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一种蓖麻Cdc5-DBD蛋白的制备及结晶方法

热词	cdc5 蛋白 dbd 蓖麻亲和 mpd 分子筛晶体 mes 表达
专利类型	发明公开	法律事件	公开; 实质审查;
专利有效性	实质审查	当前状态	实质审查
申请号	CN202411628558.4	申请日	2024-11-14
公开(公告)号	CN119242672A	公开(公告)日	2025-01-03
申请人	淄博市农业科学研究院;	申请人类型	科研院所
发明人	王超; 刘红光; 刘婷婷; 谭德云; 徐刚; 谢凯丽; 张立凯;	第一发明人	王超
权利人	淄博市农业科学研究院	权利人类型	科研院所
当前权利人	淄博市农业科学研究院	当前权利人类型	科研院所
省份	当前专利权人所在省份：山东省	城市	当前专利权人所在城市：山东省淄博市
具体地址	当前专利权人所在详细地址：山东省淄博市张店区商场西街197号	邮编	当前专利权人邮编：255000
主IPC国际分类	C12N15/70	所有IPC国际分类	C12N15/70 ; C12N15/62 ; C07K19/00 ; C07K1/22 ; C07K1/16 ; C07K1/30
专利引用数量	0	专利被引用数量	0
专利权利要求数量	9	专利文献类型	A
专利代理机构	河北虑恒知识产权代理事务所	专利代理人	王然;
摘要	本发明涉及蛋白质工程领域，尤其涉及一种蓖麻Cdc5‑DBD蛋白的制备及结晶方法。所述蓖麻Cdc5‑DBD蛋白的制备方法为：利用原核表达系统表达蓖麻Cdc5‑DBD蛋白，经过菌体裂解，裂解上清液依次过亲和层析柱、分子筛层析柱，最终得到纯化的目的蛋白。在MES缓冲液环境下，Cdc5‑DBD蛋白表达纯化更容易操作，蛋白表达量更大，纯度更高，蛋白性质更好；本发明还提供了蓖麻Cdc5‑DBD蛋白的结晶方法，所得晶体重复性好、分辨率高。
权利要求	1.一种蓖麻Cdc5‑DBD蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)融合表达载体的构建；将蓖麻Cdc5‑DBD蛋白的目的基因克隆到表达载体中，构建融合表达载体； (2)目的基因的表达将融合表达载体转入感受态中，经IPTG诱导表达；收集经IPTG诱导的菌液，将菌液离心后收集菌体； (3)亲和层析纯化目的蛋白将菌体重悬后，与蛋白酶抑制剂和还原剂混合，将混合液超声破碎、离心后制备目标蛋白上清液；将Ni‑亲和层析柱用亲和缓冲液平衡后，将目标蛋白上清液梯度洗脱； (4)分子筛层析纯化目的蛋白将分子筛层析柱用分子筛层析缓冲液平衡后，收集400mM咪唑洗脱液，通过分子筛层析根据蛋白大小进一步纯化目的蛋白。 2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述蓖麻Cdc5‑DBD蛋白的目的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其氨基酸序列SEQ ID NO.6所示。 3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述诱导表达是经0.8mM IPTG，18℃、160rpm诱导培养12h。 4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述蛋白酶抑制剂为PMSF；所述还原剂为DTT。 5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述亲和层析缓冲液的配方为20mM MES，150mM NaCl，1mM DTT，pH 6.0。 6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述分子筛层析缓冲液的配方为20mM MES，150mM NaCl，pH 6.0。 7.一种蓖麻Cdc5‑DBD蛋白的结晶方法，其特征在于，用缓冲液将权利要求1～6任一项所述方法制备的蓖麻Cdc5‑DBD蛋白配制成浓度5mg/mL的蛋白溶液，然后在MPD沉淀剂存在的条件下，于16℃恒温培养箱中静置培养7天，得到蓖麻Cdc5‑DBD蛋白的单晶。 8.根据权利要求7所述的的结晶方法，其特征在于，所述MPD沉淀剂为MPD水溶液，其中MPD水溶液的体积浓度为10～30％。 9.根据权利要求7所述的结晶方法，其特征在于，所述缓冲液的配方为20mM MES，150mM NaCl，pH 6.0。
