一种eIF2α的突变体、突变体细胞及制备方法和应用
| 热词 | eif2α 细胞 s52a 翻译 蛋白 突变 表达 裂解 上清液 体外 | ||
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202410237067.0 | 申请日 | 2024-03-01 |
| 公开(公告)号 | CN118290560A | 公开(公告)日 | 2024-07-05 |
| 申请人 | 南方科技大学; | 申请人类型 | 学校 |
| 发明人 | 曾福星; 杜子朔; 杜梦谭; | 第一发明人 | 曾福星 |
| 权利人 | 南方科技大学 | 权利人类型 | 学校 |
| 当前权利人 | 南方科技大学 | 当前权利人类型 | 学校 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：广东省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：广东省深圳市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：广东省深圳市南山区桃源街道学苑大道1088号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：518055 |
| 主IPC国际分类 | C07K14/47 | 所有IPC国际分类 | C07K14/47 ; C12N15/12 ; C12N5/10 ; C12N15/866 ; C12N7/01 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 深圳市君胜知识产权代理事务所 | 专利代理人 | 孙果; |
| 摘要 | 本 发明 提出了一种eIF2α的突变体、突变 体细胞 及制备方法和应用，以包含SEQ ID NO.1所示的eIF2α的 氨 基酸序列的质粒为模板，利用引物对进行PCR扩增，得到所述eIF2α的突变体(S52A)；再获取所述的瞬时表达eIF2α(S52A)的细胞，离心，根据细胞的鲜重，加入缓冲液重悬，在 冰 浴环境中 破碎 细胞，离心，使细胞破碎物沉淀，即得到真核细胞裂解上清液；使蛋白不被 磷酸 酶磷 酸化 从而活性不被抑制；优化了现有制备真核细胞裂解上清液的方法；构建一种体外翻译体系，使用瞬时表达eIF2α(S52A)的细胞裂解上清液以提高翻译的活性。 | ||
| 权利要求 | 1.一种eIF2α的突变体，其特征在于，所述eIF2α的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，所述eIF2α的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。 |
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| 说明书全文 | 一种eIF2α的突变体、突变体细胞及制备方法和应用技术领域背景技术[0002] 基因表达的最终产物除了非编码RNA之外主要是以蛋白质的形式存在。目前，蛋白质表达技术主要包括原核细菌表达、真核昆虫细胞表达以及人源工程化细胞表达。尽管原核细胞表达具有成本低廉的优势，但许多蛋白质在原核系统中无法得到有效表达。相比之下，真核细胞表达的效率较高，但目前仍面临成本较高、时间周期较长的问题。相比于基于细胞的蛋白质表达，无细胞蛋白表达(CFPS)系统具有多个明显的优势，包括提高了功能性和可溶性全长蛋白的总产率，并且节省了大量时间。一般来说，体内蛋白质合成方法最少需要几天，最长需要几周时间才能完成。体外翻译反应可仅在几小时内完成(包括制备提取物所用的时间)，为表型(被表达的蛋白的功能)和基因型建立联系提供了最快的方式，这便与体内方法形成了鲜明对比。使用无细胞方法时，蛋白质合成也是灵活多样的，因为可以使用多种方式进行。无细胞翻译系统利用mRNA作模板，而在转录/翻译偶联系统中，质粒DNA或线性PCR片段可作为DNA模板。CFPS的另一优势是一种开放性反应系统。由于无细胞蛋白表达不受细胞壁的限制，因此有充分的机会可直接操控化学环境，可添加外源成分或分子，创造更有利于蛋白质折叠和活动的环境。CFPS系统可主动监测，迅速取样和筛选，不需要基因克隆步骤。由于没有细胞障碍限制翻译控制，CFPS系统可作为一种较为理想的方法，用于合成传统方式难以表达和进行后续分析的蛋白质。