000g离心1min。弃去流出液。
[0079] 4.将柱子放在一个新的2ml收集管中，加上300μl RNA wash buffer I，室温离心10000g离心1min。弃去流出液。
[0080] 5.加入500μl RNA wash buffer II，室温离心10000g离心1min。弃去流出液。
[0081] 6.重复第五步步骤一次。
[0082] 7.20000g离心2min使HiBind RNA Mini柱子干燥。
[0083] 8.洗脱RNA。将HiBind RNA Mini柱子转移到一个新的无酶的1.5ml EP管中，加入30μl DEPC水洗脱柱子，室温离心10000g离心1min。收集流出液即总RNA。
[0084] 9.Nano Drop测RNA浓度后备用或-80度冰箱冻存。
[0085] 采用逆转录试剂盒(TAKARA RR047A，Japan)将mRNA按如下步骤逆转成cDNA：
[0086]
[0087] 42度，2min，4度。
[0088]
[0089] 37度15min，85度5s，4度。
[0090] 采用Power SYBR Green Master Mix(ABI 4367659，USA)以及荧光定量PCR仪(ABI ViiA 7，USA)检测人单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、单核细胞趋化蛋白3(MCP-3)、以及肿瘤坏死因子α(TNFα)mRNA的表达。
[0091] 引物序列如下：
[0092] MCP-1上游引物：5’-TCATAGCAGCCACCTTCATTC-3’
[0093] MCP-1下游引物：5’-TAGCGCAGATTCTTGGGTTG-3’
[0094] MCP-3上游引物：5’-AAGCAGAGGCTGGAGAGCTACA-3’
[0095] MCP-3下游引物：5’-GGGTCAGCACAGATCTCCTTG-3’
[0096] TNFα上游引物：5’-GACCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG-3’
[0097] TNFα下游引物：5’-CAGCCTTGGCCCTTGAAGAGGAC-3’
[0098] GAPDH上游引物：5’-GTCGCTGTTGAAGTCAGAGG-3’
[0099] GAPDH下游引物：5’-GAAACTGTGGCGTGATGG-3’。
[0100] 图6展示了实施例5的多肽处理能明显促进人单核细胞趋化因子MCP-1、MCP-3以及细胞因子TNFα的表达，从而增强单核细胞迁移和防御病原的能力。
[0101] 试验例6多肽对人外周血单核细胞趋化因子表达的影响
[0102] 采用EasySepTM Direct Human Monocyte Isolation Kit免疫磁珠分选试剂盒按照说明书分离正常人外周血(EDTA抗凝)单核细胞。即加入50μL Isolation Cocktail/mL血TM样以及50μL RapidSpheres /mL血样，室温静置5min后，加入4倍体积的试验例2中完全培养基吹打均匀后放入磁力架中，室温静置3min后再重复一遍上述步骤，即可获得人外周血单核细胞。
[0103] 采用100μM上述实施例的多肽分别处理人外周血单核细胞趋化因子MCP-1的表达，步骤如试验例5。
[0104] 图7展示了五条多肽均能促进人外周血单核细胞趋化因子MCP-1的表达，其中以实施例5的多肽促进外周血单核细胞MCP-1的表达效果最好。更说明上述多肽对不同来源人单核细胞均有类似的免疫增强作用。
[0105] 试验例7多肽对人单核细胞NF-κB信号通路的影响
[0106] 采用100μM如实施例5所述的多肽处理人单核细胞THP-1细胞，1h后1000rpm离心5min后弃上清，1×PBS洗一遍，收集细胞，将RIPA蛋白裂解液(Beyotime P0013B，China)加入细胞沉淀中裂解细胞，冰上放置30min后4度12000g离心20min后吸取上清液即为总蛋白。
采用BCA蛋白定量试剂盒(Thermo 23225，USA)按照说明书加样后，采用读板器检测样品再
562nm处的吸光度，对总蛋白进行定量。定量后按每份样品30μg蛋白的量加入1×蛋白上样缓冲液制备样品，95度变性5min。采用蛋白免疫印迹实验(Western blot)，经过上样、电泳、转膜、5％脱脂奶封闭、一抗孵育4度过夜、1×TBST洗膜三次，每次10min、二抗孵育室温2h、1×TBST洗膜三次，每次10min、ECL发光液(Millipore WBKLS0500，USA)显影等步骤检测NF-κB信号通路关键蛋白p-IκBα的表达，α-tubulin为内参。采用的一抗为抗p-IκBα兔单克隆抗体(CST2859，USA)，抗α-tubulin兔多克隆抗体(Proteintech 11224-1-AP，USA)；二抗为山羊抗兔HRP标记二抗(Biosharp BL003A，China)。
采用BCA蛋白定量试剂盒(Thermo 23225，USA)按照说明书加样后，采用读板器检测样品再
562nm处的吸光度，对总蛋白进行定量。定量后按每份样品30μg蛋白的量加入1×蛋白上样缓冲液制备样品，95度变性5min。采用蛋白免疫印迹实验(Western blot)，经过上样、电泳、转膜、5％脱脂奶封闭、一抗孵育4度过夜、1×TBST洗膜三次，每次10min、二抗孵育室温2h、1×TBST洗膜三次，每次10min、ECL发光液(Millipore WBKLS0500，USA)显影等步骤检测NF-κB信号通路关键蛋白p-IκBα的表达，α-tubulin为内参。采用的一抗为抗p-IκBα兔单克隆抗体(CST2859，USA)，抗α-tubulin兔多克隆抗体(Proteintech 11224-1-AP，USA)；二抗为山羊抗兔HRP标记二抗(Biosharp BL003A，China)。
[0107] 结果见图8所示，蛋白免疫印迹实验表明，多肽处理能够明显增加人单核细胞中磷酸化hκBα的表达，表明能够激活NF-κB信号通路。
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