说明书全文	一种蓖麻Cdc5‑DBD蛋白的制备及结晶方法技术领域 [0001] 本发明涉及蛋白质工程领域，尤其涉及一种蓖麻Cdc5‑DBD蛋白的制备及结晶方法。背景技术 [0002] 蓖麻作为重要的能源与油料作物，具有耐旱、耐盐碱、耐瘠薄的特点明显，是盐碱地上的优势作物，可用于盐碱地生态改良、增加盐碱地区农民收入。 [0003] Prp19复合物影响蓖麻油酸合成途径。Prp19复合物的核心骨架蛋白Cdc5，N端DNA‑Binding Domain(DBD)序列参与了DNA结合，在DNA修复过程中，引导修复Prp19复合物快速的定位到DNA损伤位点，并控制细胞周期检查点，使受损细胞周期停滞，且Cdc5‑DBD在整个真核生物系统中高度保守。 [0004] 由于Cdc5‑DBD蛋白结构尚不清楚，与DNA的结合机制还有待进一步研究，因此，获得高质量的Cdc5‑DBD蛋白样品和稳定性好、可重复的高质量晶体对推进结构生物学解析Cdc5‑DBD与DNA结合互作机制具有重要意义。发明内容 [0005] 本发明的目的是提供一种蓖麻Cdc5‑DBD蛋白的制备及结晶方法。 [0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案： [0007] 本发明提供了一种蓖麻Cdc5‑DBD蛋白的制备方法，包括以下步骤： [0008] (1)融合表达载体的构建； [0009] 将蓖麻Cdc5‑DBD蛋白的目的基因克隆到表达载体中，构建融合表达载体； [0010] (2)目的基因的表达 [0011] 将融合表达载体转入感受态中，经IPTG诱导表达；收集经IPTG诱导的菌液，将菌液离心后收集菌体； [0012] (3)亲和层析纯化目的蛋白 [0013] 将菌体重悬后，与蛋白酶抑制剂和还原剂混合，并将混合液依次超声破碎、离心后制备目标蛋白上清液；将Ni‑亲和层析柱用亲和缓冲液平衡后，将目标蛋白上清液梯度洗脱； [0014] (4)分子筛层析纯化目的蛋白 [0015] 将分子筛层析柱用分子筛层析缓冲液平衡后，收集400mM咪唑洗脱液，通过分子筛层析根据蛋白大小进一步纯化目的蛋白。 [0016] 优选的，步骤(1)所述蓖麻Cdc5‑DBD蛋白的目的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示： [0017] atgaggataatgataaaaggaggagtgtggaagaacacggaggatgagatactgaaagcggcggttatgaaatatggaaaaaatcaatgggctcgtatctcttctcttcttgttcgtaagtctgctaaacaatgtaaggctcgctggtatgagtggcttgacccctccattaaaaagactgagtggaccagagaggaggatgagaaattgcttcatcttgctaagctcatgccaactcaatggcgaactattgctccaattgttggccgtactccgtctcagtgtctcgagcgatatgagaagcttcttgatgctgcgtgtgttaaggat； [0018] 其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示： [0019] MRIMIKGGVWKNTEDEILKAAVMKYGKNQWARISSLLVRKSAKQC KARWYEWLDPSIKKTEWTREEDEKLLHLAKLMPTQWRTIAPIVGRTPSQ CLERYEKLLDAACVKD。 [0020] 优选的，步骤(2)所述诱导表达是经0.8mM IPTG，18℃、160rpm诱导培养12h。 [0021] 优选的，步骤(3)所述蛋白酶抑制剂为PMSF，所述还原剂为DTT。 [0022] 优选的，步骤(3)所述亲和层析缓冲液的配方为20mM MES，150mM NaCl，1mM DTT，pH 6.0。 [0023] 优选的，步骤(4)所述分子筛层析缓冲液的配方为20mM MES，150mM NaCl，pH 6.0。 [0024] 本发明还提供了一种蓖麻Cdc5‑DBD蛋白的结晶方法，用缓冲液将所述蓖麻Cdc5‑DBD蛋白的制备方法制备的蓖麻Cdc5‑DBD蛋白配制成浓度5mg/mL的蛋白溶液，然后在MPD沉淀剂存在的条件下，于16℃恒温培养箱中静置培养7天，得到蓖麻Cdc5‑DBD蛋白的单晶。 [0025] 优选的，所述MPD沉淀剂为MPD水溶液，其中MPD水溶液的体积浓度为10～30％。 [0026] 优选的，所述缓冲液的配方为20mM MES，150mM NaCl，pH 6.0。 [0027] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果： [0028] 本发明利用原核表达系统表达蓖麻Cdc5‑DBD蛋白，经过菌体裂解，裂解上清液依次过亲和层析柱、分子筛层析柱，最终得到纯化的目的蛋白。在MES缓冲液环境下，蓖麻Cdc5‑DBD蛋白表达纯化会更容易操作，蛋白表达量更大，纯度更高，蛋白性质更好。本发明还提供了蓖麻Cdc5‑DBD蛋白的结晶方法，蓖麻Cdc5‑DBD蛋白在25％ MPD条件下，可获得大量单晶体，所得晶体大、质量好、分辨率高，且该方法重复性好；通过本发明所述结晶方法得到的晶体分辨率高，能够更好满足蛋白与DNA结合互作机制研究的需求。附图说明 [0029] 图1为实施例1中检测蛋白诱导表达效果的SDS‑PAGE电泳图；其中，泳道1为对照，泳道18℃表示在温度18℃下诱导； [0030] 图2为实施例1中亲和层析过程中各液浆中蛋白样品情况的SDS‑PAGE电泳图；其中，S为Supernatant，离心后上清液总蛋白；P为Precipitate，离心后的沉淀总蛋白；FT为Flow through，穿出总蛋白；0‑400分别表示洗脱液(20mM MES，pH 6.0，150mM NaCl)中含有0mM、20mM、80mM、400mM咪唑；M为蛋白标准品Marker； [0031] 图3为实施例1中蛋白样品的分子筛层析图(SuperdexTM 75 10/300GL)以及蛋白样品分子筛主峰的SDS‑PAGE电泳图； [0032] 图4为实施例2中pETM10‑Cdc5‑DBD蛋白晶体图；其中图A为20％MPD，图B为25％ MPD。 [0033] 图5为实施例2中pETM10‑Cdc5‑DBD蛋白晶体衍射图。具体实施方式 [0034] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。 [0035] 实施例1蓖麻Cdc5‑DBD蛋白的制备方法 [0036] 1、表达载体的构建 [0037] (1)引物设计 [0038] 经NCBI查询蓖麻Cdc5(XP_002521973.1)基因1‑110AA序列，利用Snap Gene，设计Sticky‑end方法所需引物，本发明所用具体引物序列见表1。 [0039] 表1具体引物序列 [0040] [0041] (2)目的基因的PCR扩增和回收 [0042] 目的基因PCR扩增过程中，反应体系的变性温度根据PCR聚合酶的活性调整，退火温度则根据引物退火温度做相应的调整，延伸时间是根据PCR聚合酶活性和目的基因的片段长度来确定。具体PCR扩增体系和反应参数，分别见表2和表3。 [0043] 表2PCR扩增体系 [0044] [0045] 表3PCR反应参数 [0046] [0047] [0048] PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测目的片段大小和纯度(参照DNA Marker)。