在无内在细胞代谢或生化途径相冲突的情况下，膜蛋白、病毒蛋白、毒性蛋白以及通过细胞内过程进行快速蛋白水解降解的蛋白更容易表达。因此，可缓解对于生产蛋白的潜在毒性的担忧。此外，现有的细胞外翻译技术也存在着活性低、效率不高以及经济性较差等问题。 [0003] 翻译的过程包括起始、翻译和终止三个阶段，在起始阶段，eIF2起始复合体整合了各种各样应激相关的信号来调控全局和特异性mRNA翻译。在适宜的条件下，eIF2会结合GTP和Met‑tRNAi形成三元复合体(TC)，三元复合体随后结合40S核糖体亚基、eIF1、eIF1A、eIF5和eIF3，形成43S起始前复合体(PIC)。43SPIC扫描mRNA UTR以寻找AUG起始密码子。在识别AUG后，eIF2在GTP酶活化蛋白eIF5的帮助下可将GTP水解为GDP，并从mRNA上分解下来，以结合60S核糖体亚基并延长多肽链。在eIF5作为GDI而存在的情况下，eIF2保持与GDP的结合。要开始另一轮翻译，eIF2B必须同时作为GDI位移因子(GDF)和鸟嘌呤交换因子(GEF)，从而在eIF2上将GDP交换为GTP。此步骤必须受到密切调控，不同家族的4种应激激活的激酶‑PKR(dsRNA)、PERK(ER应激)、GCN2(氨基酸饥饿)和HRI(血红素不足)对eIF2α的磷酸化后，eIF2可作为显性失活复合体隔绝eIF2B，从而阻断核苷酸交换，降低翻译活性。eIF2α、eIF2β和eIF2γ共同形成eIF2复合物，eIF2α是该复合物的主要调节亚基，因为它包含磷酸化和RNA结合位点。前述激酶常见的磷酸化位点是eIF2α亚基第52位丝氨酸。 [0004] 在体外翻译时，目前还不能通过加入固定的已知体系进行翻译的过程，因为翻译过程相对转录过程要复杂的多，所以必须要加入细胞提取物(细胞裂解上清液)，它含有翻译必须的核糖体、RNA聚合酶及其他转录和翻译辅助蛋白。而制作细胞裂解上清液的方法各有不同，并且最终活性也难以精确控制。制作细胞裂解上清液的过程中，细胞不可避免的要进行物理破碎或者化学裂解等，引起细胞内的应激反应，其中会影响翻译活性的反应之一就是上述eIF2α的磷酸化。磷酸化的eIF2α占据了eIF2B与正常eIF2α相互左右的位点，阻断了eIF2B介导的GDP与GTP的交换，从而阻止了翻译起始复合物的形成。 [0005] 所以本发明通过在细胞中过表达eIF2α突变体(S52A)，通过增加翻译起始因子增加翻译的活性。并且将常见的磷酸化位点突变之后，在制作细胞裂解上清液过程中细胞处于应激反应条件下，但是eIF2α(S52A)的活性不会受到磷酸化酶的影响，保证了较高的翻译活性。 发明内容[0006] 有鉴于此，本发明提出了一种eIF2α的突变体、突变体细胞及制备方法和应用，解决了现有技术中eIF2α的磷酸化影响体外翻译活性，难以精确控制的技术问题。 [0007] 本发明的技术方案是这样实现的： [0008] 一方面，本发明提供了一种eIF2α突变体，所述eIF2α突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，所述eIF2α突变体的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。 [0009] 在此技术方案的基础上，进一步优选地，所述eIF2α的突变体的制备方法，包括以下步骤： [0010] 以包含SEQ ID NO.1所示eIF2α的氨基酸序列的质粒为模板，利用引物对进行PCR扩增，得到所述eIF2α的突变体。 [0011] 在此技术方案的基础上，进一步优选地，所述eIF2α第52位丝氨酸进行突变，突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。 [0012] 在此技术方案的基础上，进一步优选地，所述eIF2α第52位丝氨酸突变为丙氨酸。 [0013] 第二方面，本发明还提供了一种eIF2α突变体细胞，由第一方面所述eIF2α突变体瞬时表达获得。 [0014] 在此技术方案的基础上，进一步优选地，将所述氨基酸序列为SEQ ID NO.1包含cDNA序列的质粒，转染到HEK293F细胞中瞬时表达。 [0015] 第三方面，本发明还提供了一种真核细胞裂解上清液，由第二方面所述的瞬时表达eIF2α突变体细胞制备获得。 [0016] 在此技术方案的基础上，进一步优选地，一种真核细胞裂解上清液的制备过程，具体还包括以下步骤： [0017] 获取所述的瞬时表达eIF2α突变体的细胞，离心，根据细胞的鲜重，加入缓冲液重悬，在冰浴环境中破碎细胞，离心，使细胞破碎物沉淀，即得到真核细胞裂解上清液。 [0018] 在此技术方案的基础上，进一步优选地，所述缓冲液：细胞的体积比为1:2。 [0019] 第四方面，本发明还提供了第一方面所述eIF2α突变体在体外翻译、质粒转染和杆状病毒表达中的应用。 [0020] 本发明所述的eIF2α突变体、突变体细胞及制备方法和应用，相对于现有技术具有以下有益效果： [0021] 相比现有的体外翻译技术，更高的蛋白质表达量：传统的活细胞蛋白表达技术受限于细胞本身的多方面因素，其表达的蛋白质数量往往受到限制。而无细胞蛋白表达技术通过在体外底物浓度高的环境中进行合成反应，不但避免了传统活细胞表达所面临的方方面面的限制，还能够很好地控制反应体系，从而获得表达量更高的蛋白质。 [0022] 更快的表达速度：传统活细胞蛋白表达需要细胞生长并达到最佳密度才能进行蛋白质表达，这个过程往往需要数天时间。而无细胞蛋白表达技术通常只需要数小时就能够完成蛋白质的表达，这个速度明显快于传统活细胞表达技术。 [0023] 更精准的蛋白质合成：无细胞蛋白表达技术在体外进行蛋白质合成，能够精确控制底物浓度、反应温度、反应剂比例等参数，因此可以更加精准地合成定制的蛋白质，这对于研究和应用来讲具有重要意义。 [0024] 更灵活控制：在无细胞蛋白表达技术中，可以使用分离的组分体系进行蛋白质的合成，可以控制底物和反应剂的比例，也可以在适当的反应条件下进行自定义的修饰，如蛋白质标记、药效分析等。这些优点使得无细胞蛋白表达技术更加灵活、可控，适用于更广泛的应用领域。附图说明 [0025] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。 [0026] 图1为控制组(crtl)和实施例2制备的eIF2α(S52A)突变体细胞各自制备的细胞裂解上清液检测结果图； [0027] 图2为正常培养的细胞和实施例2制备的eIF2α(S52A)表达质粒的细胞同时制备的细胞裂解上清液检测重组蛋白Western Blot分析结果图； [0028] 图3为正常培养的细胞和实施例2制备的eIF2α(S52A)表达质粒的细胞同时制备的细胞裂解上清液检测重组蛋白Western Blot分析结果图； [0029] 图4为使用表达eIF2α(S52A)和正常培养细胞的cell extract体外翻译Nano luciferase并且检测荧光活性； [0030] 图5为正常培养的细胞和实施例2制备的eIF2α(S52A)表达质粒的细胞同时制备的细胞裂解上清液在不同温度下检测重组蛋白Western Blot分析结果图。 具体实施方式[0031] 下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。 [0032] 应当理解，在此本发明实施例说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明实施例。如在本发明实施例说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。 [0033] 实施例1 [0034] 本实施例提供了一种eIF2α突变体，具体制备方法，包括以下步骤： [0035] 以包含SEQ ID NO.1所示eIF2α的氨基酸序列的质粒为模板，利用引物对进行PCR扩增，将eIF2α第52位苏氨酸突变成丙氨酸的引物： [0036] F:5’‑TCTTCTTAGTGAATTAGCAAGAAGGCGTATCCG‑3’ [0037] R:5’‑TGCTAATTCACTAAGAAGAATCATGCCTTCAATG‑3’ [0038] 其中，将所述氨基酸序列为SEQ ID NO.1包含cDNA序列的质粒，转染到HEK293F细胞中瞬时表达。 [0039] 所述eIF2α第52位丝氨酸进行突变，突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述eIF2α第52位丝氨酸突变为丙氨酸。 [0040] 转染过程具体包括： [0041] 转染前细胞的准备：将HEK‑293细胞复苏后置于37℃和5％CO2恒温摇床中培养，传5 代3次以上以恢复细胞状态；将HEK‑293细胞以3‑5×10cells/ml的密度接种，继续培养，当 6 细胞处于对数生长期(一般2‑3×10cells/ml)且细胞活率大于98％时开始转染。 [0042] 开始细胞转染：培养液体积100ml，当细胞密度为2.0×106cells/ml且细胞活率大6 6 于98％时进行转染，使用试剂如下：PEI Buffer用量：100/20＝5ml；DNA用量：2.0×10+10×100×0.45＝90ug；PEI用量：90×3＝270uL。 [0043] 转染完成后，以构建好的表达eIF2α的质粒为模板，使用上述引物进行PCR扩增，将得到的PCR产物进行DpnI酶消化以除去作为模板的质粒，将PCR产物转入DH5α感受态，将得到的单克隆菌落送sanger测序，得到转进突变质粒的单克隆菌落，再进行培养扩增提取质粒，即可获得eIF2α突变体。 [0044] 实施例2 [0045] 一种真核细胞裂解上清液，具体制备过程，包括以下步骤： [0046] 转染后的放回37℃和5％CO2的恒温摇床中培养两天，获取所述的eIF2α的突变体细胞，离心，根据细胞的鲜重，按缓冲液：细胞体积比为1:2，加入缓冲液重悬，在冰浴环境中使用Dounce型组织研磨器破碎细胞，在4℃高速离心机进行离心，使细胞破碎物沉淀，即得到真核细胞裂解上清液。 [0047] 其中，所述eIF2α突变体细胞由所述eIF2α突变体瞬时表达获得。 [0048] 应用实施例1 [0049] 一种eIF2α突变体在体外翻译萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)并检测其浓度和活性中的应用，具体包括： [0050] 1、缓冲液和荧光素酶底物来自Promega的ONE‑GloTMLuciferase Assay System。 [0051] 2、Firefly luciferase的合成，反应体系：6×reaction Buffer 5μL，Firefly luciferase mRNA 3μL，Creatine phosphokinase 1μL，Cell extract 15μL，AA mix 1μL，ddH2O 5μL。 [0052] 反应条件：37℃反应1h，其中Cell extract分别为正常培养的细胞和实施例2制备的eIF2α(S52A)表达质粒的细胞同时制备的细胞裂解上清液。 [0053] 3、检测Firefly luciferase的浓度和活性，进行体外翻译获得Firefly Luciferase之后，加入等体积的Firefly Luciferase substrate，等待约2分钟后检测荧光值。 [0054] 结果：图1为控制组(crtl)和实施例2制备的eIF2α(S52A)突变体细胞各自制备的细胞裂解上清液检测结果，可见，crtl为正常培养条件下制备的细胞裂解上清液，用于体外翻译FireFly luciferase并检测活性；+eIF2α(S52A)为在细胞系中表达eIF2α(S52A)制备细胞裂解上清液，用于体外翻译FireFly luciferase并检测活性；图1可见，转进eIF2α(S52A)表达质粒的细胞相比正常培养的细胞具有更高的体外翻译活性。 [0055] 应用实施例2 [0056] 一种eIF2α突变体在体外翻译重组蛋白并检测其浓度中的应用，具体包括： [0057] 1、缓冲液来自Promega的ONE‑GloTMLuciferase Assay System。 [0058] 2、重组蛋白的合成，反应体系：6×reaction Buffer 5μL，蛋白mRNA 5μL，Creatine phosphokinase 1μL，Cell extract 15μL，AA mix 1μL，ddH2O 3μL。 [0059] 反应条件：37℃反应1h，其中Cell extract分别为正常培养的细胞和实施例2制备的eIF2α(S52A)表达质粒的细胞同时制备的细胞裂解上清液。 [0061] 结果：图2为正常培养的细胞和实施例2制备的eIF2α(S52A)表达质粒的细胞同时制备的细胞裂解上清液检测重组蛋白Western Blot分析结果图，分别使用表达eIF2α(S52A)和正常培养细胞的cell extract体外翻译一个带有flag‑tag的约20kDa的蛋白；由图2结果可看出，转进eIF2α(S52A)表达质粒的细胞相比正常培养的细胞具有更高的体外翻译活性。 [0062] 应用实施例3 [0063] 一种eIF2α突变体在体外翻译重组蛋白并检测其浓度中的应用，具体包括： [0064] 1、缓冲液来自Promega的ONE‑GloTMLuciferase Assay System。 [0065] 2、重组蛋白的合成，反应体系：6×reaction Buffer 5μL，蛋白mRNA 5μL，Creatine phosphokinase 1μL，Cell extract 15μL，AA mix 1μL，ddH2O 3μL。 [0066] 反应条件：37℃反应1h，其中Cell extract分别为正常培养的细胞和实施例2制备的eIF2α(S52A)表达质粒的细胞同时制备的细胞裂解上清液。 [0067] 3、检测重组蛋白的浓度，在进行体外翻译获得带有FLAG‑tag约20kDa的蛋白质之后，SDS‑PAGE(十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳)并进行Western Blot分析。 [0068] 结果：图3为正常培养的细胞和实施例2制备的eIF2α(S52A)表达质粒的细胞同时制备的细胞裂解上清液检测重组蛋白Western Blot分析结果图，分别使用表达eIF2α(S52A)和正常培养细胞的cell extract体外翻译一个带有flag‑tag的约20kDa的蛋白；由图2结果可看出，转进eIF2α(S52A)表达质粒的细胞相比正常培养的细胞具有更高的体外翻译活性。 [0069] 应用实施例4 [0070] 一种eIF2α突变体在体外翻译纳米荧光素酶(Nano luciferase)中的应用，具体包括： [0071] 1、缓冲液来自Promega的ONE‑GloTMLuciferase Assay System。 [0072] 2、重组蛋白的合成，反应体系：6×reaction Buffer 5μL，蛋白mRNA 5μL，Creatine phosphokinase 1μL，Cell extract 15μL，AA mix 1μL，ddH2O 3μL。 [0073] 反应条件：37℃反应1h，其中Cell extract分别为正常培养的细胞和实施例2制备的eIF2α(S52A)表达质粒的细胞同时制备的细胞裂解上清液。 [0074] 3、检测重组蛋白的浓度，在进行体外翻译获得带有FLAG‑tag约20kDa的蛋白质之后，SDS‑PAGE(十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳)并进行Western Blot分析。 [0075] 结果：图4为分别使用表达eIF2α(S52A)和正常培养细胞的cell extract体外翻译Nano luciferase并且检测荧光活性，由图4结果可看出，转进eIF2α(S52A)表达质粒的细胞相比正常培养的细胞具有更高的体外翻译活性。 [0076] 应用实施例5‑9 [0077] 一种eIF2α突变体在体外翻译重组蛋白并检测其浓度中的应用，与应用实施例2的区别在于，翻译温度分别为25℃、27.5℃、30℃、33.5℃和37℃。 [0078] 结果如图5所示，应用实施例5‑9使用eIF2α(S52A)的真核细胞裂解上清液，对比普通细胞裂解上清液，在不同温度下翻译cap‑dependent翻译起始的luciferase mRNA并且测定活性，图5可见，细胞裂解上清液在33.5℃时具有最高的活性，并且加有eIF2α(S52A)的真核细胞裂解上清液在33.5℃时，相比控制组(crtl)增加得更多；由此可见，应用实施例表达出的eIF2α(S52A)蛋白，在具有cap序列的mRNA上具有很强的增强翻译起始的功能。 [0079] 较佳实施例中，在细胞系中瞬时表达eIF2α(S52A)的细胞裂解上清液可以增强体外翻译的活性，其应用领域包括了cap依赖mRNA翻译起始也包括了其他mRNA，也就是目前报道过的eIF2α介导的翻译起始，应用时如果需要增强活性，可以选择33.5℃左右的温度，会有更明显的增强效果。 [0080] 综上所述，本发明提供了一种eIF2α的突变体、突变体细胞及制备方法和应用，eIF2α进行突变(S52A)并在293F细胞中瞬时表达，使蛋白无法被磷酸酶磷酸化从而活性不被抑制；改良了一种制备真核细胞裂解上清液的方法；构建一种体外翻译体系，使用瞬时表达eIF2α(S52A)的细胞裂解上清液以提高翻译的活性。 |
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