切胶回收目的片段，并用Nano Drop微量分光光度计检测回收产物浓度，备用。 [0049] (3)DNA变复性产生粘性末端 [0050] 将F1/R1，F2/R2纯化产物按照摩尔比1:1混合，加入1×Pryrobest PCR Buffer。变复性参数：94℃5min，65℃15min，16℃冷却。 [0051] (4)酶切表达载体 [0052] 本发明中主要利用Nco I/Xho I两种内切酶处理表达载体，双酶切是在37℃下反应5‑6h。酶切体系见表4。 [0053] 表4酶切体系 [0054] [0055] 酶切孵育产物进行1％琼脂糖胶电泳检测，切胶回收目的片段(参照DNA 片段快速回收试剂盒)。 [0056] (5)载体与目的片段连接 [0057] 按照T4 DNA Ligase 说明书，将带有粘性末端的变复性产物和质粒pETM10混合，16℃过夜孵育。连接体系见表5。 [0058] 表5粘性末端连接体系 [0059] [0060] [0061] (6)热击转化与抗性筛选 [0062] 感受态细胞E.coli DH5α，置于冰上融化； [0063] 将连接产物加入到50μL感受态细胞中，冰上孵育30min； [0064] 42℃水浴90s，立即置于冰上冷却45s； [0065] 无菌操作加入500μL SOC培养基，37℃、220rpm复苏培养30min； [0066] 将培养菌体均匀平铺在含有与载体相对应抗性的LB平板上； [0067] 倒置于37℃恒温培养箱过夜培养，挑取单克隆菌落，送公司测序。 [0068] 2、目的蛋白表达 [0069] (1)将测序正确的质粒，热激转化到大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)中； [0070] (2)挑取单克隆菌落接种到含有抗性的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养5‑6h，OD值大约在0.6‑0.8； [0071] (3)转接入750mL LB抗性培养基中； [0072] (4)37℃、220rpm培养4‑6h，检测OD600值达0.6‑0.8； [0073] (5)加入1mM IPTG，18℃、180rpm诱导培养15h； [0074] (6)12 800×g室温离心10min，弃上清，收集菌体。 [0075] SDS‑PAGE电泳检测蛋白诱导表达效果(见图1)。在1mM IPTG，18℃、180rpm诱导培养15h条件下，蛋白表达明显，满足蛋白纯化条件。 [0076] 3、目的蛋白纯化 [0077] (1)亲和层析 [0078] 原核表达中，重组蛋白以6×His标签熬合金属离子为最简单有效的蛋白纯化方式。本发明采用的金属离子(镍离子或锌离子)亲合层析，即是以固定金属离子拉取6×His重组蛋白的方式。 [0079] Cdc5‑DBD的理论分子量MW＝12.3kDa，等电点为9.2，用20mM MES，pH 6.0，150mM NaCl，1mM DTT为亲和缓冲液。80mL亲和缓冲液重悬菌体，搅拌或旋涡震荡使菌体分散，菌液均匀； [0080] 加入蛋白酶抑制剂PMSF(终浓度为1mM)和还原剂DTT(终浓度为1mM)，搅拌混匀，冰上操作； [0081] 超声破壁10min(2sec on/4sec off，功率400W)，冰浴操作；超声破碎后理想效果为菌体类似蛋清状透明； [0082] 将破壁菌浆分装到50mL离心管，12 800×g，4℃离心20min。 [0083] 平衡：使用10mL(5‑10倍柱体积)亲和缓冲液平衡His beads； [0084] 上样：将离心获得的蛋白上清液加入到His beads，重力作用下，液浆流穿His beads，为保证蛋白充分螯合，反复上样两次； [0085] 洗杂：使用20mL含有20mM咪唑亲和缓冲液清洗His beads，去除非特异性结合的杂蛋白和80mM咪唑去除弱结合重组蛋白； [0086] 洗脱：使用高浓度咪唑(400mM)亲和缓冲液，洗脱目的蛋白； [0087] 电泳：SDS‑PAGE电泳检测每一步液浆中蛋白样品情况； [0088] 填料保存：用50mM EDTA清洗His beads，脱去金属离子，再多次用ddH2O清洗，20％乙醇密封柱子，4℃保存。 [0089] 菌体经过超声破碎后，在重力作用下流穿Ni‑sepharose填料柱，经80mM低浓度咪唑Buffer除去非特异性结合蛋白，400mM高浓度咪唑Buffer竞争性洗脱目的蛋白。从亲和层析后SDS‑PAGE电泳结果(见图2)分析，蓖麻Cdc5‑DBD蛋白在MES pH 6.0Buffer环境下，有很高的溶解度。在80mM低浓度咪唑缓冲液除杂过程中，目的蛋白基本没有与亲和层析填料柱解离，在高浓度咪唑(400mM)竞争下，目的蛋白被洗脱下来，杂蛋白较少，达到亲和层析除杂目的。 [0090] (2)分子筛层析 [0091] 将亲和层析所得的较纯蛋白样品，经分子筛层析以蛋白大小及聚集状态进一步精纯化，分子筛层析缓冲液用20mM MES，pH 6.0，150mM NaCl。 [0092] 平衡：使用2倍柱体积缓冲液冲洗凝胶过滤层析柱样至Surperdex 7510/300GL凝胶柱； [0093] 上样：通过蛋白纯化系统自动将0.5mL样品缓慢流入层析柱中； [0094] 洗脱：在缓冲液推动下，蛋白样品依据分子大小依次流穿分子筛层析柱，起到分离和纯化目的； [0095] 检测：蛋白纯化仪对蛋白样品A280 nm吸收峰进行检测，判定蛋白大小及聚集状态。 [0096] 收集亲和层析纯化的目的蛋白，通过分子筛层析根据蛋白大小进一步纯化目的蛋白。pETM10‑Cdc5‑DBD蛋白在13.4mL检测到蛋白主峰(见图3)，根据标准品推测，蛋白大小是11kDa左右，与理论分子量12.3kDa接近，说明pETM10‑Cdc5‑DBD蛋白在MES pH 6.0Buffer中是以单体存在。收集pETM10‑Cdc5‑DBD主峰蛋白，浓缩至8mg/mL，分装EP管中，置于液氮中速冻，‑80℃保存备用。 [0097] 实施例2 [0098] 蓖麻Cdc5‑DBD蛋白的结晶方法 [0099] 1、蓖麻Cdc5‑DBD蛋白晶体制备 [0100] 将实施例1制备的pETM10‑Cdc5‑DBD蛋白溶解于缓冲液(20mM MES，pH 6.0，150mM NaCl)中，得浓度5mg/mL的蛋白溶液。然后进行鸟枪法晶体试剂盒筛选。16℃恒温培养箱中，经过一周的静置，pETM10‑Cdc5‑DBD蛋白在含20％MPD((v/v)％)沉淀剂的池液中结晶，晶体呈六方形片状，有层叠(见图4A)。为得到晶型比较好，适于衍射的单晶，需进一步优化结晶条件。 [0101] 以原始20％ MPD(v/v)％沉淀剂条件为基础，10％、15％、18.5％、20％、22.5％、25％、30％进行晶体生长条件梯度筛选。结果发现，在25％ MPD沉淀剂条件下，观察到适于衍射的六方菱形单晶体出现(见图4B)。 [0102] 2、晶体衍射和数据收集 [0103] 防冻液制备：在晶体生长池液条件下补加20％甘油，混匀； [0104] 晶体冻存：显微镜下操作，选择稍大于晶体的Loop环，在表面张力作用下将晶体从原始液浆中转移到防冻液内，晶体粘附在Loop环中，迅速转移到液氮中冻存； [0105] 晶体衍射：晶体衍射在上海同步辐射光源完成。 [0106] 将晶体用Loop环转移到含有20％甘油的防冻液中，迅速在液氮中冻存，送到上海同步辐射中心进行X‑ray衍射(见图5)。晶体衍射波长与检测器距离为300mm，曝光时长为0.5s，晶体分辨率为每张衍射图摆角为1°，共收集360°。衍射数据分析，属于C 2 2 21空间群，晶胞参数 α＝β＝γ＝90°。具体收集参数见表6。 [0107] 表6pETM10‑Cdc5‑DBD蛋白晶体结构数据收集和处理 [0108] [0109] [0110] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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